用于产生重配流感病毒的方法与流程

1.本发明属于重配流感病毒领域。它涉及制备重配流感病毒，尤其是在制造流感疫苗的情况下可用作种病毒的重配病毒的方法。通过本发明的方法产生的重配流感病毒和疫苗也是本发明的各方面。


背景技术：

2.重配流感病毒的基因组含有源自两种或更多种亲本流感菌株的区段。此类重配病毒可用于制造流感疫苗，因为可以利用高生长流感菌株的特性来增加循环菌株的血凝素(ha)和/或神经氨酸酶(na)抗原的产生，其中循环菌株的ha和/或na抗原是流感疫苗的典型组分。在疫苗制造中，重配病毒(可称为种病毒)通常含有循环菌株的ha和na区段，以及高生长流感菌株的骨架区段(即pb1、pb2、pa、m、ns和np)。这种种病毒可用于使含有ha和na的病毒比简单地繁殖循环菌株更快地生长，后者在流感疫苗制造过程中使用的培养宿主平台(例如卵或细胞)中可具有较差的生长特性。例如，最近已经证实含有循环菌株的ha和na以及来自高生长亲本a/波多黎各/8/34(pr8)的六个骨架基因的重配甲型流感病毒由于循环菌株ha在pr8骨架的背景下的高产率是用于疫苗制造的优选种病毒。[1]两种方法已用于生成重配流感病毒；经典重配和反向遗传学。
[0003]
在经典重配中，向培养宿主(通常是禽卵)接种两种亲本菌株(即循环菌株和高生长菌株)。然后通过使培养宿主在针对高生长菌株的ha和/或na的抗体的存在下生长来选择包含循环菌株的ha和/或na的重配病毒。可以分离含有所需ha和na表面基因的重配病毒，并将其用作疫苗制造的种病毒。
[0004]
然而，与经典重配相关的一个缺点是它不允许对基因序列进行受控操纵，这在设法从高致病性流感病毒生成候选种病毒时可能是一个问题。例如，一些h5或h7流感菌株的ha含有呈多碱基裂解位点形式的致病决定簇，不能使用经典重配方法使该致病决定簇缺失。经典重配还可以产生来自每个亲本菌株的基因群(gene constellation)比率为7:1、6:2、5:3或4:4的重配病毒混合物，因为培养宿主接种了两种流感菌株，这意味着存在16个基因(即每个亲本菌株有8个)。因此，分离所需的重配流感病毒以用作疫苗制造中的种病毒可能是耗时的。例如，目前从新的流感菌株到达起需要大约35天才能获得最终的高生长重配株，该重配株将用作疫苗制造中的种病毒。
[0005]
在反向遗传学中，将产生所需流感病毒所需要的遗传信息递送至细胞，然后该细胞能够生成流感病毒。反向遗传学最初需要将病毒核糖核蛋白(rnp)体外组装和转染到被辅助病毒感染的细胞中[2,3]。后续技术涉及用聚合酶和np基因的蛋白质表达构建体一起转染编码所有病毒rna(vrna)的rna聚合酶i质粒[4]。最近，反向遗传学方法涉及使用经修饰的rna聚合酶i系统，该系统允许从同一模板表达负义vrna和正义mrna[5]。在该方法中，将每个所需基因克隆到phw2000质粒中，该质粒由插入在rna聚合酶i启动子和终止序列之间并且侧接有cmv启动子和多聚腺苷酸化信号的病毒cdna组成。将八种质粒转染到细胞中后，发生vrna和mrna两者的合成，从而产生病毒。进一步的改进导致了系统的开发，其中使
用线性dna表达构建体代替质粒[6]，并且使用单个表达构建体[7]。
[0006]
与经典重配不同，反向遗传学允许操纵用于产生病毒的基因序列。因此，反向遗传学可用于生成用于产生减毒活流感疫苗的种病毒，因为可在细胞中表达构建体转染之前操纵病毒基因序列以产生具有减毒表型的病毒。合成dna序列也可在反向遗传学中用于产生种病毒，从而不需处理野生型大流行病毒[8]。反向遗传学还允许在4-7天内产生种病毒，这比经典重配提供的速度显著更快。
[0007]
然而，有许多与反向遗传学相关的缺点。例如，在反向遗传学中，在制备表达构建体时每个流感基因的序列是预先确定的，这意味着与经典重配相比，该技术产生更具同源性的重配病毒群。如果循环ha和na与在反向遗传学中用作标准的骨架基因不太相容并且因此不能有效生长，这可能是一个问题。在这种情形下，ha和na可以与不同的骨架基因群更有效地生长，但是鉴定和测试更适当的骨架基因以用于反向遗传学是耗时的。这可以引起反向遗传学来源的重配流感病毒的几次传代，使得能够开发在骨架区段中具有序列变异的病毒并选择具有合适生长特征的种病毒。一些反向遗传学系统的另一个问题是可能难以将所需的表达构建体引入培养宿主(例如，由于转染效率低)，这可使反向遗传学系统效率低下。
[0008]
先前已经讨论了产生组合经典重配和反向遗传学的要素的重配流感病毒的方法。例如，参考文献11中讨论了一种方法，其中宿主细胞用第一种流感菌株感染并用编码来自第二流感菌株的至少一个区段的一个或多个表达构建体转染。该方法仅在使用抑制流感病毒区段翻译和/或转录的剂(诸如sirna)以产生其中sirna靶向的区段不存在的重配病毒的背景下进行了描述。
[0009]
因此，本发明的一个目的是提供生成重配流感病毒的改良方法，该方法克服了与经典重配和反向遗传学方法相关的缺点。


技术实现要素：

[0010]
在第一方面，本发明提供了生成重配流感病毒的方法，该方法包括以下步骤：(i)使培养宿主与包含第一血凝素(ha)基因和第一神经氨酸酶(na)基因的亲本流感病毒株接触；(ii)向所述培养宿主中引入包含一个或多个流感基因的一个或多个表达构建体，其中所述流感基因包含第二ha基因或第二na基因；(iii)培养所述培养宿主以便产生重配病毒；(iv)选择包含所述第二ha基因或所述第二na基因的重配病毒；并且和任选地(v)分离包含所述第二ha基因或所述第二na基因的重配流感病毒。
[0011]
本发明还提供了通过本发明的方法产生的重配流感病毒群。
[0012]
本发明还提供了通过本发明的方法产生的分离的重配流感病毒。
[0013]
本发明的方法是有利的，因为提供第一ha基因和第一na基因的亲本流感病毒株包含非同源的病毒粒子群(即存在序列变体/准种)。这在递送至培养宿主的骨架区段中引入了序列可变性，从而使得本发明的方法能够产生比其中利用克隆表达构建体(例如质粒)的反向遗传学技术更广泛的重配病毒多样性。与反向遗传学系统不同，其中最初挽救的病毒可能需要多次传代以引入序列变异并选择具有改良特性的病毒，本发明的方法使得序列变体能够立即存在于通过本发明的方法产生的重配病毒中(由于在亲本流感菌株的繁殖期间已经自然积聚的积聚序列变异)。通过该方法产生的重配病毒的更大多样性也增加了鉴定具有一种或多种特别期望的特性(例如高ha产率和/或高生长)的重配病毒的可能性。
[0014]
本发明方法的另一个优点是该方法固有地针对病毒基因组中与所需ha和/或na的相容性差的任何序列进行选择，否则会产生非功能性重配病毒。这些非功能性病毒不会在培养宿主中有效繁殖，并且会被具有所需高生长特征的变体淘汰。这与反向遗传学技术形成不同，其中序列不相容性将仅在表达构建体产生并递送至培养宿主后才被鉴定，并且在生成所需重配病毒方面存在问题。在相关的优点中，本发明的方法还允许更容易和更频繁地鉴定含有突变组合的重配病毒，所述突变组合协同提供改良的生长特性。事实上，使用反向遗传学可能根本无法鉴定多个突变。例如，在单个突变具有负面影响的情形下，该变体可丢弃，因此不会在进一步的序列变体的背景下进行测试，这可以挽救负面影响并以组合形式引发进一步的优势。
[0015]
本发明与经典重配不同，因为第二ha基因或第二na基因作为表达构建体的一部分引入培养宿主中，而不是用第二流感病毒株感染。使用表达构建体提供第二ha基因或第二na基因意味着ha基因或na基因可以在提供给培养宿主之前以经典重配中不可能的方式进行操纵。这种操纵ha序列的能力在大流行或可能大流行的菌株(诸如h5和h7菌株)的背景下特别有利，因为它允许致病决定簇，诸如多碱基裂解位点的缺失。在表达构建体上递送ha基因或na基因的另一个优点是这允许具有预定序列的单个ha或na克隆的表达。这与在复制病毒的背景下递送ha和na基因的方法(例如经典重配)形成对比，其中存在在复制期间将突变引入ha或na基因中的风险，这可能导致，例如，降低的抗原性。
[0016]
因此，该方法允许控制重配流感病毒中存在的ha区段或na区段，因为它可能处于反向遗传学中，但同时通过用亲本流感病毒株感染，将骨架基因群引入培养宿主至培养宿主来提供具有一定固有变异性的骨架区段库。这是有利的，因为该方法允许更快速地生成用于疫苗制造的优化种病毒，特别是通常在反向遗传学中使用的骨架基因(例如pr8)在与循环菌株的ha和/或na重配时提供次优特性的情形下。在此类情形下，最初在反向遗传学实验中挽救的病毒需要在培养宿主中多次传代，以便促进病毒的生长。在本发明的方法中不一定需要相同的多次传代，因为可以从通过该方法产生的多样重配病毒库中选择具有强生长特性的重配病毒。换句话说，在复制病毒的背景下生成的亲本菌株中骨架基因的多样性，结合针对无活力或生长不良的重配病毒的低水平选择和消除，允许更有效地生成高生长重组病毒。
[0017]
通过本发明的方法产生的重配流感病毒可对流感疫苗的制造特别有用。因此，在另一方面，本发明提供了一种制备疫苗的方法，其包括以下步骤：(a)通过本发明的方法制备重配流感病毒，并且(b)由所述重配流感病毒制备疫苗。还提供了通过本发明的方法产生的疫苗。
附图说明
[0018]
图1是通过经典重配产生的h1n1病毒和通过反向遗传学产生的病毒的m1蛋白中存在的序列变异的图形表示，如表1中所述。0％cf共有骨架的值指示相对于共有骨架序列在该位置不存在序列变体。通过反向遗传学产生的病毒的m1蛋白中没有序列变体。
[0019]
图2是通过经典重配产生的h1n1和h3n2病毒和通过反向遗传学产生的病毒的np蛋白中存在的序列变异的图形表示，如表2中所述。0％cf共有骨架的值指示在该位置不存在序列变体。在通过经典重配制备的病毒中，np蛋白在整个序列上显示出变异，而通过反向遗
传学获得的病毒的np蛋白仅在四个序列位置显示出变异。
[0020]
图3是通过经典重配产生的h1n1和h3n2病毒和通过反向遗传学产生的病毒的ns1蛋白中存在的序列变异的图形表示，如表3中所述。0％cf共有骨架的值指示在该位置不存在序列变体。在通过经典重配制备的病毒中，ns1蛋白在整个序列中显示出变异，而通过反向遗传学获得的病毒的ns1蛋白仅在三个序列位置显示出变异。
[0021]
图4是通过经典重配产生的h1n1和h3n2病毒和通过反向遗传学产生的病毒的pa蛋白中存在的序列变异的图形表示，如表4中所述。0％cf共有骨架的值指示在该位置不存在序列变体。在通过经典重配制备的病毒中，pa蛋白在整个序列中显示出变异，而通过反向遗传学获得的病毒的pa蛋白仅在两个序列位置显示出变异。
[0022]
图5是通过经典重配产生的h1n1和h3n2病毒和通过反向遗传学产生的病毒的pb2区段中存在的序列变异的图形表示，如表5中所述。0％cf共有骨架的值指示在该位置不存在序列变体。在通过经典重配制备的病毒中，pb2蛋白在整个序列中显示出变异，而通过反向遗传学获得的病毒的pb2蛋白仅在八个序列位置显示出变异。
具体实施方式
[0023]
重配流感病毒
[0024]
流感病毒是分段的负链rna病毒。甲型和乙型流感病毒基因组含有八个单链病毒rna(vrna)区段。甲型和乙型流感病毒的八个基因组区段按大小顺序为pb2、pb1、pa、ha、np、na、m、ns。pb2、pb1、pa、np、m和ns编码内部和非结构蛋白，并且可以称为骨架区段。ha和na区段编码表面糖蛋白。本发明的方法可用于产生重配甲型流感病毒。可替代地，本发明的方法可用于产生重配乙型流感病毒。
[0025]
对于甲型流感病毒，八个基因组区段编码十一种蛋白质，如下：血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)、两种基质蛋白(m1和m2)、异源三聚体rna依赖性rna聚合酶(由一个聚合酶酸性亚基(pa)和两个聚合酶碱性亚(pb1和pb2)组成)、核蛋白(np)和两种非结构蛋白(ns1和ns2；ns2也称为核输出蛋白(nep))。一些甲型流感病毒还表达促凋亡肽pb1-f2。pb2、pa、ha、np和na区段各自编码单一的表达蛋白。pb1、m和ns区段编码一种以上的蛋白。pb1区段编码pb1蛋白以及pb1-f2蛋白(在pb1区段上的 1阅读框中编码)。m区段编码m1和m2蛋白。ns区段编码ns1和ns2/nep蛋白。m2和ns2/nep蛋白由来自m和ns区段的剪接mrna表达。
[0026]
对于乙型流感病毒，八个基因组区段也编码十一种蛋白质，但是与甲型流感病毒有一些差异。对于甲型流感病毒，pb2、pa、ha和np区段各自编码单一的表达蛋白，且ns区段编码ns1和ns2/nep蛋白。在乙型流感病毒中不存在pb1-f2蛋白，这意味着pb1区段单独编码pb1蛋白。除na蛋白外，乙型流感病毒中的na区段还在交替的-1阅读框中编码nb基质蛋白。nb基质蛋白对应于甲型流感中的m2蛋白。m区段编码m1蛋白，并且在交替的 2阅读框中编码bm2蛋白。
[0027]
重配流感病毒包含源自两种或更多种亲本流感病毒株的基因组区段。通过本发明的方法产生的重配流感病毒包含来自第一亲本流感病毒株(供体菌株)的一个或多个基因区段，和来自第二亲本流感病毒株(疫苗菌株)的一个或多个基因区段。流感供体菌株是通常在重配流感病毒中提供骨架区段的菌株，即使它们有时也可能提供病毒的na区段。疫苗菌株是提供ha或na区段的流感菌株。通常，重配流感病毒中的ha和na区段两者都将来自疫
苗菌株。在本发明的方法中，作为表达构建体的一部分引入到培养宿主中的第二ha基因或第二na基因源自疫苗菌株。疫苗菌株通常是循环菌株。疫苗菌株与供体菌株不同。
[0028]
可以使用基因群比率来描述重配病毒中存在的基因组区段，该比率指示每个亲本流感病毒株提供的区段数目。例如，当重配病毒含有来自两个亲本流感病毒株(诸如供体菌株和疫苗菌株)的基因组区段时，它可能具有1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1的基因群比率。重配病毒可包含来自三个亲本流感病毒株(在存在的情况下)的基因组区段。在这些实施方案中，重配病毒可以具有1:1:6、1:2:5、1:3:4、1:4:3、1:5:2、1:6:1、2:1:5、2:2:4、2:3:3、2:4:2、2:5:1、3:1:2、3:2:1、4:1:3、4:2:2、4:3:1、5:1:2、5:2:1或6:1:1的基因群比率。
[0029]
本发明产生的重配病毒的大部分基因组区段通常来自供体菌株，因为希望通过供体菌株区段与来自疫苗菌株的区段的重配来利用供体菌株的特性。在某些此类实施方案中，通过本发明的方法产生的重配流感病毒具有5:3、6:2或7:1的基因群比率，其中该比率的第一个数字指示来自供体菌株的区段数目且该比率的第二个数字指示来自疫苗菌株的区段数目。
[0030]
在优选的实施方案中，重配流感病毒具有6:2的基因群比率。在这些实施方案中，重配流感病毒包含来自供体菌株的六个骨架区段(即pb1、pb2、pa、np、m和ns)和来自疫苗菌株的两个区段(即ha和na)。在特别优选的实施方案中，重配流感病毒是具有6:2的基因群比率的重配甲型流感病毒。
[0031]
在其它实施方案中，重配流感病毒具有7:1的基因群比率。在这些实施方案的一些中，重配流感病毒包含来自供体菌株的六个骨架区段、来自疫苗菌株的ha区段和来自供体菌株的na区段。换言之，重配流感病毒包含来自疫苗菌株的ha区段和其余七个来自供体菌株的区段。换言之，重配流感病毒包含来自供体菌株的六个骨架区段和ha区段，以及来自疫苗菌株的na区段。换言之，重配流感病毒包含来自疫苗菌株的na区段和其余七个来自供体菌株的区段。对于重配乙型流感病毒，优选7:1的基因群比率。
[0032]
在其它实施方案中，重配流感病毒具有5:3的基因群比率。在这些实施方案中，重配病毒包含五个骨架区段(即，选自下组的五个区段：pb1、pb2、pa、np、m和ns)和来自疫苗菌株的三个区段。在这些实施方案中，来自疫苗菌株的三个区段是ha、na和一个骨架区段(即，选自下组的一个区段：pb1、pb2、pa、np、m和ns)。在一个优选的实施方案中，来自疫苗菌株的三个区段是ha、na和pb1，其余五个骨架区段(即pb2、pa、np、m和ns)来自供体菌株。
[0033]
流感病菌株
[0034]
在本发明的方法中，与培养宿主接触的亲本流感病菌株是供体菌株。供体菌株具有复制能力(即它可以在感染后在培养宿主中自我繁殖)。使培养宿主与供体菌株接触导致当病毒感染培养宿主时，供体菌株的基因组区段被递送至培养宿主。
[0035]
任何具有一组所需特征的流感病毒株都可以用作供体菌株。在某些实施方案中，供体菌株是在细胞和/或卵中具有良好生长特征的菌株。通常，良好的生长特征是根据病毒在培养宿主中繁殖时的ha产率来衡量的。具有良好生长特征的供体菌株可称为高生长亲本菌株(hgp菌株)。因此，在某些实施方案中，与培养宿主接触的亲本流感病毒株是高生长亲本菌株。可用于本发明方法中的高生长亲本菌株的实例是a/波多黎各/8/1934(a/puerto rico/8/1934，pr8)、a/德克萨斯/1/1977(a/texas/1/1977)、a/纽约/55/2004(a/new york/55/2004)、a/安娜堡/6/60(a/ann arbor/6/60)、a/列宁格勒/134/17/57(a/leningrad/
134/17/57)、b/安娜堡/1/66(b/ann arbor/1/66)、b/佛罗里达/4/2006(b/florida/4/2006)、b/巴拿马/45/1990(b/panama/45/1990)和b/李/1940(b/lee/1940)。在一个优选的实施方案中，a/波多黎各/8/1934是甲型流感病毒的供体菌株。与高生长亲本菌株相比，生长到相似或更高病毒滴度的菌株可用作供体菌株。
[0036]
可在本发明的方法中用作供体菌株的流感菌株通常为培养宿主提供不同源的骨架区段群。这是因为供体菌株包含不同源的病毒粒子群(即存在序列变体)。这些变体骨架区段可能来自流感病毒基因组中的自发突变。突变率可以表示为每次细胞感染的每个核苷酸的取代数(s/n/c)且流感病毒的突变率范围为10-5
至10-7
。这意味着病毒粒子群中大约1/1000的流感病毒粒子在基因组区段中包含突变。因此，可用于本发明的方法中的供体菌株包括密切相关的准种流感病毒群。术语“准种”用于指源自单一来源但含有序列变体的流感病毒。这与源自不同来源(被认为是单独的物种)的流感病毒之间的序列变异不同。因此本发明的方法涉及使培养宿主与包含流感病毒准种群(即具有源自单一来源的序列变异的流感病毒)的供体菌株接触。这样，变体骨架区段群被递送到培养宿主。
[0037]
当比对骨架区段的序列时，骨架区段群体(例如np区段)内的变异可以根据在骨架区段群体内的两个最不同的序列之间不同的序列位置的数量表示为百分比。序列差异可以是取代、缺失或插入。为了鉴定群体内两个最不同的序列，可以进行多序列比对。可以使用适于比对多个蛋白质序列的工具(例如，使用其默认参数的clustal omega工具，如maderia等人nucleic acids research 2019(47)doi:10.1093/nar/gkz268所述)。例如，如实施例5中所讨论的，np蛋白具有498个氨基酸的序列，并且在通过经典重配产生的h1n1病毒的np蛋白氨基酸序列中鉴定出44个突变。当比较h1n1重配组内两个最不同的np蛋白序列时，这对应于np蛋白上约9％的变异。可以使用以下公式计算骨架蛋白上的序列变异百分比：
[0038][0039]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在一个或多个骨架区段中包含至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％或至少20％的氨基酸序列变异。准种的供体菌株群可以在任何骨架区段中包含不超过30％的氨基酸序列变异。
[0040]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在m1蛋白中包含至少5％的氨基酸序列变异。
[0041]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在np蛋白中包含至少5％的氨基酸序列变异。在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在np蛋白中包含至少8％的氨基酸序列变异。
[0042]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在ns1蛋白中包含至少5％的氨基酸序列变异。在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在ns1蛋白中包含至少15％的氨基酸序列变异。
[0043]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在pa蛋白中包含至少5％的氨基酸序列变异。
[0044]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其在pb2蛋白中包含至少5％的氨基酸序列变异。
[0045]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其包含m1蛋白中至少5％的氨基酸序列变异、np蛋白中至少5％的氨基酸序列变异、ns1蛋白中至少5％的氨基酸序列变异、pa蛋白中至少5％的氨基酸序列变异和pb2蛋白中至少5％的氨基酸序列变异。
[0046]
在一些实施方案中，供体菌株包含流感病毒准种群，其包含m1蛋白中至少5％的氨基酸序列变异、np蛋白中至少8％的氨基酸序列变异、ns1蛋白中至少15％的氨基酸序列变异、pa蛋白中至少5％的氨基酸序列变异和pb2蛋白中至少5％的氨基酸序列变异。
[0047]
可以产生其它供体菌株用于本发明的方法中。为了产生用于本发明方法的供体菌株，可以在用于本发明方法的培养宿主中繁殖流感病毒株。使流感病毒株在用于本发明方法的培养宿主中传代，导致生成变异流感病毒株，所述变异流感病毒株含有与它们所来源的流感病毒株相比，允许变异菌株生长到更高病毒滴度的序列变异(在相同时间和相同生长条件下)。因此变异流感菌株在用于本发明方法的培养宿主中具有改良的生长特征，并且是优选的供体菌株。例如，使a/波多黎各/8/1934流感菌株在细胞培养物中多次传代产生一种变异流感菌株(pr8-x菌株)，该变异流感菌株与原始a/波多黎各/8/1934菌株相比，在那些细胞中生长到更高的病毒滴度。因此，在某些实施方案中，pr8-x菌株是供体菌株。类似地，使a/新喀里多尼亚/20/1999菌株在细胞培养物中多次传代产生一种变异菌株(105p30菌株)，该变异菌株与野生型a/新喀里多尼亚/20/1999菌株相比，在相同时间和相同生长条件下生长到更高的病毒滴度。
[0048]
pr8-x的基因区段具有seq id no:1(pa)、seq id no:2(pb1)、seq id no:3(pb2)、seq id no:4(np)、seq id no:5(m)、seq id no:6(ns)、seq id no:7(ha)或seq id no:8(na)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含编码与pr8-x基因区段相同的氨基酸序列的基因区段的流感菌株可用作供体菌株。
[0049]
105p30的基因区段具有seq id no:9(pa)、seq id no:10(pb1)、seq id no:11(pb2)、seq id no:12(np)、seq id no:13(m)、seq id no:14(ns)、seq id no:15(ha)或seq id no:16(na)的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含编码与105p30基因区段相同的氨基酸序列的基因区段的流感菌株可用作供体菌株。
[0050]
适合用于本发明方法的供体菌株通常会实现与使用供体菌株所来源的流感菌株获得的病毒滴度相比，改善的病毒滴度和/或生长动力学。在某些实施方案中，供体菌株的改善的病毒滴度在与供体菌株所来源的流感菌株相同的生长条件和相同的时间(例如12小时、24小时、48小时或72小时)生长时，高至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％或至少1000％。
[0051]
在某些实施方案中，供体菌株是获得监管批准用于疫苗制造的菌株。使用获得监管批准的供体菌株是有利的，因为通过本发明的方法生成的重配病毒可用于制备疫苗，与供体菌株没有预先获得监管批准相比，疫苗可能更容易上市。
[0052]
发明人已经发现，当培养宿主与纯化的供体菌株接触时，重配流感病毒的产生增强。当供体菌株随着第二ha基因和/或第二na基因的转染同时被递送至培养宿主时，供体菌株的纯化可能是有利的。这是因为污染性卵蛋白或细胞培养蛋白(可在供体菌株繁殖后存在)可干扰表达构建体向培养宿主的转染。因此，在一些实施方案中，使培养宿主与纯化的供体菌株接触。在某些此类实施方案中，使培养宿主与纯化的供体菌株接触，并且通过转染将包含第二ha基因或第二na基因的一个或多个表达构建体引入培养宿主中。
[0053]
在用于该方法之前，供体菌株可能已经在细胞培养物和/或卵中繁殖。在一些实施方案中，该方法包括使流感病菌株在细胞培养物或卵中传代以产生用于感染培养宿主的供体菌株(例如供体菌株群)的步骤。预传代步骤(或多于一个预传代步骤)可能是有利的，因为这可以增加递送至培养宿主的病毒粒子群中存在的序列变体数目。
[0054]
可以使用标准方法从细胞培养基或尿囊液中浓缩和纯化供体菌株。在一些实施方案中，所述方法包括在培养宿主与供体菌株接触之前纯化供体菌株的步骤。例如，纯化过程可涉及使用蔗糖梯度溶液或亲和色谱法进行离心。在一个实施方案中，供体菌株通过过滤和/或离心纯化。在一个实施方案中，纯化供体菌株的步骤包括过滤步骤，接着是离心步骤。例如，包含供体菌株的培养基或尿囊液可通过0.45μm过滤器过滤，随后通过离心纯化，例如使用离心过滤装置以大约1400x g离心1小时。在纯化之后，供体菌株可以悬浮在缓冲液(例如pbs)中，这允许将纯化的供体菌株储存和运输，之后用于本发明的方法。
[0055]
辅助病毒用于早期反向遗传学技术中以促进流感基因区段从表达构建体中的表达(例如，通过提供诸如rna依赖性rna聚合酶(rdrp)或其它涉及病毒基因组复制的蛋白质的组分)。通常，这些早期反向遗传学系统使用核糖核蛋白复合物形式的表达构建体，其包含病毒区段编码rna、纯化的rna依赖性rna聚合酶蛋白和病毒核蛋白组分。这些蛋白质组分将复制rna编码的病毒区段所需的机制递送到培养宿主。核糖核蛋白复合物(rdrp和np)的蛋白质组分在与病毒区段编码rna进行体外组装之前需要从流感病毒中纯化。除了用rnp组分转染培养宿主外，有效产生病毒还需要辅助病毒。然而，通常不打算将辅助病毒的组分掺入在这些反向遗传学技术中产生的重配病毒中。反向遗传学系统中使用的表达构建体的后续开发意味着rnp和辅助病毒成分都不是必需的，因为后来的表达构建体可以提供产生病毒颗粒所需的所有组分。
[0056]
在本发明的方法中与培养宿主接触的亲本流感病毒株不是辅助病毒，因为打算将涉及病毒基因组复制的亲本流感病毒株的组分掺入通过本发明的方法产生的重配流感病毒中。因此，在一些实施方案中，本发明的方法无辅助病毒。
[0057]
表达构建体
[0058]
在本发明的方法中，将包含一个或多个流感基因的一个或多个表达构建体引入培养宿主中。可以使用引入来自已知反向遗传学技术的表达构建体的任何方法将所述一个或多个表达构建体引入细胞培养物中。
[0059]
本发明的方法不需要使用外源添加的rnp，因此不需要与所述一个或多个表达构建体一起提供另外的病毒rna指导的rna聚合酶蛋白和病毒核蛋白。因此，在本发明的上下文中，核糖核蛋白复合物(例如，与纯化的rna依赖性rna聚合酶蛋白和病毒核蛋白复合的病毒区段编码rna)不是表达构建体。根据本发明的表达构建体不含rnp。将一个或多个表达构建体引入培养宿主中的步骤包括将一个或多个表达构建体递送到培养宿主中，而不用核糖核蛋白复合物接触或转染培养宿主(例如，不同时或单独地用rnp复合物接触或转染培养宿主)。
[0060]
在本发明的上下文中，流感病毒粒子不是表达构建体。这意味着使培养宿主与流感菌株接触并不等于将一个或多个表达构建体引入培养宿主中。换言之，将一个或多个表达构建体引入培养宿主中的步骤包括经由不用流感病毒粒子接触或感染培养宿主的方式将一个或多个表达构建体递送到培养宿主中。这与经典重配不同，其中所有流感基因都通
过亲本流感病毒株的感染递送到培养宿主。
[0061]
用于本发明的表达构建体通常是重组或合成的核酸构建体，其可能已经在体外组装(例如使用本领域技术人员已知的重组技术)。使用一个或多个表达构建体意味着可以精确操纵流感基因的序列，其方式是通过流感病毒感染提供必要的流感基因是不可能的(经典重组方法就是这样)。
[0062]
适合用于本发明方法的表达构建体可以是单向或双向表达构建体。由于流感病毒需要蛋白质才具有感染性，因此通常优选使用双向表达构建体，因为这减少了宿主细胞所需的表达构建体的总数。因此，本发明的方法可以利用至少一种双向表达构建体，其中至少一个基因或cdna位于上游pol ii启动子与下游非内源pol i启动子之间。基因或cdna从pol ii启动子转录产生可以翻译成蛋白质的加帽正义病毒mrna，而从非内源pol i启动子转录产生负义vrna。双向表达构建体可以是双向表达载体。
[0063]
双向表达构建体含有至少两个启动子，它们驱动在不同方向(即5'至3'和3'至5')从同一构建体的表达。这两个启动子可以可操作地连接到同一双链dna的不同链上。优选地，启动子之一是pol i启动子并且至少一个其它启动子是pol ii启动子。这是有用的，因为pol i启动子可用于表达未加帽的vrna，而pol ii启动子可用于转录mrna，该mrna随后可翻译成蛋白质，从而允许从同一构建体同时表达rna和蛋白质。在表达系统内使用多于一个表达构建体的情况下，启动子可以是内源性和非内源性启动子的混合物。
[0064]
表达构建体中使用的pol i和pol ii启动子对于与宿主细胞来源相同的分类目的生物体而言可以是内源的。可替代地，启动子可以源自与宿主细胞不同分类目的生物体。术语“目”是指常规的分类排名，并且目的实例有灵长目、啮齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和黑猩猩属于同一分类目(灵长目)，但人和狗属于不同的目(灵长目与食肉目)。例如，人pol i启动子可用于在犬类细胞(例如mdck细胞)中表达病毒区段[9]。
[0065]
表达构建体通常将包括rna转录终止序列。终止序列可以是内源性终止序列或不是宿主细胞内源性的终止序列。合适的终止序列对本领域技术人员来说将是显而易见的并且包括但不限于rna聚合酶i转录终止序列、rna聚合酶ii转录终止序列和核酶。此外，表达构建体可以含有mrna的一个或多个多聚腺苷酸化信号，特别是在其表达受pol ii启动子控制的基因的末端。
[0066]
表达构建体可以是载体，诸如质粒或其它附加型构建体。此类载体通常将包含至少一个细菌和/或真核复制起点。此外，载体可以包含允许在原核和/或真核细胞中进行选择的选择标志物。此类选择标志物的实例是赋予抗生素(诸如氨苄青霉素或卡那霉素)抗性的基因。载体还可包含一个或多个多克隆位点以促进dna序列的克隆。
[0067]
表达构建体可以是线性表达构建体。此类线性表达构建体通常将不含任何扩增和/或选择序列。然而，包含此类扩增和/或选择序列的线性构建体也在本发明的范围内。参考文献6描述了线性表达构建体，它描述了每个病毒区段的单独的线性表达构建体。也可以在同一线性表达构建体上包括多于一个，例如两个、三个、四个、五个或六个病毒区段。例如，在参考文献6中已经描述了此类系统。
[0068]
可以使用本领域已知的方法生成表达构建体。例如，在参考文献10中描述了此类方法。在表达构建体是线性表达构建体的情况下，可以在表达构建体引入宿主细胞之前利用单限制酶位点将其线性化。可替代地，可以使用至少两个限制酶位点从载体中切除表达
构建体。此外，还可以通过使用核酸扩增技术(例如通过pcr)对其进行扩增来获得线性表达构建体。
[0069]
本发明方法中使用的表达构建体可以是非细菌表达构建体。这意味着该构建体可以驱动其中编码的病毒rna区段在真核细胞中的表达，但它不包括构建体在细菌中繁殖所需的组分。因此，该构建体将不包括细菌复制起点(ori)，并且通常将不包括细菌选择标志物(例如抗生素抗性标志物)。此类表达构建体在参考文献7中进行了描述。
[0070]
表达构建体可以通过化学合成制备。表达构建体可以整体或部分通过化学合成制备。通过化学合成制备表达构建体的合适方法例如在参考文献7中有描述。因此，在某些实施方案中，表达构建体可以包含合成核酸序列。在一些实施方案中，表达构建体可以包含合成dna序列。在一些实施方案中，表达构建体可以包含合成rna序列。
[0071]
可以使用本领域技术人员已知的任何技术将本发明方法中使用的表达构建体引入宿主细胞。例如，可以通过采用电穿孔、deae-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、显微注射或微粒轰击将本发明的表达构建体引入宿主细胞中。
[0072]
在一些实施方案中，表达构建体可以是裸核酸的形式。裸核酸可以已经从流感病毒中纯化。在另一个实施方案中，表达构建体可以是转录rna的形式。在其它实施方案中，表达构建体可以是一种或多种穿梭载体的形式。穿梭载体的实例包括非流感病毒和复制子，例如基于甲病毒的复制子。
[0073]
可以操纵表达构建体的核苷酸序列，这允许控制本发明方法中产生的重配病毒中存在的流感区段的序列。因此，由表达构建体编码的流感ha可以具有如同在野生型病毒中发现的天然ha，或具有经修饰的ha。例如，已知修饰ha以去除导致病毒具有高致病性的决定簇(例如ha1/ha2裂解位点周围的超碱性区域)。在一些实施方案中，修饰ha以去除多元裂解位点。在某些此类实施方案中，ha来自h5或h7流感菌株并且不包含多碱基裂解位点。类似地，由表达构建体编码的流感na可以具有如同在野生型病毒中发现的na，或具有经修饰的na。例如，如果疫苗菌株na包含预先存在的神经氨酸酶抑制剂抗性突变，则可以修饰na以赋予对抗病毒神经氨酸酶抑制剂的敏感性。将流感基因(例如，ha或na基因)引入培养宿主的表达构建体上允许序列在引入培养宿主之前进行修饰。
[0074]
也可以操纵ha和/或na序列以产生含有来自一种以上流感菌株的序列的嵌合ha或嵌合na序列。例如，嵌合ha或嵌合na可以含有来自一种菌株的ha或na的细胞质部分或细胞质和跨膜部分，以及来自不同菌株的ha或na的至少细胞外抗原部分。该方法先前已被描述为在未修饰的ha和/或na区段可能以低产率产生的情况下产生含有ha或na的抗原部分的流感病毒的技术。然而，本发明的方法可以避免对使用嵌合ha和/或嵌合na区段的需要，因为通过流感病毒株感染递送至培养宿主的病毒粒子群中存在的序列变体可以为有效产生包含非嵌合ha和/或非嵌合na的重配病毒提供足够的变异。
[0075]
因此，在一些实施方案中，ha序列是非嵌合ha序列。换言之，ha序列包含来自同一流感菌株的细胞质、跨膜和细胞外结构域。在一些实施方案中，na序列是非嵌合na序列。换言之，na序列包含来自同一流感菌株的细胞质、跨膜和细胞外结构域。在某些此类实施方案中，虽然ha序列和/或na序列是非嵌合序列，但它可以包含如本文所述的其它修饰。例如，可以修饰非嵌合ha序列以去除导致病毒具有高致病性的决定簇(例如ha1/ha2裂解位点周围的超碱性区域)。类似地，如果疫苗菌株na包含预先存在的神经氨酸酶抑制剂抗性突变，则
可以修饰非嵌合na序列以赋予对抗病毒神经氨酸酶抑制剂的敏感性。
[0076]
在本发明的方法中可以控制递送至培养宿主的流感基因的数目。在某些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过七个流感基因。提供不超过七个流感基因是有利的，因为这意味着提供给培养宿主的流感基因比经典重配更少(其中八个区段由第二流感病毒株提供)，所以减少了通过所述方法生成的重配病毒中存在的基因群比率的数目。通过进一步限制流感基因的数目，通过该方法生成的重配病毒中可存在的基因群比率也受到限制。因此，在某些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过六个流感基因。在其它实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过五个流感基因。在其它实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过四个流感基因。
[0077]
当设法最大化具有特定基因群比率的重配病毒的产量时，提供较少的流感基因可特别有利。例如，当所述一个或多个表达构建体包含不超过单个ha基因和单个na基因时，产生7:1和6:2病毒的可能性增加。这是因为培养宿主中存在的用于产生重配病毒的唯一骨架区段来自供体菌株。因此，在优选的实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过两个流感基因。在某些此类实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含一个ha基因和一个na基因。
[0078]
在一些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过三个流感基因。在这些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含一个ha基因、一个na基因和一个骨架基因。骨架基因选自：pb2、pb1、pa、np、m和ns。优选地，骨架基因是pb1。将具有ha和na基因的单个骨架区段引入培养宿主允许产生5:3重配病毒。在这些实施方案中，针对来自供体菌株的相应骨架区段的负向选择可以优选使用抑制骨架区段转录和/或翻译的剂进行。在某些实施方案中，使用rnai剂。使用抑制转录和/或翻译的剂是有利的，因为与ha和na相比，骨架区段较少暴露在流感病毒粒子的表面上，因此不太适合使用一种或多种抗体对于或针对骨架区段进行选择。
[0079]
在一些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含不超过单个流感基因。在某些此类实施方案中，单个流感基因是第二ha基因。本发明的这个方面在期望从供体菌株产生具有na基因的重配病毒的情形下是有用的。使用包含不超过单个ha基因的一个或多个表达构建体会增加7:1重配病毒的产生，因为培养宿主中仅存在单个第二ha基因。在其它实施方案中，单个流感基因是第二na基因。本发明的这个方面在期望从供体菌株产生具有ha基因的重配病毒的情形下是有用的。使用包含不超过单个na基因的一个或多个表达构建体会增加7:1重配病毒的产生，因为培养宿主中仅存在单个第二na基因。当设法产生重配乙型流感病毒时，本发明的这些实施方案可特别有用，因为具有期望特征的重配乙型流感病毒可含有亲本乙型流感菌株的na区段。
[0080]
在某些实施方案中，在培养宿主与供体菌株接触的同时将所述一个或多个表达构建体引入培养宿主中。在培养宿主与供体菌株接触的同时将所述一个或多个表达构建体引入培养宿主中也可以被描述为共同递送。发明人已经发现同时的表达构建体递送和供体菌株感染增强了重配流感病毒的产生。在本发明的上下文中，同时意指在5分钟内。因此，使培养宿主与供体菌株接触，接着在最多5分钟后将所述一个或多个表达构建体引入培养宿主中被认为是同时递送。
[0081]
在一个实施方案中，所述一个或多个表达构建体的共同递送和使培养宿主与供体
菌株接触包括表达构建体和纯化的供体菌株的共同转染。在某些此类实施方案中，所述一个或多个表达构建体与纯化的亲本流感菌株混合并使用本领域技术人员已知的任何转染方法递送至宿主细胞。合适的转染方法包括电穿孔、deae-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、显微注射、微粒轰击或其它转染试剂。
[0082]
在其它实施方案中，在培养宿主与供体菌株接触之前将所述一个或多个表达构建体引入培养宿主中。在某些实施方案中，在培养宿主与供体菌株接触之后将所述一个或多个表达构建体引入培养宿主中。在某些实施方案中，接触培养宿主与引入所述一个或多个表达构建体之间的时间差不超过10、20、30、40、50、60、90、120或180分钟。在其它实施方案中，接触培养宿主与引入所述一个或多个表达构建体之间的时间差不超过3、4、5、6、8、10、12、18或24小时。在某些实施方案中，接触培养宿主与引入所述一个或多个表达构建体之间的时间差为1-3小时。在共同递送不实际的情况下，此类交错递送可能是有利的。
[0083]
引入培养宿主中的所述一个或多个表达构建体可以含有甲型流感病毒ha亚型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16。它们可含有甲型流感病毒na亚型n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8或n9。引入培养宿主中的所述一个或多个表达构建体可包含来自季节性流感菌株的一个或多个流感基因。在这些实施方案中，所述一个或多个表达构建体可以例如含有具有h1或h3亚型的ha。在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含来自疫苗菌株的流感基因，该疫苗菌株是h1n1或h3n2菌株。
[0084]
重配病毒的产生、选择和分离
[0085]
通过培养已经与供体菌株接触并且其中已经引入包含第二ha基因或第二na基因的表达构建体的培养宿主而产生的重配病毒，包含来自供体菌株的流感基因和由所述一个或多个表达构建体编码的第二ha基因或第二na基因。在优选的实施方案中，通过培养已经与供体菌株接触并且其中已经引入包含第二ha基因和第二na基因的表达构建体的培养宿主而产生的重配病毒，包含来自供体菌株的流感基因和由所述一个或多个表达构建体编码的第二ha基因和第二na基因。在其它实施方案中，通过培养已经与供体菌株接触并且其中已经引入包含第二ha基因、第二na基因和第二骨架基因(即pb1、pb2、pa、m、ns或np基因)的表达构建体的培养宿主而产生的重配病毒，包含来自供体菌株的流感基因、由所述一个或多个表达构建体编码的第二ha基因、第二na基因和第二骨架基因。
[0086]
本发明的方法还进一步包括选择步骤以增强包含第二ha基因(即疫苗菌株的ha基因)的重配病毒的产生。该选择步骤可以包括增强对包含源自疫苗菌株的ha(第二ha基因)的重配病毒的选择的任何方法。在一些实施方案中，该选择步骤在培养宿主以便产生重配流感病毒之后进行。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：(i)使培养宿主与包含第一血凝素(ha)基因和第一神经氨酸酶(na)基因的亲本流感病毒株接触；(ii)向所述培养宿主中引入包含一个或多个流感基因的一个或多个表达构建体，其中所述流感基因包含第二ha基因或第二na基因；(iii)培养所述培养宿主以便产生重配病毒；并且随后，在重配病毒已经产生之后，(iv)选择包含所述第二ha基因或所述第二na基因的重配病毒。
[0087]
在一些实施方案中，所述方法包括在选择步骤之前从培养宿主中分离重配病毒的步骤。例如，在某些实施方案中，将包含重配病毒的细胞培养上清液与培养宿主分离，并对包含重配病毒的上清液进行选择步骤。
[0088]
在一些实施方案中，该选择步骤可以包括针对包含来自供体菌株的ha的重配病毒
的负向选择。在一些实施方案中，该选择步骤可以包括对于包含来自疫苗菌株的ha的重配病毒的正向选择。在一些实施方案中，该选择步骤包括一个或多个负向选择步骤和一个或多个正向选择步骤。在其它实施方案中，该选择步骤包括一个或多个负向选择步骤，但不包括正向选择步骤。在其它实施方案中，该选择步骤包括一个或多个正向选择步骤，但不包括负向选择步骤。一个或多个负向选择步骤可用于增强包含源自疫苗菌株的ha的重配病毒的产生。类似地，一个或多个负向选择步骤可用于增强包含源自疫苗菌株的ha的重配病毒的产生。
[0089]
负向和/或正向选择步骤也可用于增强包含来自疫苗菌株的其它区段的重配病毒的产生。在某些实施方案中，该选择步骤增强对包含源自疫苗菌株的na(第二na基因)的重配病毒的选择。在优选实施方案中，该选择步骤增强对包含来自疫苗菌株的ha和na的重配株的选择。在其它实施方案中，该选择步骤增强对包含来自疫苗菌株的pb1、pb2、pa、m、ns或np区段的重配病毒的选择。在优选实施方案中，该选择步骤增强对包含疫苗菌株的ha、na和选自pb1、pb2、pa、m、ns或np区段的骨架区段的重配病毒的选择。
[0090]
在一些实施方案中，负向选择包括使培养宿主与一种或多种针对第一ha蛋白的抗体接触。在一些实施方案中，负向选择包括使已经从培养宿主分离的重配病毒与一种或多种针对第一ha蛋白的抗体接触。在某些实施方案中，负向选择包括使包含通过所述方法产生的重配病毒的细胞培养上清液与一种或多种针对第一ha蛋白的抗体接触。在某些实施方案中，所述抗体存在于针对第一ha蛋白的抗血清中。在其它实施方案中，在负向选择步骤中使用针对第一ha蛋白的一种或多种单克隆抗体。
[0091]
负向选择还可以包括将培养宿主暴露于抑制剂，所述抑制剂相对于疫苗菌株的ha基因或蛋白优先降低供体菌株的ha基因或蛋白的转录和/或翻译。在转录或翻译水平上优先降低供体菌株的ha基因或蛋白水平有利于形成包含疫苗菌株ha的重配流感病毒，因为疫苗菌株的ha基因将被并入和繁殖的可能性随着它们的相对丰度增加而增加。合适的抑制剂将是技术人员来说已知的并且在别处有描述[11]。在某些实施方案中，优先降低供体菌株的ha基因或蛋白的转录和/或翻译的抑制剂选自短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微rna(mirna)、短发夹rna(shrna)或小干扰dna(sidna)，例如硫代磷酸酯寡聚体(pso)或二氨基磷酸吗啉寡聚体(pmo)。在某些实施方案中，使用一种以上优先降低供体菌株的ha基因或蛋白的转录和/或翻译的抑制剂。
[0092]
在一些实施方案中，所述方法不包括将培养宿主暴露于抑制剂，所述抑制剂相对于疫苗菌株的ha基因或蛋白优先降低供体菌株的ha基因或蛋白的转录和/或翻译。
[0093]
在优选实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含第二ha基因和第二na基因。在一些实施方案中，选择步骤可包括使培养宿主与一种或多种针对第一ha蛋白的抗体和/或一种或多种针对第一na蛋白的抗体接触。在特别优选的实施方案中，所述抗体存在于针对第一ha和/或na蛋白的抗血清中。在其它实施方案中，在负向选择步骤中使用针对第一ha蛋白的一种或多种单克隆抗体和/或针对第一na蛋白的一种或多种单克隆抗体。
[0094]
在某些实施方案中，所述一个或多个表达构建体包含第二pb1、pb2、pa、m、ns或np基因。在这些实施方案中，由疫苗菌株向培养宿主提供附加骨架区段(即pb1、pb2、pa、m、ns或np区段)。此类实施方案可以包括针对供体菌株的第一pb1、pb2、pa、m、ns或np基因的负向选择步骤，以便增强含有第二pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段的重配病毒的产生。优选使用
相对于疫苗菌株的pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段优先降低供体菌株的pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段的转录和/或翻译的抑制剂进行负向选择。这是因为由骨架区段编码的蛋白质不像ha和na蛋白那样容易被流感病毒粒子表面的抗体接近，所以抑制骨架区段的翻译或转录作为负向选择步骤比暴露于一种或多种抗体更有效。然而，将培养宿主暴露于一种或多种针对第二pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段的抗体可以替代地或另外地用作负向选择步骤。在一些实施方案中，所述方法不包括将培养宿主暴露于抑制剂，所述抑制剂相对于疫苗菌株的pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段优先降低供体菌株的pb1、pb2、pa、m、ns或np基因区段的转录和/或翻译。
[0095]
在一些实施方案中，正向选择步骤包括使培养宿主与一种或多种对第二ha蛋白有特异性的抗体接触。在一些实施方案中，正向选择步骤包括使已经从培养宿主分离的重配病毒与一种或多种对第二ha蛋白有特异性的抗体接触。在某些实施方案中，正向选择包括使包含通过所述方法产生的重配病毒的细胞培养上清液与一种或多种对第二ha蛋白有特异性的抗体接触。这样，可以从培养宿主中正相关选择出包含第二ha基因的重配病毒。在优选的实施方案中，用于正向选择的一种或多种抗体经标记(例如，经磁珠标记)。标记有助于后续分离包含第二ha基因的重配病毒。
[0096]
本发明的方法可以包括一个或多个选择步骤。例如，重配病毒可以在抗血清的存在下多次传代。进行多个选择步骤以增强对包含第二ha基因的重配流感病毒的选择。在优选实施方案中，进行多个选择步骤以增强对包含第二ha基因的重配流感病毒的选择。在某些实施方案中，所述方法包括两个、三个、四个、五个或六个负向选择步骤。在优选实施方案中，所述方法包括两个负向选择步骤。在其它优选实施方案中，所述方法包括三个负向选择步骤。
[0097]
在本发明的方法中使用一个或多个表达构建体意味着当所有流感基因区段均由亲本流感病毒菌株提供时，培养宿主包含的不需要的序列变体或准种比经典重配中存在的更少。因此，所述方法通常需要更少的选择步骤来产生所需的重配病毒。更少的选择步骤意味着重配病毒可以比在经典重配中更快地产生。因此，在一个实施方案中，所述方法包括不超过单个选择步骤。在另一实施方案中，所述方法包括不超过两个选择步骤。在再一实施方案中，所述方法包括不超过三个选择步骤。选择步骤可以同时(即，在相同时间)或依序(即一个接一个)进行。
[0098]
可以使用选择步骤来选择具有特定基因群比率的病毒。例如，仅对于或针对单个基因的选择步骤可用于增加7:1病毒的产量。在某些实施方案中，负向选择是针对单个流感区段。在某些实施方案中，负向选择是针对单独的ha基因。在其它实施方案中，负向选择是针对单独的na基因。类似地，当设法增加6:2重配病毒的产生时，负向选择是针对两个流感区段。在这些实施方案中，选择通常是针对来自供体菌株的ha和na区段的负向选择。
[0099]
在一些实施方案中，选择步骤在所述方法的第一步骤中使用的相同培养宿主中进行。在其它实施方案中，选择步骤在不同的培养宿主中进行。在这些实施方案中，将在所述方法的步骤(iii)中产生的病毒从第一培养宿主转移到第二培养宿主，在第二培养宿主中进行一个或多个负向选择步骤。第一培养宿主和第二培养宿主可以相同或不同。在一个实施方案中，第一培养宿主是细胞并且第二培养宿主是含胚鸡卵。
[0100]
本发明的方法产生重配病毒库，可从中分离特定类别的重配病毒。这提供了比反
向遗传学所提供的更大的选择病毒的某些特性的能力，因为在反向遗传学技术中产生的变体更少且病毒多样性更低。特定重配流感病毒的分离意味着可以选择具有有利特性的重配病毒用于进一步加工。例如，可以分离具有高生长特性并且包含循环流感菌株的ha和na的重配病毒用作疫苗制造中的种病毒。因此，本发明的方法还可包括分离包含第二ha基因和第二na基因的重配流感病毒的步骤。
[0101]
在某些实施方案中，该方法产生重配甲型流感病毒或具有甲型流感ha的重配病毒。在一些实施方案中，该方法产生重配甲型流感病毒或具有甲型流感ha和na的重配病毒。对疫苗种病毒的分析揭示，95％的甲型流感种病毒具有6:2或5:3的基因群比率。本发明的方法因此在生成甲型流感种病毒方面特别有效，因为该方法提供有限数目的骨架区段，从而增加了生成6:2或5:3重配病毒的可能性。
[0102]
通过本发明的方法产生的重配流感病毒可以含有甲型流感病毒ha亚型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16。它们可以含有甲型流感病毒na亚型n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8或n9。在本发明的重配流感病毒中使用的疫苗菌株是季节性流感菌株的情况下，该疫苗菌株可以具有h1或h3亚型。在本发明的一个方面，该疫苗菌株是h1n1或h3n2菌株。
[0103]
在其它实施方案中，所述方法生成重配乙型流感病毒或具有乙型流感ha的重配病毒。在一些实施方案中，所述方法产生重配乙型流感病毒或具有乙型流感ha和na的重配病毒。乙型流感病毒中的基因群比率具有更大的变化并且更难以预测。本发明的方法是有利的，因为它们提供了对重配乙型流感病毒的基因群比率的改良控制。通过本发明的方法产生的重配流感病毒可以含有乙型流感病菌株的ha区段。
[0104]
在某些实施方案中，本发明的方法用于产生基于大流行菌株或潜在大流行菌株的重配流感病毒。在某些实施方案中，重配病毒包含来自大流行菌株或潜在大流行菌株的ha。流感菌株有可能导致大流行爆发的特征是：(a)与目前流行的人类菌株，即在人类群体中已经超过十年不明显的菌株(例如h2)，或先前完全未在人类群体中见过的菌株(例如h5、h6或h9，通常仅在鸟类群体中发现过)中的血凝素相比，它含有一种新的血凝素，使得人类群体对该菌株的血凝素将是免疫原始的；(b)它能够在人类群体中水平传播；以及(c)它对人类具有致病性。在某些实施方案中，本发明的方法产生包含h5血凝素类型的重配流感病毒。在疫苗中使用重配病毒以免疫大流行性流感，诸如h5n1菌株的情况下，h5血凝素类型是优选的。其它可能的菌株包括h5n3、h9n2、h2n2、h7n1和h7n7，以及任何其它新出现的潜在大流行菌株。本发明适于产生用于疫苗中的重配病毒，以防止可以或已经从非人类动物群体传播到人类的潜在大流行病菌株，诸如猪源h1n1流感菌株。
[0105]
培养宿主
[0106]
用于本发明方法的培养宿主可以是含胚鸡卵或细胞。在一个优选的实施方案中，培养宿主是细胞培养物。
[0107]
流感病毒生长的一种方法使用不含特定病原体(spf)的含胚鸡卵，将病毒接种到卵内容物(尿囊液)中，使其生长并进行纯化。流感病毒也可以在动物细胞培养物中生长，并且出于复制准确性、速度和患者过敏的原因，这种生长方法是优选的。如果使用基于卵的病毒生长，则可以将一种或多种氨基酸与病毒一起引入卵的尿囊液中[42]。
[0108]
当使用细胞时，本发明通常将使用细胞系，但是例如原代细胞也可以作为替代物。
细胞通常将是哺乳动物的。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类动物(包括人和猴)和狗细胞。可以使用各种细胞类型，诸如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的实例是名称为bhk21或hkcc的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴细胞，诸如vero细胞系中的肾细胞[12-14]。合适的狗细胞是例如肾细胞，如在cldk和mdck细胞系中。因此合适的细胞系包括但不限于：mdck；cho；293t；bhk；vero；mrc-5；per.c6；wi-38等。用于使流感病毒生长的优选哺乳动物细胞系包括：mdck细胞[15-18]，其源自madin darby犬肾；vero细胞[12-14]，其源自非洲绿猴(黑长尾猴(cercopithecus aethiops))的肾；或per.c6细胞[19]，其源自人胚胎视网膜母细胞。这些细胞系可广泛获得，例如可从美国模式细胞培养物(american type cell culture，atcc)保藏中心[20]、coriell细胞库[21]或欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)获得。例如，atcc提供目录号为ccl-81、ccl-81.2、crl-1586和crl-1587的各种不同的vero细胞并提供目录号为ccl-34的mdck细胞。per.c6可从ecacc以保藏号96022940获得。作为哺乳动物细胞系的不太优选的替代物，病毒可以在禽类细胞系[例如参考文献22-24]上生长，包括源自鸭(例如鸭视网膜)或母鸡(例如鸡胚成纤维细胞(cef))的细胞系等。实例包括禽胚胎干细胞[22,25]，包括源自鸡胚胎干细胞的ebx细胞系eb45、eb14和eb14-074[26]。eb66是优选的细胞系。
[0109]
用于本发明的特别优选的细胞源自madin darby犬肾的mdck细胞[15-1618]。原始mdck细胞可从atcc作为ccl-34获得。也可以使用mdck细胞的衍生物。例如，参考文献15公开了一种适合在悬浮培养中生长的mdck细胞系(
‘
mdck 33016’，保藏为dsm acc 2219)。类似地，参考文献27公开了在无血清培养物中悬浮生长的mdck来源的细胞系(
‘
b-702’，保藏为ferm bp-7449)。参考文献28公开了非致瘤性mdck细胞，包括'mdck-s'(atcc pta-6500)、'mdck-sf101'(atcc pta-6501)、'mdck-sf102'(atcc pta-6502)和'mdck-sf103'(pta-6503)。参考文献29公开了对感染高度敏感的mdck细胞系，包括
‘
mdck.5f1’细胞(atcc crl-12042)。可以使用这些mdck细胞系中的任何细胞系。
[0110]
为了在细胞系上，诸如在mdck细胞上生长，病毒可以在悬浮[15,30,31]或贴壁培养的细胞上生长。一种优选的用于悬浮培养的mdck细胞系是mdck 33016(保藏为dsm acc 2219)。作为替代方案，可以使用微载体培养。
[0111]
支持流感病毒复制的细胞系优选在无血清培养基和/或无蛋白质培养基中生长。如果培养基不含来自人或动物来源的血清的添加剂，则在本发明的上下文中将培养基称为无血清培养基。无蛋白理解为意指在其中发生细胞增殖，而不包括蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可以任选地包括蛋白质，诸如胰蛋白酶或病毒生长可能必需的其它蛋白酶的培养物。在此类培养物中生长的细胞本身天然含有蛋白质。
[0112]
支持流感病毒复制的细胞系优选在低于37℃[33](例如30-36℃，或在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)，例如在病毒复制期间生长。
[0113]
在病毒在细胞系上生长的情况下，则生长培养物以及还有用于开始培养的病毒接种物优选不含以下病毒(即将检测以下病毒污染并给出以下病毒污染的阴性结果)：单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、sars冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双rna病毒、圆环病毒和/或细小病毒[32]。
[0114]
在病毒已在哺乳动物细胞系上生长的情况下，则组合物将有利地不含卵蛋白(例如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡dna，从而降低变应原性。避免过敏原对最小化th2响应有
用。在本发明的方法中使用细胞作为培养宿主的情况下，已知细胞培养条件(例如温度、细胞密度、ph值等)在易受所采用的细胞系和流感病菌株影响的广泛范围内是可变的并且可以适应应用的要求。因此，以下信息仅代表指导方针。
[0115]
细胞的增殖可以根据本领域技术人员已知的方法进行。例如，可以使用离心或过滤等普通支持方法在灌注系统中培育细胞。而且，细胞可以根据本发明在感染前在补料分批系统中增殖。在本发明的上下文中，培养系统称为分批补料系统，其中细胞最初在分批系统中培养并且培养基中营养物(或部分营养物)的消耗通过浓缩营养物受控补料来补偿。在感染前的细胞增殖期间将培养基的ph值调节到ph 6.6至ph 7.8之间的值且尤其是ph 7.2至ph 7.3之间的值是有利的。细胞培养优选在30至40℃的温度下进行。在流感病毒感染后，细胞优选在30℃至36℃或32℃至34℃或约33℃的温度下培养。这是特别优选的，因为已经证实在该温度范围内孵育受感染的细胞会产生病毒，当配制成疫苗时，该病毒会引起效力提高[33]。
[0116]
氧分压可以在感染之前在培养期间调节，优选在25％至95％之间的值且尤其是在35％至60％之间的值。本发明上下文中陈述的氧分压值基于空气的饱和度。细胞感染在分批系统中以优选约8-25x105个细胞/ml的细胞密度或在灌注系统中以优选约5-20x106个细胞/ml的细胞密度发生。可以用10-8
至10之间，优选0.0001至0.5之间的病毒剂量(moi值，“感染复数”；对应于感染时每个细胞的病毒单位数)感染细胞。
[0117]
根据本发明的方法可以包括收获和分离病毒或由病毒产生的蛋白质。在病毒或蛋白质的分离期间，通过分离、过滤或超滤等标准方法将细胞从培养基中分离出来。然后根据本领域技术人员已知的方法，如梯度离心、过滤、沉淀、色谱法等来浓缩病毒或蛋白质，然后纯化。优选在纯化期间或纯化后灭活病毒。病毒灭活可以发生在纯化过程中的任何时候，例如，通过β-丙内酯或甲醛灭活。
[0118]
宿主细胞dna
[0119]
在病毒已分离和/或在细胞系上生长的情况下，标准做法是将最终疫苗中残留细胞系dna的量减到最少，以便将dna的任何潜在致癌活性减到最低。
[0120]
因此根据本发明制备的疫苗组合物优选含有少于10ng(优选少于1ng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞dna，但是可存在痕量的宿主细胞dna。
[0121]
优选任何残留宿主细胞dna的平均长度小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。
[0122]
污染dna可以在疫苗制备过程中使用标准纯化程序例如色谱法等去除。残留宿主细胞dna的去除可以通过核酸酶处理，例如通过使用dna酶增强。参考文献34和35中公开了一种减少宿主细胞dna污染的便利方法，包括两步处理，首先使用可在病毒生长期间使用的dna酶(例如benzonase)，然后使用可在病毒粒子破坏期间使用的阳离子洗涤剂(例如ctab)。用烷化剂(诸如β-丙内酯)处理也可用于去除宿主细胞dna，也可有利地用于灭活病毒粒子[36]。
[0123]
疫苗
[0124]
本发明利用根据所述方法产生的病毒来产生疫苗。流感疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可以基于完整病毒粒子、“分裂”病毒粒子或纯化的表面抗原。抗原也可以以病毒粒子的形式呈现。本发明可用于制造任何这些类型的疫苗。
[0125]
在使用灭活流感病毒的情况下，疫苗可包含完整病毒粒子、分裂病毒粒子或纯化的表面抗原(包括血凝素，并且通常还包括神经氨酸酶)。用于灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧酸富勒烯(c60)、二元乙胺、乙酰乙烯亚胺或它们的组合。病毒灭活的非化学方法是本领域已知的，例如uv光或γ辐射。
[0126]
可以通过各种方法从含病毒的液体例如尿囊液或细胞培养上清液中收获病毒粒子。例如，纯化过程可涉及使用线性蔗糖梯度溶液(其任选地包括破坏病毒粒子的洗涤剂)或亲和色谱法进行区带离心。然后可以在任选稀释后通过渗滤纯化抗原。
[0127]
通过用洗涤剂(例如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三正丁酯、triton x-100、triton n101、十六烷基三甲基溴化铵、tergitol np9等)处理纯化的病毒粒子以获得亚病毒粒子制剂，包括
‘
吐温-醚’分裂过程，获得分裂病毒粒子。例如，分裂流感病毒的方法是本领域众所周知的，例如参见参考文献37-42等。病毒的分裂通常通过用破坏浓度的分裂剂破坏或片段化完整病毒(无论是感染性的还是非感染性的)来进行。破坏导致病毒蛋白完全或部分溶解，从而改变病毒的完整性。优选的分裂剂是非离子和离子(例如阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、n,n-二烷基-葡糖胺、hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、np9、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)、磷酸三正丁酯、cetavlon、肉豆蔻基三甲基铵盐、lipofectin、脂转染胺(lipofectamine)和dot-ma、辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如triton表面活性剂，诸如triton x-100或triton n101)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的分裂程序使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且分裂可以发生在初始病毒粒子纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此分裂过程可以涉及澄清含病毒粒子的物质(以去除非病毒粒子物质)、浓缩收获的病毒粒子(例如使用吸附方法，诸如cahpo4吸附)、将完整病毒粒子与非病毒粒子物质分离、在密度梯度离心步骤中使用分裂剂分裂病毒粒子(例如使用含有分裂剂诸如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。分裂病毒粒子可以有用地重新悬浮在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。分裂流感疫苗的实例是begrivac
tm
、fluarix
tm
、fluzone
tm
和flushield
tm
产品。
[0128]
纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，并且通常还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域众所周知的。fluvirin
tm
、agrippal
tm
和influvac
tm
产品是流感亚单位疫苗。
[0129]
另一种形式的灭活抗原是病毒体[43](无核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可以通过用洗涤剂溶解病毒，接着去除核衣壳并重构含有病毒糖蛋白的膜来制备。制备病毒体的替代方法涉及将病毒膜糖蛋白添加到过量的磷脂中，以得到在其膜中具有病毒蛋白的脂质体。
[0130]
本发明的方法也可用于产生活疫苗。此类疫苗通常是通过从含有病毒粒子的流体中纯化病毒粒子来制备的。例如，流体可以通过离心澄清，并用缓冲液(例如含有蔗糖、磷酸钾和谷氨酸一钠)稳定。目前可获得各种形式的流感病毒疫苗(例如，参见参考文献44的第17章和第18章)。活病毒疫苗包括medimmune的flumist
tm
产品(三价活病毒疫苗)。
[0131]
该病毒可以减毒。该病毒可以是温度敏感的。该病毒可为冷适应性。当使用活病毒
作为抗原时，这三个特征特别有用。
[0132]
ha是当前灭活流感疫苗中的主要免疫原，并且疫苗剂量通过参考ha水平标准化，通常通过srid测量。现有疫苗通常每个菌株含有约15μg的ha，但是可以使用较低剂量，例如用于儿童，或在大流行情形下，或在使用佐剂时。已使用分数剂量，诸如1/2(即每个菌株7.5μg ha)、1/4和1/8，也具有更高的剂量(例如3x或9x剂量[45,46])。因此，疫苗可以包括每个流感菌株0.1至150μg的ha，优选0.1至50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如每个菌株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等。
[0133]
对于活疫苗，剂量是通过中位组织培养感染剂量(tcid50)而不是ha含量来测量的，并且每个菌株的tcid50在106至108之间(优选在10
6.5-10
7.5
之间)是典型的。
[0134]
本发明的组合物除了适于针对大流行间期菌株进行免疫外，还可用于针对大流行或潜在大流行菌株进行免疫。本发明适于对人类以及非人类动物进行疫苗接种。
[0135]
其抗原可以有用地包含在组合物中的其它菌株是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥司他韦(oseltamivir)[47]和/或扎那米韦(zanamivir)有抗性)的菌株，包括抗性大流行菌株[48]。
[0136]
本发明的组合物(例如根据本发明产生的疫苗)可以包括来自一种或多种(例如1、2、3、4种或更多种)流感病菌株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。在疫苗包括一种以上的流感菌株的情况下，不同的菌株可以分开生长并在收获病毒和制备抗原后混合。因此本发明的方法可以包括混合来自多于一种流感菌株的抗原的步骤。三价疫苗是典型的，包括来自两种甲型流感病菌株和一种乙型流感病菌株的抗原。四价疫苗也是有用的[49]，包括来自两种甲型流感病菌株和两种乙型流感病菌株，或三种甲型流感病菌株和一种乙型流感病菌株的抗原。
[0137]
药物组合物
[0138]
根据本发明制造的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常包括除抗原之外的组分，例如它们通常包括一种或多种药物载剂和/或赋形剂。“药学上可接受的载剂”包括本身不诱导对接受该组合物的个体有害的抗体产生的任何载剂。合适的载剂通常是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。此类载剂是本领域普通技术人员众所周知的。所述组合物还可以含有药学上可接受的稀释剂，诸如水、盐水、甘油等。另外，可存在辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、ph缓冲物质等。无菌无热原、磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载剂(有关此类组分的透彻讨论在参考文献50中可获得)。如下所述，还可以包括佐剂。
[0139]
疫苗组合物通常呈水性形式。然而，一些疫苗可以呈干燥形式，例如呈可注射固体形式或贴片上的干燥或聚合制剂形式。疫苗组合物可以包括防腐剂，诸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选疫苗应基本上不含(即小于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[41,51]。更优选不含汞的疫苗。可以包括α-生育酚琥珀酸酯作为汞化合物的替代物[41]。特别优选不含防腐剂的疫苗。
[0140]
为了控制张力，优选包括生理盐，诸如钠盐。氯化钠(nacl)是优选的，可以1至20mg/ml存在。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0141]
疫苗组合物通常将具有在200-400mosm/kg之间，优选在240-360mosm/kg之间的摩
尔渗透压浓度，并且将更优选落在290-310mosm/kg的范围内。先前已经报道称摩尔渗透压浓度对疫苗接种引起的疼痛没有影响[52]，但仍优选将摩尔渗透压浓度保持在该范围内。
[0142]
疫苗组合物可以包括一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。通常将包含在5-20mm范围内的缓冲液。
[0143]
疫苗组合物的ph通常将在5.0至8.1之间，且更通常在6.0至8.0之间，例如6.5至7.5，或7.0至7.8之间。因此本发明的方法可以包括在包装之前调节散装疫苗的ph的步骤。
[0144]
疫苗组合物优选是无菌的。疫苗组合物优选是无热原的，例如每剂含有《1eu(内毒素单位，标准量度)，并且优选地每剂含有《0.1eu。疫苗组合物优选是无麸质的。
[0145]
本发明的疫苗组合物可以包括洗涤剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(称为
‘
吐温’)、辛基酚聚醚(诸如辛基酚聚醚-9(triton x-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(
‘
ctab’)或脱氧胆酸钠，尤其是对于分裂或表面抗原疫苗而言。洗涤剂可仅以痕量存在。因此该疫苗可包含各小于1mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。其它痕量的残留成分可为抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素b)。
[0146]
疫苗组合物可以包括用于单次免疫的物质，或者可以包括用于多次免疫的物质(即
‘
多剂量’试剂盒)。在多剂量布置中优选包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或附加)，所述组合物可以容纳在具有用于去除物质的无菌适配器的容器中。
[0147]
流感疫苗通常以约0.5ml的剂量体积施用，但是可以向儿童施用半剂量(即约0.25ml)。
[0148]
组合物和试剂盒优选储存在2℃至8℃之间。它们不应冷冻。理想情况下，它们应避免阳光直射。
[0149]
佐剂
[0150]
本发明的组合物(例如根据本发明产生的疫苗)可以有利地包括佐剂，其可以起到增强在接受该组合物的受试者中引发的免疫响应(体液响应和/或细胞响应)的作用。
[0151]
佐剂优选是水包油乳化佐剂，因为已经证实它们对流感抗原作用良好。
[0152]
水包油乳化佐剂
[0153]
已发现水包油乳液特别适合用于作为流感病毒疫苗的佐剂。各种此类乳液是已知的，并且它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，并且甚至可能具有亚微米直径，这些小尺寸通过微流化器实现，以提供稳定的乳液。平均尺寸小于220nm的液滴是优选的，因为它们可以经受过滤灭菌。
[0154]
在优选的实施方案中，水包油乳液是均匀的。均匀乳液的特征在于分散在其中的大部分液滴(颗粒)在指定的尺寸范围内(例如，直径)。合适的指定尺寸范围可以是，例如，50-220nm之间、50-180nm之间、80-180nm之间、100-175nm之间、120-185nm之间、130-190nm之间、135-175nm之间、150-175nm之间。在一些实施方案中，均匀乳液含有≤10％的在指定直径范围以外的液滴(颗粒)数目。在一些实施方案中，如通过动态光散射测量的，水包油乳液制剂中油滴的平均粒径在135-175nm之间，例如155nm
±
20nm，并且如通过光学颗粒传感测量的，此类制剂含有不超过1x107个大颗粒/ml制剂。如本文所用，“大颗粒”意指直径＞1.2μm，通常在1.2-400μm之间的那些颗粒。在优选的实施方案中，均匀乳液含有小于10％、
小于5％或小于3％的落在优选尺寸范围外的液滴。在一些实施方案中，水包油乳液制剂中颗粒的平均液滴尺寸在125-185nm之间，例如约130nm、约140nm、约150nm、约155nm、约160nm、约170nm或约180nm，并且水包油乳液是均匀的，因为制剂中小于5％的液滴数目落在125-185nm范围外。
[0155]
本发明可以与油，诸如来自动物(诸如鱼)或植物来源的油一起使用。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最常可获得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油就是坚果油的例证。可以使用例如从荷荷巴豆获得的荷荷巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物类中，玉米油是最容易获得的，但是也可以使用其它谷类粮食诸如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草、黑小麦等的油。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种子油中，但可以从坚果和种子油开始通过适当物质的水解、分离和酯化来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可以用于本发明的实践中。从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它手段的程序是本领域众所周知的。大多数鱼含有可以容易地回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)是本文可用的几种鱼油的例证。许多支链油通过生物化学方法以5-碳异戊二烯单元合成并且通常称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，这是本文特别优选的。角鲨烷，角鲨烯的饱和类似物，也是优选的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，容易从商业来源获得或者可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。
[0156]
表面活性剂可按其
‘
hlb’(亲水/亲油平衡)进行分类。本发明的优选表面活性剂具有至少10，优选至少15，更优选至少16的hlb。本发明可与表面活性剂一起使用，所述表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，尤其是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以dowfax
tm
商品名销售的环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，诸如线性eo/po嵌段共聚物；重复乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)基团的数目可以变化的辛基酚聚醚，其中辛基酚聚醚-9(triton x-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)特别受关注；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(igepal ca-630/np-40)；磷脂诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂基醚(brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为span)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子表面活性剂。包含在乳液中的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、span 85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和triton x-100。
[0157]
可以使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/span 85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛基酚聚醚诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(triton x-100)的组合也合适。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9(laureth 9)加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛基酚聚醚。
[0158]
表面活性剂的优选量(重量％)是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(诸如吐温80)0.01-1％，尤其是约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(诸如triton x-100，或triton系列的其它洗涤剂)0.001至0.1％，尤其是0.005至0.02％；聚氧乙烯醚(诸如月桂醇聚醚9)0.1至20％，优选0.1至10％且尤其是0.1至1％或约0.5％。
[0159]
最优选的水包油乳液是水包角鲨烯乳液，优选亚微米水包角鲨烯乳液。
[0160]
可用于本发明的具体水包油乳液包括但不限于以下，其中优选含角鲨烯的乳液：
[0161]
角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。该乳液可以在水相中包含柠檬酸根离子，例如10mm柠檬酸钠缓冲液。该乳液可包含3.2-4.6mg/ml角鲨烯、4.1-5.3mg/ml聚山梨醇酯80和4.1-5.3mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯。按体积计，该乳液的组成可以是约4.6％的角鲨烯、约0.45％的聚山梨醇酯80和约0.5％的脱水山梨糖醇三油酸酯。称为“mf59”的佐剂[53,54,55]在参考文献56的第10章和参考文献57的第12章中有更详细的描述。角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯可以9750:1175:1175的重量比存在。约39mg/ml角鲨烯、约4.7mg/ml聚山梨醇酯80和约4.7mg/ml脱水山梨糖醇三油酸酯的浓度是典型的。在155-185nm之间的z平均液滴尺寸是优选的，多分散性《0.2。
[0162]
一种乳液，包含角鲨烯、生育酚(尤其是dl-α-生育酚)和聚山梨醇酯80。该乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。这些乳液可具有按体积计2至10％的角鲨烯、2至10％的生育酚和0.3至3％的聚山梨醇酯80，并且角鲨烯:生育酚的重量比优选《1(例如，0.90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以以约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯80)可以以1068:1186:485或大约55:61:25的重量比存在。一种此类乳液(“as03”)包括4.3重量％的角鲨烯、4.8重量％的生育酚和2重量％的聚山梨醇酯80。约42.7mg/ml角鲨烯、约47.4mg/ml dl-α-生育酚和约19.4mg/ml聚山梨醇酯80的浓度是典型的。在140-170nm之间的z平均液滴尺寸是优选的。该乳液还可以包括3-去-o-酰化单磷酰基脂质a(3d mpl)。这种类型的另一种有用的乳液可以每个人类剂量例如按以上讨论的比率包含0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨醇酯80[58]。
[0163]
一种乳液，包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂基醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如，脱水山梨糖醇酯或甘露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或
‘
span 80’)。该乳液优选是热致可逆的和/或具有至少90％的油滴(按体积计)，油滴尺寸小于200nm[59]。该乳液还可以包含以下的一种或多种：醛醇；冷冻保护剂(例如糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基多苷。乳液可以包含tlr4激动剂[60]。此类乳液可以冻干。优选的乳液包含角鲨烯、脱水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯鲸蜡硬脂醚和甘露醇(例如，32.5％的角鲨烯、4.82％的脱水山梨糖醇油酸酯、6.18％的聚氧乙烯鲸蜡硬脂醚和6％的甘露醇；重量％)，平均液滴尺寸在150nm以下。约49.6mg/ml角鲨烯、约7.6mg/ml脱水山梨糖醇油酸酯和约9.6mg/ml聚氧乙烯鲸蜡硬脂醚和9.2mg/ml甘露醇的浓度是典型的。
[0164]
一种乳液，包含角鲨烯、磷脂酰胆碱、泊洛沙姆188、甘油和磷酸铵缓冲液[61]，任选地还包含α-生育酚('se')。
[0165]
角鲨烯、生育酚和triton洗涤剂(例如triton x-100)的乳液。该乳液还可以包含3d-mpl(参见下文)。该乳液可以含有磷酸盐缓冲液。
[0166]
一种乳液，包含聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、triton洗涤剂(例如，triton x-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)。该乳液可以以约75:11:10的质量比包含这三种组分(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80、110μg/ml triton x-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，并且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可以包含角鲨烯。水相可以含有磷酸盐缓冲液。
[0167]
角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(“pluronic
tm l121”)的乳液。该乳液可以在
ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水中配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送媒介物，并且已与苏氨酰-mdp一起在“saf-1”佐剂[62](0.05-1％thr-mdp、5％角鲨烷、2.5％pluronic l121和0.2％聚山梨醇酯80)中使用。它也可以在没有thr-mdp的情况下使用，如在“af”佐剂[63](5％角鲨烷、1.25％pluronic l121和0.2％聚山梨醇酯80)中使用。优选微流化。
[0168]
角鲨烯、泊洛沙姆105和abil-care的乳液[64]。这些组分在含佐剂的疫苗中的最终浓度(重量)为5％角鲨烯、4％泊洛沙姆105(普朗尼克多元醇)和2％abil-care 85(bis-peg/ppg-16/16peg/ppg-16/16二甲聚硅氧烷)；辛酸/癸酸甘油三酯。
[0169]
一种乳液，含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂。如参考文献65中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。
[0170]
一种非代谢油(诸如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(诸如卵磷脂、吐温80或span80)的亚微米水包油乳液。可以包含添加剂，诸如quila皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体缀合物(诸如参考文献66中描述的gpi-0100，通过经由葡萄糖醛酸的羧基将脂肪胺加成到脱酰基皂苷上而生成)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或n,n-双十八烷基-n,n-双(2-羟乙基)丙二胺。
[0171]
一种乳液，其中皂苷(例如，quila或qs21)和甾醇(例如，胆固醇)缔合为螺旋胶束[67]。
[0172]
一种乳液，包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)[68]。
[0173]
为了制备注射用疫苗，这些乳液通常将与水性免疫原制剂混合。这种混合通常涉及1:1体积比的水性形式的乳液与水性形式的免疫原，在这种情况下乳液组分的比例将在最终疫苗中减半。例如，可以将含5体积％角鲨烯的乳液与抗原溶液以1:1的比率混合以得到最终浓度为2.5体积％的疫苗。当然，其它混合比也是可以的，例如使用在5:1至1:5之间的两种液体的体积比混合。因此在疫苗组合物中，上述乳液组分的浓度可以通过稀释(例如，按整数倍稀释，诸如稀释2或3倍)来修改，其中它们的比率保持相同。例如，儿科疫苗可以含有较低浓度的佐剂，例如按体积计4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的角鲨烯。
[0174]
抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常会保留在水溶液中，但是本身可以分布在油/水界面周围。一般来说，几乎没有血凝素会进入乳液的油相。
[0175]
在组合物包含生育酚的情况下，可以使用任何α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚，但优选α-生育酚。生育酚可以采取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。d-α-生育酚和dl-α-生育酚均可使用。生育酚有利地包含在用于老年患者(例如，60岁或以上)的疫苗中，因为据报道维生素e对该患者组的免疫响应具有积极作用[69]。它们还具有抗氧化特性，抗氧化特性可有助于稳定乳液[70]。优选的α-生育酚是dl-α-生育酚并且该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。已发现琥珀酸盐在体内与tnf相关配体协同作用。而且，已知琥珀酸α-生育酚与流感疫苗相容并且是一种作为汞化合物的替代物的有用防腐剂[41]。特别优选不含防腐剂的疫苗。
[0176]
疫苗组合物的包装
[0177]
用于本发明组合物(或试剂盒组分)的合适容器包括小瓶、注射器(例如一次性注射器)、鼻喷雾器等。这些容器应该是无菌的。
[0178]
在组合物/组分位于小瓶中的情况下，小瓶优选地由玻璃或塑料材料制成。优选在将组合物添加到其中之前对小瓶进行灭菌。为了避免乳胶敏感患者出现问题，小瓶优选用不含乳胶的塞子密封，并且优选在所有包装材料中都不存在乳胶。小瓶可以包括单剂疫苗，或者它可以包括多于一剂(“多剂”小瓶)，例如10剂。优选的小瓶由无色玻璃制成。
[0179]
小瓶可以具有适合的帽(例如鲁尔锁)，使得预填充的注射器可以插入帽中，注射器的内容物可以排出到小瓶中(例如以重构其中的冻干物质)，并且可以将小瓶的内容物移回注射器中。在从小瓶中取出注射器后，然后可以附接针头并且可以将组合物施用于患者。帽优选地位于密封件或盖内，使得在可以接触帽之前必须移除密封件或盖。小瓶可具有容许无菌取出其内容物的帽，特别是对于多剂量小瓶而言。
[0180]
在将组分包装到注射器中的情况下，该注射器可以有针头与之附接。如果未附接针头，可以为注射器提供单独的针头以供组装和使用。此类针头可以有护套。安全针头是优选的。1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头是典型的。注射器可带有可剥离标签，标签上可打印内容物的批号、流感季节和有效期，以利于记录保存。注射器中的柱塞优选地具有塞子以防止柱塞在抽吸期间被意外移除。注射器可以具有乳胶橡胶帽和/或柱塞。一次性注射器含有单剂疫苗。注射器通常有一个尖端帽，以在附接针头之前密封尖端，并且尖端帽优选地由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装备有丁基橡胶罩。优选的注射器是以商品名“tip-lok”tm
销售的那些。
[0181]
容器可以有标记以显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。
[0182]
在使用玻璃容器(例如注射器或小瓶)的情况下，则优选使用由硼硅酸盐玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。
[0183]
试剂盒或组合物可以与传单一起包装(例如包装在同一个盒子中)，传单包括疫苗的详细信息，例如施用说明书、疫苗内抗原的详细信息等。说明书还可以含有警告，例如保持肾上腺素溶液在接种疫苗后发生过敏反应等情况下随时可用。
[0184]
疫苗的治疗和施用方法
[0185]
本发明提供了根据本发明制造的疫苗。这些疫苗组合物适合施用于人或非人类动物受试者，诸如猪，并且本发明提供了在受试者中产生免疫响应的方法，其包括将本发明的疫苗组合物施用于受试者的步骤。本发明还提供了用作药物的本发明的组合物，并且提供了本发明的组合物制备用于在受试者中产生免疫响应的药物的用途。
[0186]
通过这些方法和用途产生的免疫响应通常将包括抗体响应，优选保护性抗体响应。在流感病毒疫苗接种后评估抗体响应、中和能力和保护作用的方法是本领域众所周知的。人体研究已经证实针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用相关(约30-40的血清样品血凝抑制滴度产生约50％的保护作用，以免受同源病毒感染)[71]。抗体响应通常通过血凝抑制、微量中和、单向免疫扩散(srid)和/或单扩散溶血(srh)来测量。这些测定技术在本领域中是众所周知的。
[0187]
本发明的组合物可以各种方式施用。最优选的免疫途径是肌肉注射(例如臂部或腿部)，但其它可用途径包括皮下注射、鼻内[72-74]、口服[75]、皮内[76,77]、透皮、经皮[78]等。
[0188]
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。目前建议流感疫苗从6月龄开始
用于儿童和成人免疫接种。因此人类受试者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的优选受试者是老年人(例如≥50岁，≥60岁，并且优选≥65岁)、年轻人(例如≤5岁)、住院受试者、医疗保健工作者、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者、免疫缺陷受试者、在接受疫苗前7天内服用过抗病毒化合物(例如奥司他韦或扎那米韦化合物；参见下文)的受试者、鸡蛋过敏的人和出国旅行的人。然而，这些疫苗并不仅仅适合这些群体，而且可以更普遍地用于群体中。对于大流行菌株，优选对所有年龄组施用。
[0189]
本发明的优选组合物满足cpmp功效标准中的1、2或3项。在成人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)gmt增加≥2.5倍。在老年人(》60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)gmt增加≥2倍。这些标准基于至少50名患者的开放标签研究。
[0190]
治疗可以通过单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初级免疫计划和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可以通过相同或不同的途径给予各种剂量，例如肠胃外初免和粘膜加强、粘膜初免和肠胃外加强等。多于一剂(通常为两剂)的施用在免疫学初治患者，例如以前从未接受过流感疫苗的人，或接种过新的ha亚型疫苗的人(如在大流行病爆发中)中特别有用。多个剂量通常将间隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用。
[0191]
通过本发明产生的疫苗可以与其它疫苗基本上同时(例如在同一医疗咨询或在保健专业人员或疫苗接种中心就诊期间)施用给患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、mmr疫苗、水痘疫苗、mmrv疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、dtp疫苗、乙型流感嗜血杆菌结合疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗(诸如四价a-c-w135-y疫苗)、呼吸道合胞病毒、肺炎球菌结合疫苗等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时施用对老年患者特别有用。
[0192]
类似地，本发明的疫苗可以与抗病毒化合物且尤其是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(例如奥司他韦和/或或扎那米韦)基本上同时(例如在同一医疗咨询或在保健专业人员就诊期间)施用给患者。这些抗病毒药包括神经氨酸酶抑制剂，诸如(3r,4r,5s)-4-乙酰氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-无水-3,4,5-三脱氧-d-甘油-d-半乳糖酮-2-烯酸，包括其酯类(例如乙酯)及其盐类(例如磷酸盐)。优选的抗病毒药是(3r,4r,5s)-4-乙酰氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯、磷酸(1:1)，也称为磷酸奥司他韦(tamiflu
tm
)。
[0193]
定义
[0194]
术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如“包含”x的组合物可以仅由x组成或者可以包括另外的东西，例如x y。
[0195]
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
[0196]
与数值x相关的术语“约”是任选的并且意指例如x
±
10％。
[0197]
实施例
[0198]
材料和方法
[0199]
除非另有说明，否则在以下实施例中使用以下材料和方法。
[0200]
细胞、病毒和抗血清
[0201]
293t细胞获自墨尔本大学(melbourne university)并维持在含有10％fbs、1 x glutamax(gibco)和1 x抗生素/抗真菌剂(gibco)的dmem中。mdck(who)细胞获自who并维持在含有10％fbs、1 x glutamax(gibco)和1 x抗生素/抗真菌剂(gibco)的dmem中。mdck33016pf细胞[79]维持在化学成分确定的培养基(lonza)中。
[0202]
a/德克萨斯/1/1977高生长亲本(hgp)病毒(与pr8的5:3重配株)获自d274(seqirus)。pr8 hgp病毒是使用反向遗传学生成的。病毒在含胚鸡卵中繁殖。
[0203]
a/pr/8/1934和a/德克萨斯/1/1977的经胰蛋白酶高碘酸盐处理的绵羊抗血清在seqirus生成。
[0204]
质粒
[0205]
使用标准分子生物学技术在phw2000载体[80]中生成含有pr8(h1n1)、a/怀俄明/3/2003(h3n2)和a/印度尼西亚/nihrd11771/2011(h5n1)的ha和na的质粒。对于h6n1，使用标准分子生物学技术生成编码h6(a/土耳其/马萨诸塞州/3740/1965)和n1(a/布里斯班/59/2007和a/加利福尼亚/07/2009)的质粒。
[0206]
hgp病毒的纯化
[0207]
在感染培养宿主之前纯化高生长亲本病毒(pr8和a/德克萨斯/1/1977)。对于每个亲本流感病毒株，将2ml受感染的尿囊液通过0.45μm过滤器过滤，并通过使用microsep 300k omega离心装置(pall)以大约1400x g离心1小时进行纯化。保留的病毒在磷酸盐缓冲盐水(pbs)-中稀释并使用新的microsep装置再次离心。使用pbs-将保留的病毒稀释到1ml，并在-80℃下以100μl等分试样冷冻。
[0208]
流感病毒基因向培养宿主的交错递送
[0209]
通过用质粒dna转染293t/mdck共同培养物，接着在转染后1-24小时用hgp感染，进行流感基因的交错递送以产生重配流感病毒。使用transit-293(mirus)、lipofectamine 2000(invitrogen)或lipofectamine 3000(invitrogen)转染试剂根据制造商的说明，用1-2μg表达病毒ha和na的质粒转染293t/mdck细胞。
[0210]
在转染后大约3小时，用pbs-洗涤细胞，并用1ml/孔的新鲜optimem替换上清液。然后用hgp感染细胞。在转染后第1天添加tpck-胰蛋白酶(1μg/ml)。在转染后第3天收集上清液。
[0211]
流感病毒基因向培养宿主的共同递送
[0212]
293t和mdck细胞(who或mdck 33016pf，悬浮或贴壁)的共同培养物用纯化的hgp病毒(10-20μl/转染(6_孔板)纯的纯化hgp病毒)连同各1-2μg编码病毒ha和na的质粒dna共同转染。根据制造商的说明使用转染试剂transit-293(mirus)、lipofectamine 2000(invitrogen)或lipofectamine 3000(invitrogen)。使用transit-293转染的细胞在转染后大约3小时进行洗涤。如先前所述，在转染后第1天，或在转染后4-8小时添加tpck-胰蛋白酶(1μg/ml)。在转染后第3-6天收集上清液。
[0213]
重配流感病毒的选择
[0214]
随后在针对hgp病毒产生的抗血清的存在下，转染上清液在卵中进行传代。简言之，对于第一次抗血清传代，用200μl/蛋的纯转染上清液接种含胚蛋，且于一小时后接种200μl/蛋的胰蛋白酶高碘酸盐处理的抗血清(针对pr8或a/德克萨斯/1/1977产生的，视情况而定)。对于第二次抗血清传代，从第一次抗血清传代收获的受感染的尿囊液根据ha滴度
稀释，并在室温下与等体积的抗血清孵育1小时，然后以200μl/卵将卵接种。对于一些转染，通过有限稀释克隆病毒。
[0215]
使用基因特异性引物(geneworks)和探针(applied biosystems或sigma)通过实时pcr确定重配株的ha和na基因型。根据制造商的说明，使用taqman rt-pcr主混合物(applied biosystems)制备反应物，并使用7500快速实时pcr系统(7500 fast real-time pcr system，applied biosystems)进行pcr。
[0216]
实施例1-h5n1(a/印度尼西亚/nihrd11771/2011)重配病毒的生成
[0217]
使用高生长亲本菌株(a/德克萨斯/1/1977)和编码a/印度尼西亚/nihrd11771/2011的ha和na基因的质粒生成h5n1重配病毒。
[0218]
293t/mdck(who)的共同培养物用编码a/印度尼西亚/nihrd11771/2011的ha和na基因的质粒转染，并随后用高生长亲本菌株感染，或者用编码ha和na的质粒和高生长亲本菌株同时共同转染(表1)。
[0219]
表1：a/印度尼西亚/nihrd11771/2011重配病毒的挽救
[0220][0221][0222]
转染后，用抗血清处理细胞培养物。在第一次抗血清传代后，两个实验都检测ha滴度，但是在高生长亲本与质粒同时递送至细胞培养物的情况下观察到更高的ha滴度。第二次抗血清传代展示同时转染，以及在用高生长亲本菌株转染之前用质粒转染细胞培养物的实验两者的病毒复制水平相似。
[0223]
通过rt-pcr进行的基因分型表明两种病毒都是重配株。
[0224]
实施例2-h1n1(a/pr/8/1934)重配病毒的生成
[0225]
使用高生长亲本菌株(a/德克萨斯/1/77)和编码a/pr/8/1934的ha和na基因的质粒生成重配h1n1病毒(a/pr/8/1934)。
[0226]
293t/mdck(who)的共同培养物用编码ha和na的质粒和hgp同时共同转染(表2)。
[0227]
表2：a/pr/8/1934重配病毒的挽救。
[0228][0229]
为确认病毒分离，进行了第三次抗血清传代，与第二次抗血清方法相同涉及病毒与抗血清的预孵育。在第三次抗血清传代之后，子代病毒的ha滴度增加到野生型a/pr/8/1934的典型水平。第三次抗血清传代后的病毒基因分型显示a/pr/8/1934的ha和na基因，证明成功生成了6:2重配株。
[0230]
实施例3-h3n1(a/怀俄明/3/2003)重配病毒的生成。
[0231]
通过使用h1n1 hgp病毒(a/pr/8/1934)和编码a/怀俄明/3/2003的ha和na基因的质粒生成重配h3n1病毒。
[0232]
293t/mdck(who)的共同培养物用编码a/怀俄明/3/2003的ha和na基因的质粒转染，并随后在转染后大约3.5小时用hgp感染，或者用编码ha和na的质粒和hgp同时共同转染(表3)。
[0233]
表3：a/怀俄明/3/2003重配病毒的挽救。
[0234][0235]
在第一次抗血清传代之后，针对交错的hgp重配株和共同递送的hgp重配株两者检测ha滴度。第二次抗血清传代展示对于两种混合重配方法而言病毒复制水平相似。通过实时pcr进行的基因分型显示两种病毒都是重配株。
[0236]
实施例4-h6n1重配病毒的生成。
[0237]
通过使用h3n2 hgp病毒(a/德克萨斯/1/1977)和编码h6(a/土耳其/马萨诸塞州/3740/1965)和n1(a/布里斯班/59/2007和a/加利福尼亚/07/2009)基因的质粒生成重配h6n1病毒。
[0238]
293t/贴壁mdck 33016pf的共同培养物用编码ha和na的质粒和hgp同时共同转染(表4)。
[0239]
表4：h6n1重配病毒的挽救。
[0240]
[0241][0242]
nd-未完成
[0243]
通过实时pcr进行的基因分型显示两种h6n1子代病毒都是重配株。
[0244]
实施例5-遗传多样性评估
[0245]
通过比较通过经典重配或反向遗传学(rg)获得的甲型流感病毒中存在的非表面流感蛋白的序列，评估在复制流感病毒产生准种的情况下可出现的遗传多样性。对来自10种rg病毒的库(最初由seqirus、cdc和nibsc挽救)的骨架基因的核酸序列进行测序，然后翻译以确定蛋白质序列。将这些序列与通过经典重配获得的16种h1n1病毒和32种h3n2病毒(由seqirus、nymc和nibsc生成的重配株)的相应序列进行比较。
[0246]
对m1、np、ns1、pa和pb2蛋白序列的分析展示，重配病毒中存在的序列变异水平高于rg挽救病毒。对于重配病毒数据集，每个数据集内的序列差异始终大于rg挽救病毒。
[0247]
每个骨架区段中的氨基酸序列变异在下表1-5中说明。指定位置处的氨基酸频率表示为每个来源分析的序列数目的百分比。图1-5中呈现了相同的数据。
[0248]
表1：m1蛋白序列变异
[0249]
[0250][0251]
表2：np氨基酸序列变异
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256][0257]
表3：ns1氨基酸序列变异
[0258]
[0259]
[0260]
[0261][0262]
表4：pa氨基酸序列变异
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267][0268]
表5：pb2氨基酸序列变异
[0269]
[0270]
[0271][0272]
这些数据说明了在存在准种的情况下当培养宿主与亲本流感病毒株接触时，递送给培养宿主的骨架基因区段的序列变异性。这些数据还说明了病毒缺乏序列变异性，其中骨架区段最初是在表达构建体上递送的，诸如用于反向遗传学技术的质粒。
[0273]
还通过评估测序的骨架基因中存在的突变数目来分析通过经典重配和反向遗传学产生的病毒中存在的序列多样性。这些分析呈现在表6-10中并且说明了通过感染流感病
毒粒子群(例如在经典重配中)将流感基因区段递送至培养宿主而产生的病毒中的骨架基因序列多样性增加。当用于本发明的杂合重配方法时，可以预期会在亲本流感病毒株的骨架基因区段中发生相对于rg重配株中的序列变异程度类似地增强。
[0274]
表6：m1序列分析
[0275][0276]
表7：np序列分析
[0277][0278]
表8：ns1序列分析
[0279][0280][0281]
表9：pa序列分析
[0282][0283]
表10：pb2序列分析
[0284][0285]
序列
[0286]
seq id no:1(pa,pr8-x)
[0287]
agcgaaagcaggtactgatccaaaatggaagattttgtgcgacaatgcttcaatccgatgattgtcgagcttgcggaaaaaacaatgaaagagtatggggaggacctgaaaatcgaaacaaacaaatttgcagcaatatgcactcacttggaagtatgcttcatgtattcagattttcacttcatcaatgagcaaggcgagtcaataatcgtagaacttggtgatccaaatgcacttttgaagcacagatttgaaataatcgagggaagagatcgcacaatggcctggacagtagtaaacagtatttgcaacactacaggggctgagaaaccaaagtttctaccagatttgtatgattacaaggagaatagatttatcgaaattggagtaacaaggagagaagttcacatatactatctggaaaaggccaataaaattaaatctgagaaaacacacatccacattttctcgttcactggggaagaaatggccacaaaggcagactacactctcgatgaagaaagcagggctaggatcaaaaccagactattcaccataagacaagaaatggccagcagaggcctctgggattcctttcgtcagtccgagagaggagaagagacaattgaagaaaggtttgaaatcacaggaacaatgcgcaagcttgccgaccaaagtctcccgccgaacttctccagccttgaaaattttagagcctatgtggatggattcgaaccgaacggctacattgagggcaagctgtctcaaatgtccaaagaagtaaatgctagaattgaaccttttttgaaaacaacaccacgaccacttagacttccgaatgggcctccctgttctcagcggtccaaattcctgctgatggatgccttaaaattaagcattgaggacccaagtcatgaaggagagggaataccgctatatgatgcaatcaaatgcatgagaacattctttggatggaaggaacccaatgttgttaaaccacacgaaaagggaataaatccaaattatcttctgtcatggaagcaagtactggcagaactgcaggacattgagaatgaggagaaaattccaaagactaaaaatatgaagaaaacaagtcagctaaagtgggcacttggtgagaacatggcaccagaaaaggtagactttgacgactgtaaagatgtaggtgatttgaagcaatatgatagtgatgaaccagaattgaggtcgcttgcaagttggattcagaatgagtttaacaaggcatgcgaactgacagattcaagctggatagagctcgatgagattggagaagatgtggctccaattgaacacattgcaagcatgagaaggaattatttcacatcagaggtgtctcactgcagagccacagaatacataatgaagggggtgtacatcaatactgccttgcttaatgcatcttgtgcagcaatggatgatttccaattaattccaatgataagcaagtgtagaactaaggagggaaggcgaaagaccaacttgtatggtttcatcataaaaggaagatcccacttaaggaatgacaccgacgtggtaaactttgtgagcatggagttttctctcactgacccaagacttgaaccacataaatgggagaagtactgtgttcttgagataggagatatgcttataagaagtgccataggccaggtttcaaggcccatgttcttgtatgtgagaacaaatggaacctcaaaaattaaaatgaaatggggaatggagatgaggcgttgcctcctccagtcacttcaacaaattgagagtatgattgaagctgagtcctctgtcaaagagaaagacatgaccaaagagttctttgagaacaaatcagaaacatggcccattggagagtcccccaaaggagtggaggaaagttccattgggaaggtctgcaggactttattagcaaagtcggtattcaacagcttgtatgcatctccacaactagaaggattttcagctgaatcaagaaaactgcttcttatcgttcaggctcttagggacaaccttgaacctgggacctttgatcttggggggctatatgaagcaattgaggagtgcctgattaatgatccctgggttttgcttaatgcttcttggttcaactccttccttacacatgcattgagttagttgtggcagtgctactatttgctatccatactgtccaaaaaagtaccttgtttctact
[0288]
seq id no:2(pb1,pr8-x)
[0289]
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[0290]
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[0291]
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[0292]
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[0294]
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[0296]
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[0298]
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[0299]
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[0300]
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[0302]
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[0304]
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[0305]
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