一种高选择性识别ClbP荧光探针的合成及应用

一种高选择性识别clbp荧光探针的合成及应用
技术领域
1.本发明属于荧光探针分析技术领域，具体涉及一种用于有害大肠杆菌中clbp检测的荧光探针的合成与应用。


背景技术：

2.肠道细菌对肠道微环境的调控有着不可或缺的巨大作用。其中，大肠杆菌在肠道环境的维持中扮演者重要角色。研究表明，结直肠癌患者发病机制与其肠道微环境中有害大肠杆菌分泌的一种名为colibactin基因毒素密切相关。在基因毒素colibactin生物合成中存在着一种关键的肽酶clbp，其通过将无生物活性的colibactin前体化合物水解产生具有生物活性物质的基因毒素colibactin。鉴于此，通过clbp专一的水解作用，实现对colibactin的检测，进而实现对结直肠癌中有害大肠杆菌的高选择性区分，具有很大的可行性。因此，开发简单、高效的检测方法/技术用于对clbp灵敏识别，实现高选择性区分有害大肠杆菌以及进一步探究其在结直肠癌之间的作用分析，具有十分重要的临床价值与广阔的应用前景。
3.因此，利用有害大肠杆菌分泌colibactin这一特性，结合clbp的专一性，有望为结直肠癌中有害大肠杆菌的高选择性区分提供一个新的方向。目前，在肠道细菌的区分检测中，主要是通过宏观基因组学分析，其存在操作复杂，需要昂贵的设备，对样本预处理时间长，高成本且耗时较长等不足；荧光探针检测方法具有高选择性，高灵敏度，以及灵活简单易于处理等优势，已经在分析检测领域得到广泛的关注及应用。


技术实现要素：

4.鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单快速用于有害大肠杆菌中clbp检测的荧光探针，具体涉及荧光探针的合成方法，及光谱性质研究；还在于可对专一的clbp特异性检测，进而实现高选择性识别有害大肠杆菌，并对不同肠道细菌进行选择性探究；本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、成本较低的上述荧光探针的合成与应用方法。
5.本发明解决问题采取的具体技术方案为，一种高选择性识别clbp的荧光探针的合成与应用，其探针的化学结构式如下：。
6.一种高选择性识别clbp荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光探针的制备方法包括以下步骤。
7.步骤：合成(r)-n
1-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-2-十四酰胺基琥珀酰胺ⅰ．将适量的4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯胺，n-boc-d-天冬酰胺，hatu和dmap加入乙腈中，室温反应2-10h；中和，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，柱层析纯化得白色固体；
ⅱ
．将适量ⅰ所得白色固体溶于二氯甲烷，滴加适量的三氟乙酸，室温反应0.5-10 h；中和，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，柱层析纯化得到化合物c：白色固体；ⅲ．将适量ⅱ所得化合物c、肉豆蔻酸和hatu溶于吡啶，室温反应1-18 h；中和，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，柱层析纯化得到白色固体；ⅳ．将适量ⅲ所得白色固体溶于浓盐酸中，20-80 ℃反应1-10 h；中和，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，重结晶得探针(r)-n
1-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-2-十四酰胺基琥珀酰胺。
[0008]
本发明提供了一种能够用于有害大肠杆菌中clbp开启型检测的荧光探针的应用。
[0009]
所述的荧光探针检测clbp的使用方法：探针在有机相和水相体积比为2:8的环境体系下用于检测clbp，有机相为丙酮（acn），水相为ph = 7.4的hepes缓冲溶液和clbp的菌液。探针用二甲基亚砜（dmso）溶解，用pbs配制clbp菌液，其clbp细菌浓度od
600nm
为0.3，探针溶解在有机相和水相体积比为2:8体系中，与clbp菌液37℃反应1.5 h后，在340 nm激发波长下检测440 nm的荧光信号。
[0010]
本发明还提供了一种高选择性地识别且区分有害大肠杆菌的荧光探针的应用。
附图说明
[0011]
图1.本发明所述的荧光探针的核磁共振氢谱图。
[0012]
图2.本发明所述的荧光探针在丙酮和hepes缓冲液（体积比为2:8）环境体系中，荧光发射强度随clbp菌液体积的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0013]
图3.本发明所述的荧光探针在不同的细菌裂解液中，荧光发射强度随不同菌液的响应情况（1，transetta-pgex4t-1-clbp大肠杆菌菌液；2，短乳杆菌；3，戊糖乳杆菌；4，植物乳杆菌；5，乳酸杆菌；6，金黄色葡萄球菌），横坐标为不同种类菌液，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
[0014]
结合下图对本发明做进一步的说明。
[0015]
本发明所述的荧光探针的合成路线如下图所示。
[0016]
实施例1.合成(r)-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯；4-苯基-2-(三氟甲基)喹啉-7-胺（20.0 mg，83.0 μmol），n-boc-d-天冬酰胺（27.0 mg，99.0 μmol），hatu（79.0 mg，200.0 μmol）和dmap（30 mg, 280.0 μmol）在乙腈溶液，室温反应7 h后，加入饱和碳酸氢钠溶液（10 ml）猝灭反应，乙酸乙酯（10 ml
×
3）萃取，合并有机相，无水na2so4干燥，旋干溶剂，得粗品，柱层析纯化，得(r)-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯23.0 mg，产率为56 %。
[0017]
实施例2.合成(r)-2-氨基-n-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-3-氰基丙酰胺
ꢀ
(r)-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯（110 mg, 206 μmol）溶于4.0 ml二氯甲烷，慢慢滴加1.5ml三氟乙酸，常温反应0.8 h后，饱和碳酸氢钠溶液中和，乙酸乙酯（20 ml
×
3）萃取，无水na2so4干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得(r)-2-氨基-n-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-3-氰基丙酰胺40.0 mg，产率为43.6%。
[0018]
实施例3.合成(r)-n-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)十四酰胺 (r)-2-氨基-n-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-3-氰基丙酰胺（100.0 mg, 250.0 μmol）、肉豆蔻酸（63.0 mg, 276.0 μmol）和hatu（210.0 mg, 552.0 μmol）溶于5ml吡啶，室温反应3 h，中和，乙酸乙酯（20 ml
×
3）萃取，无水na2so4干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得白色固体(r)-n-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)十四酰胺69 mg，产率为41.6%。
[0019]
实施例4.合成(r)-n
1-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-2-十四酰胺基琥珀酰胺 (r)-n-(1-((4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)氨基)-3-氰基-1-氧代丙烷-2-基)十四酰胺（200.0 mg, 337.0 μmol）溶于5.0 ml浓盐酸，45 ℃反应2h，饱和碳酸氢钠溶液中和，乙酸乙酯（20 ml
×
3）萃取，无水na2so4干燥，旋干溶剂，重结晶得白色固体探针(r)-n
1-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)苯基)-2-十四酰胺基琥珀酰胺80.0 mg，产率为44.3%。
[0020]
实施例5.荧光探针实现clbp细菌菌液开启型荧光检测本发明所述的荧光探针检测clbp的细菌菌液实施方法：探针溶解在二甲基亚砜(dmso)中配置成浓度为1 mm的探针溶液，用pbs配制clbp的细菌菌液，其clbp细菌浓度od
600
为0.3，具体测试方法为：取10 μl的1 mm的探针溶液，390 μl的分析纯丙酮，所需量的细菌溶液和所需量的hepes缓冲液于2 ml的样品管中，所有测试样品均保持总体积2 ml，其有机相和水相的体积比为2：8。例如配制样品情况为：取10 μl的1 mm的探针溶液，390 μl的分析纯丙酮，取50 μl的细菌溶液，1550 μl的hepes缓冲液于2 ml的样品管中，37℃下震荡摇匀孵育1.5 h，在340 nm激发下，收集440 nm处的荧光信号。
[0021]
实施例6.荧光探针高选择性区分有害大肠杆菌本发明所述的荧光探针高选择性实施方法如下：选取细菌浓度od
600
为0.3，裂解，用于后续光谱测试。
[0022]
具体实施方式为：取10 μl的1 mm的探针溶液，390 μl的分析纯丙酮，所需量对应的细菌溶液和所需量的hepes缓冲液于2 ml的样品管中，所有测试样品均保持总体积2 ml，其有机相和水相的体积比为2：8。例如配制样品情况为：取10 μl的1 mm的探针溶液，390 μl的分析纯丙酮，取100μl的细菌菌液，1500 μl的hepes缓冲液于2 ml的样品管中，37℃下震荡摇匀孵育1.5 h，在340 nm激发下观察440 nm处荧光信号情况。
[0023]
本发明提供一种用于检测有害大肠杆菌中clbp的荧光探针，并对光谱性能进行探究，实现了高选择性检测有害大肠杆菌中clbp的方法；并对不同的肠道菌进行了选择性区分，高选择性识别有害大肠杆菌，为复杂的肠道菌落区分检测筛选提供了一种简单、可靠、快速及成本低的新方法，可进一步开发用于肠道菌区分检测试剂盒，对生物化学、分析检测等领域都具有较大的实际应用价值。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读
了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征相及类似clbp检测的荧光探针，均落入本专利的保护范围。