大白菜显性桔红色基因BrOr的KASP标记及其应用

大白菜显性桔红色基因bror的kasp标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种大白菜显性桔红色基因bror的高通量检测标记及其在育种中的应用


背景技术：

2.大白菜(brassica rapa ssp.pekinensis)是原产于我国的一种十字花科重要蔬菜作物。其心叶通常呈白色、黄色，目前市面上也有一些新选育的桔红心大白菜。与白色心叶相比，桔红色心叶白菜积累的类胡萝卜素更多。类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，是由8个异戊二烯单位首尾相连形成的四萜化合物，在人类营养和健康方面也发挥着重要的作用，既是体内维生素a的主要来源，同时还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等功效。由于桔红心大白菜颜色艳丽、营养丰富、新颖性强等受到了消费者的喜爱，因此桔红心大白菜品种是重要的品种选育方向之一。
3.目前在选育桔红色大白菜过程中仍是通过传统的育种手段，费时费力，极大的延缓了育种进程。利用分子标记可加快品种的选育，然而已知桔红心基因crtiso为隐性单基因控制，不能在育种中很好的应用。此外，国内外关于白菜桔红心性状缺乏具有应用价值的分子标记，限制了其在分子育种中的应用。使用与桔红心基因紧密连锁的分子标记，在苗期就可对植株抗性进行筛选与鉴定，提高材料鉴定效率，有效缩短桔红心品种的培育年限。因此，开发大白菜桔红心连锁分子标记，对桔红心品种的培育具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.本发明的第一个方面提供一种大白菜显性桔红色基因bror，其特征在于，该基因位于a09染色体1.42-12.19mb区间内，braa09g007080.3c(a09：4062751
–
4064398mb)，在红色心叶品种中，a09染色体的569bp位置存在一个4670bp的插入，而在白色心叶品种中并不存在。
5.本发明的第二个方面是提供上述的基因在白菜育种中的应用，其特征在于用于培育球心为桔红色心叶白菜品种或是白色心叶品种。
6.本发明的第三个方面提供一种用于鉴定白菜显性桔红色基因bror的indel标记a09-4063965的引物组，其中包括bror-kasp1fa、bror-kasp1fb、bror-kasp1r，其序列分别为seq id no:1-3所示。
7.本发明的第四个方面提供一种用于鉴定白菜显性桔红色基因bror的indel标记a09-4063965的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括了上述的引物组。在另外一个具体的实施例中，所述的试剂盒还包括kasp-pcr所需要的试剂。
8.本发明的第五个方面是提供上述的引物组在鉴定白菜显性桔红色基因bror的indel标记a09-4063965中的应用。
9.本发明的第六个方面是提供所述的引物组在辅助白菜育种中的应用。
10.本发明的第七个方面是提供上述包含引物组的试剂盒在鉴定白菜显性桔红色基
因bror的indel标记a09-4063965中的应用。
11.本发明的第八个方面是提供上述包含所述引物组的试剂盒在辅助白菜育种中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的优点在于：
13.本发明挖掘了大白菜新显性桔红色基因bror，bror基因编码一个富含半胱氨酸的danj结构域蛋白，由于基因中插入一个长的反转座子，造成在转录后生成bror
del
(插入16bp，缺失36bp)，诱导前质体或其他无颜色的质体分化成有色体以积累大量的类胡萝卜素。发明了桔红色基因bror的snp标记a09-4063965，公布了检测该标记的检测引物bror-kasp1。该snp标记及其检测引物能够准确、高效地检测桔红色基因型。此筛选方法不受环境因素影响，能大幅度降低田间选择工作量，有助于辅助加快大白菜育种进程。
附图说明
14.图1为桔红色基因的定位，具体在a09染色体1.42-12.19mb区间内，绘图窗口为1mb，步移长度50kb，黄线为95％置信区间，蓝线为99％置信区间；
15.图2为bror的克隆及序列差异：在569bp位置，在桔红色材料y1264-1中存在4670bp的大片段插入，而在白色y358-10中并不存在；
16.图3为利用标记bror-kasp1对f2群体进行kasp基因分型：纯合桔红色材料的信号点为蓝色，5'末端连接fam荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在x轴附近；纯合白色材料的信号点为绿色，5'末端连接hex荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在y轴附近；杂合桔红色材料的信号点为红色，聚合在对角线附近。
具体实施方式
17.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
18.实施例1：供试材料和表型性状调查
19.选择大白菜白色dh系材料y358-10(p1)和桔红色材料y1264-1(p2)作为亲本，对两个材料进行杂交获得f1代种子，f1材料自交获得f2代种子，f1分别与y358-10(p1)和y1264-1(p2)杂交获得bc1p1和bc1p2种子。将所有材料种植于河南现代农业研究开发基地，田间统一管理，白菜结球后进行球心色调查。
20.大白菜桔红色性状遗传规律：通过对p1、p2、f1、f2、bc1p1和bc1p2六个世代的红色性状调查发现，12株f1植株的球心色为红桔色，f2群体中桔红色植株1459株，白色植株491株，经卡平方测验符合3︰1的分离比例，bc1p1群体中有桔红色植株37株，白色植株35株，经卡平方测验符合1︰1的分离比例，bc1p2群体中所有植株均桔红色。综上，遗传分析表明白菜桔红色、白色性状由1对核基因控制，桔红色对白色为显性。
21.表1大白菜亲本及其后代桔红色、白色植株分离情况
22.群体总数桔红色白色期望比卡方(x2)x
20.05
p1(y358-10)12120
‑‑‑
p2(y1264-1)12010
‑‑‑
f112120
‑‑‑
bc1p1(f1×
y358-10)7237351:12.053.84bc1p2(f1×
y1264-1)72720
‑‑‑
f2195014594913:10.763.84
23.实施例2基因组dna提取
24.采用改良的ctab法提取p1、p2、f1、bc1p1、bc1p2和f2各单株基因组dna。具体步骤如下。
25.取新鲜叶片于2.0ml eppendorf离心管中，向每管放入钢珠1粒(直径为5mm)，之后加1000μl 2％ctab提取缓冲液，在组织破碎仪(型号:德国retsch mm400)上以30次/秒的频率破碎1min。65℃温浴1h，待冷却后加入500μl24:1的氯仿/异戊醇抽提液，上下摇动30次，静置分层，离心(12000r/min)10min，吸取400μl上清液至新的1.5ml离心管中，之后加400ul异丙醇沉淀dna，上下混匀后离心(12000r/min)5min，弃上清，然后加70％乙醇750μl清洗dna沉淀，离心(12000r/min)2min，弃上清，室温晾干dna，加入100μl ddh2o溶解dna，置于-20℃冰箱中备用。
26.实施例3大白菜显性桔红色新基因bror的定位
27.以上述f2分离群体为试材，挑选桔红色和白色f2单株各50株，构建桔红色和白色两个基因混池，利用bsa-seq技术对两个混池进行全基因组重测序。以大白菜chiifu-401-42基因组序列(v3.0)作为参考序列，利用bwa(v0.7.15-r1140)软件将双亲以及两个混池的clean reads分别比对到参考基因组上，使用samtools(v1.3.1)和picard(v1.91)进行snp calling，获得各样本的snp位点。分别计算桔红色混池和白色混池的snp-index，然后用桔红色池的snp-index减去白色池的snp-index，得到两个混池之间的
△
snp-index，以1mb为窗口，50kb为步长进行滑窗分析确定桔红色基因的候选区间。通过显著性分析，将桔红色基因定位在a09染色体1.42-12.19mb区间内(图1)，区间长度为10.77mb。该基因的定位区间和已报道隐性桔红心的brcrtiso(a09染色体，braa09g063710.3c，43.923664
–
43.926770mb)的定位区间并不一样，为一个新的显性桔红色基因，命名为bror。
28.实施例4大白菜显性桔红色新基因bror的kasp分子标记
29.通过基因定位方法确定了bror的候选基因为braa09g007080.3c(a09：4062751
–
4064398mb)，对候选基因在两个亲本及f2分离群体极端池个体进行测序和序列比对，发现a09染色体569bp位置存在一个4670bp的插入，如图2所示在569bp位置，在桔红色材料y1264-1中存在4670bp的大片段插入，而在白色y358-10中并不存在，将此变异称为indel标记a09-4063965。
30.针对此indel标记a09-4063965设计kasp检测引物bror-kasp1，包括三条引物:
31.bror-kasp1fa:5'-gaaggtgaccaagttcatgctgctgttggtgtgatctcagct-3'(seq id no:1)；
32.bror-kasp1fb:5'-gaaggtcggagtcaacggattgctgttggtgtgatctcagcg-3'(seq id no:2)；
33.bror-kasp1r:5'-cttgtgctcttgctgcttcacg-3'(seq id no:3)。
34.bror-kasp1fa和bror-kasp1fb为两条等位基因特异性正向引物，bror-kasp1fa为纯合桔红色性状的特异引物，bror-kasp1fb为纯合白色性状的特异引物，5'端分别加上fam和hex荧光序列标签序列(下划线部分)。bror-kasp1r为一条共同的反向引物。
35.利用kasp引物bror-kasp1在亲本y358-10、y1264-1及其f2后代单株中进行检验。kasp-pcr反应在96孔pcr仪上进行，反应体系8μl：1.5μl dna(80ng
·
μl-1)，4μl kasp master mix(2
×
)，0.14μl引物混合物(由浓度为100μmol
·
l-1
的bror-kasp1fa、bror-kasp1fb、bror-kasp1r与ddh2o按12:12:30:46的体积比混合得到)，其余用ddh2o补齐。
36.kasp-pcr扩增程序为：第一阶段94℃变性15min；第二阶段94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环(从第二个循环开始，每个循环降低0.6℃，)；第三个阶段94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环；第四阶段37℃1min。
37.kasp-pcr扩增产物用罗氏荧光定量pcr仪lightcycler 480ii(lc480ii)进行终点法荧光信号读取。利用lc480 software v1.5.1分析snp分型结果：纯合桔红色材料的信号点为蓝色，5'末端连接fam荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在x轴附近；纯合白色材料的信号点为绿色，5'末端连接hex荧光标签序列的引物竞争性扩增，聚合在y轴附近；杂合桔红色材料的信号点为红色，聚合在对角线附近(图3)。bror-kasp1标记能够显著区分两种纯合基因型，而且可以鉴别出杂合基因型，具有共显性标记特点，标记开发成功。
38.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。