一种降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法

一种降低羊肉滴水损失的atg5基因的单倍型组合的筛选方法
技术领域
1.本发明涉及动物遗传育种领域，特别是一种降低羊肉滴水损失的atg5基因的单倍型组合的筛选方法。


背景技术：

2.随着人民生活水平的提高，对肉类的需求不断增加，羊肉以其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富等特点备受消费者青睐，高品质羊肉产品已成为人们饮食需求的重要组成部分，近些年消费者对羊肉的需求由吃上肉到吃好肉转变，即由量到质的转变。因此，选育具有生产高品质羊肉的品种，提高羊肉品质是当下肉羊产业的工作热点。
3.羊肉品质是一个综合性状，包含多方面的评价指标，如肌内脂肪含量、系水力、嫩度、ph值等。其中，系水力是一项重要的肉质性状，是指肌肉组织保持水分的能力。即当肌肉受到外力作用时，如加压、切碎、冷冻、加热、融冻、加工和贮存等，保持原有水分的能力。系水力主要针对肌肉中的结合水，其与肌原纤维蛋白质分子表面结合，不易解离和蒸发。系水力直接影响肉的滋味、多汁性、嫩度、色泽、营养成分及香气等食用品质。系水力高，生肉表现为多汁、鲜嫩、表面干爽，烹调后肉质嫩爽；系水力低则表面水渗出，贮藏过程中滴水损失大，肉成熟后肉质老韧。我们常用滴水损失来衡量肌肉的系水力，滴水损失大的个体系水能力差，滴水损失小的个体，系水能力优。
4.滴水损失是反映系水力的典型代表性指标，当前多数研究或应用都表现在肉质评价的过程中，滴水损失指标在肉羊选育的早期选择中很少涉及，往往被忽视，同时也没有很好的方法用于此性状的选择。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要提供一种降低羊肉滴水损失的atg5基因的单倍型组合的筛选方法。
6.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
7.一种降低羊肉滴水损失的atg5基因的单倍型组合的筛选方法，包括以下步骤：
8.s1、采集待测羊只的血液，提取待测羊只基因组dna；
9.s2、设计atg5基因引物，并使用设计的atg5基因引物对待测羊只基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物，然后对pcr扩增产物进行测序；
10.s3、将pcr扩增产物的测序结果通过dnaman、chromas软件进行比对以确定其有效突变位点，然后进行基因分型；
11.s4、根据待测羊中每个个体对应的基因型进行遗传多样性分析，计算基因频率及基因型频率，判断各个位点是否处于哈迪温伯格平衡状态，其中：基因频率表示atg5基因各突变位点的等位基因在群体中的比例，基因型频率表示atg5基因各突变位点产生的不同基因型在群体中的比例；
12.s5、针对检测到的有效突变位点，利用haploview软件进行单倍型分析，并对每一
个个体所对应的单倍型组合进行确定，选留单倍型组合h1h2的待测羊个体。
13.进一步地，所述步骤s2具体包括：
14.根据genbank中公布的绵羊atg5基因的序列信息及ensemble网站确定其外显子1的边界，利用primer premier 5.0软件设计引物，上游引物序列如seq no.1所示，下游引物序列如seq no.2所示；pcr反应体系为20μl：2
×
es taq master mix 10μl，上、下游引物各0.5μl，dna1μl，ddh2o为8μl，pcr反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸23s，从第二步开始共34个循环；72℃延伸8min；4℃保存；然后将条带明亮的pcr扩增产物进行sanger测序。
15.进一步地，所述pcr扩增产物长度为746bp。
16.进一步地，所述步骤s3具体包括：
17.将pcr扩增产物的测序结果通过dnaman软件进行比对以确定其有效突变位点，有效突变位点为：atg5基因第1外显子的s1:g61t、s2:a64g和s3:t215c等3个突变位点；随后利用chromas软件对测序峰图逐一比对确认，每个位点分别有3种基因型，分别为61bp处的gg、tt、gt；64bp处的aa、gg、ag；215bp处的tt、cc、tc。
18.进一步地，所述上游引物序列为f:5'gatggagggcttcagtattcag 3'；下游引物序列为r:5'ccctcctttttaccacacctac 3'。
19.与现有技术相比，本发明选用atg5基因的单倍型组合作为遗传标记进行早期选择，多snp位点组成的有效单倍型组合对于24小时、48小时、72小时的滴水损失均有效，相比普通的snp位点的选择具有更好的准确性和稳定性；通过发明的实施，可以在羊出生时早期选择肌肉系水力高的肉羊个体进行培育或生产，提高羊肉品质。缩短了时间间隔(常规方法需要饲养至屠宰后才可以判断)4-6个月，节省了人力、物力等经济成本。
附图说明
20.图1为atg5基因第1外显子的pcr扩增电泳图。
21.图2为野生型个体分型结果。
22.图3为突变型个体分型结果。
23.图4为突变杂合子分型结果。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
25.以49只双乾肉羊为目标进行具体实施，实施过程如下：
26.(1)实施目标
27.肉羊(公羊)49只均为同场出生，同一环境饲养。
28.(2)基因组dna提取
29.采集静脉血，edta抗凝，使用血液基因组dna快速提取试剂盒提取基因组dna，并用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，将检测合格的dna样品分装，-80℃保存。
30.(3)引物设计及合成
31.根据genbank中公布的绵羊atg5基因的序列信息(xm_012182695.3)及ensemble网
站确定其外显子边界，利用primer premier 5.0软件设计引物，引物序列为f:5'gatggagggcttcagtattcag 3'；r:5'ccctcctttttaccacacctac 3'，扩增产物长度为746bp。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
32.(4)pcr扩增
33.pcr反应体系为20μl：2
×
es taq master mix 10μl，上、下游引物各0.5μl，dna1μl,ddh2o为8μl。pcr反应程序为：95℃预变性5min,95℃变性30s,56.5℃退火30s,72℃延伸23s，从第二步开始共34个循环；72℃延伸8min；4℃保存。pcr产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将条带明亮的pcr产物送金唯智生物科技有限公司进行测序，atg5基因第1外显子的pcr扩增电泳图如图1所示。
34.pcr产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测发现，片段长度约为746bp，与预期大小一致，条带明亮无杂带符合后续试验要求(参见图1)。
35.(5)基因分型
36.49个样品的测序结果通过dnaman软件比对分析snps位点，结果在atg5基因第1外显子发现三个位点突变s1:g61t、s2:a64g和s3:t215c，用chromas软件对测序峰图逐一比对，确定每个位点的基因型：分别为61bp处的gg、tt、gt；64bp处的aa、gg、ag；215bp处的tt、cc、tc，具体结果参见图2-图4。
37.(6)atg5基因遗传多样性分析
38.由表1可知，双乾肉羊群体atg5基因第1外显子g61t、a64g、t215c位点的优势基因型分别为gg、aa、tt；优势等位基因分别为g、a、t。三个位点具有相同的基因频率和基因型频率。卡方适合性检验证明，三个位点在双乾肉羊群体中处于哈迪-温伯格平衡状态(p＞0.05)。
39.表1 atg5基因g61t、a64g和t215c位点遗传多态性分析
[0040][0041]
(7)单倍型分析
[0042]
对检测到的3个snps位点，利用haploview软件进行单倍型分析，发现s1、s2、s3位点间d’＝1、r2＝1，3个位点处于完全连锁不平衡状态，同时3个位点的等位基因有着相同的频率，3个位点组成的8种可能单倍型中仅表现为2种单倍型，分别命名为h1(gat)、h2(tgc)，单倍型频率分别为0.745、0.255。根据单倍型组成特点，对照49只待测群体分别确定每只个体对应的单倍型组合，共形成3种有效的单倍型组合：h1h1(gg aa tt)、h1h2(gt ag tc)、h2h2(tt gg cc)。
[0043]
(8)atg5基因不同单倍型组合间肉质性状差异显著性检验
[0044]
进行atg5基因不同单倍型组合间滴水损失均值的差异显著性检验，结果发现(表2)24小时、48小时的滴水损失性状均值，单倍型组合h1h2分别极显著(p《0.01)或显著(p《0.05)低于单倍型组合h1h1，并且低于单倍型组合h2h2；单倍型组合h1h2对应的72小时滴水损失性状值也低于其他两个单倍型组合。
[0045]
表2 atg5基因不同单倍型组合间滴水损失性状的差异显著性检验
[0046] h1h2(17)h2h2(4)h1h1(28)滴水损失24h/％0.74
±
0.20b0.83
±
0.25
ab
0.99
±
0.30a滴水损失48h/％1.54
±
0.47b2.17
±
1.41
ab
2.04
±
0.59a滴水损失72h/％2.51
±
0.742.77
±
0.952.93
±
0.76
[0047]
注：同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(p＜0.01)、小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
[0048]
综上，单倍型组合h1h2个体对应的滴水损失值，24小时、48小时、72小时3个时间点均为最低。滴水损失为系水力的典型评价指标，滴水损失低的个体系水力强，由此说明，单倍型组合h1h2个体具有较高的系水力，肉用品质更好。通过对影响羊肉滴水损失的atg5基因单倍型组合的检测及应用，可以早期优选系水力高的肉羊群体，提升羊肉品质，促进肉羊产业的良性发展。
[0049]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。