黑色素合成抑制剂及其美白用途的制作方法

1.本发明属于化妆品领域，涉及美白，具体涉及黑色素合成抑制剂及其美白用途。


背景技术：

2.经过近十年的发展，中国已经成为全球第二大化妆品消费市场，市场规模仅次于美国。2019年国内化妆品市场规模达2444亿元。得益于消费升级和中国市场化妆品消费人群基数大，到2025年，中国化妆品市场规模预计将达到5400亿元，将会超越美国成为全球第一大化妆品市场。其中，以天然来源的成分作为有效成分的化妆品因为其纯净、天然、安全的特点占据了举足轻重的市场地位，且这种需求与日俱增。
3.在我国几千年的文明社会中，审美情趣随着时代的发展不断变化，但“以白为美”的观念从未改变。有过美白淡斑经历的人都知道，想达到理想效果并不是一件容易的事情。皮肤变黑、产生色斑的主要原因，是皮肤内部“黑色素”大量增加和沉积造成的。在黑色素的生成、转移、代谢过程中，酪氨酸酶是非常重要的一种酶。抑制酪氨酸酶等黑色素合成相关蛋白的活性对抑制黑色素的生成具有显著效果。
4.多糖作为构成生命活动的基本物质之一在抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗凝血等方面均发挥着特殊的生物活性作用。


技术实现要素：

5.本发明是为了提供一种黑色素合成抑制剂及其美白用途。
6.本发明技术方案如下：
7.一种多糖，通过如下方法制备：
8.取干燥粉碎的地肤花序，用蒸馏水加热浸提，提取液浓缩，冷却，滤除析出物，滤液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，静置、过滤，沉淀用无水乙醇反复冲洗，得地肤花序粗多糖；
9.sevage法去除地肤花序粗多糖中的蛋白，脱蛋白后的多糖溶液冷冻干燥得脱蛋白粗多糖；
10.deae分级：取适量deae-52纤维素装入内径为3cm的层析柱中，冲洗、平衡，柱床高度为50cm；取脱蛋白粗多糖适量，用去离子水溶解配制成浓度为10mg/ml的粗多糖溶液，上样于层析柱，上样体积为20ml，依次用0.1、0.3、0.5mol/l氯化钠溶液以1ml/min流速各洗脱300ml，合并0.3mol/l氯化钠溶液洗脱液，透析除盐，冷冻干燥得到级份0.3分级多糖；
11.sephadex g-100纯化：取适量用去离子水充分溶胀的sephadexg-100葡聚糖凝胶装入内径为2.5cm的层析柱中，去离子水冲洗、平衡，柱床高度为50cm；取级份0.3分级多糖适量，用去离子水溶解配制成浓度为5mg/ml的溶液，上样于层析柱，上样体积为10ml，用去离子水以0.2ml/min流速洗脱300ml，收集50～150ml洗脱液，透析除盐，冷冻干燥得精多糖ⅱ。
12.优选地，加热浸提的温度为70～80℃。
13.优选地，sevage法脱蛋白的具体方法为：将粗多糖用蒸馏水加热溶解，与sevage试剂按体积比4:1混合，强烈震荡0.5h，离心分层，弃去中间的蛋白质层和下层的sevage溶液，上层多糖溶液继续加入sevage试剂重复，直至不再出现蛋白层为止。
14.优选地，sevage试剂由体积比4:1氯仿-正丁醇组成。
15.上述多糖用作黑色素合成抑制剂的用途。
16.上述多糖的美白用途。
17.上述多糖用于制备美白化妆品的用途。
18.有益技术效果：
19.本发明先通过酪氨酸酶抑制试验初步确定有效的分级多糖，再对分级多糖进行纯化，得到精多糖ⅱ。进一步的活性测试显示精多糖ⅱ具有良好的抑制黑色素含量的活性，抑制黑色素合成相关蛋白mitf、tyr表达是精多糖ⅱ抑制黑色素合成的机制之一。这证明了精多糖ⅱ为一种黑色素合成抑制剂，具有美白用途。
附图说明
20.图1为deae分级洗脱曲线；
21.图2为级份0.1的sephadex g-100洗脱曲线；
22.图3为级份0.3的sephadex g-100洗脱曲线；
23.图4为westernblot检测黑色素合成相关蛋白mitf、tyr表达水平。
具体实施方式
24.下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
25.一、材料和方法
26.1、多糖制备
27.采集地肤(kochia scoparia(l.)schrad.)的穗状花序，风干后粉碎作为多糖提取原料。
28.取干燥粉碎的地肤花序2kg，置于提取罐中，加入蒸馏水20l，于70～80℃温度条件下浸提2次，每次5h，合并提取液，回收至1/20体积，冷却至常温，滤除析出物，滤液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，静置24h后过滤，沉淀用无水乙醇反复冲洗，即得地肤花序粗多糖。
29.使用sevage法去除粗多糖中的蛋白，具体方法为：将粗多糖用蒸馏水加热溶解，与sevage试剂(氯仿-正丁醇体积比4:1)按体积比4:1混合，强烈震荡0.5h，离心分层，弃去中间的蛋白质层和下层的sevage溶液，上层多糖溶液继续加入sevage试剂重复5次，直至不再出现蛋白层为止。脱蛋白后的多糖溶液冷冻干燥得到脱蛋白粗多糖。
30.deae分级：取适量deae-52纤维素装入内径为3cm的层析柱中，去离子水冲洗，平衡12h，柱床高度为50cm；取脱蛋白粗多糖适量，用去离子水溶解配制成浓度为10mg/ml的粗多糖溶液，上样于层析柱，上样体积为20ml，依次用0.1、0.3、0.5mol/l氯化钠溶液以1ml/min流速各洗脱300ml，苯酚-硫酸法监测。不同浓度氯化钠溶液洗脱液分别合并，透析除盐，冷冻干燥得到级份0.1、级份0.3和级份0.5分级多糖。
31.sephadex g-100纯化：取适量用去离子水充分溶胀的sephadexg-100葡聚糖凝胶
装入内径为2.5cm的层析柱中，去离子水冲洗，平衡2h，柱床高度为50cm；分别取级份0.1、级份0.3分级多糖适量，用去离子水溶解配制成浓度为5mg/ml的溶液，上样于层析柱，上样体积为10ml，用去离子水以0.2ml/min流速洗脱300ml，苯酚-硫酸法监测。级份0.1、级份0.3分级多糖洗脱液均收集50～150ml，透析除盐，冷冻干燥得到精多糖ⅰ、ⅱ。
32.2、酪氨酸酶抑制活性
33.参考文献方法(肉桂酸-香豆素酯类似物的合成及抑制酪氨酸酶活性研究，有机化学，chin.j.org.chem.2020,40)测定级份0.1、级份0.3和级份0.5分级多糖的酪氨酸酶抑制活性。将级份0.1、级份0.3和级份0.5分级多糖分别用50％dmso水溶液溶解，并稀释成不同浓度的溶液。将130μl磷酸缓冲溶液(50mm，ph＝6.8)、10μl酪氨酸酶溶液(终浓度33.3u/ml)和10μl待测多糖混匀后，加入50μl l-dopa(终浓度0.5mm)混匀，10min后于490nm波长下测定od值。同时设置对照组，对照组加入10μl溶媒代替多糖溶液。各设5个复孔，计算均值，根据如下公式计算不同浓度多糖对酪氨酸酶的抑制率：
34.抑制率(％)＝(od对照-od多糖)/od对照
×
100％。
35.3、抑制黑色素含量的测定
36.参考文献方法(莪术醇的结构修饰以及抑制黑色素含量研究，天然产物研究与开发，nat prod res dev 2020,32)，采用naoh裂解法测定细胞内的黑色素含量。取对数生长期b16f10细胞，消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2
×
105个细胞，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；24h后，多糖组更换为含有30、60μg/ml精多糖ⅰ、ⅱ的完全培养基，对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基，各设3个复孔，继续培养72h后，弃去上清液，pbs洗涤3次，使用细胞刮收集细胞后每孔加入细胞裂解液200μl，4℃充分裂解40min后，12000rpm离心20min，转移上清至ep管测定蛋白浓度。沉淀物中加入190μl 1mol/l的naoh(含10％dmso)裂解液，并于80℃水浴1h充分溶解后，在405nm处测定吸光值，最终的黑色素含量按如下公式使用相对蛋白浓度归一化处理。
37.黑色素相对含量＝(od405多糖组/蛋白浓度)/(od405对照组/蛋白浓度)
×
100％。
38.4、抑制黑色素合成相关蛋白的表达
39.取对数生长期b16f10细胞，消化制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2
×
105个细胞，在37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；24h后，多糖组更换为含有30、60μg/ml精多糖ⅰ、ⅱ的完全培养基，对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基，各设3个复孔，继续培养72h后，弃去上清液，pbs洗涤收集细胞，裂解，bca法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行sds-page电泳，浓缩胶80v、30min，分离胶90min，将凝胶湿转到pvdf膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下一抗mitf、tyr、gapdh(内参)孵育过夜，pbst洗膜3次，每次约15min，取相应的二抗常温孵育1.5h，pbst洗膜3次，每次15min，pvdf膜采用碧云天ecl发光液，用发光仪进行显影，拍照分析。
40.5、统计学分析
41.数据以平均值
±
sd表示，组间比较采用t检验，p《0.05代表具有显著性差异。
42.二、实验结果
43.1、基于酪氨酸酶抑制活性的活性精多糖制备
44.脱蛋白粗多糖经deae分级制备得到级份0.1、级份0.3和级份0.5分级多糖，洗脱曲线如图1所示。使用酪氨酸酶抑制活性测试(结果见表1)发现，级份0.1、级份0.3分级多糖具
有明显的酪氨酸酶抑制活性，级份0.5分级多糖对酪氨酸酶无明显抑制作用。因此，对级份0.1、级份0.3分级多糖进行进一步纯化。级份0.1、级份0.3分级多糖经sephadex g-100纯化得到精多糖ⅰ、ⅱ，图2、图3为sephadex g-100洗脱曲线。精多糖ⅰ、ⅱ应分别为级份0.1、级份0.3分级多糖的活性成分。
45.表1不同浓度分级多糖对酪氨酸酶的抑制率
[0046][0047]
2、黑色素抑制活性
[0048]
各组b16f10细胞中黑色素相对含量如表2所示，与对照组相比，30、60μg/ml精多糖ⅰ、ⅱ组b16f10细胞中黑色素含量显著降低。这说明精多糖ⅰ、ⅱ抑制了黑色素含量。
[0049]
表2各组b16f10细胞中黑色素相对含量
[0050][0051]
图4为western blot结果，与对照组相比，30、60μg/ml精多糖ⅰ、ⅱ组mitf、tyr蛋白的表达水平均下调。这说明抑制黑色素合成相关蛋白mitf、tyr表达是精多糖ⅰ、ⅱ抑制黑色素合成的机制之一。
[0052]
综合上述实验，本发明先通过酪氨酸酶抑制试验初步确定有效的分级多糖，再对分级多糖进行纯化，分别得到精多糖ⅰ、ⅱ。进一步的活性测试显示精多糖ⅰ、ⅱ具有良好的抑制黑色素含量的活性，抑制黑色素合成相关蛋白mitf、tyr表达是精多糖ⅰ、ⅱ抑制黑色素合成的机制之一。这证明了精多糖ⅰ、ⅱ具有美白祛斑功效，可以开发成相关的美白祛斑化
妆品。
[0053]
上述实施例用于介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。