一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及构建方法和应用

一种表面展示
β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及构建方法和应用
技术领域
1.涉及酶的基因工程领域，具体涉及一种细胞表面展示来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶laca的重组毕赤酵母菌株的构建方法和应用。


背景技术：

2.微生物表面展示技术是伴随着基因工程的发展而兴起的重要的生物技术之一，酵母表面展示体系是继噬菌体展示体系和细菌表面展示体系之后发展迅速的一种外源蛋白表达体系。酵母是具有细胞壁的单细胞真核生物，酵母表面展示技术的基本原理是以细胞表面的蛋白(通常是细胞壁外层的甘露糖蛋白)作为锚定蛋白，通过基因工程手段，将编码外源蛋白或多肽的基因序列与编码特定的锚定蛋白的基因序列融合后导入酵母中，从而使外源蛋白或多肽与锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母细胞的表面，被展示的外源蛋白或多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性，并可使表达、纯化、固定于一体，从而省去提取纯化的繁琐工序。酵母表面展示体系有其独特的优势，主要表现在以下几个方面：
3.(1)通常作为锚定蛋白的细胞壁蛋白可通过共价键连接到细胞壁内层葡聚糖骨架上，从而使外源蛋白牢固的展示在酵母细胞的表面；
4.(2)酵母作为真核生物，拥有比较完善的蛋白质折叠和分泌机制，因此可用来表达需要进行翻译后修饰的来自真核生物的蛋白；
5.(3)酵母是单细胞生物，颗粒相对比较大，可通过流式细胞术对展示有目标外源蛋白的细胞进行方便的筛选和分离。
6.酵母细胞表面展示体系已经广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域。毕赤酵母细胞表面展示体系是近年来发展迅速且应用广泛的一种真核表达体系，运用毕赤酵母细胞表面展示体系展示各种酶作为全细胞催化剂，不仅具有固定化酶的特性及优点，而且制备方法简单，易于回收与再生利用，因此具有广阔的应用前景。现有技术中尚未有在细胞表面展示来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶laca的重组毕赤酵母菌株的构建的报导。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种毕赤酵母表面展示菌株，提高酶的重复利用次数，可使表达、纯化、固定化于一体，省去繁杂的提取纯化步骤。
8.本发明还要解决的技术问题是提供上述表面展示β-半乳糖苷酶laca的重组毕赤酵母菌株的构建方法。
9.本发明进一步要解决的技术问题是提供上述表面展示β-半乳糖苷酶laca的重组毕赤酵母菌株的应用。
10.本发明旨在采用毕赤酵母表面展示技术将来自米曲霉aspergillus oryzae bk03的β-半乳糖苷酶基因laca展示表达在毕赤酵母pichia pastoris gs115细胞表面，获得一
kh2po4和150ml h2o组成，生物素母液由20mg和100ml h2o组成。
27.本发明还提出了上述重组毕赤酵母在发酵产低聚半乳糖中的应用。具体地，将所述重组毕赤酵母接种于毕赤酵母发酵培养基bmmy中发酵培养，离心收集菌体，然后以乳糖为底物进行细胞转化，得到低聚半乳糖。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明采用酵母表面展示技术将来自米曲霉aspergillus oryzae bk03的β-半乳糖苷酶基因laca展示表达在毕赤酵母pichia pastoris gs115细胞表面，获得一株能合成低聚半乳糖的重组菌株，并且重组表面展示菌株能一直保持较高的酶活力，酶活能持续较久，随着菌的存活一直稳定存在，所得的重组菌株通过锚定蛋白将β-半乳糖苷酶基因laca锚定在细胞表面，固定化后的酶可以用做全细胞催化剂。
附图说明
29.图1为pir1p和laca基因pcr扩增片段；
30.图2为pir1p和laca overlap结果；
31.图3为ppic9k-pir1p-laca酶切验证；
32.图4为gs115-pir1p-laca重组菌株菌落pcr验证；
33.图5为重组菌原位染色实验图，其中，左为gs115-pir1p-laca,右为对照；
34.图6为重组菌免疫荧光检测实验图，其中，左为在荧光显微镜下的细胞发光状态，右为在可见光显微镜的细胞状态；
35.图7为表面展示laca菌株和异源表达laca菌株的酶活对比；
36.图8为酶活测定标准曲线结果图；
37.图9为低聚半乳糖产量图。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
39.实施例1异源表达来源于酿酒酵母细胞壁蛋白pir1p和来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶laca基因，获得重组菌。
40.(一)提取酿酒酵母菌株saccharomyces cerevisiae s288c的基因组：
41.使用takara公司的真菌基因组提取试剂盒(dr.gentle
tm
(from yeast)high recovery)
42.(1)取od 1.2-1.8的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c过夜培养液至2ml微型管中，12000rpm，离心1min，弃上清液，得沉淀；
43.(2)向步骤(1)所得沉淀中加入500μl的gentle yeast solution a轻松震荡并充分悬浮沉淀于37℃，温浴1h，期间轻轻震荡离心管数次；
44.(2)加入100μl的gentle yeast solution b，轻微震荡，混匀后于70℃水浴10min；
45.(3)加入200μl的gentle yeast solution c，轻微震荡，混匀后于冰上静置5min；
46.(4)将微型管于4℃下，转速12000rpm离心5min；
47.(5)将上清液移入新的微型管中，加入400μl的异丙醇，充分颠倒混匀；
48.(6)将微型管于4℃下，转速12000rpm离心5min，弃上清液；
49.(7)向沉淀中加入500μl预冷的70％乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，于4℃下，转速12000rpm离心5min；
50.(8)弃上清液，室温下自然干燥dna，沉淀至无乙醇气味；
51.(9)加入50μl的te buffer/ddh2o，溶解基因组dna。
52.(二)米曲霉rna的获取：
53.将菌种接种于v8培养基进行活化，在30℃培养箱培养3天后，将菌种转接于v8液体培养基中，30℃再次培养3天，获得的菌体用于提取米曲霉rna。米曲霉rna的提取步骤参照rnaiso plus reagent提取试剂盒(三)运用pcr技术分别扩增目的基因pir1p和laca：
54.(1)以步骤(一)提取的酿酒酵母基因组为模板，采用pcr技术扩增pir1基因，以步骤(二)提取的米曲霉rna为模板，采用pcr技术扩增laca基因。
55.反应体系如下表：
56.表1 pcr反应体系
[0057][0058]
扩增pir1p基因的引物如下：
[0059]
pir1p-up：aaagagaggctgaagcttacgtatatgctccaaaggacccpir1p-down：ccagaaccaccaccaccgaattcacagttgagcaaatcga
[0060]
扩增laca基因的引物如下：
[0061]
laca-up：
[0062][0063]
laca-down：
[0064][0065]
其中，上引物部分包含linker,，加粗斜体部分为linker，45bp；下引物部分包含flag标签，在终止密码子之前，加粗斜体部分为flag标签24bp；
[0066]
使用1.2％(1.2g/100ml)琼脂糖凝胶对上述pcr产物(pir1p和laca基因片段)进行电泳，结果见图1。
[0067]
(2)胶回收纯化片段pir1p和laca
[0068]
使用takara试剂盒(takara minibest agarose gel dna extraction kitver.4.0)进行操作。
[0069]
2.1使用tbe缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的片段pir1和laca进行琼脂糖凝胶电泳；
[0070]
2.2在紫外灯下切出含有目的片段pir1p和laca的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体；
[0071]
2.3切碎胶块，称量胶块重。计算体积时，以1mg＝1μl进行计算；
[0072]
2.4向胶块中加入溶解液buffer gm，buffer gm加量没过胶块即可，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解；
[0073]
2.5将试剂盒中的过滤柱安置于2ml收集管上；
[0074]
2.6将步骤2.4得到的溶液转移至过滤柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；
[0075]
2.7将700μl的buffer wb加入过滤柱中，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
[0076]
2.8重复操作步骤2.7；
[0077]
2.9将过滤柱安置于2ml收集管上，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
[0078]
2.10将过滤柱安置于新的1.5ml的离心管上，在过滤柱膜的中央处加入50μl灭菌水，室温静置1min；
[0079]
2.11室温12000rpm离心1min洗脱pir1p和laca片段；
[0080]
2.12对纯化后的pir1p和laca目的片段进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度；其中pir1p和laca基因的核苷酸序列分别如seq id no：2和seq id no：1所示。
[0081]
(四)pir1p和laca基因overlap的连接。
[0082]
以步骤(三)提取的pir1p和laca基因为模板，采用pcr技术扩增pir1p laca overlap基因。
[0083]
反应体系如下表：
[0084]
表2 pcr反应体系
[0085][0086]
扩增pir1p laca overlap基因的引物如下：
[0087]
pir1p-up：
[0088]
aaagagaggctgaagcttacgtatatgctccaaaggaccc
[0089]
laca-down：
[0090]
ttaattcgcggccgccctaggttacttatcatcatcatccttgtaatcgt
[0091]
aagcaccctttctt。
[0092]
胶回收pir1p laca overlap步骤参考步骤(三)，跑胶结果见图2。
[0093]
(五)提取质粒ppic9k：
[0094]
利用axygen的提质粒试剂盒(axyprep
tm plasmid miniprep kit)操作。
[0095]
其中本操作中buffer s1-buffer s3、buffer w1-buffer w2均是axygen的提质粒试剂盒中的试剂。
[0096]
(1)从平板培养基上挑选e.coli dh5α单菌落(内含ppic9k，其核苷酸序列见seq id no：3)，其中e.coli dh5α购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，no.b528413，pet-28a的保存方法参考按照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，中国，科学出版社，2002，第三版)中方法进行；然后接种至5ml的含有抗生素的lb液体培养基中(抗性为氨苄霉素100mg/ml)，37℃过夜培养12-16h；
[0097]
(2)取2ml的过夜培养菌液，12000rpm离心1min，弃上清；
[0098]
(3)用250μl的4℃预冷的buffer s1(含rnase a)充分悬浮细菌沉淀；
[0099]
(4)加入250μl的buffer s2轻轻上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；
[0100]
(5)加入350μl的buffer s3轻轻上下翻转混合6-8次，直至形成紧实凝集块；
[0101]
(6)室温12000rpm离心10min，取上清液；
[0102]
(7)将试剂盒中的过滤柱安置于2ml收集管上；
[0103]
(8)将步骤(6)得到的上清液转移至过滤柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；
[0104]
(9)将500μl的buffer w1加入过滤柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；
[0105]
(10)将700μl的buffer w2加入过滤柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；
[0106]
(11)重复操作步骤(10)；
[0107]
(12)重新将过滤柱安置于2ml收集管上，12000rpm离心1min，除尽残留洗液；
[0108]
(13)将过滤柱安置于新的1.5ml的离心管上，在过滤柱膜的中央处加入30-50μl的65℃灭菌水，室温静置1min；
[0109]
(14)12000rpm离心1min洗脱dna；
[0110]
(15)对提取后的质粒ppic9k进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度。
[0111]
(六)利用限制性内切酶snabi和avrⅱ双酶切质粒ppic9k。
[0112]
表3酶切反应体系
[0113][0114]
[0115]
37℃酶切30min，跑胶验证(如图3)，确认片段正确后进行胶回收，步骤如(三)。
[0116]
(七)连接目的基因pir1p laca overlap和酶切后质粒ppic9k得到重组质粒ppic9k pir1p laca。
[0117]
表4一步克隆体系
[0118][0119]
37℃水浴30min后，立即冰浴5min，-20℃保存备用。
[0120]
(八)将重组质粒ppic9k pir1p laca转化到e.coli dh5α
[0121]
(1)从-80℃冰箱中取出一管100μle.coli dh5α感受态细胞(上海生工生物工程(上海)股份有限公司no.b528413)悬液，室温下解冻，解冻后立即置于冰上；
[0122]
(2)加入10μl步骤七得到的重组质粒ppic9k pir1p laca溶液于e.coli dh5α感受态细胞悬液中，轻轻摇匀，冰上放置30min；
[0123]
(3)42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却5min；
[0124]
(4)加入1ml的lb液体培养基混匀后，37℃振荡培养1h，使菌体恢复正常生长状态；
[0125]
(5)将上述菌液摇匀后取100μl涂布于lb抗性板，倒置培养皿，37℃恒温培养箱培养12h；
[0126]
其中lb抗性板的配方如下：氯化钠10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、琼脂粉20g/l，121℃灭菌20min，冷却后加氨苄霉素200μl(每200ml的lb培养基)；
[0127]
(6)从抗性板上挑取单菌落，保菌后，按步骤五提取质粒ppic9k pir1p laca，对提取后的质粒ppic9k pir1p laca进行琼脂糖凝胶电泳验证和测序验证，其核苷酸序列分别如seq id no：5所示。
[0128]
(九)将重组质粒ppic9k pir1p laca电转化到原始毕赤酵母中
[0129]
(1)将2-5μg的ppic9k pir1p laca重组质粒与毕赤酵母感受态混匀，于冰上预冷30min；
[0130]
(2)将混合液转移至2mm电转杯中，冰浴5min；
[0131]
(3)擦干电转杯外部水分，放入电转仪，进行电转(电压1500v，电容25μf，电阻200ω)；
[0132]
(4)向电转杯中加入1ml ypd培养基，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，250rpm，复苏1h；
[0133]
(5)6000rpm离心5min,弃900上清液，取200菌液涂布在md平板上，30℃培养至长出菌落；
[0134]
其中，md平板的配方如下：13.4g/lynb、20g/l葡萄糖、20g/l琼脂粉，等培养基冷却到60℃时，加入0.04％生物素过滤除菌。
[0135]
(6)菌落pcr验证是否为gs115-pir1p-laca重组酿酒酵母菌株。以质粒和基因连接处设置为上引物，基因片段1000bp处设置一个下引物，菌p结果为1000bp左右，结果正确，见图4。
[0136]
实施例2：重组菌原位染色实验。
[0137]
将上述pcr验证正确的单菌落，用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒检验laca
[0138]
基因表达和拷贝情况，若有颜色反应则证明laca基因表达，若相同时间内颜色越
[0139]
深则初步证明其拷贝数较多，具体操作如下：
[0140]
(1)挑取转化子于5mlypd液体培养基中，30℃250rpm培养过夜；
[0141]
(2)取2ml的ypd培养基加入到25ml/250ml bmgy培养基中,30℃250rpm培养20-24h；
[0142]
(3)取2ml的bmgy培养基,6000rpm离心5min,去上清，用无菌水洗涤菌体，并将沉淀转移至50ml/250ml bmmy中30℃250rpm培养72h,其中，每隔24h加1％的甲醇诱导培养。
[0143]
(4)用离心管取1ml菌体，6000rpm离心5min，去上清；
[0144]
(5)用pbs洗涤细胞3次，配制染色工作液(1ml体系)
[0145]
表5染色工作液体系
[0146][0147]
(6)每支离心管中加入500μl染色工作液，用移液枪悬浮菌体，37℃孵育，
[0148]
随时记录每支离心管颜色变蓝的时间，至蓝色不再变化，观察颜色深浅，并在光
[0149]
学显微镜下观察细胞形态，如图5所示。
[0150]
结论：如图，左边的是毕赤酵母重组表面展示菌株和原始对照，重组表面展示菌株gs115-pir1p-laca在刚加入染色液没多久就开始出现蓝色，过了10分钟左右蓝色已经非常深，并且不再变化。通过光学显微镜可以观察到，菌株表面几乎都变成了蓝色，说明β-半乳糖苷酶基因laca表达量高。
[0151]
实施例3：细胞表面展示重组毕赤酵母gs115-pir1p-laca菌株免疫荧光检测实验。
[0152]
为了检测laca基因是否展示在毕赤酵母表面，采取免疫荧光标记的方法，以荧光显微镜下的细胞形态判定该基因是否展示在酵母表面，同时以原始菌株pichia pastoris gs115做空白对照，具体方法如下：
[0153]
(1)在bmmy培养基中分别培养细胞至120h，取1ml培养结束的菌体，7000rpm离心5min并收集菌体；
[0154]
(2)弃上清，加入pbs(ph 7.4)洗涤悬浮细胞3次，7000rpm离心5min；
[0155]
(3)用1ml含2％bsa的pbs(ph 7.4)悬浮菌体，封闭5min；
[0156]
(4)取200μl菌体悬浮液于1.5ml离心管中，免疫反应的一抗(flag tag mouse monoclonal antibody)按1:100稀释；
[0157]
(5)将上述含有混合液的离心管用锡箔纸包裹，置于37℃，60rpm摇床中轻摇3h，使菌体处于悬浮状态；
[0158]
(6)取出混合液，7000rpm离心5min；
[0159]
(7)用1ml pbs(ph 7.4)洗涤3次(轻柔)，7000rpm离心5min；
[0160]
(8)用含2％bsa的pbs(ph 7.4)洗涤菌体(轻柔)，7000rpm离心5min；
[0161]
(9)用200μl含有2％bsa 的pbs(ph 7.4)悬浮菌体，每管加入1μl二抗(fitc标记的山羊抗小鼠igg)，体积比按1:500稀释；
[0162]
(10)用1ml pbs(ph 7.4)洗涤3次，7000rpm离心5min，最终用200μl pbs(ph 7.4)悬浮菌体。
[0163]
利用荧光显微镜检测、观察免疫荧光标记处理后的重组毕赤酵母gs115-pir1p-laca细胞和原始细胞的区别，结果如图6。
[0164]
结论：如图所示，上面的图是以gs115-ppic9k为原始对照，在荧光显微镜下不发光，而下图中的毕赤酵母重组菌株gs115-pir1p-laca在荧光显微镜下发出绿色荧光，并且荧光显微镜下的细胞形态是整个菌体表面在发光，说明laca 基因成功展示在毕赤酵母表面。
[0165]
实施例4：重组毕赤酵母gs115-pir1p-laca的诱导表达和酶活测定实验。
[0166]
一、诱导表达实验
[0167]
(1)在md平板上划线分离菌落pcr鉴定正确的重组毕赤酵母菌株，30℃培养2-3天；
[0168]
(2)分别挑取3个单菌落接种至装有5m l ypd液体培养基的50ml离心管中，30℃,250rpm过夜培养制备种子液；
[0169]
(3)在超净工作台中取2ml种子液接种至装液量为25mlbmgy培养基的250ml三角瓶中，在30℃,250rpm培养至od600达到2-6。
[0170]
(4)取2ml的bmgy培养基,6000rpm离心5min,去上清，用无菌水洗涤菌体，并将沉淀转移至50ml/250ml bmmy中30℃250rpm培养120h，其中，每隔24h取1ml诱导液测定酶活，同时加1％的甲醇继续诱导培养。
[0171]
二、酶活测定实验
[0172]
邻硝基苯-β-d-半乳糖苷(o npg)无色、易溶于水，在β-半乳糖苷酶的催化下，o npg发生水解生成邻硝基苯酚(onp)，420nm波长下，onp有最大吸收峰。
[0173]
分别取200、400、600、800、1000、1200、1400、1600μl浓度为0.1m/l 的onp溶液加入试管中，定容至10ml，以h2o为空白，在420nm比色，以onp浓度为横坐标，相对应的od420为纵坐标绘制标准曲线，如图8所示。
[0174]
如步骤一，每隔24h取1ml诱导液，用pbs洗涤两次，弃上清。向沉淀中加入50μl的pbs悬浮沉淀，将50μl的样品加入到96孔板中，并在每个孔板中加入β-半乳糖苷酶检测试剂50μl，混合后盖上盖子，放置37℃培养箱中反应十分钟至样品内出现浅黄色，加入150μl反应终止液终止反应。之后使用酶标仪在od420 nm处测定吸光度，结果如图7所示。
[0175]
其中1个酶活力单位定义为以o npg为底物，每分钟生成1μmol的onp所需细胞量。结果如图所示，以游离的gs115-laca重组菌株为对照，重组菌株gs115-laca在96h时达到最高酶活，最高酶活为4429.67u/g，而游离菌株在96h的时候也达到最高酶活，酶活最高为29.3u/ml，表面展示菌株上清中也发现了少量酶活，并且酶活力随着时间逐渐升高，我们猜
测，可能并不是所有的酶展示在细胞表面，由于毕赤酵母是蛋白分泌表达的常用宿主，可能会有许多胞外水解酶分泌到培养基中。
[0176]
实施例5：重组毕赤酵母gs115-pir1p-laca的发酵实验。
[0177]
(1)挑取单菌落接种至装有5m lypd液体培养基的50ml离心管中，30℃,250rpm过夜培养制备种子液；
[0178]
(2)在超净工作台中取2ml种子液接种至装液量为25mlbmgy培养基的250ml三角瓶中，在30℃，250rpm培养至od600达到2-6。
[0179]
(3)取8ml的bmgy培养基，6000rpm离心5min，去上清，用无菌水洗涤菌体，并将沉淀转移至200ml/500ml bmmy中30℃250rpm培养120h，其中，每隔24h加1％的甲醇继续诱导培养。
[0180]
(4)发酵结束后，离心收集菌体，用pbs缓冲液(ph 5.5)洗涤细胞三次，约15000mg酵母干重细胞直接用于细胞转化。
[0181]
(5)配制500g/l乳糖作为底物，在ph＝5.5、60℃的转化体系里200rpm摇瓶培养，不同时间段取样500μl，离心稀释，hplc分析各组分含量。
[0182]
结果如图9所示：表面展示菌株在6h时产量达到最高，最高产量为239g/l，最高转化率为47.8％，而游离酶在12h时产量达到最高，最高产量为175g/l，最高转化率为35％，表面展示菌株的产量提升了64g/l，表面展示菌株从7-24h内酶活相对稳定，表面展示菌株缩短了最高产量的生成时间，且该表面展示的方法具有较高产率。
[0183]
本发明提供了一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及其构建的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。