一种寡糖在促进hUC-MSCs增殖、制备相应培养基中的应用的制作方法

一种寡糖在促进huc-mscs增殖、制备相应培养基中的应用
技术领域
1.本发明属于干细胞领域，涉及寡糖在促进huc-mscs增殖、制备相应培养基中的应用。


背景技术：

2.脐带间充质干细胞(uc-mscs)是一种存在于新生儿脐带组织中的多功能干细胞，可以在特定条件下持续增殖并分化成一种或多种细胞类型。uc-mscs具有易于获得、分离、培养和纯化等优点。多次传代和扩增后，uc-mscs仍可保持原有的细胞表型和分化特性。人脐带间充质干细胞(huc-mscs)具有非侵入性获得特性和低免疫原性特点，使其在临床应用中具有独特优势。近年来，huc-mscs已广泛应用于临床疾病治疗并取得一些进展。比如，huc-mscs能够靶向炎症组织、调节过度免疫和炎症、发挥抗炎作用，具有促进组织修复等功能，在aid、ns、代谢性疾病、cvds等难治疾病治疗中具有广阔应用前景。
3.琼胶寡糖作为一种新型的海洋功能性低聚糖，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、美白和保湿等生物活性，已成为国内外研究的热点。根据还原性末端的不同，琼胶寡糖可分为琼寡糖(aos)和新琼寡糖(naos)。新琼四糖就是一种naos。
4.现有技术没有新琼四糖对huc-mscs体外增殖的影响报道。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术不足，提供一种寡糖在促进huc-mscs增殖、制备相应培养基中的应用，以提高huc-mscs的增殖效率。
6.本发明目的通过下面的技术方案实现：
7.一种寡糖在促进huc-mscs体外增殖中的应用，所述寡糖为新琼四糖。具体实施例中，从表1的a值可以看出，20μma值＞10μma值＞0μma值，说明新琼四糖有效促进huc-mscs增殖，且新琼四糖浓度越高，对huc-mscs的促增殖作用越强；从图1中c图可以看出，20μm克隆数量＞10μm克隆数量＞0μm克隆数量，说明新琼四糖有效促进huc-mscs增殖，且新琼四糖浓度越高，对huc-mscs的促增殖作用越强。
8.一种寡糖在制备促进huc-mscs增殖的培养基中的应用，所述寡糖为新琼四糖。
9.优选地，所述培养基包括基础培养基和活性成分，所述活性成分为新琼四糖。
10.优选地，所述培养基还包括胎牛血清。
11.优选地，所述培养基还包括青链霉素。
12.优选地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
13.一种huc-mscs增殖培养基，在基础培养基dmem/f12培养基中添加新琼四糖配制而成。进一步地，该增殖培养基中可以预添加胎牛血清、青链霉素，也可以临用时再将胎牛血清、青链霉素加入到含有新琼四糖的dmem/f12培养基中。
14.本发明取得的有益效果：
15.本发明通过mtt实验和克隆形成实验证明，新琼四糖可以有效促进huc-mscs增殖，
且新琼四糖浓度越高，对huc-mscs的促增殖作用越强。本发明进一步通过westernblot实验证明，新琼四糖干预培养在促进huc-mscs增殖的同时，并不会比常规培养明显降低huc-mscs的干细胞特性。
附图说明
16.图1中：a为流式细胞术测定的cd105、cd90、cd73、cd34、cd45表达，cd105、cd90、cd73表达阳性，cd34、cd45表达阴性；b为酶标仪测定的490nm波长处光密度(a)值，20μma值＞10μma值＞0μma值；c为克隆形成结果，20μm克隆数量＞10μm克隆数量＞0μm克隆数量；d为westernblot测定的干性转录因子nanog、oct4、sox2的表达水平，10μm、20μm新琼四糖干预培养与0μm新琼四糖干预培养的huc-mscs中的干性转录因子nanog、oct4、sox2表达水平并无明显差异。
具体实施方式
17.为了更好地介绍本发明，下面通过具体实施例详细阐述本发明的实质性内容，但需要注意并不以此限定本发明的保护范围。
18.实施例1：
19.一、实验材料
20.dmem/f12培养基购自gibco公司。
21.胎牛血清(fbs)购自gibco公司。
22.双抗购自sigma-aldrich公司。
23.胰酶购自sigma-aldrich公司。
24.新琼四糖(hplc≥98％)购自源叶生物。
25.mtt购自sigma-aldrich公司。
26.结晶紫sigma-aldrich公司。
27.一抗、二抗购自武汉博欧特生物科技有限公司。
28.二、实验方法
29.1、huc-mscs分离与培养
30.收集正常分娩产妇的脐带标本，pbs清洗去除脐动脉和静脉及羊膜，获得华通氏胶，剪碎成约1mm3大小的组织块，接种于培养皿内，用含10％fbs、1％双抗的dmem/f12培养基于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中培养，待细胞融合度达约85％时接种于25cm2培养瓶内，每2～3天换液1次，待细胞融合达80％，胰酶消化传代。取第3代细胞重悬后倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术检测cd105、cd90、cd73、cd34、cd45。
31.2、mtt检测huc-mscs增殖
32.取生长状态良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％双抗的dmem/f12培养基(完全培养基)重悬，调整细胞密度为5
×
104个/ml后铺至96孔板，每孔100μl。12h后，每孔分别加入100μl含有不同浓度新琼四糖的完全培养基，使新琼四糖终浓度分别为0μm、10μm、20μm，每个浓度5个复孔。继续培养48h后，每孔中加入20μl新制备0.5％mtt溶液，静置4h，弃去培养基，pbs冲洗，每孔中加入150μldmso溶液，震荡15min使结晶充分溶解，静置2h，取上清，酶标仪测定490nm波长处光密度(a)值。
33.3、克隆形成检测huc-mscs增殖
34.取生长状态良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％双抗的dmem/f12培养基(完全培养基)重悬，以2
×
103个/孔接种至12孔板，每孔1ml。24h后，每孔分别加入1ml含有不同浓度新琼四糖的完全培养基，使新琼四糖终浓度分别为0μm、10μm、20μm，每个浓度3个复孔，于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中培养。继续培养9d后(每2～3d更换一次含对应浓度新琼四糖的完全培养基)，弃去上清液，pbs洗涤3次，无水乙醇固定30min，弃去固定液，10mg/ml结晶紫染液染色30min，pbs洗涤3次，空气干燥，观察拍照比较新琼四糖不同浓度组的克隆数量。
35.4、westernblot检测huc-mscs干性
36.取生长状态良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％双抗的dmem/f12培养基(完全培养基)重悬，以2
×
103个/孔接种至12孔板，每孔1ml。24h后，每孔分别加入1ml含有不同浓度新琼四糖的完全培养基，使新琼四糖终浓度分别为0μm、10μm、20μm，每个浓度3个复孔，于37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中培养。继续培养9d后(每2～3d更换一次含对应浓度新琼四糖的完全培养基)，收集细胞，pbs洗涤，裂解，小心吸取上清，采用bca试剂盒进行定量。分别取35μg总蛋白质样品，进行含10％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至pvdf膜上。转膜结束后，50g/l脱脂奶粉室温封闭2h后，加入nanog、oct4、sox2、gapdh(内参)稀释一抗，4℃孵育过夜，tbts漂洗，加稀释二抗，常温孵育2h，tbts漂洗，加入ecl发光液显影、拍照。
37.5、统计学分析
38.所有数据采用均数
±
标准差(x
±
s)表示，多组之间比较采用anova分析方法，两组间差异的比较采用t检验方法，p＜0.05具有显著差异，采用spss20.0进行相关数据统计分析。
39.三、实验结果
40.1、huc-mscs分离与培养
41.倒置显微镜下观察细胞呈梭形旋涡状特点；流式细胞术显示cd105、cd90、cd73表达阳性，cd34、cd45表达阴性(图1中a图)。这表明已经成功分离培养huc-mscs。
42.2、huc-mscs增殖
43.酶标仪测定的490nm波长处光密度(a)值见表1和图1中b图，a值与细胞数量成正比例相关。从表1的a值可以看出，20μma值＞10μma值＞0μma值，说明新琼四糖有效促进huc-mscs增殖，且新琼四糖浓度越高，对huc-mscs的促增殖作用越强。
44.表1 490nm波长处光密度(a)值
45.浓度a值显著性分析0μm0.683
±
0.022/10μm0.949
±
0.027v.s.0μm，p＜0.0520μm1.371
±
0.024v.s.0μm，p＜0.05
46.克隆形成结果比较见图1中c图。从图1中c图可以看出，20μm克隆数量＞10μm克隆数量＞0μm克隆数量，说明新琼四糖有效促进huc-mscs增殖，且新琼四糖浓度越高，对huc-mscs的促增殖作用越强。
47.3、huc-mscs干性
48.干性转录因子nanog、oct4、sox2是表征huc-mscs干细胞特性的重要标志物，通过跟踪nanog、oct4、sox2表达水平的变化可以半定量分析huc-mscs是否依然维持良好的干细胞特性。westernblot测定的nanog、oct4、sox2表达水平结果见图1中d图。从图1中d图可以看出，10μm、20μm新琼四糖干预培养与0μm新琼四糖干预培养的huc-mscs中的干性转录因子nanog、oct4、sox2表达水平并无明显差异。这表明，新琼四糖干预培养在促进huc-mscs增殖的同时，并不会比常规培养明显降低huc-mscs的干细胞特性。
49.实施例2：
50.一种huc-mscs增殖培养基，在基础培养基dmem/f12培养基中添加新琼四糖配制而成。进一步地，该增殖培养基中可以预添加胎牛血清、青链霉素，也可以临用时再将胎牛血清、青链霉素加入到含有新琼四糖的dmem/f12培养基中。
51.上述实施例的作用是为了详细阐述本发明的实质性内容，但需要强调的是，本领域技术人员不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。