体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法与流程

技术特征：
1.体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：步骤1：将牛肾细胞经复苏后进行细胞传代，对生长良好的细胞计数，确保活细胞数＞96％后，调整细胞浓度备用；步骤2：牛肾细胞铺在孔装培养板中培养至长成单层；步骤3：设置细胞对照组和不同浓度牛肠道病毒感染组，细胞对照组加入dmem培养液，牛肠道病毒感染组加入等量不同浓度bev病毒液，分别与细胞孵育1h后弃液，pbs洗涤3次，加入2ml不含fbs的dmem培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、36、48h收集细胞培养上清液，用于细胞分泌炎性相关因子指标的测定。2.根据权利要求1所述的体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：步骤1的而具体过程为：将牛肾细胞从液氮罐取出，置于37℃恒温水浴锅中使其充分融化，转入含10％fbs的dmem培养液的25cm3细胞瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，在24小时弃掉培养液，使用预冷无菌pbs洗涤三次，将细胞碎片等洗净，换上新鲜含10％fbs的dmem培养液继续培养，即为细胞复苏。当细胞长至85％以上时进行传代培养，首先弃掉细胞瓶内的培养液，然后使用预冷无菌pbs洗涤3次，再使用0.25％胰酶消化，再以1∶4的比例进行传代培养，生长良好的传代细胞，将其洗脱并进行细胞计数及稀释，将mdbk细胞浓度调整为1x10
6 cell/ml备用。3.根据权利要求1所述的体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：步骤2的而具体过程为：分别设置细胞对照组和6个不同浓度牛肠道病毒感染组，每组3个重复，按2000ul/孔将调整好浓度的mdbk细胞加至12孔板内，置于37℃、5％co2培养箱中培养过夜使细胞贴壁长成单层。4.根据权利要求1所述的体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：步骤3的而具体过程为：孔装培养板为12孔培养板，孔内细胞长成单层后弃去培养液，无菌预冷pbs缓冲液洗3次，细胞对照组加入不含fbs的dmem培养液800ul，病毒组分别加入等量的用不含fbs的dmem稀释的不同浓度牛肠道病毒液，置于培养箱中孵育1小时，弃去病毒液，pbs缓冲液清洗3次后，每孔加入2000ul不含fbs的dmem培养液后继续培养，分别于第4、8、12、24、36、48h收集细胞培养上清液，用于炎性因子指标测定。5.根据权利要求4所述的体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：牛肠道病毒感染组分为6个不同浓度，分别是10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
bev。6.根据权利要求4所述的体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，其特征在于：炎性因子指标测定包括细胞lif、tnf-α、csf2、il-1β、il-2、il-6、il-8、il-10、il-11炎性因子水平。

技术总结
本发明提供体外感染牛肠道病毒建立牛肾细胞炎症模型的方法，属于细胞炎症模型技术领域，采用牛肠道病毒(BEV)体外感染牛肾细胞(MDBK)诱导细胞出现炎症反应。该模型具有构建技术方法先进、操作简便，模型稳定、实用性强的特点。应用本发明建立BEV体外感染MDBK细胞炎症模型后，通过测定BEV感染MDBK后，细胞LIF、TNF-α、CSF2、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11炎性因子水平，可探讨BEV病毒不同感染量、不同感染时间对MDBK细胞炎性因子水平的影响。通过测定BEV感染MDBK细胞后，在药物作用下MDBK细胞的炎性因子水平等，可探讨药物对BEV诱导MDBK炎症反应的调控作用，为研究药物对BEV感染MDBK引起细胞炎症反应的最佳调控作用的药物浓度、作用方式、作用时间及其机制提供了较好的体外模型，进而为研究BEV感染致病的机理及其防控治疗提供参考。机理及其防控治疗提供参考。机理及其防控治疗提供参考。


技术研发人员：冯世文 李军 贺会利 彭昊 吴翠兰 秦若甫 李常挺 胡帅 钟舒红 马春霞 李小宁 白慧丽
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：2022.07.11
技术公布日：2022/11/22