单点突变基因转录本高效特异敲降sgRNA的筛选方法及应用

单点突变基因转录本高效特异敲降sgrna的筛选方法及应用
技术领域
1.本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及单点突变基因转录本高效特异敲降sgrna的筛选方法及应用，具体涉及一种基于crispr-cas13系统的sgrna特异高效作用靶点的筛选方法及应用。


背景技术：

2.迄今为止，已知人类致病突变的最大类别是点突变，也称为单核苷酸多态性(snp)，尽管由于广泛使用短阅读测序来分析基因组多样性而导致的采样偏差可能会扭曲这种分布。因此，高效、干净地安装或逆转致病snps对于遗传疾病的研究和治疗非常有意义，并且需要一种方法来特异性地改变基因组中个体碱基对的序列。
3.基因编辑是自80年代末发展起来的一种分子生物学技术。它是一种通过一定的途径实现人为修改特定基因的技术。早期的基因编辑主要是利用dna同源重组原理,通过设计同源片段替代靶基因片段，从而达到基因编辑的目的。目前应用比较成功的基因敲除技术主要有：zinc-finger,talen,crispr/cas9。crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/cas(crispr-associated)是一种由rna指导的cas核酸酶对靶向基因进行特定dna修饰的技术。
4.crispr是细菌和古生菌为了应对噬菌体和外源质粒的不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。crispr/cas系统可实现高效的基因敲除、敲入、替换及转录水平的调控。然而，针对单个碱基突变的基因的修正，传统crispr/cas系统的表现却不尽如人意。由于dna双链断裂时，细胞更倾向于利用非同源末端修复(henj)原理对dna进行修复，因而利用同源重组(hdr)进行的单个碱基的替换过程往往十分低效。而单碱基编辑器(be)系统的出现成功攻克了这一技术壁垒，实现了高效且安全的单个碱基的替换编辑。be4，abe7.10，pe系统是目前最先进的可实现单个碱基精准替换的基因编辑工具。be4编辑过程中不产生dsb，仅需一个dna单链切口就能实现单碱基精准编辑，可有效避免编辑过程中产生基因组损伤。be4单碱基编辑器通过在传统crispr-cas9系统中的cas9n(d10a)蛋白上融合胞嘧啶脱氨基酶apobec1及尿嘧啶糖基化酶抑制剂ugi，可实现安全、高效、高特异性、高保真性的c-》t的碱基替换编辑(komor et al.，2017)，而abe7.10可将腺嘌呤转化为肌苷，从而形成a-》g突变(gaudelli et al.，2017)，但上述两种编辑都存在编辑窗口及只能做到嘌呤-嘌呤或者嘧啶-嘧啶的互相转变的问题，无法实现单个碱基的精确编辑及多碱基间的相互转换。
5.pe系统可以介导靶向的插入、缺失以及所有的碱基替换。而且，它可以将不同类型的编辑相结合。所有这些都可以在没有双链断裂(dsb)或供体dna模板的情况下进行(anzalone，a.v et al.，2019)，但目前的pe系统在编辑效率及脱靶事件等方面仍存在缺陷。目前仍然没有一种极高效及特异的单碱基编辑方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是高效特异的对单碱基进行编辑，为了实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种基于crispr-cas13系统的单点突变基因转录本高效特异敲降sgrna的筛选方法。
[0007]ⅱ类ⅵ型crispr效应蛋白pspcas13b、rfxcas13d蛋白可高效切割ssrna，依赖crrna来切割目标，而不依赖hepn结构域。pspcas13b、rfxcas13d蛋白对目标的侧翼序列没有要求，可以靶向任何rna序列。
[0008]
基于此，本发明提供的一种特异敲除转录本中单碱基突变的sgrna的筛选方法，将报告载体、含有pspcas13b或rfxcas13d蛋白的表达载体和sgrna表达载体共同导入真核细胞，待转化细胞培养一段时间后，对比同一sgrna对不同报告载体中目标核酸序列的切割效率，筛选出高效高保真的sgrna。
[0009]
pspcas13b蛋白载体可选自：pspcas13b-nes-ha；rfxcas13d蛋白载体可选自：rfxcas13d-nls-ha(casrx)。
[0010]
在本发明提供的筛选方法中，选择在单碱基突变序列的报告载体中切割效率高，而在未突变序列的报告载体中切割效率低或不切割的sgrna，作为高效高保真的sgrna。
[0011]
本发明巧妙的设计了用于敲除单碱基突变的sgrna序列集合，在所述sgrna序列集合中，突变碱基位于sgrna的第一位至最后一位，形成n条sgrna，具体地，基于目标核酸序列设计用于crispr-pspcas13b或crispr-rfxcas13d系统的sgrna序列集合，所述目标核酸序列为编码5
‘
端具有帽子结构，3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。
[0012]
此外，为保证筛选得到的sgrna是特异性敲除突变位点，且筛选得到的sgrna对于未突变序列(野生型序列)无影响，本发明在构建报告载体时，进行两种不同的报告载体的构建，包括：
[0013]
构建mcherry-target-mut和mcherry-target-wt荧光报告载体；所述mcherry-target-mut为载体pcdna3.1-mcherry中mcherry基因的下游连接单碱基突变序列；所述mcherry-target-wt为载体pcdna3.1-mcherry中mcherry基因的下游连接未突变序列；
[0014]
优选地，所述mcherry基因的下游为mcherry荧光蛋白的c端。
[0015]
在本发明提供的筛选方法中，含有rfxcas13d蛋白的表达载体为在rfxcas13d蛋白的氮端连有nls序列的载体，含有pspcas13b蛋白的表达载体为在pspcas13b蛋白的碳端连有nes序列的载体。
[0016]
更具体地，本发明提供的筛选方法中，基于crispr-pspcas13b系统的sgrna表达载体为pc0043-pspcas13b crrna backbone哺乳基因编辑质粒，基于crispr-rfxcas13d系统的sgrna表达载体为tc1049-rfxcas13d crrna backbone哺乳基因编辑质粒。
[0017]
根据本领域技术人员的理解，本发明要求保护上述筛选方法在新型rna药物的开发和/或单点突变疾病治疗中的应用。
[0018]
第二方面，本发明提供一种筛选特异性敲除prrsv的tmc1基因点突变序列的sgrna的方法，将包含单点突变a的90bp序列与未突变的该段序列分别融合到mcherry基因的碳端构建mcherry-target-mut与mcherry-target-wt靶向报告质粒。针对突变位点构建sgrnas，分别将突变碱基a落在30bp长度sgrna的第一位至第三十位，分别构建针对pspcas13b与rfxcas13d蛋白识别的sgrna表达质粒，利用crispr-pspcas13b或crispr-rfxcas13d系统分
别进行mcherry-target-mut/wt的靶向切割，筛选高效靶向切割mcherry-target-mut的sgrnas与特异保真mcherry-target-wt的sgrnas，最终筛选出针对target单点突变转录本的高效特异敲降sgrna。
[0019]
步骤如下：
[0020]
(1)基于含有突变位点的目标核酸序列设计用于crispr-pspcas13b或crispr-rfxcas13d系统的sgrna序列集合，并构建sgrna表达载体；所述sgrna序列集合中，突变碱基位于sgrna的第一位至最后一位，形成如seq no id.3-32所示的sgrna；
[0021]
(2)构建mcherry-target-mut和mcherry-target-wt荧光报告载体；所述mcherry-target-mut为载体pcdna3.1-mcherry中mcherry基因的下游连接单碱基突变序列；所述mcherry-target-wt为载体pcdna3.1-mcherry中mcherry基因的下游连接未突变序列；
[0022]
(3)将报告载体、含有pspcas13b或rfxcas13d蛋白的表达载体和sgrna表达载体共同导入真核细胞，利用sgrna序列来将pspcas13b或rfxcas13d定位到目标序列以使目的序列mrna被切割，从而实现mcherry报告系统mrna的敲降，对比同一sgrna对不同报告载体中目标核酸序列的切割效率，筛选出高效高保真的sgrna。
[0023]
在本发明提供的筛选特异性敲除prrsv的tmc1基因点突变序列的sgrna的方法中，所述报告载体为携带mcherry荧光蛋白的真核表达载体，所述目标核酸序列位于mcherry荧光蛋白的c端，所述目标核酸序列为含有突变位点的90bp的mrna序列；报告载体的构建方法如下：利用载体同源重组的方法将从合成的90bp点突变序列与未突变序列连接到常用商业化载体pcdna3.1-mcherry中mcherry基因的下游，构建得到mcherry-target-mut和mcherry-target-wt荧光报告载体。
[0024]
合成的90bp点突变序列的核酸序列如下：
[0025]
gggccgtgcgagcaggccgagtgcggttccggaggctctggctcaggggaggacggtgactgtgagcaggagctgtgccggcagcgcggt(seq id no.1)；
[0026]
合成的90bp未突变序列的核酸序列如下：
[0027]
gggccgtgcgagcaggccgagtgcggttccggaggctctggctctggggaggacggtgactgtgagcaggagctgtgccggcagcgcggt(seq id no.2)。
[0028]
本发明的有益效果至少在于：
[0029]
(1)本发明提供的筛选方法，通过分别靶向表达突变目的序列与未突变序列的荧光报告质粒进行高效切割突变序列且高保真未突变序列，筛选获得单点突变转录本高效特异敲降的sgrna，具有普适性，且提供了一种很好的识别切割单点突变mrna的方法，这是sirna等方法所无法做到的，为新型rna药物的开发与单点突变疾病治疗提供了新的思路；
[0030]
(2)本发明所提供的筛选方法，利用荧光报告系统筛选得到的高效特异的sgrna，结合crispr-pspcas13b或crispr-rfxcas13d系统，成功在mcherry-target-mut点突变报告系统中进行了验证，充分显示了该方法筛选获得的sgrna对突变mrna敲降的高效性；
[0031]
(3)本发明提供的筛选方法，保护未突变mrna转录本的高保真性，利用荧光报告系统筛选得到的高效特异的sgrna，结合crispr-pspcas13b或crispr-rfxcas13d系统，成功在mcherry-target-wt未突变报告系统中进行了验证，充分显示了该方法筛选获得的sgrna对未突变mrna的保护。
附图说明
[0032]
图1为本发明实施例1中mcherry-target-mut及mcherry-target-wt载体构建示意图。
[0033]
图2为本发明实施例1中工程化pspcas13b-nes、nls-rfxcas13d载体构建示意图。
[0034]
图3为本发明实施例1中mcherry-target-mut报告系统靶向序列的sgrna设计示意图。
[0035]
图4为本发明实施例1中利用工程化pspcas13b-nes在hek293t上敲降mcherry-tmc1-mut报告系统mrna的效果图。
[0036]
图5为本发明实施例1中利用工程化nls-rfxcas13d在hek293t上敲降mcherry-tmc1-mut报告系统mrna的效果图。
[0037]
图6为本发明实施例1中利用工程化pspcas13b-nes在hek293t上敲降mcherry-target-wt报告系统mrna的效果图。
[0038]
图7为本发明实施例1中利用工程化nls-rfxcas13d在hek293t上敲降mcherry-target-wt报告系统mrna的效果图。
[0039]
图8为本发明实施例1中pspcas13b介导的mcherry-wt/mut荧光报告系统mrna敲降统计图。
[0040]
图9为本发明实施例1中rfxcas13d介导的mcherry-wt/mut荧光报告系统mrna敲降统计图。
[0041]
图10为本发明实施例1中pspcas13b介导的mcherry-wt/mut荧光报告系统mrna敲降效率的比值统计图。
[0042]
图11为本发明实施例1中rfxcas13d介导的mcherry-wt/mut荧光报告系统mrna敲降效率的比值统计图。
具体实施方式
[0043]
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
[0044]
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0045]
实施例1
[0046]
本实施例提供筛选对猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)单点突变特异敲降的sgrna的方法，包括：
[0047]
一、构建mcherry-target-mut/-target-wt荧光报告系统
[0048]
如图1所示，将target-mut/-target-wt序列合成后，融合至mcherry基因的碳端(c端)，形成如下两种荧光报告系统：
[0049]
(1)mcherry-target-mut；
[0050]
(2)mcherry-target-wt。
[0051]
同时构建出核信号nes介导的pspcas13b与入核信号nls介导的rfxcas13d系统，如图2所示，将合成的nes插入至pspcas13b蛋白的氮端，nls插入至rfxcas13d蛋白的碳端，形成如下两种工程化表达系统：
target-mut/mcherry-target-wt报告质粒的mrna切割，实现高效特异靶向结合sgrna的筛选。
[0088]
按常规操作，进行细胞株的mrna敲降(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。
[0089]
(1)以hek293t细胞为例，进行真核生物细胞的培养与转染：
[0090]
hek293t细胞接种培养于添加10％fbs的dmem高糖培养液中(hyclone,sh30022.01b),其中含青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)。
[0091]
(2)在转染前分至48孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。
[0092]
(3)转染以脂质体转染为例。按照lipofectamine
tm 2000transfection reagent(invitrogen,11668-019)的操作手册，以mcherry-target-mut报告质粒为例，将50ng mcherry-target-mut质粒与300ng nes-pspcas13b-nes或rfxcas13d-nls及150ng sgrna表达质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，48小时后进行切割效率的鉴定及检测。
[0093]
(4)mrna切割效率分析
[0094]
a、转染细胞48h后，使用pbs清洗细胞两次，补充300ul浓度10％fbs的培养基，进行细胞荧光成像拍照，所得到的荧光成像结果见图4、图5、图6、图7，其中图4为利用工程化pspcas13b-nes在hek293t上敲降mcherry-tmc1-mut报告系统mrna的荧光效果图；图5为利用nls-rfxcas13d在hek293t上敲降mcherry-tmc1-mut报告系统mrna的荧光效果图；图6为利用工程化pspcas13b-nes在hek293t上敲降mcherry-target-wt报告系统mrna的荧光效果图；图7为利用工程化nls-rfxcas13d在hek293t上敲降mcherry-target-wt报告系统mrna的荧光效果图。然后消化部分细胞进行c-flow检测mcherry荧光效率；
[0095]
b、收取另外一部分细胞使用trizol法进行总rna提取，提取的rna进行浓度测定，使用反转试剂进行反转录获取cdna，反转录体系(以1μg为例)：
[0096]
1μg mrna，4μl 5
×
hiscript ii select qrt supermix，4μl 4
×
gdna wiper mix，不含rnase的ddh2o，补齐至20μl。
[0097]
反转录程序：42℃，15min；50℃，20min；85℃，5s；4℃保持。
[0098]
c、实时荧光定量pcr：针对target-mut/wt设计q-pcr检测引物，利用反转录产物(稀释10倍)进行q-pcr检测转染48h后mcherry-target-mut/wt mrna的相对表达量。q-pcr反应体系为：1μl cdna，5μl 2
×
q-pcr mix，0.2μl正向引物，0.2μl反向引物，不含rnase的ddh2o，补齐至10μl。
[0099]
q-pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；按照仪器操作说明选择熔解曲线分析：95℃，15s；60℃，15s；95℃；利用
△△
ct法分析定量数据。q-pcr引物如下：
[0100]
target-mut：
[0101]
forward:gggccgtgcgagcaggccga(seq id no.33)
[0102]
reverse:accgcgctgccggcacagct(seq id no.34)
[0103]
target-wt:
[0104]
forward:gggccgtgcgagcaggccga
[0105]
reverse:accgcgctgccggcacagct
[0106]
gapdh(内参基因)：
[0107]
forward:agaaggctggggctcatttg(seq id no.35)
[0108]
reverse:aggggccatccacagtcttc(seq id no.36)
[0109]
实验结果表明：
[0110]
mcherry-target-wt报告质粒mrna未(极微)发生敲降的sgrna编号为：target-sgrna4,7,8,9,13,17,18,20,22,23,24(crispr-pspcas13b系统),target-sgrna5,6,7,12,13,14,15,16,19,20,21,23,24,28,29,30(crispr-rfxcas13d系统)；见图8。
[0111]
mcherry-target-mut报告质粒mrna发生了高效的敲降的sgrna编号为：target-sgrna1,2,3,7,8,9,16,17,18,19,22(crispr-pspcas13b系统)，target-sgrna1,2,3,4,5,6,7,8,20,22,24,26,27,29(crispr-rfxcas13d系统)，见图9。
[0112]
mcherry-target-wt报告质粒mrna及mcherry-target-mut报告质粒mrna在crispr-pspcas13b系统和crispr-rfxcas13d系统中的被敲除结果见表1。
[0113]
表1特异敲降mrna的sgrna结果
[0114][0115]
根据30个sgrna在pspcas13b系统中的荧光值，统计各sgrnamut/wt的荧光比值，见图10。统计各sgrna在rfxcas13d系统中的mut/wt的荧光比值，见图11。选择荧光比值低的sgrna，作为高保真sgrna。可作为后续点突变高效特异敲降mrna的sgrna；通过三组实验的荧光灰度统计分析得到，在rfxcas13d系统中，sgrna3的mut敲降与wt敲降荧光比值最低，可作为敲除效果最好的高保真sgrna。在后续的治疗应用中，使用cas13d系统中比值最低的sgrna3作为特异敲除单突变位点的转录本的sgrna。
[0116]
本发明利用crispr-cas13系统筛选出针对target(t》a)单点突变转录本的高效特异敲降sgrna。本发明提供的单点突变基因转录本高效特异敲降sgrna的筛选方法具有单点特异识别，高效率切割突变转录本，高精准率保留未突变转录本的优势。为后续内源性基因点突变mrna的敲降，相关点突变疾病的临床研究及rna药物的开发提供新的思路与方法。
[0117]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。