靶向GD2的嵌合受体及其用途的制作方法

靶向gd2的嵌合受体及其用途
技术领域
1.本公开涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及表达包含dap12和共刺激信号分子信号域的靶向gd2的嵌合受体、其免疫效应细胞、包含其的组合物、其制备方法及用途。


背景技术：

2.双唾液酸神经节苷脂(gd2，pubchem:6450346)是一种含唾液酸的鞘糖脂，主要在细胞表面上表达，其在神经外胚层起源的肿瘤(包括神经母细胞瘤和黑素瘤)中丰富存在的，而在正常组织中的表达高度受限。gd2在神经母细胞瘤(neuroblastoma)上密集，同质且几乎普遍表达的。在正常组织中，gd2的表达很大程度上限制在皮肤黑色素细胞，和外周疼痛纤维髓鞘。在cns中，gd2似乎是胚胎抗原，但发现在分散的少突胶质细胞中和在垂体后叶中暗淡地表达。这使得gd2非常适合用于靶向抗肿瘤疗法。
3.近年来，尽管放疗、化疗及手术治疗等常规肿瘤治疗方法可以起到一定的治疗效果，但肿瘤的转移、复发及患者生存率低等问题仍未得到妥善解决。随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。其中，嵌合抗原受体t细胞(car-t)技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。
4.目前国内外car结构设计主要包括传统的二代、三代car。二代car为scfv-41bb-cd3ζ或scfv-cd28-cd3ζ，三代car为scfv-41bb-cd28-cd3ζ或scfv-cd28-41bb-cd3ζ，目前临床应用最多的是传统二代car，且在血液瘤中疗效显著。
5.cn107580628a公开了用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞，其中采用了dap12/kirs2作为car结构的胞内信号域。然而，由于缺乏共刺激信号分子，导致其存在可持续性不佳的技术问题，实验中与肿瘤细胞共培养时，dap12/kirs2 car-t的il-2分泌量很低，且在临床治疗中导致治疗无效。
6.因此，需要新的策略以增强临床疗效，以实现car-t细胞治疗的潜力最大化。


技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的问题，本公开将共刺激信号分子4-1bb和抗gd2的单链抗体引入到dap12/kirs2中，形成了新的抗gd2抗原的car结构gd2-dap12/kirs2-4-1bb，并且验证了基于该car结构的体外药效学(杀伤，细胞因子分泌，增殖等)，证明了该car结构对gd2表达阳性的实体瘤细胞具有有效的杀伤作用。
8.因此，在一方面，本公开提供了一种靶向gd2的嵌合抗原受体。
9.在一方面，本公开提供了编码如前述嵌合抗原受体的核酸。
10.在一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。
11.在一方面，本公开提供了包含前述载体的细胞。
12.在一方面，本公开提供了包含前述嵌合抗原受体、其核酸和/或细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。
13.在一方面，本公开提供了将前述核酸或载体导入免疫效应细胞制备细胞方法。
14.在一方面，本公开提供了前述嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病或病症的药物中的用途。
15.在一方面，本公开提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。
16.在一方面，本公开提供了一种治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。
附图说明
17.图1示出了gd2-dap12/kirs2 car结构设计。
18.图2示出了两种car-t细胞的扩增和体积变化。
19.图3示出了两种car-t的阳性率。
20.图4示出了两种car-t细胞分化亚型检测结果。
21.图5示出了car-t细胞及ntd对靶细胞裂解率。
22.图6示出了两种car-t细胞il-2和ifn-γ检测结果。
23.图7示出了car-t增殖流式检测结果。
具体实施方式
24.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
25.如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
[0026]“嵌合抗原受体”或“car”，如该术语在本文所用，是指与来自例如t细胞或nk细胞的细胞免疫功能受体或衔接分子共享结构和功能特性的嵌合多肽。在实施方案中，car包含结合同源抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在结合同源抗原后，car可以活化或失活其所处的细胞毒性细胞，或调节细胞的抗肿瘤活性或调节细胞的免疫应答。
[0027]
本文所用的术语“抗体”是指来源于与靶抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是来源于天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以是多克隆或单克隆，多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以来自天然来源或来自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本文所述的抗体分子可以多种形式存在，其中抗体的抗原结合部分表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdab)，单链抗体(scfv)和人源化或人抗体，例如，如本文所述。
[0028]
就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序
列。
[0029]
序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性(参见，例如：computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university pres,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；and sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(carrillo,h.&lipman,d.,siam j applied math 48:1073(1988))。
[0030]“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。
[0031]
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(cdrs；即cdr1、cdr2和cdr3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为构架(fr)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个fr区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个cdrs连接起来，cdrs形成环，所述环连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的cdrs通常被fr区在邻近连接起来，并且借助于来自其它链的cdr，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成(参看kabat等人sequences of proteins of immunological interest,nationalinstitute of health,bethesda,md(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个cdr可具有特异结合关联表位的能力。
[0032]
术语抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参
见，例如，methods in molecular biology，vol 207:recombinant antibodies for cancer therapy methods and protocols(2003)；chapter 1；p 3-25,kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10
7-108m-1的ka)抗原的抗体。“功能片段”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段
″
含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等等。“fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(v
h-v
l
二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdrs相互作用，以确定v
h-v
l
二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个cdrs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的cdrs的fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
[0033]
术语“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(smith et al.(2004)j.clin.pathol.57,912-917；和nelson et al.,j clin pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化b细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如ebv的病毒感染b细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
[0034]
术语全长抗体是具有两条全长重链(例如vh-ch1-ch2-ch3或vh-ch1-ch2-ch3-ch4)和两条全长轻链(vl-cl)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌b细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
[0035]
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
[0036]“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(cdr)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的cdr残基置换。
[0037]
此外，在人源化中，还可能对vh和/或vl的cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如pcr介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，cdr内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖cdr内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
[0038]
术语“cdr”指互补决定区(complementarity-determining region)，已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个cdr。cdr也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可
变区中，在cdr的一级结构中具有非常高的变异性位点。本说明书中，重链的cdr由来自重链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示，轻链的cdr由来自轻链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示。这些位点在三级结构中彼此临近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。
[0039]
术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0040]
术语关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1
×
107m-1
或1x108m-1
或更大的亲和常数ka(或者1x10-7
m或1
×
10-8
m或更低的解离常数(kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(spr)(rich and myszka(2000)curr.opin.biotechnol 11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，paul,ed.,fundamental immunology,2nd ed.,raven press,new york,pages332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性spr和itc方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，biacore 2000,biacore ab,upsala,sweden and ge healthcare life sciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)。
[0041]
术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括dna分子及rna分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cdna。
[0042]
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cdna分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
[0043]
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
[0044]
亦提供本文所述序列表中所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及pcr介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列表中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带
电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见brummell et al.,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi et al.,protein eng.12(10):879-884(1999)；burks et al.,proc.natl.acad.sci.usa 94:412-417(1997))。
[0045]
术语“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过elisa定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，lowry蛋白测定以及bradford蛋白测定。
[0046]
术语“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于cho细胞、各种cos细胞、hela细胞、hek细胞例如hek 293细胞。
[0047]
术语“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
[0048]
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
[0049]
术语“表达载体”包括能够表达dna的载体，所述dna与诸如启动子区的能够影响这类dna片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒dna，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组dna或rna构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆dna的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
[0050]
术语“刺激”指的是通过刺激分子(例如，tcr/cd3复合体)与其同源配体结合，从而介导信号转导事件的初次应答，诸如，但由不限于，经tcr/cd3复合体的信号转导。刺激可介导某些分子的改变的表达，例如tgf-β的下调，和/或细胞骨架结构的重组等。
[0051]
术语“刺激性分子”是指由t细胞表达的提供一级细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于t细胞信号传导途径的至少一些方面的tcr复合体的一级活化。在一个方面，一级信号是通过例如tcr/cd3复合体与负载有肽的mhc分子的结合启动，并且其导致介导t细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的
一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。特别地用于本发明的含有itam的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(也称作“icos”)、fcεri、cd66d、dap10和dap12。在本发明的特异性car中，在本发明的任一个或更多个car中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列。
[0052]
术语“抗原呈递细胞”或“apc”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(mhc的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，b-细胞、树突细胞等)。t-细胞可以使用其t-细胞受体(tcr)识别这些复合体。apc加工抗原且将其呈递给t-细胞。
[0053]
术语“胞内信号传导结构域”，是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以产生促进含car细胞(例如car-t细胞或表达car的nk细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的实例(例如在car-t细胞或表达car的nk细胞中)包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，细胞内信号结构域转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，此类截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0054]
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括一级胞内信号传导结构域。示例性的一级胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在表达car的免疫效应细胞，例如car-t细胞或表达car的nk细胞的情况下，一级胞内信号传导结构域可以包含t细胞受体的细胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。
[0055]
一级胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。含有itam的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些:cd3ζ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cd5，cd22，cd79a，cd79b，cd278(“icos”)，fcεri，cd66d，dap10和dap12。
[0056]
术语“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合从而介导t细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子，tnf受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)，激活nk细胞受体，btla，toll配体受体，ox40，cd2，cd7，cd27，cd28，cd30，cd40，cds，icam-1，lfa-1(cd11a/cd18)，4-1bb(cd137)，b7-h3，cds，icam-1，icos(cd278)，gitr，baffr，light，hvem(lightr)，kirds2，slamf7，nkp80(klrf1)，nkp44，nkp30，nkp46，cd19，cd4，cd8α，cd8β，il2rβ，il2rγ，il7rα，itga4，vla1，cd49a，itga4，ia4，cd49d，itga6，vla-6，cd49f，itgad，cd11d，itgae，cd103，itgal，cd11a，lfa-1，itgam，cd11b，itgax，cd11c，itgb1，cd29，itgb2，cd18，lfa-1，itgb7，nkg2d，nkg2c，tnfr2，trance/rankl，dnam1(cd226)，slamf4(cd244，2b4)，cd84，cd96(tactile)，ceacam1，crtam，ly9(cd229)，cd160(by55)，psgl1，cd100
(sema4d)，cd69，slamf6(ntb-a，ly108)，slam(slamf1，cd150，ipo-3)，blame(slamf8)，selplg(cd162)，ltbr，lat，gads，slp-76，pag/cbp，cd19a和与cd83特异性结合的配体。
[0057]
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段。
[0058]
术语“4-1bb”是指具有如genbank acc.no.aaa62478.2提供的氨基酸序列的tnfr超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1bb共刺激结构域”被定义为genbank acc.no..aaa62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1bb共刺激结构域”为如seq id no:5提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
[0059]
术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括t细胞，例如，α/β的t细胞和γ/δt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
[0060]
术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指免疫效应细胞，例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或者抑制生长或增殖的t细胞或nk细胞的属性。在t细胞的情况下，一级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
[0061]
在一些实施方案中，细胞群体(例如收获的细胞群体)包含例如处于不同分化阶段的t细胞或t细胞群体。t细胞分化阶段从最少到最多分化包括幼稚t细胞、干中央记忆t细胞、中央记忆t细胞、效应记忆t细胞和末端效应t细胞。抗原暴露后，幼稚t细胞增殖并分化成记忆t细胞，例如干中央记忆t细胞和中央记忆t细胞，然后分化成效应记忆t细胞。记忆t细胞在接受适当的t细胞受体、共刺激和炎症信号后，进一步分化成末端效应t细胞。
[0062]
幼稚t细胞(tn)由以下细胞表面标志物的表达模式表征：ccr7 、cd62l 、cd45ro-、cd95-。干细胞中央记忆t细胞(tscm)的特征在于以下细胞表面标志物的表达模式：ccr7 、cd62l 、cd45ro-、cd95 。中央记忆t细胞(tcm)的特征在于细胞表面标志物的以下表达模式：ccr7 、cd62l 、cd45ro 、cd95 。效应记忆t细胞(tem)的特征在于以下细胞表面标志物的表达模式：ccr7-、cd62l-、cd45ro 、cd95 。末端效应t细胞(teff)的特征在于细胞表面标志物的以下表达模式：ccr7-、cd62l-、cd45ro-、cd95 。
[0063]
来自健康供体的新鲜t细胞通常基于cd45ra和cd62l表达分为四个亚组：1)幼稚t细胞(cd45ra cd62l ，称为tn)，2)中央记忆t细胞(cd45ra-cd62l ，称作tcm)，3)效应记忆t细胞(cd45ra-cd62l-，称为tem)和4)cd45ra阳性效应t细胞(cd45ra cd62l-，简称temra)。然后进一步评估每个亚组ccr7、cd27、cd28和cd95的表达。在慢病毒转导后cd95表达显著上调。后三种t细胞亚群对cd95阳性，而仅有一小部分tn表达cd95(cd4 中为3.6
±
1.4％，cd8 t细胞中为3.7
±
1.3％)。这个小群体也共表达cd27、cd28和ccr7，被认为是记忆干细胞(tscm)。
[0064]
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，t细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0065]
术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适的药学上可接受的载体描述
于最新版的remington's pharmaceutical sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与嵌合抗原受体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
[0066]
术语“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何嵌合抗原受体以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
[0067]
术语“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
[0068]
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
[0069]
术语“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
[0070]
术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
[0071]
在一方面，本公开一种靶向gd2的嵌合抗原受体，其包含第一融合肽和第二融合肽，其中：
[0072]
所述第一融合肽包含gd2抗原结合结构域和跨膜结构域；
[0073]
所述第二融合肽包含跨膜结构域、胞质结构域和共刺激结构域。
[0074]
在一些实施方案中，所述第二融合肽的跨膜结构域通过电荷相互作用与第一融合肽的跨膜结构域相互作用，或所述第二融合肽通过胞质结构域内的磷酸化itam序列与信号分子相互作用。
[0075]
根据前一方面的嵌合抗原受体，所述第二融合肽的跨膜结构域通过电荷相互作用与第一融合肽的跨膜结构域相互作用，或所述第二融合肽通过胞质结构域内的磷酸化itam序列与信号分子相互作用。
[0076]
在一些实施方案中，所述第一融合肽的跨膜结构域是kir跨膜结构域；优选地，所述kir跨膜结构域选自kir2ds2、kir2dl3、kir2dl1、kir2dl2、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds3、kir2ds4、kir2ds5、kir3dl1、kir3ds1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1和kir3dp1；更优选地，所述kir跨膜结构域是kirs2或kir2ds2；优选地，所述kirs2包含与seq id no:2所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述kirs2的氨基酸序列如seq id no:2所示；优选地，所述kir2ds2包含与seq id no:3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上
同一性的氨基酸序列；更优选地，所述kir2ds2的氨基酸序列如seq id no:3所示。
[0077]
在一些实施方案中，所述第一融合肽包含信号肽，所述信号肽为cd8α信号肽；优选地，所述cd8α信号肽包含与seq id no:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0078]
在一些实施方案中，所述第二融合肽的跨膜结构域是dap12跨膜结构域；优选地，所述dap12的跨膜结构域包含与seq id no:5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述dap12的跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0079]
在一些实施方案中，所述胞质结构域为dap12胞质结构域或kir胞质结构域；优选地，所述胞质结构域为dap12的胞质结构域；优选地，所述dap12的胞质结构域包含与seq id no:6所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述dap12的胞质结构域的氨基酸序列如seq id no:6所示。
[0080]
在一些实施方案中，所述共刺激结构域是4-1bb；优选地，所述4-1bb包含与seq id no:9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述4-1bb的氨基酸序列如seq id no:9所示。
[0081]
在一些实施方案中，所述第二融合肽包含dap12跨膜结构域、dap12胞质结构域和共刺激结构域4-1bb，或包含截短的dap12跨膜结构域、dap12胞质结构域和共刺激结构域4-1bb；优选地，所述dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域包含与seq id no:7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域的氨基酸序列如seq id no:7所示；优选地，所述截短的dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域包含与seq id no:8所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述截短的dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0082]
在一些实施方案中，所述第二融合肽包含信号肽，所述信号肽为dap12信号肽或cd8α信号肽；优选地，所述dap12信号肽包含与seq id no:4所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述dap12信号肽的氨基酸序列如seq id no:4所示；优选地，所述cd8α信号肽包含与seq id no:1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0083]
在一些实施方案中，其中，所述gd2抗原结合结构域包含gd2抗体或其抗原结合片
段；优选地，所述gd2抗原结合结构域包含抗体的重链可变区和轻链可变区；优选地，所述gd2抗原结合结构域包含fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段。
[0084]
在一些实施方案中，所述gd2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:11所示的gd2 scfv。
[0085]
在一些实施方案中，所述第一融合肽包含gd2 scfv和kirs2，或包含gd2 scfv和kir2ds2。
[0086]
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体为gd2-kirs2/dap12-bb嵌合抗原受体，所述gd2-kirs2/dap12-bb嵌合抗原受体由融合蛋白经t2a肽切割后形成，所述融合蛋白包含dap12信号肽、dap12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1bb、t2a切割位点、cd8α信号肽、gd2 scfv1和kirs2；优选地，所述融合蛋白包含与seq id no:20所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:12所示。
[0087]
在一些实施方案中，所述t2a切割位点包含与seq id no:10所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述t2a切割位点的氨基酸序列如seq id no:10所示。
[0088]
在一方面，本公开提供了编码前述嵌合抗原受体的核酸；优选地，所述核酸包含与seq id no:13所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述编码核酸为seq id no:13所示的核酸。
[0089]
在一方面，本公开提供了包含前述核酸的载体。
[0090]
在一方面，本公开提供了包含前述核酸或载体的细胞。
[0091]
在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体和/或细胞以及药学上可接受的载体。
[0092]
在一方面，本公开提供了一种制备细胞方法，所述方法包括将前述的核酸、载体导入免疫效应细胞。
[0093]
在一方面，本公开提供了前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或组合物在制备治疗和/或预防疾病或病症的药物中的用途。
[0094]
在一些实施方案中，可将所述嵌合抗原受体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或预防受试者的与gd2相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与gd2相关的疾病或障碍，例如癌症或其它赘生性障碍的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产生效应。施用的嵌合抗原受体可消除或抑制或妨碍靶标(例如gd2)的表达、活性和/或信号传导功能。施用的嵌合抗原受体可消除或抑制或妨碍靶标(例如gd2)与其所天然结合的内源性的配体结合。例如，嵌合抗原受体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和、或以其它方式妨碍gd2表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与gd2相关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链cdr的嵌合抗原受
体施用给受试者。在一个实施方案中，与异常gd2相关的疾病或障碍可为癌症。
[0095]
作为非限制性示例，gd2相关的疾病或障碍为gd2阳性肿瘤。gd2阳性肿瘤为一种与升高的gd2表达水平相关的肿瘤，所述肿瘤包括例如成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤或成人中的脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和其它软组织肉瘤。在一个实施方案中，患者患有原发性顽固性或复发性高危险性成神经细胞瘤，或患有高危险性成神经细胞瘤的最小残留疾病。患者可以先前已被治疗或同时用另一种疗法例如手术、化学疗法、放射疗法、干细胞移植、细胞因子治疗(例如利用il-2和/或gm-csf)、和/或维a酸治疗(例如利用异维a酸)来治疗。
[0096]
与癌症及其它赘生性障碍相关的症状包括例如发炎、发烧、全身不适、发烧、疼痛、经常局部发炎、食欲不振、体重减轻、浮肿、头痛、疲乏、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和腹部症状例如腹痛、痢疾或便秘。
[0097]
在一方面，本公开提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或组合物。
[0098]
在一方面，本公开提供了一种治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的嵌合抗原受体、核酸、载体、细胞和/或组合物。
[0099]
将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。ph可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
[0100]
适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的药学上可接受的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，parsippany，n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
[0101]
根据需要，可以通过将嵌合抗原受体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将嵌合抗原受体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分
散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。
[0102]
对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。
[0103]
还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述嵌合抗原受体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
[0104]
还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。
[0105]
在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0106]
尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述嵌合抗原受体。所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：嵌合抗原受体的独特特征和待实现的具体治疗效果，和用于治疗个体的此类嵌合抗原受体的调配领域中固有的局限性。
[0107]
所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
[0108]
本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述嵌合抗原受体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。例如，可以在试剂盒中联合存在，也可以在使用中联合存在。
[0109]
在一个实施方案中，细胞因子il-6的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子il-10的产生被降低或抑制。
[0110]
在一个实施方案中，对细胞因子释放综合征进行分级。在另一个实施方案中，等级1描述了这样的细胞因子释放综合征，其中症状不危及生命且仅需要对症治疗，例如发烧、恶心、乏力、头痛、肌痛、不适。在另一个实施方案中，等级2的症状需要并响应中度干预，例如对于低血压的供氧、液体或血管加压药。在另一个实施方案中，等级3的症状需要并响应积极干预。在另一个实施方案中，等级4的症状是危及生命的症状，需要呼吸机且患者表现出器官毒性。
[0111]
在一个实施方案中，一种或多种所述嵌合抗原受体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给
予。如果顺次给予，则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检测到。在一种情况下，“联合”也可以是在试剂盒中同时包含本公开的嵌合抗原受体和其他治疗剂。
[0112]
例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种嵌合抗原受体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
[0113]
本公开通过dap12串联41bb增加共刺激信号分子元件，链接不同的抗gd2的scfv抗体，设计出抗gd2表达阳性的实体肿瘤的嵌合抗原受体，形成包含抗原结合结构域和跨膜结构域的融合肽与包含跨膜结构域、胞质结构域和共刺激结构域的另一融合肽并联的嵌合抗原受体结构。所述嵌合抗原受体对gd2阳性肿瘤细胞具有良好的杀伤活性，并能够促进细胞因子的分泌(包括il-2和infγ)。本公开的gd2-kirs2/dap12-4-1bb分子组合的car结构预期在针对car-t临床治疗实体瘤的低有效性问题方面，可以大幅度提高car-t细胞用于gd2阳性实体瘤临床应用治疗效果。
[0114]
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本发明的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
[0115]
实施例
[0116]
实施例1：靶向gd2的嵌合抗原受体的结构设计
[0117]
本实施例设计了以下两种靶向gd2的嵌合抗原受体(gd2 car)(图1)：
[0118]
(1)gd2-kirs2/dap12-bb嵌合抗原受体
[0119]
如图1(a)所示，所述gd2-kirs2/dap12-bb嵌合抗原受体包含第一融合肽gd2-kirs2和第二融合肽dap12-bb，其中：
[0120]
所述第一融合肽gd2-kirs2包含抗原结合结构域和跨膜结构域，所述抗原结合结构域为gd2 scfv，所述跨膜结构域为kirs2跨膜结构域；
[0121]
所述第二融合肽dap12-bb包含dap12跨膜结构域、dap12胞质结构域和共刺激结构域4-1bb。
[0122]
所述gd2-kirs2/dap12-bb嵌合抗原受体由pkt081融合蛋白经t2a肽切割后形成，所述pkt081融合蛋白包含dap12信号肽、dap12(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1bb、t2a切割位点、cd8α信号肽、gd2 scfv和kirs2，所述pkt081融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:12所示，其编码核酸序列如seq id no:13所示。
[0123]
pkt081：dap12信号肽 dap12 4-1bb t2a cd8α信号肽 gd2 scfv kirs2
[0124]
(2)pkt082嵌合抗原受体
[0125]
如图1(b)所示，所述gd2-41bb-cd3ζ嵌合抗原受体包含融合肽gd2-cd8-cd8hinge-cd8tm-41bb-cd3ζ，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域4-1bb和信号传导结构域cd3ζ，其中，所述抗原结合结构域为gd2 scfv，所述跨膜结构域为cd8tm跨膜结构域。
[0126]
所述gd2-41bb-cd3ζ嵌合抗原受体由pkt082融合蛋白形成，所述pkt082融合蛋白包含cd8(包括跨膜结构域和胞质结构域)、4-1bb、cd3ζ和gd2，所述pkt082融合蛋白的氨基
酸序列如seq id no:14所示，其编码核酸序列如seq id no:15所示。
[0127]
其中：
[0128]
cd8α信号肽的氨基酸序列如下：
[0129]
malpvtalllplalllhaarp(seq id no:1)
[0130]
kirs2的氨基酸序列如下：
[0131]
sktgnprhlhvligtsvvkipftillffllhrwcsnkknaavmdqepagnrtvnsedsdeqdhqevsya(seq id no:2)
[0132]
kir2ds2的氨基酸序列如下：
[0133]
hegvhrkpsllahpgplvkseetvilqcwsdvrfehfllhregkykdtlhligehhdgvskanfsigpmmqdlagtyrcygsvthspyqlsapsdpldivitglyekpslsaqpgptvlagesvtlscssrssydmyhlsregeaherrfsagpkvngtfqadfplgpathggtyrcfgsfrdspyewsnssdpllvsvtgnpsnswpsptepssktgnprhlhvligtsvvkipftillffllhrwcsnkknaavmdqepagnrtvnsedsdeqdhqevsya(seq id no:3)
[0134]
dap12信号肽的氨基酸序列如下：
[0135]
mgglepcsrflllplllavsg(seq id no:4)
[0136]
dap12跨膜结构域的氨基酸序列如下：
[0137]
gvlagivmgdlvltvlialav(seq id no:5)
[0138]
dap12胞质结构域的氨基酸序列如下：
[0139]
yflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:6)
[0140]
dap12的氨基酸序列包含dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域序列，具体序列如下：
[0141]
lrpvqvqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:7)
[0142]
dap12的截短氨基酸序列包含截短的dap12跨膜结构域和dap12胞质结构域，具体序列如下：
[0143]
cstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:8)
[0144]
4-1bb的氨基酸序列如下：
[0145]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:9)
[0146]
t2a切割位点的氨基酸序列如下：
[0147]
egrgslltcgdveenpg(seq id no:10)
[0148]
gd2 scfv氨基酸序列如下：
[0149]
dilltqtplslpvslgdqasiscrssqslvhrngntylhwylqkpgqspkllihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvppltfgagtklelkradaaptvsifpgsggggsggevklqqsgpslvepgasvmisckasgssftgynmnwvrqnigkslewigaidpyyggtsynqkfkgratltvdkssstaymhlksltsedsavyycvsgmeywgqgtsvtvssa(seq id no:11)
[0150]
pkt081的氨基酸序列如下：
[0151]
mgglepcsrflllplllavsglrpvqvqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyykdikrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelsrvegggegrgslltcgdveenpgprmalpvtalllplalllhaarpgsdilltqtplslpvs
lgdqasiscrssqslvhrngntylhwylqkpgqspkllihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvppltfgagtklelkradaaptvsifpgsggggsggevklqqsgpslvepgasvmisckasgssftgynmnwvrqnigkslewigaidpyyggtsynqkfkgratltvdkssstaymhlksltsedsavyycvsgmeywgqgtsvtvssaasggggsggggssptepssktgnprhlhvligtsvvkipftillffllhrwcsnkknaavmdqepagnrtvnsedsdeqdhqevsya(seq id no:12)
[0152]
pkt081的核酸序列如下：
[0153]
atggggggacttgaaccctgcagcaggttcctgctcctgcctctcctgctggctgtaagtggtctccgtcctgtccaggtccaggcccagagcgattgcagttgctctacggtgagcccgggcgtgctggcagggatcgtgatgggagacctggtgctgacagtgctcattgccctggccgtgtacttcctgggccggctggtccctcgggggcgaggggctgcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtcggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaagatatcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtctagagtcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccgatattttgctgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagtcttgtacaccgtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgattcacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgttctcaaagtacacatgttcctccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaggctcgggcggtggtgggtcgggtggcgaggtgaagcttcagcagtctggacctagcctggtggagcctggcgcttcagtgatgatatcctgcaaggcttctggttcctcattcactggctacaacatgaactgggtgaggcagaacattggaaagagccttgaatggattggagctattgatccttactatggtggaactagctacaaccagaagttcaagggcagggccacattgactgtagacaaatcgtccagcacagcctacatgcacctcaagagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgtaagcggaatggagtactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccgctagcggtggcggaggttctggaggtgggggttcctcacccactgaaccaagctccaaaaccggtaaccccagacacctgcatgttctgattgggacctcagtggtcaaaatccctttcaccatcctcctcttctttctccttcatcgctggtgctccaacaaaaaaaatgctgctgtaatggaccaagagcctgcagggaacagaacagtgaacagcgaggattctgatgaacaagaccatcaggaggtgtcatacgca(seqid no:13)
[0154]
pkt082的氨基酸序列如下：
[0155]
malpvtalllplalllhaarpsrdilltqtplslpvslgdqasiscrssqslvhrngntylhwylqkpgqspkllihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvppltfgagtklelkradaaptvsifpgsggggsggevklqqsgpslvepgasvmisckasgssftgynmnwvrqnigkslewigaidpyyggtsynqkfkgratltvdkssstaymhlksltsedsavyycvsgmeywgqgtsvtvssaeqkliseedlletttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelsgrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:14)
[0156]
pkt082的核酸序列如下：
[0157]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtctagagatattttgctgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatct
agtcagagtcttgtacaccgtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgattcacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgttctcaaagtacacatgttcctccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaggctcgggcggtggtgggtcgggtggcgaggtgaagcttcagcagtctggacctagcctggtggagcctggcgcttcagtgatgatatcctgcaaggcttctggttcctcattcactggctacaacatgaactgggtgaggcagaacattggaaagagccttgaatggattggagctattgatccttactatggtggaactagctacaaccagaagttcaagggcagggccacattgactgtagacaaatcgtccagcacagcctacatgcacctcaagagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgtaagcggaatggagtactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccgagcagaaactcatctctgaagaggatctgctcgagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgtccggaagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc(seq id no:15)
[0158]
实施例2：慢病毒的制备
[0159]
(1)293t细胞隔天传代
[0160]
每个t150细胞瓶种植5
×
106个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。
[0161]
(2)293t细胞铺瓶
[0162]
a)以1个t150细胞培养瓶为例，用约15ml的1
×
pbs轻柔地洗细胞两次。
[0163]
b)加入3ml 0.25％胰酶-2.21mm edta
[0164]
c)等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)fbs(购自gibico)的dmem培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中。
[0165]
d)收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm，离心10分钟。
[0166]
e)吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)fbs的dmem培养液中。
[0167]
f)细胞计数，根据细胞浓度计算12
×
106个细胞所需要的体积。
[0168]
g)将细胞和25ml的10％(wt)fbs的dmem培养液合并，放入t150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底，37℃，5％co2培养箱中培养过夜。
[0169]
(3)细胞转染
[0170]
观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时开始转染。
[0171]
a)在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。
[0172]
b)混合质粒dna和氯化钙溶液，以一个t150瓶为例，需要28μg prsv.rev(购自invitrogen公司)，28μg pgag-pol(购自invitrogen公司)，11μg pvsvg(购自invitrogen公司)，23μg慢病毒表达质粒(质粒pkt075，pkt094，pkt095，上海生工合成)，将慢病毒表达质粒分别加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。
[0173]
c)将1.5ml硼酸盐缓冲液溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把dna-氯化钙溶液混匀后滴加到硼酸盐缓冲液溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。
[0174]
d)用5ml移液管把dna-氯化钙-硼酸盐缓冲液混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到t150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。
[0175]
e)6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)fbs的dmem培养液，继续培养。
[0176]
(4)初次收集病毒上清
[0177]
a)将前一天转染的293t细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。
[0178]
b)将事先预热的20ml 5％(wt)fbs的dmem培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。
[0179]
(5)第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。
[0180]
(6)过滤上清
[0181]
将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。
[0182]
(7)病毒浓缩
[0183]
4℃，12000-24000rpm离心过夜。
[0184]
(8)病毒储存
[0185]
离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)fbs的dmem培养基重悬，进行病毒分装(记为慢病毒pkt081，pkt082)，迅速存放于-80℃冰箱备用。
[0186]
实施例3：gd2 car-t体外功能测试
[0187]
(1)细胞制备
[0188]
从新鲜血样分离血浆(灭活备用)，血细胞悬液用淋巴细胞分离液分出pbmc，获得的pbmc用t细胞分选试剂盒进行t细胞分选。t细胞加dynabeads cd3/cd28(按细胞:dynabeads＝1:1添加)进行激活，用活化培养基(x-vivo15，5％血浆，300iu/ml il-2)，调整细胞终浓度为1
×
106/ml，于37℃，5％co2培养。24h后加实施例2制备的car慢病毒(病毒pkt081，pkt082)转染t细胞，感染48h后去除慢病毒。第4天(d4)开始每1-2天观察细胞补液培养，维持细胞密度在0.8
×
106细胞/ml。第4-5天(d4-d5)使用活化培养基，第5天(d5)后使用扩增培养基(x-vivo15，300iu/ml il-2)。连续培养至第11天(d11)天，即获得两种靶向gd2的car-t细胞(car-t细胞pkt081，pkt082)。
[0189]
两种不同car结构的t细胞激活扩增无明显差异(图2a)；两种car-t细胞在培养的过程中一直处于扩增状态，体积在前4天逐渐增大，之后都逐渐降低(图2b)。
[0190]
(2)car-t细胞阳性率检测
[0191]
取第8天的pkt081、pkt082两种car-t细胞，添加抗-鼠fab抗体(pe)一抗和链霉亲和素(streptavidin)-pe二抗孵育，未转导t细胞同方式孵育作为对照，流式检测car-t细胞的阳性率。检测两种gd2 car-t细胞的阳性率，第8天pkt081阳性率高于pkt082
[0192]
取第8天(d8)的pkt081、pkt082两种car-t细胞，添加抗鼠fab抗体(pe)一抗和链霉亲和素(streptavidin)-pe二抗孵育，未转导t细胞同方式孵育作为对照，流式检测car-t细胞的阳性率。检测两种gd2 car-t细胞的阳性率，第8天两种car-t的阳性率结果显示：pkt081的car阳性率为66.87％，高于pkt082的car阳性率47.91％(图3)。
[0193]
(3)t细胞分化亚群检测
[0194]
car-t细胞亚群检测抗体：抗-人cd3(apc-cy7)，抗-人ccr7抗体(bv421)，抗-人cd 45ro抗体(apc)，cd4-bb515，cd8-bv510，cd45ra(pe-cy7)，cd62l-pe。
[0195]
在pkt081、pkt082两种car-t细胞培养的第12天取样加car-t细胞亚群检测抗体进行流式检测。检测car-t细胞分型，包括cd4 和cd8 t细胞中tn、teff、tcm、tem、teff比例。pkt081、pkt082两种t细胞分化亚型显示，pkt081的记忆群细胞比例为86.74％更多，显著高于pkt082的25.98％(图4)。本发明能够实现car-t更低的分化状态，在体内会更持久并具备记忆活性。
[0196]
(4)靶细胞培养
[0197]
lan-1培养使用dmem培养基(dmem 10％fbs 1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycine))；h1299培养使用1640培养基(1640 10％fbs 1％青霉素/链霉素)。
[0198]
(5)car-t特异性杀伤
[0199]
a、靶细胞消化计数，用培养液(dmem或1640 10％fbs)调成密度为2
×
105细胞/ml的靶细胞悬液；
[0200]
b、向eplate板中加入50μl细胞培养基，将eplate放入dp监测槽，准备测量基线。
[0201]
c、基线测量结束后，取出eplate，每孔加入1
×
104(50μl)靶细胞，室温放置30min。
[0202]
d、将加有细胞悬液的e-plate板放回对应的监测槽，开始进行监测。
[0203]
e、18h后，计数car-t和ntd细胞，按下表的效靶比(e：t)，调整效应细胞至相应的密度。
[0204]
e:t靶细胞数目细胞密度及每孔加入体积0:1050μl培养液1:11
×
10
42×
105细胞/ml,50μl5:15
×
10
41×
106细胞/ml,50μl10:11
×
10
52×
106细胞/ml,50μl
[0205]
f、暂停所有检测槽的数据采集；
[0206]
g、将放置过夜的e-plate板取出，每孔加入50μl相应的效应细胞；
[0207]
h、将e-plate板放回对应的监测槽，继续实时无标记动态细胞分析技术(rtca)系统的数据采集；
[0208]
i、效应细胞加入后，监测时间不超过48h。
[0209]
检测pkt081、pkt082两种gd2 car-t细胞及未转导t细胞(ntd)对肿瘤细胞h1299和lan-1的杀伤效果，比较不同car-t细胞的杀伤能力(图5)。结果表明，ntd对h1299和lan-1细胞杀伤作用很弱；在效靶比(e：t)为0:1，1:1，5:1，10:1的情况下，两种car-t细胞都在5:1和10:1两种效靶比时表现出了对h1299和lan-1的明显杀伤作用。pkt081细胞对靶细胞的裂解率要高于pkt082。
[0210]
(6)细胞因子分泌检测
[0211]
按照e:t＝2:1，将pkt081、pkt082分别与h1299和lan-1共培养24h；收集细胞上清，elisa检测il-2和ifn-γ。
[0212]
分析2种car-t细胞和ntd与h1299和lan-1细胞共培养24小时后取上清液，用elisa方法检测细胞因子，两种car-t与阳选靶细胞共培养后都分泌ifn-γ和il2，pkt081car-t细
胞的ifn-γ、il2的分泌量稍高于pkt082 car-t组。综合来看，在肿瘤抗原的刺激下两种car-t细胞都分泌ifn-γ和il-2(图6)。
[0213]
(7)抗原刺激增殖
[0214]
a、car-t细胞培养到第8天(d8)去磁珠，并使用不含il-2的培养基继续培养2天；
[0215]
b、第10天(d10)，计数效应细胞(car-t)和ntd；
[0216]
c、取所需的car-t细胞(5
×
106/ml)，pbs洗2遍，最后加入500μl pbs重悬细胞使浓度为1
×
107/ml；
[0217]
d、加入荧光染料cfse(购自bd生命科学，原始浓度为5mm)，使cfse终浓度为5μm，放入培养箱孵育10min；
[0218]
e、加入9倍孵育体积的pbs，离心；
[0219]
f、弃掉上清后，加入10ml含10％fbs的培养基重悬，离心，弃上清；
[0220]
g、用5ml培养基(10％fbs，300ui/ml il-2)重悬至1
×
106/ml，待用；
[0221]
h、计数靶细胞(h1299和lan-1)，用培养液(dmem或1640 10％fbs 300ui/ml il-2)调成密度为1
×
106/ml的细胞悬液，备用；
[0222]
i、按相应的效靶比(e:t)，每孔加入1ml car-t细胞，置于37℃，5％co2培养箱培养，1-2天离心换液。
[0223]
j、第五天(d5)进行流式检测。
[0224]
两种car-t(pkt081、pkt082)的cfse荧光强度流式检测结果显示(图7)，相对于ntd对照组，经过gd2阳性靶细胞刺激后，两种car-t的cfse的荧光强度左移减弱，证实阳性靶细胞能够性刺激这两种car-t的增殖。