用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和SSR荧光标记引物组及检测方法

技术特征：
1.一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性引物组，其特征在于，选择如下全部的23对引物组：引物名称：tks 01，正向：5'-ctgactttgactggggcact-3'反向：5'-cctcggtttctggggtatct-3'；引物名称：tks 02，正向：5'-aaagccaaacctatacttctccg-3'反向：5'-ctaacatacgctgattggctacc-3'；引物名称：tks 03，正向：5'-gatgggctccttcaactaac-3'反向：5'-tccacgctgatgtatgctac-3'；引物名称：tks 04，正向：5'-gcatccagaggaggagcagt-3'反向：5'-gccgtcaaaggaaccaacat-3'；引物名称：tks 05，正向：5'-tctgtctctcacactctatttctttca-3'反向：5'-aatgcgatcttcaaagtcttcaa-3'；引物名称：tks 06，正向：5'-ttgagtgatatggataaggggtg-3'反向：5'-tttcatcttgactcaaaccgtct-3'；引物名称：tks 07，正向：5'-agaagaaggaaactttgctcgat-3'反向：5'-tgtttcgtgatcttctccttgat-3'；引物名称：tks 08，正向：5'-gatgctgaagaagatgatgatga-3'反向：5'-aagtaacacacagccaaaagagc-3'；引物名称：tks 09，正向：5'-ctcaaacccgtcacccaaac-3'反向：5'-gcgtcatcatcgtctccacc-3'；引物名称：tks 10，正向：5'-cgcctcagatctctgaacttatc-3'反向：5'-aacatattgtgttgcagcgattt-3'；引物名称：tks 11，正向：5'-aaccaccacctccttcttct-3'反向：5'-tccgtacatcctcactttcc-3'；引物名称：tks 12，正向：5'-tttcccttttcatcttctcg-3'反向：5'-gtaaacctgaccttccttgc-3'；引物名称：tks 13，
master mix 10μl，浓度为10μmol/l的正、反向引物各0.2μl，20-50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o 8.6μl，在正向引物5’端以cy5磷荧光染料标记。4.根据权利要求3所述的一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性检测方法，其特征在于：所述pcr扩增的程序为：首先95℃预变性5min；94℃变性45sec，退火40sec，72℃延伸1min；30个循环，最后72℃下延伸10min。5.根据权利要求4所述的一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性检测方法，其特征在于：所述的毛细管电泳方法为，将pcr产物稀释100倍后，在遗传分析系统仪上利用毛细管电泳法检测，每个ce样品中含有μl pcr产物、0.2μl genescan-400分子量标准品和20μl sls溶液；在毛细管凝胶电泳过程中，pcr产物与genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。6.根据权利要求5所述的一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性检测方法，其特征在于：用genemapper-v软件对遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同参试材料的ssr标记的扩增片段，利用软件将扩增片段与genescan-400分子量标准品比较，得到片段长度大小。7.根据权利要求2-6任一项所述的一种基于毛细管电泳和ssr标记的橡胶草种子真实性检测方法，其特征在于：橡胶草基因组总dna的提取方法采用ctab提取方法，方法如下：称取橡胶草叶片0.5g，放入预冷的灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转移到15ml离心管，加入5ml 2
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ctab提取buffer，所述的ctab配方组成为：2％w/v ctab，1％v/vβ-巯基乙醇，1.4m nacl，20mm edta-na2，质量分数2％pvp-40，100mm tris-cl，调至ph 8.0；快速颠倒混匀，于65℃水浴30-60min，期间颠倒离心管2-3次；取出离心管，冷至室温，加入1体积氯仿，轻缓颠倒充分混匀；室温，10000r/min离心15min，取上清；加入1体积氯仿再抽提1-2次，取上清，加入1/10体积的3m naac调至ph 5.2和1体积预冷异丙醇，混匀后-20℃静置30min以上；4℃，11000r/min离心15min，沉淀用质量分数75％的乙醇4℃，10000r/min离心5min，洗2次，倒去乙醇，超净台中晾干dna；加入100μl te，te配方组成为：10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，6mol/l，调至ph 8.0，溶解后加入1μl的10μg/μl rnase，在37℃温育60min；加入te至1000μl，分别用等体积的tris-苯酚、氯仿、异戊醇的混合液、氯仿和异戊醇的混合液各抽提1次，其中，tris-苯酚：氯仿：异戊醇的体积比＝25:24:1，氯仿：异戊醇的体积比＝24:1，每次10000r/min离心10min，吸取上清液，加入1/10体积的3m naac调至ph 5.2和1体积预冷异丙醇，-20℃静置1h；4℃、11000r/min离心15min，质量分数70％乙醇洗涤2次；倒去乙醇，超净台中晾干dna，加入100μl ddh2o溶解沉淀，dna完全溶解后-20℃保存备用。

技术总结
本发明公开了一种用于橡胶草种子真实性检测的毛细管电泳和SSR荧光标记引物组及检测方法。利用23条多态性好、重复性高的引物对待测种子和标准种子的基因组DNA进行PCR扩增和毛细管凝胶电泳分离，比较所得出的扩增图谱来判断种子的真伪。该方法兼具SSR荧光标记和毛细管凝胶电泳两种技术的特色和优点，检测灵敏度高，提高试验效率，减少人为误差，具有快速、准确、操作方便等优点，使试验结果更精确，并且鉴定过程和结果不受自然环境的影响。鉴定过程和结果不受自然环境的影响。鉴定过程和结果不受自然环境的影响。


技术研发人员：沈光 杨轶华 张玉 张文天 周琳 陈菲 付俊生
受保护的技术使用者：黑龙江省科学院自然与生态研究所
技术研发日：2022.10.10
技术公布日：2022/11/25