用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和SSR荧光标记引物组及检测方法

用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和ssr荧光标记引物组及检测方法
技术领域
1.本发明属于植物分子标记检测技术领域，具体涉及一种用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和ssr荧光标记引物组及检测方法。


背景技术：

2.橡胶草(taraxacumkok-saghyz rodin)，是菊科(asteraceae)蒲公英属(taraxacum)多年生草本植物。作为一种天然橡胶植物，橡胶草根部橡胶含量高、品质优良成为巴西橡胶树橡胶替代作物之一。橡胶草是一种具有庞大基因组的同源或异源多倍体植物，遗传背景十分复杂，相互间存在明显的遗传多态性。橡胶草种质资源的遗传多样性和亲缘关系对于橡胶草种质资源收集，育种工作尤为重用，那么橡胶草种子真实性的鉴定就更显重要。目前橡胶草种子真实性鉴定主要经历了生物学的形态鉴定、染色体鉴定、同工酶鉴定、分子鉴定等几个阶段。其中种子形态学鉴定简单直观但准确性较差；由于橡胶草具有庞大的基因组，遗传背景非常复杂，常规的染色体方法鉴定橡胶草种子非常困难；同工酶鉴定是目前橡胶草种子鉴定应用较多的方法，但由于同工酶是基因表达的产物，产生的多态性较少，对某些亲本关系较近的品种难以鉴定。
3.随着分子生物技术的发展，分子标记技术已广泛应用于橡胶草品种与杂交后代真实性鉴定。在这些分子标记技术中，ssr(simple sequence repeat)标记由于具有多态性高、数量丰富、遗传上呈共显性、结果稳定可靠、实验操作简单、引物序列易交流等优点，是目前作物种子鉴定中使用最多的分子标记技术。
4.目前常用的ssr分子标记检测方法有琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳荧光检测方法，所揭示的多态性因采用的方法不同而有所差别。ssr主要表现为2-5个核苷酸重复次数的变化，多态性片段长度的差异可以小到2-4bp，这就需要更灵敏有效的检测方法。page理论上是分离可以达到1bp，实际在应用中难以实现；定性也不准确，不能准确给出片段的大小，只能粗略的估计。毛细管电泳(capillay electrophoresis，ce)是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术，具有快速、高效、高灵敏度、易定量、重现性好及易于自动化等优点。毛细管电泳结合荧光检测比变性page银染检测法的结果更精确，在微量pcr产物中更为灵敏，表现出强大的分析能力，大大地提高工作效率。将毛细管电泳应用于基于pcr技术的分子标记，不仅使分子标记的重复验证工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸银染料或同位素标记过程中出现的假带现象。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决橡胶草种子纯度和真伪的鉴定难题，提供一种用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和ssr荧光标记引物组，能够在短时间内对待测种子进行快速真伪测定。
6.本发明所采用的技术如下：一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性引物组，选择如下全部的23对引物组：
7.引物名称：tks 01，
8.正向：5'-ctgactttgactggggcact-3'
9.反向：5'-cctcggtttctggggtatct-3'；
10.引物名称：tks 02，
11.正向：5'-aaagccaaacctatacttctccg-3'
12.反向：5'-ctaacatacgctgattggctacc-3'；
13.引物名称：tks 03，
14.正向：5'-gatgggctccttcaactaac-3'
15.反向：5'-tccacgctgatgtatgctac-3'；
16.引物名称：tks 04，
17.正向：5'-gcatccagaggaggagcagt-3'
18.反向：5'-gccgtcaaaggaaccaacat-3'；
19.引物名称：tks 05，
20.正向：5'-tctgtctctcacactctatttctttca-3'
21.反向：5'-aatgcgatcttcaaagtcttcaa-3'；
22.引物名称：tks 06，
23.正向：5'-ttgagtgatatggataaggggtg-3'
24.反向：5'-tttcatcttgactcaaaccgtct-3'；
25.引物名称：tks 07，
26.正向：5'-agaagaaggaaactttgctcgat-3'
27.反向：5'-tgtttcgtgatcttctccttgat-3'；
28.引物名称：tks 08，
29.正向：5'-gatgctgaagaagatgatgatga-3'
30.反向：5'-aagtaacacacagccaaaagagc-3'；
31.引物名称：tks 09，
32.正向：5'-ctcaaacccgtcacccaaac-3'
33.反向：5'-gcgtcatcatcgtctccacc-3'；
34.引物名称：tks 10，
35.正向：5'-cgcctcagatctctgaacttatc-3'
36.反向：5'-aacatattgtgttgcagcgattt-3'；
37.引物名称：tks 11，
38.正向：5'-aaccaccacctccttcttct-3'
39.反向：5'-tccgtacatcctcactttcc-3'；
40.引物名称：tks 12，
41.正向：5'-tttcccttttcatcttctcg-3'
42.反向：5'-gtaaacctgaccttccttgc-3'；
43.引物名称：tks 13，
master mix 10μl，浓度为10μmol/l的正、反向引物各0.2μl，20-50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o 8.6μl，在正向引物5’端以cy5磷荧光染料标记。
78.进一步的，所述pcr扩增的程序为：首先95℃预变性5min；94℃变性45sec，退火40sec，72℃延伸1min；30个循环，最后72℃下延伸10min。
79.进一步的，所述的毛细管电泳方法为，将pcr产物稀释100倍后，在遗传分析系统仪上利用毛细管电泳法检测，每个ce样品中含有μl pcr产物、0.2μl genescan-400分子量标准品和20μl sls溶液；在毛细管凝胶电泳过程中，pcr产物与genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
80.进一步的，用genemapper-v软件对遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同参试材料的ssr标记的扩增片段，利用软件将扩增片段与genescan-400分子量标准品比较，得到片段长度大小。
81.进一步的，橡胶草基因组总dna的提取方法采用ctab提取方法，方法如下：称取橡胶草叶片0.5g，放入预冷的灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转移到15ml离心管，加入5ml 2
×
ctab提取buffer，所述的ctab配方组成为：2％w/v ctab，1％v/vβ-巯基乙醇，1.4m nacl，20mm edta-na2，质量分数2％pvp-40，100mm tris-cl，调至ph 8.0；快速颠倒混匀，于65℃水浴30-60min，期间颠倒离心管2-3次；取出离心管，冷至室温，加入1体积氯仿，轻缓颠倒充分混匀；室温，10000r/min离心15min，取上清；加入1体积氯仿再抽提1-2次，取上清，加入1/10体积的3m naac调至ph 5.2和1体积预冷异丙醇，混匀后-20℃静置30min以上；4℃，11000r/min离心15min，沉淀用质量分数75％的乙醇4℃，10000r/min离心5min，洗2次，倒去乙醇，超净台中晾干dna；加入100μl te，te配方组成为：10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，6mol/l，调至ph 8.0，溶解后加入1μl的10μg/μl rnase，在37℃温育60min；加入te至1000μl，分别用等体积的tris-苯酚、氯仿、异戊醇的混合液、氯仿和异戊醇的混合液各抽提1次，其中，tris-苯酚：氯仿：异戊醇的体积比＝25:24:1，氯仿：异戊醇的体积比＝24:1，每次10000r/min离心10min，吸取上清液，加入1/10体积的3m naac调至ph 5.2和1体积预冷异丙醇，-20℃静置1h；4℃、11000r/min离心15min，质量分数70％乙醇洗涤2次；倒去乙醇，超净台中晾干dna，加入100μl ddh2o溶解沉淀，dna完全溶解后-20℃保存备用。
82.本发明的优点及有益效果：本实验采用ssr分子标记技术，该标记具有多态性高，稳定性好，有高度变异、微卫星在染色体上分布均匀等优点，使得其更适用于种子的鉴定。灵敏度较高，在pcr产物稀释200倍后仍能正常检测出结果，在微量的pcr产物分析中表现出来强大的分析能力。能准确读出条带大小，区分度在1bp之内，提高了种子鉴定的准确性。各泳道的dna片段直接与其泳道中的分子量内标相比就可精确获得其大小数值，一次检测只需一块96孔板同时检测96个样品，不仅使分子标记的重复验证工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸银染料或同位素标记过程中出现的假带现象。不仅省去了人力，提高了工作效率，也避免了这些操作中的人为误差，从而增强了试验结果的稳定性和可重复性。
附图说明
83.图1为标准种子k-445的电泳图谱，
84.图2为待测样品中的真实种子的电泳图谱，
85.图3为待测样品中的混杂种子的电泳图谱，扩增引物为sks 07。
86.图4为标准种子ke-19的电泳图谱，
87.图5为检测的与标准种子条带相同的电泳图谱，
88.图6为检测的与标准种子条带不同的电泳图谱，扩增引物为sks 07。
具体实施方式
89.下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明：
90.实施例1
91.以橡胶草品种k-445种子为标准种子鉴定橡胶草种子真实性。
92.1、种子样品的选取
93.从橡胶草品种k-445中随机数取45粒种子，为检验鉴定效果，再掺入3粒k-448和2粒k-450品种的种子，共50粒种子作为检验样品。
94.2、种子样品基因组dna提取
95.(1)将橡胶草种子放于30℃恒温下发芽出苗，待长出2-3片真叶时，取橡胶草嫩叶于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，装入15ml离心管中；
96.(2)向离心管中加入5ml 2
×
ctab提取buffer，ctab配方组成为：2％w/v ctab，1％v/vβ-巯基乙醇，1.4m nacl，20mm edta-na2，质量分数2％pvp-40，100mm tris-cl，调至ph 8.0，快速颠倒混匀，于65℃水浴30-60min，期间颠倒离心管2-3次；取出离心管，冷至室温，加入1体积氯仿，轻缓颠倒充分混匀；
97.(3)室温，10000r/min离心15min，取上清；加入1体积氯仿再抽提1-2次，取上清，加入1/10体积的3m naac(调至ph 5.2)和1体积预冷异丙醇，混匀后-20℃静置30min以上；
98.(4)4℃，11000r/min离心15min，沉淀用75％乙醇洗2次，4℃，10000r/min离心5min，倒去乙醇，超净台中晾干dna；
99.(5)加入100μl te(10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，调至ph 8.0)溶解后加入1μl的10μg/μlrnase，在37℃温育60min；；
100.(6)加入te至1000μl，分别加等体积tris-苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)和等体积氯仿：异戊醇(体积比24:1)各抽提1次，每次10000r/min离心10min，吸取上清液，加入1/10体积的3m naac(调至ph 5.2)和1体积预冷异丙醇，-20℃静置1h；
101.(7)4℃，11000r/min离心15min，70％乙醇洗涤2次；倒去乙醇，超净台中晾干dna，加入100μl ddh2o溶解沉淀，dna完全溶解后-20℃保存备用；3、pcr扩增
102.从http://www.plantgdb.org，下载橡胶草转录组数据，对鉴定出的各est-ssr进行引物设计，筛选出的23对ssr引物，引物序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司提供，23对引物组如下：
103.引物名称：tks 01，条带大小：165-233bp，引物退火温度：62℃，引物序列：
104.正向：5'-ctgactttgactggggcact-3'
105.反向：5'-cctcggtttctggggtatct-3'；
106.引物名称：tks 02，条带大小：158-171bp，引物退火温度：60℃，引物序列：
107.正向：5'-aaagccaaacctatacttctccg-3'
108.反向：5'-ctaacatacgctgattggctacc-3'；
109.引物名称：tks 03，条带大小：203-229bp，引物退火温度：62℃，引物序列：
110.正向：5'-gatgggctccttcaactaac-3'
111.反向：5'-tccacgctgatgtatgctac-3'；
112.引物名称：tks 04，条带大小：127-152bp，引物退火温度：58℃，引物序列：
113.正向：5'-gcatccagaggaggagcagt-3'
114.反向：5'-gccgtcaaaggaaccaacat-3'；
115.引物名称：tks 05，条带大小：92-127bp，引物退火温度：58℃，引物序列：
116.正向：5'-tctgtctctcacactctatttctttca-3'
117.反向：5'-aatgcgatcttcaaagtcttcaa-3'；
118.引物名称：tks 06，条带大小：134-154bp，引物退火温度：60℃，引物序列：
119.正向：5'-ttgagtgatatggataaggggtg-3'
120.反向：5'-tttcatcttgactcaaaccgtct-3'；
121.引物名称：tks 07，条带大小：138-185bp，引物退火温度：62℃，引物序列：
122.正向：5'-agaagaaggaaactttgctcgat-3'
123.反向：5'-tgtttcgtgatcttctccttgat-3'；
124.引物名称：tks 08，条带大小：160-190bp，引物退火温度：60℃，引物序列：
125.正向：5'-gatgctgaagaagatgatgatga-3'
126.反向：5'-aagtaacacacagccaaaagagc-3'；
127.引物名称：tks 09，条带大小：168-252bp，引物退火温度：52℃，引物序列：
128.正向：5'-ctcaaacccgtcacccaaac-3'
129.反向：5'-gcgtcatcatcgtctccacc-3'；
130.引物名称：tks 10，条带大小：122-146bp，引物退火温度：48℃，引物序列：
131.正向：5'-cgcctcagatctctgaacttatc-3'
132.反向：5'-aacatattgtgttgcagcgattt-3'；
133.引物名称：tks 11，条带大小：214-229bp，引物退火温度：54℃，引物序列：
134.正向：5'-aaccaccacctccttcttct-3'
135.反向：5'-tccgtacatcctcactttcc-3'；
136.引物名称：tks 12，条带大小：205-220bp，引物退火温度：58℃，引物序列：正向：5'-tttcccttttcatcttctcg-3'
137.反向：5'-gtaaacctgaccttccttgc-3'；
138.引物名称：tks 13，条带大小：146-186bp，引物退火温度：60℃，引物序列：正向：5'-caaattgacattgctgctcaac-3'
139.反向：5'-caaaaatccacaacacaaaacct-3'；
140.引物名称：tks 14，条带大小：122-157bp，引物退火温度：52℃，引物序列：正向：5'-cttacatcaaatcccctgtccta-3'
141.反向：5'-cacagaattggtcccaagaatag-3'；
142.引物名称：tks 15，条带大小：126-158bp，引物退火温度：62℃，引物序列：正向：5'-agcttgatcttcaatcgagttct-3'
143.反向：5'-agttttgagctccccatattgac-3'；
144.引物名称：tks 16，条带大小：136-175bp，引物退火温度：60℃，引物序列：正向：
5'-tatcacccattcagaacctc-3'
145.反向：5'-atcctcctctaaatcatactcg-3'；
146.引物名称：tks 17，条带大小：112-134bp，引物退火温度：54℃，引物序列：正向：5'-tatcactgggcttagaaatggtg-3'
147.反向：5'-tgcatcatcactcacttcacttc-3'；
148.引物名称：tks 18，条带大小：156-184bp，引物退火温度：58℃，引物序列：正向：5'-ttccggtaaacaaaattgatacg-3'
149.反向：5'-tgattttacaagacaacagagcg-3'；
150.引物名称：tks 19，条带大小：118-148bp，引物退火温度：60℃，引物序列：正向：5'-aacattctaaaaactggcacgaa-3'
151.反向：5'-gtcttcaaacagaaagccaaaaa-3'；
152.引物名称：tks 20，条带大小：132-175bp，引物退火温度：60℃，引物序列：正向：5'-tcgaatcgctggttaatttattg-3'
153.反向：5'-gtttggaagagttttcttggaga-3'；
154.引物名称：tks 21，条带大小：221-268bp，引物退火温度：62℃，引物序列：正向：5'-tttgatgcggaggagtaaga-3'
155.反向：5'-cgagcgaagaaaacagaaga-3'；
156.引物名称：tks 22，条带大小：150-175bp，引物退火温度：54℃，引物序列：正向：5'-tgtactcctgtactcccaccaat-3'
157.反向：5'-catatacactcgaaggcggatac-3'；
158.引物名称：tks 23，条带大小：208-228bp，引物退火温度：62℃，引物序列：正向：5'-tggaggtagggagtattgcg-3'
159.反向：5'-tgggctcttctgatggttga-3'；
160.正向引物5'端以cy5磷荧光染料标记，反应体系为：20μl，各组分包括：2
×
taq master mix(mg
2
)10μl，浓度为10μmol/l的正反向引物各0.2μl，20-50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o8.6μl。
161.pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性45sec，退火40sec，72℃延伸1min；30个循环，最后72℃下延伸10min。
162.4、毛细管凝胶电泳检测
163.上样板：将所得到的pcr产物稀释100倍，在96孔板的各孔中分别加入20μl甲酰胺，0.3μl0.3μlrox-500分子量标准品和1μl稀释后的pcr产物。
164.缓冲板：在96孔板的各孔中加入分离液，大约为每孔的2/3。
165.将上样板和缓冲板放入beckman coulter ceq 8800遗传分析系统仪(美国，beckman公司生产)中，90℃变性2min；进样电压2kv，时间30sec；分离电压7.5kv，时间40min。在毛细管凝胶电泳过程中，pcr产物与0.3μlrox-500分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
166.5、数据分析
167.用genemapper-v4.0软件对beckman coulter ceq 8800遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出各供试材料的ssr标记的扩增片段，软件系统
将根据扩增片段目标峰的位置与同一泳道中的rox-500分子量标准品进行比较，得到片段长度大小。
168.6、鉴定结果分析
169.将待测样品每粒种子dna的23对引物扩增的电泳图谱分别与按照上述步骤1-5的方法获得的标准种子k-445的23对引物的电泳图谱相比较，结果表明，50粒待测种子中有45粒种子的20对引物扩增条带结果与均与k-445品种的种子相同，5粒种子带型有差异，与预选掺杂的情况相符，说明前者为k-445的种子，后者为混杂种。其中，部分检测结果如图1-3所示。
170.实施例2
171.鉴定某单位正在使用的亲本材料a是否为品种ke-19，鉴定操作流程如下：随机挑取待测品种a种子10粒，进行dna制备，pcr扩增，毛细管凝胶电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1。
172.鉴定结果分析
173.将待测品种a的10粒种子的23对引物扩增结果分别与标准品ke-19扩增结果相对比，结果表明，其中三粒种子的扩增结果中含有与标准种子相差异的条带，说明该单位使用的亲本材料a不是橡胶草品种ke-19。其中部分检测结果如图4-6所示。