一种脐带间充质干细胞的制备方法与流程

1.本技术涉及脐带间充质干细胞制备技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，msc)目前广泛应用于再生医学的诸多领域。msc具有自我更新能力，增殖活跃；能分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。此外，msc还能分泌多种可溶性的生物活性物质，例如细胞因子和生长因子等，发挥抗炎症、促血管新生、抗凋亡和免疫调节等作用。
3.获得msc的来源多样，但与骨髓和脂肪组织等相对成熟的组织相比，出生时的胚胎外组织，例如脐带和胎盘的不同部位等，具有更好的前景。这些胚胎外组织易于采集，且量大，不存在伦理问题。
4.脐带间充质干细胞，就是从脐带组织分离培养获得的间充质干细胞。21世纪以来，出现了大批从脐带组织分离培养msc的方法。一些方法使用胶原酶和/或透明质酸酶、胰酶及中性蛋白酶等处理脐带的不同部位。酶的处理时间各异，有的长达16小时。此外，组织块培养法也广泛应用于脐带msc的原代培养。
5.人脐带间充质干细胞原代分离制备方法主要为组织块贴壁培养法和酶消化法。组织块培养法主要是对脐带组织块进行处理后，采用组织块进行培养获得脐带间充质干细胞，例如专利申请201811409243.5；组织块培养法经济成本低，易于开展，但是耗时长，一般需要两周以上。酶消化培养法主要是对脐带进行组织消化酶处理后，采用消化获得的悬浮液为原材料进行间充质干细胞培养，获得脐带间充质干细胞，例如专利申请201310020489.4；酶消化培养法的原代处理时间更长，消化程度不易把控，消化不够无法得到足够数量的细胞，消化时间过久则会损伤细胞，并且，存在消化液离心时不易分离出细胞的问题。
6.综上所述，尽管目前已经有很多从脐带分离培养msc的方法，但是，如何更高效地分离脐带间充质干细胞仍然是脐带间充质干细胞的研究热点。


技术实现要素：

7.本技术的目的是提供一种改进的脐带间充质干细胞的制备方法。
8.本技术采用了以下技术方案：
9.本技术公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括将获取自脐带的华通氏胶剪成不大于2mm3的组织块，采用浓度大于或等于1％的胶原酶在37℃～39℃下对华通氏胶组织块进行30-60分钟的消化，分别对消化获得的悬浮液和消化后组织块进行间充质干细胞培养，获得本技术的脐带间充质干细胞。
10.本技术创造性的采用高浓度的胶原酶，在较高温度下对华通氏胶进行快速消化，并且，分别采用消化获得的细胞悬浮液和消化后的组织块进行间充质干细胞培养，获得脐
带间充质干细胞。本技术的制备方法，不使用胰酶，减少了细胞损伤；采用高浓度的胶原酶，并提高胶原酶处理温度，减少了消化处理时间；并且，为了避免浪费，本技术还对消化后的组织块进行间充质干细胞培养。总的来说，本技术的制备方法结合组织块贴壁培养法和酶消化法的优势，能够有效且可重复的分离msc，有效提高了脐带msc的分离效率以及细胞数量，为后期基础研究和临床应用提供了保障。
11.优选的，华通氏胶采用以下方法获得，取离体的脐带，在无菌条件下去除静脉和动脉，剥离脐带外膜，即获得华通氏胶。
12.优选的，胶原酶为ii型胶原酶或iv型胶原酶。
13.优选的，胶原酶采用hanks缓冲液制备。
14.优选的，本技术的制备方法中，分别对消化获得的悬浮液和消化后组织块进行间充质干细胞培养，具体包括，消化完成后，采用缓冲液进行清洗，离心去上清液，再采用缓冲液重悬；采用网筛过滤分离缓冲液重悬的细胞悬浮液和消化后组织块；对网筛分离获得的细胞悬浮液进行离心，去上清液，采用培养基重悬后进行间充质干细胞培养；对网筛分离获得的消化后组织块，直接加入培养基进行间充质干细胞培养。
15.优选的，缓冲液为d-hanks缓冲液。
16.优选的，间充质干细胞培养采用的培养基为含有10％胎牛血清的dmem/f12培养基。
17.优选的，培养基中还含有细胞因子bfgf和egf。
18.优选的，培养基中还含有its细胞培养添加物。
19.优选的，间充质干细胞培养的条件为，在5％二氧化碳的培养箱中，室温培养24-48小时后换液，之后每2-3天换液。
20.本技术的有益效果在于：
21.本技术脐带间充质干细胞的制备方法，采用高浓度胶原酶，在较高温度下对华通氏胶进行快速消化；一方面，快速消化能够获得部分细胞悬浮液用于培养脐带间充质干细胞，并且快速消化，不仅效率高，而且对细胞的损伤也较小；另一方面，对于没有被消化下来的残留在组织块上的细胞，本技术也进行了间充质干细胞培养；因此，本技术的制备方法结合组织块贴壁培养法和酶消化法的优势，能够更高效的制备获得更多数量的脐带间充质干细胞，为脐带间充质干细胞培养提供了一种新的方法和思路。
附图说明
22.图1是本技术实施例中消化后的细胞悬液培养的间充质干细胞的显微镜观察细胞图；
23.图2是本技术实施例中消化后的组织块培养的间充质干细胞的生长曲线图；
24.图3是本技术实施例中分别采用ii型胶原酶和iv型胶原酶消化后的细胞悬液培养和组织块培养的原代细胞收获时间对比图；
25.图4是本技术实施例中ii型胶原酶消化和无消化的组织块培养的原代细胞收获时间对比图。
具体实施方式
26.本技术实施例中所有采用的试剂和设备，除特殊说明以外，都是实验室常规的试剂和设备。
27.本技术的部分技术名称解释如下：
28.hanks缓冲液，是无机盐溶液和平衡盐溶液(balanced salt solutions,bss)，简称hbss。
29.d-hanks缓冲液，是不含钙离子、镁离子和葡萄糖的hanks缓冲液。
30.下面通过具体实施例结合附图对本技术进行详细说明。以下实施例仅用于对本技术进行说明，不应理解为对本技术的限制。
31.实施例1
32.本例的脐带间充质干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
33.1)无菌条件下，75％酒精(利尔康)清洗脐带10秒，d-hanks缓冲液(biosharp)清洗3次。
34.2)无菌手术剪(新华医疗)剪去脐带两端，把脐带分为5cm的小段。
35.3)使用无菌镊子和剪刀(新华医疗)操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用d-hanks缓冲液清洗3次。
36.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
37.5)将剪碎的华通氏胶小块与1％ii型胶原酶混合，用量以ii型胶原酶溶液能够完全浸泡华通氏胶小块为准，在37℃恒温避光孵育60min，期间进行90-150rpm缓慢震荡，本例具体采用90rpm震荡，得到未消化完的组织块与消化细胞悬液；其中，1％ii型胶原酶由hanks缓冲液(hyclone)配制。
38.6)加入30ml清洗缓冲液，即d-hanks缓冲液，1700rmp离心10min。
39.7)去除上清，使用50ml的d-hanks缓冲液重悬沉淀，采用200目的细胞筛(falcon)过滤分离为未消化完的组织块与细胞悬液。
40.8)对网筛分离获得的消化后组织块加入完全培养基，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
41.9)对网筛分离获得的细胞悬浮液，1700rmp离心10min，去上清液；使用完全培养基重悬细胞沉淀，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
42.完全培养基配方：dmem/f12培养基，其中添加10％的胎牛血清，20ng/ml的bfgf，20ng/ml的egf，以及1％的its细胞培养添加物。
43.实施例2
44.本例的所有原材料、试剂和设备都与实施例1相同，唯一区别在于，步骤5)中消化孵育温度为39℃，其余都与实施例1相同，具体如下：
45.1)无菌条件下，75％酒精清洗脐带10秒，缓冲液清洗3次。
46.2)无菌手术剪剪去两端，把脐带分为5cm的小段。
47.3)使用无菌镊子和剪刀操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用缓冲液清洗3次。
48.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
49.5)将剪碎的华通氏胶小块与1％ii型胶原酶混合，在39℃恒温避光孵育60min，缓
慢震荡，得到未消化完的组织块与消化细胞悬液。
50.6)加入30ml清洗缓冲液，1700rmp离心10min。
51.7)去除上清，使用50ml缓冲液重悬沉淀，采用200目的细胞筛过滤分离为未消化组织块与细胞悬液。
52.8)对网筛分离获得的消化后组织块加入完全培养基，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
53.9)对网筛分离获得的细胞悬浮液，1700rmp离心10min，去上清液；使用完全培养基重悬细胞沉淀，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
54.实施例3
55.本例的所有原材料、试剂和设备都与实施例1基本相同，唯一区别在于，步骤5)中消化孵育采用1％的iv型胶原酶，其余都与实施例1相同，具体如下：
56.1)无菌条件下，75％酒精清洗脐带10秒，缓冲液清洗3次。
57.2)无菌手术剪剪去两端，把脐带分为5cm的小段。
58.3)使用无菌镊子和剪刀操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用缓冲液清洗3次。
59.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
60.5)将剪碎的华通氏胶小块与1％iv型胶原酶混合，在37℃恒温避光孵育60min，缓慢震荡，得到未消化完的组织块与消化细胞悬液。
61.6)加入30ml清洗缓冲液，1700rmp离心10min。
62.7)去除上清，使用50ml缓冲液重悬沉淀，采用200目的细胞筛过滤分离为未消化组织块与细胞悬液。
63.8)对网筛分离获得的消化后组织块加入完全培养基，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
64.9)对网筛分离获得的细胞悬浮液，1700rmp离心10min，去上清液；使用完全培养基重悬细胞沉淀，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
65.实施例4
66.本例的所有原材料、试剂和设备都与实施例3相同，唯一区别在于，步骤5)中消化孵育温度为39℃，其余都与实施例3相同，具体如下：
67.1)无菌条件下，75％酒精清洗脐带10秒，缓冲液清洗3次。
68.2)无菌手术剪剪去两端，把脐带分为5cm的小段。
69.3)使用无菌镊子和剪刀操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用缓冲液清洗3次。
70.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
71.5)将剪碎的华通氏胶小块与1％iv型胶原酶混合，在39℃恒温避光孵育60min，缓慢震荡，得到未消化完的组织块与消化细胞悬液。
72.6)加入30ml清洗缓冲液，1700rmp离心10min。
73.7)去除上清，使用50ml缓冲液重悬沉淀，采用200目的细胞筛过滤分离为未消化组织块与细胞悬液。
74.8)对网筛分离获得的消化后组织块加入完全培养基，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱
中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
75.9)对网筛分离获得的细胞悬浮液，1700rmp离心10min，去上清液；使用完全培养基重悬细胞沉淀，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
76.实施例5
77.高浓度胶原酶处理后有胶状物不容易过细胞筛，本例使用大体积缓冲液洗一次再过细胞筛，以改善这个过程。详细如下：
78.1)无菌条件下，75％酒精清洗脐带10秒，缓冲液清洗3次。
79.2)无菌手术剪剪去两端，把脐带分为5cm的小段。
80.3)使用无菌镊子和剪刀操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用缓冲液清洗3次。
81.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
82.5)将剪碎的华通氏胶小块与1％ii型胶原酶混合，在37℃恒温避光孵育60min，缓慢震荡，得到未消化完的组织块与消化细胞悬液。
83.6)加入30ml清洗缓冲液，采用200目的细胞筛过滤分离为未消化组织块与细胞悬液。
84.7)未消化完的组织块加入完全培养基，铺瓶，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
85.8)细胞悬液1700rmp离心10min。
86.9)使用完全培养基重悬细胞沉淀，铺瓶后在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
87.实施例6
88.本例作为对比试验，直接采用华通氏胶小块铺瓶培养，培养基实施例1相同，华通氏胶的获取也与实施例1相同，具体如下：
89.1)无菌条件下，75％酒精清洗脐带10秒，缓冲液清洗3次。
90.2)无菌手术剪剪去两端，把脐带分为5cm的小段。
91.3)使用无菌镊子和剪刀操作，去除脐带中的血液、静脉、动脉、外膜，获得华通氏胶，使用缓冲液清洗3次。
92.4)将华通氏胶剪成2mm3大小的小块。
93.5)将剪碎的华通氏胶小块铺瓶。
94.6)37℃放置2小时。
95.7)加入完全培养基，在5％二氧化碳培养箱中培养，培养2天后换液，之后每2-3天换液。
96.分别对以上实施例获得的间充质干细胞进行检测和对比分析，具体如下：
97.分别对实施例1消化后细胞悬液培养第2天和第4天的细胞进行显微镜观察，结果如图1所示。图1中，左图为培养第2天的细胞图，右图是培养第4天的细胞图。图1的结果显示，实施例1顺利培养出了所需的间充质干细胞。
98.对实施例4脐带(5cm)消化后组织块培养的msc进行生长曲线测试，结果如图2所示。图2的结果显示，1％的iv型胶原酶39℃处理1小时后的组织块培养能获得大量msc，该方法可行、且细胞产量高。
99.对比分析实施例2和实施例4获得的间充质干细胞的原代细胞收获时间，结果如图3所示。图3的结果显示，39℃胶原酶消化后组织块法比胶原酶消化后细胞悬液培养法原代收获的提前时间；实施例2中，ii型胶原酶消化后组织块法比细胞悬液培养法提前2.40
±
1.34天获得原代细胞；实施例4中，iv型胶原酶消化后组织块法比细胞悬液培养法提前0.25
±
0.50天获得原代细胞。由此可见，在获得原代细胞时间上ii型胶原酶消化后组织块法比iv型胶原酶处理快(p《0.05)。
100.对比分析实施例1和实施例2的ii型胶原酶消化后组织块培养法比实施例6的无消化组织块培养法的原代细胞收获时间，结果如图4所示。图4的结果显示，实施例1和实施例2的ii型胶原酶消化后组织块培养法比实施例6的无消化组织块培养法提前收获时间；且如图所示，39℃处理提前3.25
±
2.87天，比37℃处理提前0.33
±
1.5，p《0.01；说明39℃处理能更早获得原代细胞。
101.以上内容是结合具体实施方式对本技术所作的详细说明，不能认定本技术的实现方式只局限于这些说明。对于本技术技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术基本发明构思的前提下，还可以进行若干简单推演或替换。