靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体及其应用

1.本发明涉及药物化学和化学生物学技术领域，具体涉及一种靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体及其应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)是最常见的神经退行性疾病，其典型临床表现是进行性记忆丧失和痴呆。随着人口老龄化，ad的患病率呈急剧升高趋势，预计到2050年中国将有约4000万ad患者。目前临床用于治疗ad的药物只能短暂缓解症状，不能治愈疾病或延缓病情的进展。因此，全球迫切期待针对ad病理、能延缓ad进展或治愈ad的新药。
3.ad的两个特征性脑病理变化是老年斑和神经原纤维缠结，二者分别由β-淀粉样蛋白(aβ)及过度磷酸化的tau蛋白形成；其中，只有tau蛋白病变与ad患者的痴呆程度呈正相关。大量研究显示，过度磷酸化的tau蛋白可介导aβ的神经毒性，为aβ发挥神经毒性所必需；过度磷酸化的tau是朊脘病毒样蛋白，可通过在不同脑区神经细胞之间传播，从而导致tau蛋白病变的扩散。这些研究提示，tau蛋白是ad药物研发的有效靶点。
4.过度磷酸化的tau蛋白聚集也见于原发性年龄相关性tau病(primary age-related tauopathy,part)、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(frontotemporal dementia linked to chromosome-17 parkinsonism,ftdp-17)、老化相关tau星形胶质细胞病(aging-related tau astrogliopathy,artag)、球形胶质细胞tau病变(globular glial tauopathy,ggt)、皮克病(pick’s disease,pid)、进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy,psp)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration,cbd)、嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease,agd)、慢性创伤性脑病(chronic traumatic encephalopathy,cte)、帕金森病(parkinson’s disease,pd)、亨廷顿病(huntington’s disease,hd)等一系列神经退行性相关疾病。这类疾病包括ad被统称为tau病(tauopathies)。过度磷酸化的tau蛋白在神经细胞内聚集是引起这类疾病的重要原因；此外，tau蛋白磷酸化和聚集还参与癫痫、脑卒中、嗅觉障碍、视网膜变性、肿瘤的发病过程。因此，降低tau蛋白磷酸化从而阻止异常tau蛋白聚集也是这类疾病的重要治疗策略和分子靶标。
5.目前，基于tau蛋白的治疗策略主要基于对tau蛋白的降解。这一策略的优点是：(1)大量证据显示，在正常动物中降低细胞内tau蛋白的含量不引起显著副作用。(2)降低tau蛋白的含量可抑制tau蛋白的聚集，而tau蛋白聚集则是引起神经元退行性变的重要原因。(3)降低tau蛋白的含量可降低多种因素(比如aβ)引起的神经元兴奋性神经毒性作用。因此，降低tau蛋白也被认为是一种新的潜在的治疗癫痫及脑卒中的方案。
6.常用降低细胞内靶蛋白的技术有两种：(1)降低靶蛋白的表达：常用的分子有sirna、mirna或反义寡核苷酸。由于这些寡核苷酸在组织中的分别不好、药物代谢动力学效果差、还存在脱靶可能性，严重限制了核苷酸类药物向临床应用的推进。(2)增强靶蛋白的
降解：常见的方法是增强蛋白降解系统，包括蛋白水解酶系统和自噬系统的活性。然而，由于非特异性地增强蛋白降解系统的活性可引起其它非靶蛋白的降解，可引起严重副作用，故目前尚未见激活蛋白降解系统的药物获批在临床应用。


技术实现要素：

7.鉴于上述针对tau蛋白技术的缺陷，本发明的目的是构建一种小分子tau蛋白靶向去磷酸化的嵌合体(small-molecule dephosorylation-targeting chimaeras，简称为sdeptac)，用以特异性促进过度磷酸化tau蛋白的去磷酸化，从而改善tau蛋白的促微管组装和稳定微管功能。为了实现此目的，本发明的发明人通过深入研究发现，基于蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras,protac)相似的原理，可以构建一种双功能小分子嵌合体，小分子的一端能特异结合靶蛋白(即tau蛋白)，另一端特异结合特定的磷酸酯酶，两者之间经由连接体(linker)连接。所构建的小分子嵌合体可同时结合靶蛋白(tau)和磷酸酯酶，达到选择性促进tau蛋白去磷酸化，改善神经细胞的结构和功能。并且，所述sdeptac技术还具有以下优点：(1)可选择性结合并促进靶蛋白ptau去磷酸化。(2)可作用于许多传统难以成药的靶点。许多传统小分子药物必须作用于靶蛋白的特定结合口袋(bindingpockets)才能发挥作用，sdeptac技术则没有这种限制，它只要能与靶蛋白的任何区段相互作用，无需很高的亲和力便可导致靶蛋白的快速去磷酸化，从而改善靶蛋白的功能。(3)sdeptac技术在细胞内能被重复使用，其作用类似催化效应，故无需很高浓度即可达到治疗效果。
8.为此，第一方面，本发明提供了靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物，所述小分子嵌合体包括tau蛋白配体、连接体和磷酸酯酶募集体，所述tau蛋白配体与所述磷酸酯酶募集体通过所述连接体连接。
9.优选地，所述磷酸酯酶为abαc型磷酸酯酶2a。
10.优选地，所述tau蛋白配体选自如下结构中的任意一种：
[0011][0012]
其中，
[0013]
a选自nh2、cooh、cho或oh；
[0014]
b选自c、n或o；
[0015]
c选自c、n或o；
[0016]
d选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一种；
[0017]
e选自ch2、nh、o或s；
[0018]
f选自c或n；
[0019]
g选自其中m选自0-10整数；h选自nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或卤素；n选自0-10整数；i选自nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或卤素；
[0020]
优选地，所述tau蛋白配体的结构式如式(i)所示：
[0021][0022]
优选地，所述磷酸酯酶募集体为：
[0023][0024]
其中，
[0025]
j选自c或n；
[0026]
k选自nh、o或s；
[0027]
l选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一种；
[0028]
m选自ch、ch2或羰基；
[0029]
n选自其中m为0-10之间整数；
[0030]
o选自h、卤素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或以下任一结构：
[0031][0032]
其中n为0-10之间整数，p选自卤素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基；
[0033]
优选地，所述磷酸酯酶募集体的结构如式(ii)所示：
[0034][0035]
优选地，所述连接体选自如下结构中的任意一种：
[0036][0037][0038]
其中，m和n为0-10之间整数；
[0039]
优选地，所述连接体的结构如式(iii)或式(iv)所示：
[0040][0041]
优选地，所述小分子嵌合体的结构如式(v)或式(vi)所示：
[0042][0043][0044]
优选地，所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐；
[0045]
优选地，所述无机酸选自盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸中的至少一种；
[0046]
优选地，所述有机酸选自甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸和琥珀酸中的至少一种。
[0047]
第二方面，本发明提供了上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物在制备用于治疗和/或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用；
[0048]
优选地，所述与tau蛋白有关的疾病为阿尔茨海默病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、皮克病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、原发性年龄相关性tau病、嗜银颗粒病、老化相关tau星形胶质细胞病、慢性创伤性脑病、球形胶质细胞tau病变、帕金森病、亨廷顿病、脑卒中、癫痫、嗅觉障碍、视网膜变性和肿瘤中的至少一种。
[0049]
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
[0050]
第四方面，本发明提供了促进有需要的患者体内的tau蛋白去磷酸化的方法，该方法包括向患者给药有效量的上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物；
[0051]
优选地，所述给药方式选自口服、肌内、静脉内、鼻服、吸入、局部、皮下、经皮、腹腔、硬膜外、鞘内途径中的至少一种。
[0052]
本发明提供通过化学合成靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体。使用本发明的小分子嵌合体处理稳定或瞬时过表达人类tau蛋白的hek293细胞，可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平，从而降低细胞内的tau蛋白病理性聚集。由此表明，本发明所述的靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体可在预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的一系列tau疾病中发挥作用。与已经报道的全肽段或部分肽段形式的
去磷酸化嵌合体分子相比，本发明为完全的小分子去磷酸化嵌合体，具有小分子属性，可以解决多肽类嵌合体血脑屏障透过性差的问题，具有更强的成药性优势。
[0053]
图1显示了小分子嵌合体sdeptac对hek293细胞中稳定表达的人类磷酸化tau蛋白的去磷酸化作用。
[0054]
图2显示小分子嵌合体sdeptac对大鼠原代神经元细胞中对tau蛋白的去磷酸化作用。
[0055]
图3显示了小分子嵌合体sdeptac对p301l小鼠海马组织中tau蛋白的去磷酸化情况。
[0056]
其中，“sdeptac”为本发明提供的小分子嵌合体，“pt205、ps262、ps396、ps404”分别为位点特异性磷酸化tau蛋白的抗体，可分别检测thr205、ser262、ser396和ser404位点发生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后的tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404位点的磷酸化水平降低；“tau5”为一种总tau蛋白抗体，可检测人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的总体水平。
具体实施方式
[0057]
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0058]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0059]
第一方面，本发明提供了靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物，所述小分子嵌合体包括tau蛋白配体、连接体和磷酸酯酶募集体，所述tau蛋白配体与所述磷酸酯酶募集体通过所述连接体连接。
[0060]
优选地，所述磷酸酯酶为abαc型磷酸酯酶2a。
[0061]
在优选的实施方式中，所述tau蛋白配体选自如下结构中的任意一种：
[0062][0063]
其中，
[0064]
a选自nh2、cooh、cho或oh；
[0065]
b选自c、n或o；
[0066]
c选自c、n或o；
[0067]
d选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一种；
[0068]
e选自ch2、nh、o或s；
[0069]
f选自c或n；
[0070]
g选自其中m选自0-10整数；h选自nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或卤素；n选自0-10整数；i选自nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或卤素；
[0071]
进一步优选地，所述tau蛋白配体的结构式选自如下结构中的任意一种：
[0072][0073]
更进一步优选地，所述tau蛋白配体的结构式如式(i)所示：
[0074][0075]
在优选的实施方式中，所述磷酸酯酶募集体为：
[0076][0077]
其中，
[0078]
j选自c或n；
[0079]
k选自nh、o或s；
[0080]
l选自h、d、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、c1-c4烷基、卤代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一种；
[0081]
m选自ch、ch2或羰基；
[0082]
n选自其中m为0-10之间整数；
[0083]
o选自h、卤素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基或以下任一结构：
[0084][0085]
其中n为0-10之间整数，p选自卤素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、叠氮基；
[0086]
优选地，所述磷酸酯酶募集体的结构式选自如下结构中的任意一种：
[0087][0088]
进一步优选地，所述磷酸酯酶募集体的结构如式(ii)所示：
[0089][0090]
优选地，所述连接体选自如下结构中的任意一种：
[0091][0092]
其中，m和n为0-10之间整数；
[0093]
进一步优选地，所述连接体的结构如式(iii)和式(iv)所示：
[0094][0095][0096]
在优选的实施方式中，所述小分子嵌合体具有如下结构中的的任意一种：
[0097][0098]
其中，linker为连接体，a-l的定义如前文所述。
[0099]
进一步优选地，所述小分子嵌合体的结构式选自如下结构中的任意一种：
[0100][0101]
更进一步优选地，所述小分子嵌合体的结构如式(v)和式(vi)所示，其包括tau蛋白配体(如式i所示)、磷酸酯酶募集体(如式ii所示)和连接体(如式iii或式iv所示)，能够募集abαc型磷酸酯酶2a，以对特异性结合的tau蛋白进行去磷酸化；
[0102][0103]
根据本发明，所述小分子嵌合体还可以连接有本领域常规的其他结构，这些均为本领域技术人员所公知，本发明在此不再赘述。
[0104]
优选地，所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐；
[0105]
进一步优选地，所述无机酸选自盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸中的至少一种；
[0106]
进一步优选地，所述有机酸选自甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸和琥珀酸中的至少一种。
[0107]
第二方面，本发明提供了上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物在制备用于治疗和/或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用；
[0108]
优选地，所述与tau蛋白有关的疾病为阿尔茨海默病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、皮克病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、原发性年龄相关性tau病、嗜银颗粒病、老化相关tau星形胶质细胞病、慢性创伤性脑病、球形胶质细胞tau病变、帕金森病、亨廷顿病、脑卒中、癫痫、嗅觉障碍、视网膜变性和肿瘤中的至少一种。
[0109]
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
[0110]
第四方面，本发明提供了促进有需要的患者体内的tau蛋白去磷酸化的方法，该方法包括向患者给药有效量的上述靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其溶剂合物、或其同位素化合物；
[0111]
优选地，所述给药方式选自口服、肌内、静脉内、鼻服、吸入、局部、皮下、经皮、腹腔、硬膜外、鞘内途径中的至少一种。
[0112]
本发明提供通过化学合成靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体。使用本发明的小分子嵌合体处理稳定或瞬时过表达人类tau蛋白的hek293细胞，可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404等表位的磷酸化水平，从而降低细胞内的tau蛋白病理性聚
集。由此表明，本发明所述的靶向促进tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合体可在预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的一系列tau疾病中发挥作用。
[0113]
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
[0114]
实施例1
[0115]
该实施例用于说明式(v)所述小分子嵌合体的制备过程。
[0116]
(一)磷酸酯酶募集体的合成
[0117]
1、中间体2的合成：
[0118][0119]
向茄形瓶中加入2-氯吩噻嗪(233.7mg，1mmol)，随后加入5ml四氢呋喃将其溶解，冰浴条件下加入200mg nah(5mmol)，继续搅拌30分钟，缓慢滴加1-溴-3-氯丙烷(787.2mg，5mmol)，升温至65℃反应5小时。除去四氢呋喃，加入20ml乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗涤有机层3次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱色谱层析纯化获得无色油状物，产率80％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.15(ddd,j＝14.6,7.5,1.5hz,2h),7.02(d,j＝8.1hz,1h),6.94(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.91
–
6.83(m,3h),4.02(t,j＝6.5hz,2h),3.64(t,j＝6.1hz,2h),2.20(p,j＝6.3hz,2h)。
[0120]
2、中间体3的合成：
[0121][0122]
将中间体2(70mg，0.226mmol)用2ml乙腈溶解，依次加入n-boc-哌嗪(63.2mg，0.339mmol)和三乙胺(100μl，0.678mmol)，置于80℃反应4小时。除去乙腈，加入10ml乙酸乙酯溶解，用饱和食盐水洗涤有机层3次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱色谱层析纯化获得无色油状物，产率86％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.08
–
7.00(m,2h),6.90(d,j＝8.0hz,1h),6.83(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.78(td,j＝8.2,1.5hz,2h),6.75(d,j＝2.1hz,1h),3.81(t,j＝6.7hz,2h),3.29(t,j＝5.0hz,4h),2.36(t,j＝6.9hz,2h),2.25(t,j＝5.1hz,4h),1.82(p,j＝6.9hz,2h),1.37(s,9h)。
[0123]
3、中间体4(磷酸酯酶募集体)的合成：
[0124][0125]
取适量中间体3，冰浴条件下加入过量的氯化氢乙酸乙酯溶液，搅拌30分钟，除去过量氯化氢乙酸乙酯即得中间体4，为粉色至紫色固体。
[0126]
(二)连接体的合成
[0127]
4、中间体6(连接体)的合成：
[0128][0129]
取中间体5(癸二酸，100mg，0.49mmol)，用3ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下，依次加入edci(103.3mg，0.54mmol)、dmap(0.6mg，0.005mmol)和19.8μl甲醇，反应2小时。加入10ml二氯甲烷，用水洗涤3次，经硅胶柱色谱层析纯化获得无色油状物，产率30％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ11.96(s,1h),3.57(s,3h),2.27(t,j＝7.4hz,2h),2.17(t,j＝7.4hz,2h),1.56
–
1.43(m,4h),1.24(s,8h)。
[0130]
(三)tau蛋白配体和连接体偶联产物的合成
[0131]
5、中间体8的合成：
[0132][0133]
将100mg 3-溴异喹啉(0.48mmol)用2ml浓硫酸溶解，冰浴条件下，缓慢加入58mg硝酸钾(0.58mmol)，反应30分钟后转移至室温继续反应3小时。向反应体系中，缓慢加入冰水，有淡黄色固体产物析出，抽滤，水系滤饼3次，收集滤饼置于烘箱干燥，产率90％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.47(s,1h),8.75(dd,j＝7.7,1.2hz,1h),8.66(dd,j＝8.2,1.3hz,1h),8.46(s,1h),7.93(t,j＝8.0hz,1h)。
[0134]
6、中间体9的合成：
[0135][0136]
100mg中间体8(0.4mmol)用10ml冰醋酸溶解，剧烈搅拌下，加入还原铁粉119mg(2mmol)，反应完毕，抽滤除去还原铁粉，滤液加水稀释，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤3次，经硅胶柱色谱层析纯化获得土黄色固体，产率76％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.00(s,1h),8.15(s,1h),7.39(t,j＝7.8hz,1h),7.28(d,j＝8.1hz,1h),6.90(dd,j＝7.6,1.1hz,1h),6.09(s,2h)。
[0137]
7、中间体10-a的合成：
[0138][0139]
取中间体6(80.5mg，0.37mmol)于3ml dmf中溶解，冰浴下依次加入hatu(176.7mg，0.47mmol)、dipea(81μl，0.47mmol)和中间体9(70mg，0.31mmol)，转为室温继续反应2小时。向反应体系中加入10ml水，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤3次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，经硅胶柱色谱层析纯化获得白色固体，产率63％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.03(s,1h),8.10(d,j＝7.5hz,1h),7.78(d,j＝8.3hz,1h),7.68(s,2h),7.57(t,j＝7.9hz,1h),3.66(s,3h),2.52(t,j＝7.6hz,2h),2.31(t,j＝7.5hz,2h),1.79(q,j＝7.6hz,2h),1.67
–
1.61(m,2h),1.45
–
1.29(m,8h)。
[0140]
8、中间体11-a的合成：
[0141][0142]
向茄形瓶中依次加入中间体10-a(36mg，0.086mmol)、6-氮杂吲哚(12mg，0.103mmol)、cu2o(0.24mg，0.002mmol)、bfmo(0.42mg，0.002mmol)和k3po4(36mg，0.172mmol)，氮气置换后，向体系中加入2ml无水dmso，置于120℃反应过夜。降温，向反应体系中加入乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤3次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱色谱层析纯化得到土黄色固体，产率20％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.03(s,1h),9.44(s,1h),8.36(d,j＝3.3hz,1h),8.22(s,1h),8.09(d,j＝7.5hz,1h),8.03(d,j＝8.2hz,1h),7.80(s,1h),7.67(t,j＝7.8hz,1h),6.91(d,j＝3.3hz,1h),3.56(s,3h),2.54(t,j＝7.4hz,2h),2.25(t,j＝7.4hz,2h),1.69(p,j＝7.4hz,2h),1.47(p,j＝6.8,6.4hz,2h),1.37(p,j＝7.2hz,2h),1.33
–
1.27(m,2h),1.25
–
1.20(m,4h)。
[0143]
9、中间体12-a的合成：
[0144][0145]
取适量中间体11-a，用甲醇溶解，配置2m氢氧化钠的水溶液，向反应体系中加入2当量的氢氧化钠水溶液，室温反应3小时，除去甲醇，加水扩大体积，用2m hcl水溶液调节ph为2-3，用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥即得白色固体产品。产率95％。
[0146]
10、终产品tp1(式v化合物)的合成：
[0147][0148]
将5mg中间体12-a(0.0112mmol)用2ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下，依次加入edci(4.3mg，0.022mmol)、hobt(3.0mg，0.022mmol)、dipea(78μl，0.045mmol)和中间体4(5.3mg，0.013mmol)，搅拌30分钟，转室温继续反应2小时。向反应体系中加入10ml二氯甲烷，用水洗涤3次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱色谱层析纯化得到土黄色固体，产率67％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.04(s,1h),9.68(s,1h),9.43(s,1h),8.34
–
8.27(m,2h),8.23(s,1h),8.09(d,j＝7.5hz,1h),8.02(d,j＝8.2hz,1h),7.70(d,j＝5.3hz,1h),7.66(t,j＝7.8hz,1h),7.21(ddd,j＝8.5,7.4,1.6hz,1h),7.17
–
7.11(m,2h),7.06(dd,j＝8.6,1.5hz,2h),7.00
–
6.93(m,2h),6.91(d,j＝3.3hz,1h),3.93(t,j＝6.7hz,2h),3.36(s,2h),2.54(t,j＝7.4hz,2h),2.43
–
2.37(m,2h),2.28(d,j＝22.5hz,4h),2.20(t,j＝7.5hz,2h),1.78(p,j＝6.9hz,2h),1.69(p,j＝7.4hz,2h),1.45
–
1.34(m,4h),1.30(h,j＝6.6hz,2h),1.22(d,j＝6.0hz,6h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ172.60,170.94,153.15,146.92,146.69,144.40,140.21,136.41,135.08,133.58,132.90,132.10,130.88,128.51,128.26,127.65,127.61,127.20,125.81,124.92,123.67,123.44,122.96,122.52,116.76,116.20,105.27,104.74,54.88,53.51,53.02,45.21,44.90,41.25,40.53,36.55,32.61,29.22,29.20,29.17,29.15,25.69,25.22,23.83,21.53.hrms(esi

):m/z calculated for c
45h48
cln7o2s[m h]

,786.3371；found,786.3351。
[0149]
实施例2
[0150]
该实施例用于说明式(vi)所述小分子嵌合体的制备过程。
[0151]
(一)磷酸酯酶募集体的合成
[0152]
参见实施例1，中间体2的合成、中间体3的合成、中间体4(磷酸酯酶募集体)的合成。
[0153]
(二)tau蛋白配体和连接体偶联产物的合成
[0154]
1、中间体10-b的合成：
[0155][0156]
合成过程参见实施例1中间体10-a的合成，10-b为土黄色固体，产率90％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.87(s,1h),9.13(d,j＝0.8hz,1h),8.07(d,j＝0.9hz,1h),7.95(ddd,j＝7.7,3.7,1.1hz,2h),7.66(t,j＝7.9hz,1h),4.20(s,2h),3.83(s,2h),3.71
–
3.67(m,2h),3.62
–
3.58(m,2h),3.56
–
3.48(m,4h),1.32(s,9h)。
[0157]
2、中间体11-b的合成：
[0158][0159]
合成过程参见实施例1中间体11-a的合成，11-b为土黄色固体，产率22％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.65(s,1h),9.47(s,1h),9.27(d,j＝0.9hz,1h),8.36(d,j＝5.3hz,1h),8.13(dd,j＝7.6,1.0hz,1h),8.11(d,j＝3.4hz,1h),7.99(d,j＝1.0hz,1h),7.91(dt,j＝8.2,1.0hz,1h),7.65
–
7.59(m,2h),6.77(d,j＝3.3hz,1h),4.31(s,2h),3.95
–
3.90(m,2h),3.84
–
3.80(m,2h),3.60
–
3.55(m,2h),3.53(s,2h),3.42
–
3.37(m,2h),1.34(s,9h)。
[0160]
3、中间体12-b的合成：
[0161][0162]
取一定量中间体11-b，用二氯甲烷溶解，冰浴条件下，加入10当量的三氟乙酸，室温继续反应3小时。反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，产率96％。
[0163]
4、终产品tp2(式vi化合物)的合成：
[0164][0165]
合成过程参见实施例1终产品tp1(式v化合物)的合成，tp2为土黄色固体，产率52％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),9.58(s,1h),9.26(s,1h),8.35(s,1h),8.23(d,j＝3.3hz,1h),8.13(d,j＝7.4hz,1h),8.03(s,1h),7.91(d,j＝8.2hz,1h),7.68(d,j＝5.4hz,1h),7.63(t,j＝7.8hz,1h),7.18
–
7.10(m,2h),7.02(d,j＝8.2hz,1h),6.94(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.88(td,j＝8.5,1.6hz,2h),6.83(dd,j＝4.1,2.6hz,2h),4.33(s,2h),3.96
–
3.92(m,2h),3.89(t,j＝6.6hz,2h),3.85
–
3.80(m,2h),3.64(s,2h),3.62
–
3.57(m,2h),3.43
–
3.38(m,2h),3.32(d,j＝6.0hz,2h),3.06(t,j＝5.1hz,2h),2.40(t,j＝6.8hz,2h),2.21(p,j＝5.2hz,4h),1.87(p,j＝6.7hz,2h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ169.88,169.43,150.14,149.16,146.22,143.71,140.75,136.17,135.55,134.05,132.62,132.22,129.35,128.27,127.78,127.70,127.62,127.47,126.15,123.96,123.32,123.30,123.13,123.11,119.37,117.00,116.51,116.42,108.36,108.26,70.35,70.30,70.06,69.59,69.58,69.38,53.66,52.86,49.51,45.69,24.70.hrms(esi

):m/z calculated for c
43h44
cln7o5s[m h]

,806.2886；found,806.2872。
[0166]
实施例3
[0167]
该实施例用于说明式(iv)所示的小分子嵌合体(sdeptac)的去磷酸化作用。
[0168]
试剂来源：人类tau-gfp质粒(htau-gfp)委托和元生物技术(上海)股份有限公司构建，可转染不表达人源性tau蛋白的细胞以使其表达人源性tau蛋白，该质粒可以在细胞
内表达人源性tau蛋白，人源性tau蛋白在表达后磷酸化水平高，能用pt205、ps262、ps396、ps404抗体检测到；
[0169]
hek293细胞购自中国典型培养物保藏中心细胞库(武汉大学)，货号gdc0187；
[0170]
大鼠原代神经元来源于原代培养的胚胎期约15天sd胎鼠海马和皮层神经元，本身有内源性鼠tau的表达，可用pt205、ps262、ps396、ps404等抗体检测其基础磷酸化水平；
[0171]
其他生化试剂均可从普通生化试剂公司购买。
[0172]
一、
[0173][0174]
高压灭菌200μl、1ml tip头各一盒。在hek293细胞培养瓶中加入1mltrypsin液，消化1分钟(37℃，5％co2)。用手轻拍培养瓶壁可观察到细胞完全从壁上脱落下来时，加入1ml的含血清培养基终止反应。加入培养液吹打细胞，并转至培养板中进行培养，待细胞贴壁，细胞密度约为60％-80％时转染htau-gfp质粒，转染后继续培养24h后，观察细胞生长状态，当超过60％以上的细胞表达gfp时，在培养基中加入小分子嵌合体sdeptac(0,0.01μm、0.1μm,1μm、10μm、20μm)，并继续培养细胞6h。用ripa液裂解细胞并收集细胞提取液，用tau5(一种tau蛋白抗体，可检测人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的总体水平)、pt205、ps262、ps396、ps404等抗体(位点特异性磷酸化tau蛋白抗体，可检测thr205、ser262、ser396、ser404位点发生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后检测到的tau磷酸化水平降低)进行免疫印迹，定量分析tau磷酸化以及tau总蛋白含量。
[0175]
结果如图1所示，在转染有htau-gfp的hek293细胞中，小分子嵌合体可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平，且具有剂量依赖性。
[0176]
二、
[0177]
胚胎期12-15天的sd胎鼠，于无菌条件下取脑并于预冷解剖液(100％dme-f12)中分离去除软膜、血管等组织，取皮层和海马组织，漂洗后用眼科剪将皮质反复剪切成碎块，移入培养皿中，吸除解剖液后加入0.25％胰蛋白酶2ml，37℃培养箱中消化20min，弃去剩余消化液，用接种液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l链霉素溶液)洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液，最后再用接种液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l链霉素溶液)1ml混悬，反复吹打混悬液中的组织块至浑浊后，将上清液移入培养瓶待用。加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块。收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l链霉素溶液)重新悬浮细胞并进行细胞记数。按约1x107个细胞/孔的密度将细胞接种于6孔培养板中，培养4h至细胞贴壁后，更换全培养液(97％neurobasal、2％b27、1％谷氨酰胺、105u/l青霉素、0.1g/l链霉素溶液)培养3天后，之后换用阿糖胞苷培养液(97％neurobasal、2％b27、1％谷氨酰胺、105u/l青霉素、0.1g/l链霉素溶液、阿糖胞苷2.5ug/ml)培养3天，以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞。最后每隔3天用全培养液1次，每次半换液。
[0178]
在原代神经元培养第10天(10div)时，用完全培养基将小分子嵌合体稀释为目标浓度(0,0.01μm、0.1μm,1μm、10μm、20μm)后继续培养原代神经元24h。再用ripa液裂解细胞并收集细胞提取液，再用tau5(一种tau蛋白抗体，可检测人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的总体水平)、pt205、ps262、ps396、ps404等抗体(位点特异性磷酸化tau蛋白抗体，可检
测thr205、ser262、ser396、ser404位点发生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后检测到的tau磷酸化水平降低)进行western blot，定量分析tau磷酸化以及tau总蛋白含量的变化。
[0179]
结果如图2所示，在大鼠原代神经元细胞中，小分子嵌合体可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平。
[0180]
其中，细胞提取液的制备方法如下：
[0181]
(1)在显微镜下观察细胞培养板内细胞生长状况和密度；
[0182]
(2)将1
×
pbs和细胞培养板放在冰上预冷，按照6孔板每孔加入80μl/6cm培养皿加入150μl配制1
×
缓冲液 pmsf(1:100) 蛋白水解酶混合抑制剂(1:1000)混合液；
[0183]
(3)用1ml加样枪贴着细胞培养板底壁吸出培养基，贴壁加入1ml 1
×
pbs，根据细胞密度轻柔冲洗1-3遍，用1ml和200μl加样枪贴着细胞培养板底壁吸出pbs，加入混合液后用超纯水清洗细胞刮子，用细胞刮子稍用力刮孔板底部，吸出细胞悬液至1.5ml ep管中，不同样品间需清洗细胞刮子；
[0184]
(4)煮沸10min(先以最高温度煮沸再以150℃维持沸腾，打开抗氧表位)；
[0185]
(5)离心后20khz超声20次(为了打开dna链，超声机按i打开o关闭，每超完一个样品后先在双蒸水中超三次再用卫生纸擦干，超声枪头不能接触气泡和ep管底部)；
[0186]
(6)振荡混匀置于-20℃冰箱。
[0187]
免疫印迹法定量分析tau蛋白含量的过程：
[0188]
1、搭架子(两种玻璃板，三个瓶子，五个试剂，滤纸，卫生纸，垃圾桶，枪，枪头，梳齿)
[0189]
(1)擦净桌面和底架，洗净梳齿、玻璃板、蒸馏水瓶和上、下部胶瓶，并烘干上、下部胶瓶，拿出配制电泳胶的试剂恢复至室温；
[0190]
(2)将较高的玻璃板朝内叠在一起，按住上部使下部紧贴桌面使其平齐，将夹子向外翻夹紧，放在底架上用夹子扣住。
[0191]
(3)注入双蒸水检验是否漏液，若漏液则重装后再检漏。
[0192]
2、制备电泳胶(见表1，天冷时ap和temed可加1.5倍)
[0193]
表1
[0194][0195]
(1)依次加入20％arc/bis，tris缓冲液，temed和10％ap，用移液器吹打混匀，整个过程防止混合液中混有气泡；
[0196]
(2)沿两个角分别将分离胶缓缓注入到胶膜内(吸取时深入液面下轻柔吹打混匀，每次枪头留少量液体以防产生气泡)，每块胶用量为3
×
900μl，观察胶不漏后沿两个角分别
用双蒸水将胶膜的空隙处填满(防止氧气抑制聚合并保持下部胶水平，可多放一段时间)；
[0197]
(3)等待凝胶30min左右待分离胶凝固后倾去双蒸水，并用滤纸将剩余水吸尽，并用记号笔标出下部胶的上沿；
[0198]
(4)沿两个角分别将浓缩胶缓缓注入到胶膜内，斜着从左往右插入所需规格梳齿(上样量＜20μl用小梳齿，上样量＞20μl用大梳齿)，在泳道间补胶避免缩胶，等待凝胶50min。
[0199]
3、样品的处理
[0200]
在细胞提取液中加入现配的溴酚蓝和β-巯基乙醇(还原剂)，溴酚蓝：β-巯基乙醇＝1:3，混合液：样品＝1：10，100℃沸水浴10min，在振荡器上振荡20秒钟后分装，若结果不佳每次上样前将样品100℃沸水浴10min。
[0201]
4、上样和蛋白的电泳分离(上样针，样品，排插，marker，电泳液，电泳槽，蒸馏水瓶)
[0202]
清洗电泳架下面的导电丝，将转移到电泳架上，用记号笔标出泳道及编号，缓慢垂直拔出梳齿，用电泳液加满凝胶槽，用微量加样器取样品加入各个泳道(marker加1μl于第1和8泳道，加入溴酚蓝和1
×
buffer混合液加于第15泳道平衡)。上完样后将电泳架转移至电泳槽，加电泳液后盖上盖子使红色对红色，黑色对黑色，加样后先用恒流10ma/块胶电泳约30min(按两次启动)，待溴酚蓝指示剂电泳至浓缩胶与分离胶交界处成以线状时，改为恒压100v(若无法恒压可调高电流)电泳约60min至溴酚蓝到凝胶底部且marker完全跑开。
[0203]
5、转膜(标记nc膜，转膜液，滤纸，冰盒，盆子，盘子，转膜槽，塑料板，清洗镊子)
[0204]
(1)将nc膜用记号笔标记后浸于回收的转膜液10min-20min(有利于蛋白质的固定，能平衡凝胶且去除sds)，按住两旁的卡口取下凝胶槽，用小板撬起玻璃板和白瓷板右侧中间部分，期间保持剩余胶的电泳。
[0205]
(2)依欲显分子量范围用玻璃板垂直略倾斜并轻微地左右来回一次切胶，用镊子将浸过转膜液的三层滤纸贴在胶上，用小板小心地将胶撬起放在的海绵上(滤纸朝下)，另一面贴上倒置的nc膜，将胶和nc膜浸没至转膜液中(胶在上)用玻璃棒赶气泡，用镊子夹起小心放在手上(胶在上)，用镊子将浸过转膜液的三层滤纸贴在胶上，倒置放在海绵上，再贴上三层滤纸。由下至上放置黑塑料板
→
一层海绵
→
三层滤纸
→
胶
→
nc膜
→
三层滤纸
→
一层海绵
→
透明塑料板，若不紧可用橡皮筋固定。
[0206]
(3)红对红，白对黑，将转膜槽放入冰浴中(通电前不要将胶长时间泡在转膜液中，以免蛋白质扩散分解)，转移电流为恒流276ma，电压一般在140v(可以适当补充甲醇提高电压)，具体转移时间根据所需要转移的蛋白质的分子量的大小决定，转移的蛋白质的分子量＜100kda时时间为1h，＞100kda时时间为1.5h。
[0207]
6、免疫印迹显色(清洗镊子，装有双蒸水的盒子，牛奶，保鲜袋，卫生纸，一抗，冰盒，平板，透明胶，tbst，黑色塑料袋，二抗)
[0208]
(1)封闭：转膜结束后小心地将nc膜用含5％脱脂奶粉的tbs封闭液于室温振荡封闭1h或4℃过夜，回收未与胶接触的滤纸。
[0209]
(2)一抗孵育：取出nc膜，用1
×
tbs漂去膜表面残留的奶渍，用镊子夹着nc膜竖在卫生纸上除去多余的水，将nc膜marker一侧朝外置于保鲜袋中用卫生纸排水排气。加入一抗(可加入0.1％的吐温20降低背景)封口贴在平板上(有marker和蛋白的一面朝上)，透明
胶带不要压在目标条带上，于4℃孵育过夜。
[0210]
(3)二抗孵育：次日从孵育袋中取出nc膜并回收一抗，用tbst缓冲液漂洗3
×
5min，用1
×
tbs漂去膜表面残留的盐离子，用镊子夹着nc膜竖在卫生纸上除去多余的水，将nc膜置于保鲜袋中用卫生纸排水排气。避光加入荧光素标记的羊抗兔或羊抗鼠的odyssey二抗(可加入0.1％的吐温20降低背景)，封口贴在平板上(有marker和蛋白的一面朝上)，透明胶带不要压在目标条带上，于室温慢摇孵育1h(超过1h可能会增加背景，天冷可延长至2h)后，从孵育袋中取出nc膜并回收二抗，用tbst缓冲液漂洗3
×
5min。漂洗完毕后，用1
×
tbs漂洗去掉膜表面残留的盐离子。
[0211]
(4)显色：先用蘸有无水乙醇的擦镜纸将玻璃板擦干净。将marker侧朝下，按分子量从小到大在扫描仪由上至下方向放置，覆盖塑料薄膜并排气。打开odyssey软件，点击file
→
new
→
browse
→
输入日期，点击obtain image选择扫膜长、宽，扫描成像并保存原图，点击alter image调整图像，用文本框标记样品和抗体类型，点击export image file
→
save，收好膜后再用卫生纸将玻璃板擦干净。
[0212]
三、
[0213]
采用4月龄雄性p301l小鼠(平均体重约30mg)，用立体定位注射法向侧脑室一次性注射sdeptac(浓度400μm，注射体积2.5μl)，对照组注射等体积溶媒(pbs)。分别在注射后24h和48h处死小鼠，分离小鼠的海马组织。
[0214]
将海马组织置于匀浆液中(50mm tris
·
hcl ph 7.4-7.5,100mm nacl,1％(vol/vol)triton x-100,5mm edta,1:100pmsf,1:1,000protease inhibitor cocktail containing 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluride hydrochloride,aprotinin,bestatin,leupeptin,e-64,and pepstatin a stored at 4℃)进行匀浆，接着在冰上继续裂解30min，随后以12000g转速4℃离心15min，收集上清。然后根据上清的体积加入终体积1/4的4xbuffer(tris-hcl 200mm ph 6.8,sds 8％,glycerol 40％)，随后沸水浴10min，冷却后稍离心，然后在冰上进行超声。超声后继续在12000g转速下4℃离心15min，收集上清，使用bca试剂盒检测蛋白浓度，然后将蛋白浓度调至5μg/μl进行后续的western blot分析。
[0215]
western blot步骤如下：
[0216]
1.将以上获得的样品加入1/10体积的一溴三巯(1体积溴酚蓝：3体积250mmβ-巯基乙醇)，沸水浴10min，冷热后振荡混匀，然后稍离心，用于后续上样；
[0217]
2.上样后在10％的聚丙烯酰胺梯度凝胶中电泳；
[0218]
3.电泳完毕后将蛋白转膜电泳至0.45um的硝酸纤维素膜，转膜时间视蛋白分子量而定，时间为60-90min；
[0219]
4.转膜完毕后，使用5％脱脂奶粉(pbs配置)室温封闭60min；
[0220]
5.tbst洗去残余脱脂牛奶，使用3％bsa配置一抗，4℃孵育过夜；
[0221]
6.tbst洗涤3次，8min/次；
[0222]
7.使用一抗对应的二抗进行孵育，室温孵育60min；
[0223]
8.tbst洗涤3次，8min/次；
[0224]
9.odyssey显色；
[0225]
10.用image j对图像进行灰度分析。
[0226]
制备sdeptac可以有效降低4月龄p301l小鼠海马组织中tau的磷酸化水平
[0227]
结果如图3所示，在4月龄p301l侧脑室一次性注射400μm/2.5μl小分子嵌合体后，24h时可见tau蛋白在pt205、ps262、ps396表位的磷酸化水平有下降趋势；48h时可见tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平显著降低，同时伴有总tau蛋白(tau5表位)和人类特异性tau蛋白(ht7表位)水平的显著降低(图3)。
[0228]
采用相同的方法进行检测分析，式(vi)所示的小分子嵌合体(sdeptac)也具有去磷酸化作用，因此不再赘述。
[0229]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。