测量样品的pH的方法与流程

测量样品的ph的方法
技术领域
1.本发明提供了一种更灵敏和更准确的监测溶液的ph的方法，其中溶液的ph被定量为两电极或三电极电化学电池中溶液的电化学反应的函数，其中所述溶液包含其氧化态和/或结构构象能够随溶液ph的变化而变化的化合物。
2.本发明还提供了能够对样品例如生物样品中的特定多核苷酸序列进行分析的高加速方法和过程。本发明的方法例如可用于在即时(point-of-care)情况下对大量样品进行快速筛选。
3.发明背景
4.核酸扩增方法对于医学和环境诊断至关重要，通常被认为是多种诊断应用中的黄金标准。聚合酶链反应、定量聚合酶链反应、逆转录酶聚合酶链反应和定量逆转录酶聚合酶链反应等传统方法在很大程度上依赖于热循环来驱动扩增，因为常用的聚合酶需要不同的温度进行变性、退火和延伸。这些方法的技术问题和由此产生的高实施成本阻碍了它们的即时使用。等温扩增方法如分支滚环扩增(branched rolling circle amplification)和环介导等温扩增是替代方法。
5.核酸扩增子的定量和扩增的实时监测是间接的并且需要标记，这对于扩增反应来说不是必需的。这些可以包括与寡核苷酸或引物连接的荧光染料或发色团，dna嵌入染料，沟槽结合剂(groove binder)，与核苷酸、磷酸基团、核糖或脱氧核糖基团以及核酸内源性的氮碱基结合的染料。这些染料或复合物可在与dna结合时表现出光谱偏移，当被合适波长的光激发时经历荧光共振能量转移和/或荧光量级的变化，从而促进光学检测。这种定量方法需要昂贵且灵敏的光学器件，从而进一步限制了分子诊断在即时应用中的使用。
6.这些dna结合分子中的一些，例如hoechst 33258、亚甲蓝、核酸结合过渡金属复合物，例如含钌、锇或铂的复合物，也具有电活性，并且可以通过将所述分子与成功扩增时新生成的扩增子连续隔离以及随后降低的反应混合物的电导率来促进间接电化学检测。
7.另外的电化学检测方法包括将酶、引物或探针寡核苷酸固定在电极表面，从而驱动对扩增子或副产物的定量。这些方法中的大多数要么是间接的，要么需要昂贵的设备。
8.环介导等温扩增技术的最新发展包括在弱缓冲反应混合物中比色检测rna和dna靶标，这是由ph敏感的染料介导的(wo 2017/209920、wo 2014/031783)。由于低浓度tris导致的弱缓冲被扩增过程中释放的质子克服，并导致通过ph指示剂颜色变化指示的终点检测。所述方法已被推行用于即时检测，但遇到反应时间长、对低核酸浓度灵敏度低以及需要昂贵的光学设备进行定量的问题。


技术实现要素：

9.本发明提供了一种更灵敏和更准确的监测溶液的ph的方法，其中溶液的ph被定量为三电极电化学电池中溶液的电化学反应的函数，其中溶液包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂。已发现这种更灵敏和更准确的方法在确定样品中是否存在靶多核苷酸时，以及还在定量样品中存在的靶多核苷酸时提供快速和准确的结果。
10.因此，本发明还提供了一种对样品中的靶多核苷酸进行定量的方法。所述方法可以以高灵敏度进行，无需光学设备进行定量，并且反应时间短。特别地，可以从电化学电池例如三电极电化学电池的电化学反应(例如，电流和/或电势和/或阻抗)的变化速率推导出靶多核苷酸的定量。
11.因此，本发明提供了能够对样品中的特定多核苷酸序列进行分析的高加速方法和过程。这些方法确实可用于在即时情况下对大量样本进行快速筛选。
12.这之所以成为可能，是因为对核酸扩增技术(例如lamp)与使用电化学电池(例如，三电极电化学电池或具有多个膜电极(film electrode)的电化学电池)对信号传导物质进行电化学定量相结合的创造性探索。
13.本发明在所附权利要求中定义。
14.根据本发明的第一个方面，提供了一种测量溶液的ph的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0015]-提供包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂的溶液；
[0016]-将溶液应用于三电极电化学电池；
[0017]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0018]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0019]
根据本发明的另一个方面，提供了三电极电化学电池用于测量溶液的ph的用途，所述用途包括：
[0020]-提供包含醌、醌衍生物、ph指示剂或其组合的溶液；
[0021]-将溶液应用于三电极电化学电池；
[0022]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0023]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0024]
根据本发明的另一个方面，提供了三电极电化学电池用于监测核酸扩增反应的用途，所述用途包括：
[0025]-提供包含醌、醌衍生物、ph指示剂或其组合的溶液；
[0026]-提供lamp混合物，其包含：包含靶多核苷酸的样品，至少两种例如至少四种引物，每种引物侧翼是靶多核苷酸，和lamp试剂；
[0027]-将溶液和lamp混合物应用于三电极电化学电池；
[0028]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0029]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0030]
根据本发明的另一个方面，提供了用于测量溶液的ph的系统，所述系统包含：
[0031]
a.包括恒电势仪(potentiostat)的仪器；和
[0032]
i.包含三电极电化学电池的第一接受器和包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第二接受器，或
[0033]
ii.包含三电极电化学电池和醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第一接受器，
[0034]
其中恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
附图说明
[0035]
图1：lamp引物及其退火的多核苷酸序列的示意图。箭头表示引物退火的位置，不
同的灰色阴影表示互补性。fip：正向内引物。bip：反向内引物。f3：正向外引物。b3：反向外引物。fl：正向环引物。bl：反向环引物。
[0036]
图2：(a)将在经过适当处理(如果有的话)后的合适的载体或运输介质(如果有的话)中的流体或流体化或重悬的生物样品与(b)lamp引物和(c)来自new england biolabs inc的warmstart colorimetric lamp 2x master mix混合，并立即添加到(d)ph传感丝网印刷电极或丝网印刷电极，该电极在59-75℃下并与恒电势仪连接，并使伏安法或其他电化学测量运行1至90分钟。测量(e)信号随时间的变化。与平行化或预校准的非模板对照相比1至90分钟内的信号零变化，表明(f)不存在模板核酸。信号的显著非零变化表明(g)存在模板核酸，并且通过使用预先确定的对lamp引物和生物样品及其处理特异的校准曲线，使用该值的变化速率来定量生物样品中模板核酸的量。
[0037]
图3：酚红的循环伏安图。确定了分别在
–
0.35v、0.2v和0.55v处的三个峰值。
[0038]
图4：在裸玻碳电极上，从相对于ag/agcl的1.5v开始，以100、300、500、700和900mv/s的扫描速率，对在0.1m pbs中ph 7.9下缓冲的含1.0mm酚红的溶液进行阴极循环伏安法扫描。插图分别显示了电流对扫描速率和扫描速率平方根的依赖性。
[0039]
图5：在裸玻碳电极上，从相对于ag/agcl的1.5v开始，以100mv/s的扫描速率，在不同的切换电势(switching potential)下对含有1.0mm酚红的溶液(在0.1m pbs中在ph 7.9下缓冲的)进行阴极循环伏安法扫描。插图显示了-0.75v附近根据切换电势而变化的ipc/ipa比率。
[0040]
图6：在裸玻碳电极上，对用0.1m pbs分别在ph(a)3.9、(b)7.9和(c)11.9下缓冲的含有1.0mm酚红的溶液进行阳极循环伏安法扫描；(d)代表对溶液(b)从更正电势开始的扫描。这些相应ph溶液的阴极循环伏安法扫描标记为a'、b'和c'。
[0041]
图7a-d：酚红在6.5至8.5的ph范围内和不同的酚红浓度下的方波伏安法示例。图7b和7d显示了峰位置(电压)和高度(电流)与酚红浓度的关系。
[0042]
图8：将ph与酚红输出信号相关联的内部算法示例，其中使用优化算法来嵌套峰电势(在0.5v左右(相对于ag/agcl)鉴定的峰)和峰电流。
[0043]
图9：显示在酚红溶液的循环伏安法中观察到的峰的伏安图。
[0044]
图10：显示传感器环境控制器设计的示意图。
[0045]
发明详述
[0046]
定义
[0047]
如本文所用，术语“核苷酸有义链”是指与核苷酸反义链互补的dna或rna链。
[0048]
如本文所用，术语“核苷酸反义链”是指与核苷酸有义链互补的dna或rna链。
[0049]
如本文所用，术语“正向内引物”或“fip”是指具有3'末端和5'末端的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含位于寡核苷酸3'末端的第一部分和位于寡核苷酸5'末端的第二部分。通常，第一部分与靶多核苷酸的反义链中的核苷酸序列互补，第二部分与靶多核苷酸的有义链中的核苷酸序列互补。换言之，第一部分可以是f2区域，第二部分可以是f1c区域。f2区域与靶dna序列中的f2c区域互补，而f1c区域与靶dna序列中的f1区域互补(图1)。
[0050]
如本文所用，术语“反向内引物”或“bip”是指具有3'末端和5'末端的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含位于寡核苷酸3'末端的第一部分和位于寡核苷酸5'末端的第二部分。通常，第一部分与靶多核苷酸的有义链中的核苷酸序列互补，第二部分与靶多核苷酸的反义
链中的核苷酸序列互补。换言之，第一部分可以是b2区域，第二部分可以是b1c区域。b2区域与靶dna序列中的b2c区域互补，b1c区域与靶dna序列中的b1区域互补(图1)。
[0051]
如本文所用，术语“正向外引物”或“f3”是指与靶多核苷酸的反义链中的核苷酸序列互补的寡核苷酸。因此，f3可包含与靶dna序列中的f3c区域互补的区域(图1)。
[0052]
如本文所用，术语“反向外引物”或“b3”是指与靶多核苷酸的有义链中的核苷酸序列互补的寡核苷酸。因此，b3可包含与靶dna序列中的b3c区域互补的区域(图1)。
[0053]
如本文所用，术语“正向环引物”或“fl”是指与靶多核苷酸的有义链中的多核苷酸序列互补的寡核苷酸。因此，fl与靶dna序列上称为flc的部分互补(图1)。
[0054]
如本文所用，术语“反向环引物”或“bl”是指与靶多核苷酸的反义链中的多核苷酸序列互补的寡核苷酸。因此，bl与靶dna序列上称为blc的部分互补(图1)。
[0055]
如本文所用，术语“核酸扩增”是指用于复制和增殖样品中的特定核酸序列的任何核酸步骤/方法/方案。
[0056]
术语“lamp”是指环介导等温扩增。lamp是用于扩增核酸的反应。lamp使用靶向靶序列内或周围的6个(或8个)区域的4个(或6个)引物(图1)。所述方法依赖于等温条件，即它在恒定温度下进行，并且不需要热循环仪。简言之，当靶基因与靶特异性引物fip、bip、f3和b3以及聚合酶在59和75℃范围内的恒定温度下孵育时，发生靶基因的lamp扩增。包括正向和反向环引物，分别为fl和bl，可以添加到lamp扩增中。可以通过任何合适的方法检测扩增产物。所述方法的结果可以与lamp扩增过程中产生的dna拷贝数相关联，并因此可以作为定量样品中存在的dna的量的基础。定量检测既可以通过终点测量也可以通过实时测量进行。dna也可以是cdna。
[0057]
术语“rt-lamp”是指逆转录环介导等温扩增。rt-lamp将lamp与逆转录步骤相结合，以检测rna。
[0058]
如本文所用，术语“核酸扩增试剂”是指添加到样品中以实现样品内任何靶多核苷酸的扩增的试剂。
[0059]
如本文所用，术语“lamp试剂”是指除了样品和至少四种引物之外添加到lamp中的试剂。lamp试剂至少包含核苷酸和核酸聚合酶。此外，lamp试剂可以包含其他化合物，例如盐和缓冲液。核酸聚合酶优选具有高的链置换活性和复制活性。
[0060]
如本文所用，术语“信号传导物质(signaling substance)”是指扩增试剂(例如lamp试剂)或发生变化的样品，或在核酸扩增过程中产生、消耗或发生相变的试剂的任何物理量，其量可以被检测到并因此可以用于证明或定量扩增反应，例如h 离子的产生，或样品/反应混合物的ph或电导率的下降。
[0061]
如本文所用，术语“靶序列”是指希望检测到的任何核酸序列。在一个实施方案中，靶序列是核酸序列，优选地是可以通过任何核酸扩增技术例如lamp扩增的核酸序列，优选地其中使用侧翼是靶序列的至少四种引物来扩增靶核酸序列。
[0062]
如本文所用，术语“靶多核苷酸”涵盖术语“靶核酸”，除非另有明确说明，否则这两个定义可以互换使用。
[0063]
如本文所用，术语“电化学装置”是指能够通过测量包含分析物的电化学电池中的电势(伏特)和/或电流(安培)来研究分析物的任何装置。通常，使用电化学装置进行测量的三个主要类别是电势法(测量电极电势差)、库仑法(随时间测量电池电流)和伏安法(在主
动改变电池电势时测量电池电流)。当涉及本发明的第一方面时，如本文所用的术语“电化学装置”也可以与术语“三电极电化学电池”互换使用。为避免疑义，除非另有明确说明，否则本文中关于“电化学装置”所描述的所有实施方案均指本发明第二方面的电化学装置和本发明第一方面的三电极电化学电池两者。
[0064]
如本文所用，术语“三电极电化学电池”是指包含三个不同电极即工作电极、对电极和参比电极的电化学电池。在使用中，电化学电池的所有三个电极均与被分析的溶液接触。在三电极实验过程中，电荷流动(电流)主要发生在工作电极和对电极之间，而工作电极的电势是相对于参比电极测量的。
[0065]
如本文所用，术语“两电极电化学电池”是指包含两个电极的电化学电池，其中一个电极是工作电极，第二电极是合并的参比电极和对电极。也就是说，第二电极是三电极电池的变体，其中参比电极和对电极变短并充当一个电极，即它们是同一电极。
[0066]
如本文所用，术语“电极”是指提供电流流入或流出电化学系统的路径的导电材料(通常由碳、金属或复合材料制成)。在电化学测量期间，电极表面的某些部分与离子导电介质或电解质直接接触，电荷通过这种直接接触在其他电极之间转移。
[0067]
如本文所用，术语“醌”是指有机化合物，其是含有相邻或被亚乙烯基(-ch＝ch-)基团分隔开的两个羰基(c＝o)基团的环状有机化合物。
[0068]
如本文所用，术语“醌衍生物”是指衍生自如上定义的醌的化合物，其中化合物环状主链中的一个或多个氢原子已被其他原子或基团置换。
[0069]
如本文所用，术语“方波伏安法”是指线性电势扫描伏安法的一种形式，其使用施加到固定电极的组合的方波和阶梯电势。
[0070]
如本文所用，术语“电化学反应”是指引起或伴随电流通过的任何可测量的过程。这种可测量的电化学反应包括测量系统的电势、电流或阻抗，或者实际上任何这些测量的组合。
[0071]
如本文所用，术语“ph指示剂”是指加酸显色的(halochromic)化学化合物，其是当ph发生变化时会改变颜色的化学化合物，并且其如果以少量添加到溶液中，可使溶液的ph(酸度或碱度)能够目测确定。
[0072]
如本文所用，术语儿茶酚包括具有根据以下通式i的结构单元(structural motive)的所有基团：
[0073][0074]
因此，残基r1、r2、r3和r4可以不存在、是氢或任何有机残基或任何有机金属残基。优选的残基是脂肪族或芳香族链(例如，c
1-c
10
脂肪族链或c
6-c
20
芳香族残基)，其可以任选地被含有氮、氧和/或硫原子的部分中断或取代，例如被-nh2、-nh-、-oh、＝o、-o-、-sh和/或-s-s-中断或取代。残基r1、r2、r3和r4在每种情况下可以彼此独立地具有相同的含义或不同的含义。如本文所用，术语儿茶酚也指取代的邻二羟基苯衍生物。儿茶酚代表两种不同的异构构象，也称为邻苯二酚和苯-1,2-二醇。
[0075]
术语“儿茶酚基团”也指儿茶酚的氧化形式及其衍生物，也被称为醌，对应于以下通式ii：
[0076][0077]
残基r1、r2、r3和r4可以具有与前文解释的相同的含义。
[0078]
如本文所用，术语“接受器(receptacle)”涉及器皿(vessel)，例如适合于容纳液体例如水性溶液的容器(container)。接受器通常包含口(aperture)和可用于关闭该口的盖子。根据本公开的接受器还可以包含三电极电化学电池。
[0079]
测量溶液的ph的方法
[0080]
根据本发明的一个方面，提供了一种测量溶液的ph的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0081]-提供溶液，所述溶液包含其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物；
[0082]-将所述溶液应用于两电极或三电极电化学电池；
[0083]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0084]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0085]
根据本发明的另一个方面，提供了一种测量溶液的ph的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0086]-提供溶液，所述溶液包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂；
[0087]-将所述溶液应用于三电极电化学电池；
[0088]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0089]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0090]
在一个实施方案中，所述溶液包含多种化合物，它们的氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化。也就是说，所述溶液可以包含多种结构不同的化合物，这些化合物的氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化，例如两种或更多种化合物，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种化合物。
[0091]
在另一个实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是儿茶酚、儿茶酚衍生物和/或包含儿茶酚基团的化合物。
[0092]
在另一个实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是醌、醌衍生物、ph指示剂或它们的组合。
[0093]
在进一步的实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是醌或醌衍生物，所述醌衍生物选自1,2-苯醌、1,4-苯醌、1,4-萘醌、9,10-蒽醌及其衍生物和组合。
[0094]
在另一个实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是选自以下的ph指示剂：孔雀石绿草酸盐(malachite green oxalate)、亮绿、黄色曙红(eosin yellowish)、赤藓红b、甲基绿、甲基紫、苦味酸、甲酚红、结晶紫、间甲酚紫、百
里酚蓝、对二甲酚蓝、(蓝色)曙红(eosin(bluish))、喹哪啶红(quinaldine red)、2,4-二硝基苯酚、4-(二甲基氨基)偶氮苯、溴氯酚蓝、溴酚蓝、刚果红(congo red)、甲基橙、溴甲酚绿、2,5-二硝基苯酚、茜素磺酸、甲基红、氯酚红、石蕊、溴甲酚紫、溴酚红、4-硝基苯酚、溴二甲酚蓝、溴百里酚蓝、酚红、3-硝基苯酚、中性红(neutral red)、甲酚红、1-萘酚酞(1-naphtholphthalein)、间甲酚紫、百里酚蓝、对二甲酚蓝、酚酞、百里酚酞、碱性蓝、茜素黄gg、靛洋红(indigo carmine)、依波西隆蓝(epsilon blue)、达旦黄(titan yellow)，及其组合。在一个实施方案中，所述溶液包含本段所列化合物中的至少两种，例如本段所列的至少三种、四种或五种化合物。
[0095]
在本公开的一个实施方案中，在同一水性溶液中提供两种或更多种化合物，所述化合物是儿茶酚、儿茶酚衍生物、包含儿茶酚基团的化合物、醌、醌衍生物或ph指示剂。因此，ph测量和定量可以在更大的ph标度上进行，例如在ph 5至8之间，例如在ph 4至8之间，例如在ph 3至8之间，例如在ph 3至9之间，例如在ph 4至9之间，例如在ph 5至9之间，例如在ph 6至9之间，例如跨所有ph范围内。
[0096]
在本公开的一个实施方案中，三电极电化学电池不包括醌氢醌(quinhydrone)电极。事实上，当测试溶液本身由于生化或化学反应而导致开路电势(ocp)随时间发生变化时，醌氢醌电极无法有效测量溶液的ph。此外，醌氢醌电极存在盐误差。醌氢醌电极的功能性可能会因氧化剂和还原剂的存在而受损，并且氢醌电极会因微量金属(例如铜、银和其他在电动序(electromotive series)中低于锑的金属)而中毒，如果在待分析的溶液中存在络合剂，这还可能会干扰ph的测量。
[0097]
更重要的是，醌氢醌电极不适合用于三电极电化学电池中，因为醌氢醌及其水性解离产物不能在三电极电化学电池中进行电化学分析，例如区分。因此，醌氢醌电极不适用于本文公开的方法和系统。
[0098]
因此，在本公开的一个实施方案中，醌、醌衍生物和/或ph指示剂不是醌氢醌。
[0099]
使用儿茶酚、儿茶酚衍生物和/或包含儿茶酚基团的化合物，例如醌或醌衍生物，例如任何一种所列出的特定化合物，例如酚红，在溶液的ph的定量上提供了多种优势。优势之一是ph测量的高分辨率，尤其是与使用测量水性溶液中氢离子活性的标准ph计定量ph相比具有更高的分辨率。这是由于富氧化还原的化学引起的，其表征儿茶酚、儿茶酚衍生物和/或包含儿茶酚基团的化合物，例如醌或醌衍生物，例如任何一种所列出的特定化合物，例如酚红，如本公开实施例3中详细提供的。
[0100]
因此，本公开中公开的方法和系统提供准确和瞬时的ph测量，因为ph测量的反应时间不取决于离子(例如质子)穿过半透膜或吸附膜的扩散，而是基于测量与儿茶酚、儿茶酚衍生物和/或包含儿茶酚基团的化合物例如醌或醌衍生物或ph指示剂的电化学状态相关的电化学反应。
[0101]
在进一步的实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是酚红。
[0102]
在另一个实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是弱酸，例如pka为约2至约14、例如pka为约4至约12、例如pka为约6至约10的弱酸。
[0103]
在一个实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物溶解在溶液中。也就是说，其氧化态和/或结构构象能够随着样品溶液ph的变化而变化
的化合物没有与两电极或三电极化学电池的任何电极结合，特别是没有不可逆地结合，无论是化学结合还是通过任何物理方法结合。
[0104]
在另一个实施方案中，溶液是水性溶液。具体地，溶液是包含至少90体积％的水，例如至少91、92、93、94、95、96、97、98或99体积％的水的水性溶液。例如，溶液是包含大于99体积％的水的水性溶液。
[0105]
在一个实施方案中，通过动电势电化学法(potentiodynamic electrochemistry)，例如循环方波伏安法、方波伏安法、线性扫描伏安法、循环伏安法或开路电势法测量两电极或三电极电化学电池的电势。
[0106]
在进一步的实施方案中，电化学电池是两电极化学电池，并且电池的电势通过开路电势法测量。
[0107]
在一个实施方案中，电化学电池是三电极化学电池，并且电池的电势通过循环方波伏安法、方波伏安法、线性扫描伏安法或循环伏安法测量。
[0108]
在另一个实施方案中，在相对于ag/agcl约-2至约2v，例如相对于ag/agcl约-1至约1v，例如相对于ag/agcl约-0.6至约0.6v的扫描范围下运行方波伏安法步骤。
[0109]
在进一步的实施方案中，方波伏安法步骤以约1至约50hz、例如约5至约20hz的频率运行。
[0110]
在一个实施方案中，方波伏安法步骤以约1至约20mv、例如约1至约10mv的电势阶跃运行。
[0111]
在另一个实施方案中，方波伏安法步骤以约1至约50mv、例如约1至约25mv、例如约5至约20mv的幅度运行。
[0112]
在进一步的实施方案中，其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物在溶液内的浓度为约1μm至约1000μm，例如约1μm至约500μm，例如约5μm至约250μm，尤其约50μm至约200μm，例如约50μm至约150μm，例如约50μm至约100μm。
[0113]
在一个实施方案中，将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数的步骤通过应用回归算法例如线性回归算法来进行。不希望受到理论的束缚，线性回归算法以线性方式将ph与氧化还原电势和电流的函数相关联。
[0114]
在另一个实施方案中，溶液包含缓冲剂。
[0115]
在一个实施方案中，缓冲液包含20至450μm的量的三氨基甲烷。
[0116]
在进一步的实施方案中，缓冲液包含5至20mm的量的(nh4)2so4。
[0117]
在另一个实施方案中，缓冲液包含25至100mm的量的kcl。
[0118]
在一个实施方案中，缓冲液包含5至20mm的量的mgso4。
[0119]
在一个实施方案中，缓冲液包含1至5mm的量的脱氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate)。
[0120]
在另一个实施方案中，缓冲液包含0.05至1％v/v的量的吐温-20。
[0121]
本公开的另一个方面涉及醌、醌衍生物和/或ph指示剂用于定量溶液的ph的用途，
[0122]
其中溶液在电化学电池中，并且
[0123]
其中通过测量电化学电池中的电化学反应来定量ph。
[0124]
定量靶多核苷酸的方法
[0125]
如以下进一步定义的，本发明的第一方面的方法还可以包括提供样品的步骤。在
一个实施方案中，将样品提供在溶液中，也就是说溶液可以包含样品。样品可以是任何样品。在一个优选的实施方案中，样品是生物样品。其非限制性示例是如下文进一步定义的体液样品或组织样品。
[0126]
设想样品可以包含或可以不包含靶多核苷酸/靶核酸。因此，在本发明的第一方面的一个实施方案中，所述方法允许确定溶液中靶多核苷酸的存在。也就是说，所述方法允许测量溶液的ph并且由此允许确定靶多核苷酸是否存在于溶液中。
[0127]
在一个实施方案中，溶液进一步包含引物和核酸扩增试剂，优选地其中核酸扩增试剂是lamp试剂。
[0128]
在进一步的实施方案中，核酸扩增试剂包含信号传导物质，或能够释放信号传导物质，或包含信号传导物质和能够释放信号传导物质的物质这两者。
[0129]
在另一个实施方案中，信号传导物质是h

和/或h3o

。
[0130]
在另一个实施方案中，lamp试剂包含逆转录酶。
[0131]
在另一个实施方案中，引物包括正向内引物、反向内引物、正向外引物和反向外引物。
[0132]
在一个实施方案中，lamp扩增用另外一对环引物例如正向环引物和/或反向环引物进行。
[0133]
在一个实施方案中，fip/bip以1.6μm的量存在于溶液中，f3/b3以0.2μm的量存在，且loopf/b以0.4μm的量存在。
[0134]
在一个实施方案中，bst dna聚合酶以0.32u/μl的量存在于溶液中，并且逆转录酶以0.3u/μl的量存在。
[0135]
在一个实施方案中，所述方法包括进行核酸扩增步骤(例如，等温核酸扩增步骤)、优选多个核酸扩增步骤的步骤。核酸扩增步骤有利地在将溶液应用于两电极或三电极电化学电池之后进行。在进一步的实施方案中，进行核酸扩增、测量电化学电池的电化学反应和将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数的步骤可以按此顺序依次进行，或以任何其他顺序进行，或可以同时进行，并且所述步骤也可以同时且连续地进行。
[0136]
设想在本发明第一方面的方法中可以使用任何核酸扩增步骤/方案/方法，并且此类扩增方法可以选自聚合酶链反应(pcr)(包括巢式(n)、定量(q)或实时逆转录酶(rt)pcr)、本文别处定义的lamp、滚环扩增和基于核酸序列的定量扩增(qt-nasba)。
[0137]
在一个具体的实施方案中，核酸扩增步骤/方案/方法是等温的，例如其中核酸扩增是等温的，并且在40至80℃、例如50至70℃、例如57至65℃范围内的温度下进行。
[0138]
在一个实施方案中，核酸等温扩增步骤是lamp步骤或滚环扩增步骤。
[0139]
在进一步的实施方案中，核酸扩增步骤是lamp步骤。为避免疑义，在仅进行一个核酸扩增步骤的情况下，在该实施方案中仅进行一个lamp步骤。然而，当设想多个核酸扩增步骤时，则进行多个lamp步骤。
[0140]
在一个实施方案中，所述方法用于定量溶液或在溶液中提供的样品中的靶多核苷酸的量。
[0141]
在另一个实施方案中，测量电化学电池的电化学反应的步骤包括测量由于信号传导物质的浓度变化引起的电化学电池的电流和/或阻抗和/或电势的变化。
[0142]
在进一步的实施方案中，所述方法包括从两电极或三电极电化学电池的电化学反
应(例如，电流和/或阻抗和/或电势)的变化速率推导核酸扩增速率的步骤。
[0143]
在一个实施方案中，推导核酸扩增速率的步骤与测量两电极或三电极电化学电池的电化学反应的步骤同时进行。
[0144]
在进一步的实施方案中，核酸扩增步骤在核酸扩增时产生或消耗信号传导物质，例如h

。其前提是核酸/多核苷酸最初就存在于溶液中。由于信号传导物质的浓度变化，信号传导物质的产生或消耗继而引起电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗的变化。作为电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗变化的结果，定量的ph值也发生变化，并且从这种ph变化可以推导出核酸/靶多核苷酸的扩增速率。为避免疑问，推导扩增速率的步骤对于确定溶液中是否存在靶多核苷酸不是必需的，因为电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗的任何可检测变化和随后定量的ph变化将指示多核苷酸的存在。
[0145]
因此，本发明的具体第一方面提供了一种测量溶液的ph和确定溶液中靶多核苷酸的存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0146]
a.提供溶液和样品，所述溶液包含其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物；
[0147]
b.将所述溶液应用于两电极或三电极电化学电池；
[0148]
c.如果存在靶多核苷酸，则进行至少一个或多个核酸扩增步骤，其中核酸扩增产生或消耗信号传导物质；
[0149]
d.测量电化学电池的电化学反应，例如由于信号传导物质的浓度变化而导致的电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗的变化；
[0150]
e.将溶液的ph和/或溶液的ph变化定量为电化学电池的电化学反应的函数；和
[0151]
f.任选地，通过电化学电池的电化学反应的变化速率推导样品中靶多核苷酸(如果最初存在的话)的扩增速率，从而定量样品中靶多核苷酸的量。
[0152]
因此，本发明的具体第一方面提供了一种测量溶液的ph和确定溶液中靶多核苷酸的存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0153]
a.提供醌、醌衍生物和/或ph指示剂；
[0154]
b.将溶液应用于三电极电化学电池；
[0155]
c.如果存在靶多核苷酸，则进行至少一个或多个核酸扩增步骤，其中核酸扩增产生或消耗信号传导物质；
[0156]
d.测量电化学电池的电化学反应，例如由于信号传导物质的浓度变化而导致的电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗的变化；
[0157]
e.将溶液的ph和/或溶液的ph变化定量为电化学电池的电化学反应的函数；和
[0158]
f.任选地，通过电化学电池的电化学反应的变化速率推导样品中靶多核苷酸(如果最初存在的话)的扩增速率，从而定量样品中靶多核苷酸的量。
[0159]
上述段落中的步骤c.、d.、e.和f.可以按照所示的顺序或以另外的顺序依次进行，或者它们可以同时进行，例如同时且连续地进行。
[0160]
为避免疑义，设想本发明不限于靶多核苷酸是否最初存在于样品中。也就是说，核酸扩增步骤可以在含有不包含靶多核苷酸的样品的溶液上进行，在这种情况下，这将导致电化学电池的电化学反应(例如，电流和/或电势和/或阻抗)的零变化或至少不可检测的变化，从而导致靶多核苷酸的阴性结果。
[0161]
靶多核苷酸
[0162]
靶多核苷酸可以是任何多核苷酸序列。靶多核苷酸尤其可以是病毒或细菌多核苷酸。理想情况下，靶多核苷酸是病毒类型或细菌物种和链所特有的一段dna，同时在进化上足够保守以在特定病毒或细菌的基因组中是稳定的。
[0163]
在一个实施方案中，病毒选自dsdna病毒、ssdna病毒、dsrna病毒、( )ssrna病毒rna、(-)ssrna病毒rna、ssrna-rt病毒rna和dsdna-rt病毒dna。
[0164]
在一个优选的实施方案中，病毒是( )ssrna病毒rna。
[0165]
在一个实施方案中，多核苷酸可以是存在于甲型流感病毒、乙型流感病毒、寨卡病毒(zika virus)、sars-cov病毒或mers-cov病毒中的任何多核苷酸。
[0166]
在一个实施方案中，多核苷酸可以是存在于冠状病毒中的任何多核苷酸。
[0167]
在一个实施方案中，靶多核苷酸可以是存在于冠状病毒内的任何多核苷酸，例如sars-cov-2rna。
[0168]
在一个实施方案中，靶多核苷酸序列是seq id no:1或seq id no:2的序列。
[0169]
在一个实施方案中，靶多核苷酸序列包含与seq id no:1或seq id no:2的70.0％、71.0％、72.0％、73.0％、74.0％、75.0％、76.0％、77.0％、78.0％、79.0％、80.0％、81.0％、82.0％、83.0％、84.0％、85.0％、86.0％、87.0％、88.0％、89.0％、90.0％、91.0％、92.0％、93.0％、94.0％、95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％和100.0％的同源性或序列同一性。
[0170]
两个多肽之间的序列同一性(或同源性)百分比可以使用合适的计算机程序来确定，例如威斯康星大学遗传计算机组(university of wisconsin genetic computing group)的gap程序，并且应当理解，同一性百分比是相对于其序列已被最优比对的多肽计算的。或者，可以使用clustal w程序(thompson等人，(1994)nucleic acids res 22,4673-80)进行比对。使用的参数可以如下：快速成对比对参数：k-元组(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分；3，顶对角线数；5.评分方法：x％。
[0171]
多个比对参数：空位开放罚分；10，空位延伸罚分；0.05。
[0172]
评分矩阵：blosum。
[0173]
样品
[0174]
在本发明的第二个方面，所述方法包括提供样品的步骤。样品可以是任何样品。在一个优选的实施方案中，样品是生物样品。其非限制性示例是体液样品或组织样品。
[0175]
在一个甚至更优选的实施方案中，样品包括人、动物植物、细菌、真菌或原生动物细胞。
[0176]
在本发明的第一个方面，所述方法还可以包括提供样品的步骤。在一个实施方案中，样品被提供在溶液中，也就是说溶液可以包含样品。样品可以是任何样品。在一个优选的实施方案中，样品是生物样品。其非限制性示例是体液样品或组织样品。
[0177]
样品可以包含如上定义的靶多核苷酸。具体地，靶多核苷酸可以是任何多核苷酸序列/核酸序列。样品中的靶多核苷酸尤其可以是病毒或细菌多核苷酸。样品中的靶多核苷酸可以是病毒类型或细菌种类和链所特有的一段dna，同时在进化上足够保守以在特定病毒或细菌的基因组中是稳定的。
[0178]
在一个实施方案中，样品可以是分离的dna样品、分离的rna样品、粗dna提取物样
品或粗rna提取物样品。
[0179]
在一个实施方案中，样品是鼻样品、咽喉样品、肛门样品、阴道样品、耳排出物样品(ear draining sample)、皮肤表面拭子样品、尿液样品、全血样品、血清样品、血浆样品和淋巴引流样品(lymph drainage sample)。
[0180]
在另一个实施方案中，样品是组织样品。组织样品可以是任何组织样品，例如上皮组织样品、结缔组织样品、肌肉组织样品和/或神经组织样品。
[0181]
所述方法还可以包括一个在将样品应用于电化学装置/两电极或三电极电化学电池之前制备样品的步骤。样品可以通过任何合适的方法制备。其实例在下文的实施例1中描述。
[0182]
通常，样品可以与任何合适的介质混合。本领域技术人员将知晓用于特定样品的合适介质。介质可以是运输介质(transport medium)。样品和运输介质可以直接添加到电化学装置中，或者在应用样品和介质之前在任何合适的温度下加热一段合适的时间。
[0183]
在一个实施方案中，将样品接种在运输介质中。运输介质可以是用于运输靶多核苷酸序列的任何合适的介质。在一个优选的实施方案中，运输介质是病毒运输介质。
[0184]
在另一个实施方案中，样品与抗凝剂如肝素、edta或柠檬酸钠混合。
[0185]
任选地与介质混合的样品可以被裂解，例如通过机械裂解、热裂解、声空化(acoustic cavitation)、渗透压冲击、酶裂解或化学裂解被裂解。
[0186]
在一个实施方案中，在将样品应用到电化学装置之前，将样品与至少四种引物和lamp试剂混合。
[0187]
在一个实施方案中，在60-100℃，例如65-95℃，例如70-90℃，例如75-85℃下加热样品。
[0188]
在一个实施方案中，将样品加热至少1分钟，例如至少2分钟，例如至少5分钟。
[0189]
在一个实施方案中，本发明的方法能够检测靶多核苷酸是否存在于样品中。
[0190]
在另一个实施方案中，本发明的方法能够定量样品中靶多核苷酸的量。
[0191]
电解装置
[0192]
在本发明的第一个方面，所述方法包括将溶液添加到两电极或三电极电化学电池中的步骤。
[0193]
在本发明的第二个方面，所述方法包括提供包含具有多个膜电极的电化学电池的电化学装置的步骤。
[0194]
在本发明的这两个方面中，电化学装置/两电极或三电极电化学电池可以是具有位于单层中的膜电极的平面装置。因此，膜电极可以被图案化到平面基底上，其厚度低于2mm，例如通过丝网印刷或厚膜技术。丝网印刷电极(screen-printed electrode，spe)通常用于形成一次性和低成本的传感器和生物传感器。这样的传感器的电极可以通过使用各种导电油墨来制造，并且可以根据分析需要以各种形状和尺寸制造。除了它们的制造之外，这些平台还适合用各种材料定制，包括纳米材料和生物元件。因此，在本公开的一个实施方案中，电极是丝网印刷电极，优选印刷在惰性材料的平面基底上。
[0195]
在本公开的一个实施方案中，三电极电化学电池的电极为线电极(wire electrode)。
[0196]
优选地，电化学装置/两电极或三电极电化学电池的面积小于500mm2，更优选小于
300mm2，使得电化学装置/两电极或三电极电化学电池可便携并且适用于即时情况。电化学装置/两电极或三电极电化学电池的电极可以朝向平面基底的边缘延伸，从而形成边缘连接，用于电连接至测量设置，例如恒电势仪。恒电势仪本身可以是便携式恒电势仪，例如手持恒电势仪。
[0197]
本发明第二个方面的电化学装置可以包含多个膜电极，例如工作电极、参比电极和对电极，其中电极优选形成三电极系统例如电化学三电极系统的一部分。
[0198]
三电极系统的工作电极通常是目标氧化还原过程(redox process of interest)的电极。因此，电分析测量的焦点通常是发生在工作电极上的特定电化学反应。
[0199]
参比电极通常具有稳定且公知的热力学电势。参比电极的高稳定性通常是通过采用具有恒定(缓冲或饱和)浓度的参与氧化还原半反应的离子或分子的氧化还原系统来实现的。当用作三电极系统的一部分时，电流不会通过参比电极。
[0200]
对电极，也称为辅助电极(auxiliary electrode)，通常用于电化学系统中，以完成与工作电极的电路。虽然目标氧化还原过程通常发生在工作电极上，但对电极可以用作电流源或电流储存器，从而使工作电极处的电化学反应不受限制。
[0201]
电化学装置/两电极或三电极电化学电池的电极可以用合适的材料制造，例如金、银、碳、铂、二氧化钌或它们的组合。电极的材料可以单独选择，从而多个电极例如每个电极的材料可以不同。或者，电极可以以相同的材料提供。然而，为了提供简易性、稳定性和小型化能力，参比电极和对电极的材料优选为ag/agcl。在本公开的可选实施方案中，电极的材料可以相同。
[0202]
此外，任何或所有电极可以包含离子选择性膜，这样的电极可以被称为离子选择性电极。所述膜可用于将溶解在样品中的特定离子的活性转化为电势。所述膜可以覆盖电极的至少一部分，并且定位以使得它在测量期间形成与溶液的界面。膜优选为玻璃膜，通常为离子交换型玻璃(硅酸盐或硫属化物(chalcogenide))。或者，膜可以是结晶膜、离子交换树脂膜或酶膜。
[0203]
可选地或另外地，对于离子选择性膜的使用，可以对任何电极的表面进行修饰。例如，可以对工作电极的表面进行化学修饰，以允许氢氧根离子oh-和/或水合氢离子h3o

的结合。在本公开的一个实施方案中，任何电极的表面可以包含结合了氧化钴和氧化铱的固态膜的ph传感层。优选地，工作电极的表面包含结合了氧化钴和氧化铱的固态膜的ph传感层。
[0204]
电极表面的进一步修饰包括氧化钌、石墨烯片(graphene platelet)、暴露的硫醇基团和/或暴露的羟基基团的化学修饰。
[0205]
优选地，与样品/溶液形成接触的任何电极的表面具有固定浓度的氯离子，例如用于真参比电极测量。因此，任何或所有电极可以包含具有固定浓度的氯离子的表面。
[0206]
在本公开的优选实施方案中，工作电极的材料为碳，对电极和参比电极的材料为ag/agcl。
[0207]
电化学装置/两电极或三电极电化学电池可以通过在平面基底上丝网印刷电极来形成。因此，电极可以是丝网印刷电极，其中电极在单层中。平面基底的材料优选为化学惰性材料，例如氧化铝、陶瓷、玻璃或惰性塑料。电化学装置/两电极或三电极电化学电池优选具有小尺寸，使其可便携，并且适用于即时测量。
[0208]
优选地，电化学装置/两电极或三电极电化学电池包含用于接收待分析溶液的进
口。进口可以是微流体进口并且可以进一步通过亲水区连接至电化学电池。理想地，亲水区被配置为使得被提供到微流体进口的溶液通过毛细作用被运输至电化学电池。储存和向电化学电池提供溶液的可选方式包括使用叠加在电化学电池上的微孔。微孔可以与电化学装置结合，和/或通过光刻(lithography)结合。
[0209]
当将溶液提供给电化学电池时，应用蒸汽屏障以防止溶液蒸发可能是有利的。这可能尤其是在较长例如至少数分钟的测量期间的要求。蒸汽屏障可以通过用物理盖、加热盖、矿物油和/或石蜡来流体密封电化学装置的进口或微孔来形成。因此，蒸汽屏障用于形成包含溶液的流体密封装置。
[0210]
在本公开的一个实施方案中，电化学装置可以包含引物和lamp试剂。换言之，可以在加载样品/溶液之前将引物和lamp试剂预加载到装置中。
[0211]
在本公开的一个方面，提供了用于测量溶液的ph的系统，所述系统包含：
[0212]
a.包含恒电势仪的仪器；和
[0213]
iii.包含三电极电化学电池的第一接受器和包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第二接受器，或
[0214]
iv.包含三电极电化学电池和醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第一接受器，
[0215]
其中恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
[0216]
在一个实施方案中，本文公开的系统的醌、醌衍生物和/或ph指示剂溶解在第一或第二接受器中的水性溶液中。
[0217]
在一个实施方案中，本文公开的系统的醌、醌衍生物和/或ph指示剂溶解在第一接受器中的水性溶液中，其中所述水性溶液还包含核酸扩增反应系统，例如至少两种被配置为侧翼是靶序列的引物和lamp试剂。
[0218]
在一个实施方案中，本文公开的系统的醌、醌衍生物和/或ph指示剂溶解在第二接受器中的水性溶液中，而第一接受器包含另外的水性溶液。因此，在测量第一接受器中水性溶液的ph之前，将合适体积的包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂的水性溶液转移至第一接受器中。
[0219]
在一个实施方案中，恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
[0220]
在一个实施方案中，恒电势仪被配置为测量电化学反应，其中电化学反应代表第一接受器中醌、醌衍生物和/或ph指示剂的氧化态。
[0221]
在一个实施方案中，所述系统进一步包含加热单元，其被配置为将第一和/或第二接受器加热至例如59℃至75℃范围内的温度。
[0222]
在一个实施方案中，第一接受器容纳核酸扩增反应系统，例如至少两种或至少四种被配置为侧翼是靶多核苷酸序列的引物和lamp试剂。
[0223]
在一个实施方案中，第一接受器包含用于接收溶液和/或样品的微流体进口。
[0224]
在一个实施方案中，第一和/或第二接受器在每次使用后被新的第一和/或第二接受器替换。
[0225]
在一个实施方案中，微流体进口通过被配置为通过毛细作用运输样品的亲水区例如多孔/纤维结构或亲水通道连接至电化学电池。
[0226]
在一个实施方案中，第一接受器和/或第二接受器是eppendorf管、微孔或培养瓶。
[0227]
在一个实施方案中，本公开的系统中的电极如本文所定义。
[0228]
lamp扩增
[0229]
本发明第二个方面的方法包括进行多个lamp扩增的步骤，每个lamp扩增均包含样品(例如，如上文“样品”部分中所述提供和/或制备的)，从而扩增靶多核苷酸序列。每个lamp扩增包含至少四种引物，每组引物侧翼是靶序列；以及lamp试剂。lamp扩增在等温条件下进行。
[0230]
在本发明第一个方面的一个实施方案中，所述方法还可以包括进行一个lamp扩增或多个lamp扩增的步骤，每个lamp扩增均包含样品(例如，如上文“样品”部分中所述提供和/或制备的)，从而扩增靶多核苷酸序列。每个lamp扩增包含至少四种引物，每组引物侧翼是靶序列；和lamp试剂。lamp扩增可以在等温条件下进行。
[0231]
整个lamp扩增可以以多种不同的方式制备。本领域技术人员已知的任何lamp扩增都可以用于本发明。
[0232]
此处描述了一个非限制性的lamp扩增实例：fip与靶dna的反义核苷酸链上的f2c区域退火。dna合成由聚合酶启动，所述聚合酶置换并释放dna链。因此，聚合酶合成与靶dna序列互补的链。接下来，f3与这条反义链上的f3c区域退火，并通过聚合酶启动新一轮的dna合成。f3介导的反义链置换导致形成由互补的f1c和f1区域连接的茎环结构。接下来，bip与dna链退火，并且通过聚合酶合成互补dna。因此，dna从环转变为双链线性结构。dna链分离并形成具有两个茎环(在该链的每个末端各一个)的哑铃状结构。该结构作为扩增循环的起点。接下来，该结构通过自引发的dna合成转化为茎环。fip与茎环中的单链区域退火并开始合成。这样做时，它释放互补链。由于分别在b1c-b1和f1-f1c区域之间具有互补性，释放的链形成了新的哑铃状结构。从b1区域的3'末端开始，开始dna合成。这释放了fip连接的互补链，由于分别在f1-f1c和b1c-b1区域之间具有互补性，其转而形成了另一个双茎环结构。接下来，自引发的dna合成从b1区域的3'末端重新开始。所述过程产生由靶序列的交替反向重复组成的扩增结构。
[0233]
在将样品应用到电化学装置之前，可以将样品与引物和lamp试剂混合。
[0234]
与传统的pcr扩增相比，lamp扩增是使用等温条件进行的。在一个实施方案中，lamp扩增可以在59-75℃、例如62-73℃、例如64-70℃、例如66-68℃的恒定温度下进行。
[0235]
lamp试剂
[0236]
本发明的第一个方面和第二个方面的方法都包括进行多个lamp扩增。lamp扩增通常将包含样品、侧翼是靶序列的至少四种引物和lamp试剂。所述lamp试剂可以是本节中描述的任何lamp试剂。
[0237]
lamp试剂通常至少包含核苷酸和核酸聚合酶。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，优选地，lamp试剂至少包含datp、dctp、dgtp和dttp。在某些情况下，lamp试剂还包含dutp。lamp试剂还包含信号传导物质，例如h 离子和/或荧光染料。
[0238]
核酸聚合酶可以是能够催化核苷酸的模板依赖性聚合(即复制)的任何酶。核酸聚合酶应该耐受用于lamp扩增的温度，并且它应该在延伸温度(elongation temperature)下具有催化活性。本领域技术人员已知多种热稳定性核酸聚合酶。
[0239]
在本发明的两个方面的一些实施方案中，核酸聚合酶除了复制活性外还具有高的链置换活性。
[0240]
核酸聚合酶可以是细菌或古细菌聚合酶。具体地，核酸聚合酶可以是大肠杆菌dna
聚合酶i。核酸聚合酶也可以是taq dna聚合酶，其具有dna合成依赖性链置换5'-3'外切核酸酶活性。其他聚合酶包括但不限于taq、tfi、tzi、tth、pwo、pfu、onedeepklenow(exo-)、bst 2.0和bst 3.0(new england biolabs,ipswich,mass.)、(lucigen,middleton,wis.)、tin dna聚合酶、gspssd lf dna聚合酶、rsp(optigene,horsham,uk)和phi29聚合酶。
[0241]
taq dna聚合酶，例如获自new england biolabs的taq dna聚合酶，可包括crimontaq dna聚合酶、crimson taq dna聚合酶、hemo klentaq
tm
或taq。
[0242]
lamp试剂可以包含逆转录酶(rt)。rt是能够从rna模板生成互补dna(cdna)的酶。因此，能够测量rna。在一个实施方案中，lamp试剂包含逆转录酶。
[0243]
此外，lamp试剂可包含盐、缓冲液和检测手段。缓冲液可以是任何可用的缓冲液，例如tris。盐可以是任何可用的盐，例如氯化钾、氯化镁或乙酸镁或硫酸镁。
[0244]
lamp试剂可以包含非特异性封闭剂，例如bsa、来自牛皮的明胶、β-乳球蛋白、酪蛋白、乳粉、鲑鱼精子dna或其他常见的封闭剂。
[0245]
lamp试剂还可以包含生物防腐剂(例如nan3)、lamp增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等)和抑制剂(例如rnase抑制剂)。其他添加剂可以包括二甲基亚砜(dmso)、甘油、甜菜碱(单)-水合物、海藻糖、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷三磷酸(7-脱氮-2'-dgtp)、牛血清白蛋白(bsa)、甲酰胺(氨基甲醛)、四甲基氯化铵(tmac)、其他四烷基铵衍生物[例如四乙基氯化铵(tea-cl)]；四丙基氯化铵(tpra-cl)或非离子去污剂，例如triton x-100、tween 20、nonidet p-40(np-40)或prexcel-q。
[0246]
此外，lamp试剂还可以包含一种或多种用于检测lamp扩增产物的额外手段。所述手段可以是任何可检测手段，并且它们可以作为单独的化合物添加或与引物之一相关，或甚至与引物之一共价连接。可检测手段包括但不限于染料、放射性化合物、生物发光和荧光化合物。在一个优选的实施方案中，用于检测的手段是一种或多种探针。
[0247]
在一个实施方案中，使用lamp试剂盒(dna和rna)进行lamp扩增。该试剂盒包含bst 2.0dna聚合酶、逆转录酶、核苷酸混合物、可见ph指示剂和低缓冲溶液(low-buffer solution)。该试剂盒还包含荧光染料。
[0248]
在另一个实例中，使用colorimetric lamp 2x master mix(dna和rna)进行lamp扩增。该试剂盒包含bst 2.0dna聚合酶、逆转录酶、核苷酸混合物和缓冲溶液。该试剂盒还包含荧光染料。
[0249]
侧翼是靶序列的引物
[0250]
本发明第二个方面的方法涉及使用侧翼是靶序列的至少四种引物。
[0251]
在本发明第一个方面的一个实施方案中，所述方法也涉及使用侧翼是靶序列的至少四种引物。
[0252]
四种引物可以包括
[0253]-正向内引物，也称为fip
[0254]-反向内引物，也称为bip
[0255]-正向外引物，也称为f3
[0256]-反向外引物，也称为b3
[0257]
在一个实施方案中，fip具有seq id no:3的序列。
[0258]
在一个实施方案中，bip具有seq id no:4的序列。
[0259]
在一个实施方案中，f3具有seq id no:5的序列。
[0260]
在一个实施方案中，b3具有seq id no:6的序列。
[0261]
所述四种引物与靶多肽的有义链和反义链的不同部分退火。参见本文所述的“定义”部分中对引物的定义。
[0262]
引物在被添加到lamp试剂中时在允许扩增靶多核苷酸的条件下能够扩增所述靶多核苷酸。
[0263]
在一个优选的实施方案中，所述至少四种引物由bip、fip、f3和b3组成。
[0264]
在一个实施方案中，lamp扩增是使用另外一对环引物进行的。在一个实施方案中，lamp扩增是使用fl引物和bl引物进行的。
[0265]
在一个实施方案中，fl引物具有seq id no:7的序列。
[0266]
在一个实施方案中，bl引物具有seq id no:8的序列。
[0267]
在本发明的两个方面的一个实施方案中，使用至少5种引物，例如至少6种引物，例如至少7种引物进行lamp扩增。
[0268]
在一个实施方案中，使用bip、fip、f3、b3、fl和bl引物进行lamp扩增。
[0269]
bip、fip、f3、b3、fl和bl引物的长度可以取决于靶多核苷酸的序列。例如，可以调整引物的长度以在特定温度下，例如在59-75℃的范围内的特定温度下，实现所需的活性。因此，引物的长度可以独立地在10至100个核苷酸的范围内，例如在10至50个核苷酸的范围内，例如在15至20个核苷酸的范围内，例如在15至25个核苷酸的范围内，例如在15至30个核苷酸的范围内，例如在15至40个核苷酸的范围内，例如在15至45个核苷酸的范围内，例如在15至50个核苷酸的范围内。通常将引物的tm调整到59至75℃的范围内。
[0270]
lamp扩增的水相内的引物浓度可以例如在0.05至4.0μm的范围内，例如在0.1至3.0μm的范围内，例如在0.2至2.0μm的范围内。其一个非限制性实例是1.6μm fip，1.6μm bip，0.2μm f3，0.2μm b3，0.4μm fl，0.4μm bl。
[0271]
通常，引物包含寡核苷酸，或甚至由寡核苷酸组成。然而，在某些情况下，引物可以包含核苷酸类似物。许多核苷酸类似物是本领域技术人员已知的，并且包括其中糖被修饰的衍生物，例如2'-o-甲基、2'-脱氧-2'-氟和2',3'-二脱氧核苷衍生物，基于其他糖骨架的核酸类似物，例如苏糖、锁核酸(lna)、lna衍生物、肽核酸(pna)、二醇核酸(gna)、苏糖核酸(tna)、双环糖或己糖、甘油和二醇糖，基于非离子骨架的核酸类似物，或非线性拓扑结构的核酸及其类似物，例如树枝状大分子、梳状结构和纳米结构。
[0272]
引物也可以与各种标签(例如，荧光标签、功能化标签或结合标签)连接，这些标签可以任选地结合至它们的末端、糖或核碱基上。
[0273]
可以通过多种方法制备引物，包括但不限于克隆适当的序列和使用本领域公知的方法[narang等人,methods enzymol.68:90(1979)；brown等人,methods enzymol.68:109(1979)]直接化学合成。引物也可以从商业来源获得。
[0274]
在一个实施方案中，可以以其中引物特异性地能够扩增靶多核苷酸序列的方式设计引物。
[0275]
测量溶液的电化学性质
[0276]
本发明第二个方面的方法包括测量电化学电池的电流和/或电势变化的步骤。
[0277]
如上所述，在一个实施方案中，本发明第一个方面的方法包括测量电化学电池的电化学反应例如电化学电池的电流和/或电势和/或阻抗的变化的步骤。
[0278]
所述变化优选是来自核酸扩增过程的信号传导物质(例如h

，例如lamp扩增产物或副产物(例如h

))的浓度变化的结果，或作为所述lamp扩增结果的物理量的变化。具体地，h

的变化导致溶解在电化学电池中的醌、醌衍生物和/或ph指示剂的氧化态的变化，其被测量为电化学电池的电化学反应的变化。电化学装置的电化学电池的电化学反应(例如电流和/或电势和/或阻抗)的变化的测量优选在使电化学装置/两电极或三电极电化学电池与测量设置接触用于形成电化学系统之后进行。
[0279]
电化学系统通常包含电化学装置/两电极或三电极电化学电池，包括，如果存在的话，膜电极、溶液和单独的电流路径，通常是恒电势仪。因此，电化学系统包含多个膜电极，例如工作电极、对电极和参比电极，它们在空间上分开并分布在一种或多种离子导电介质或电解质中，同时还通过单独的电流路径(优选包含恒电势仪或由恒电势仪组成)彼此电接触。
[0280]
电化学系统中的电极经历氧化和还原反应，电子的运动产生电流通过电流路径，同时离子通过介质的运动产生系统内电荷转移的总体平衡。
[0281]
恒电势仪通常是被设计为通过调节电势(或电流)和测量对电势(或电势)的随后影响来控制电化学系统中的电极的仪器。该任务通常通过多个内部电路、运算放大器和反馈回路来完成。外部电缆通常用于物理连接至每个电极，其通常包括工作电极、对电极和参比电极。
[0282]
可以根据任何电分析方法进行测量，例如开路电势测量、电势测量、阻抗测量、库仑测量、伏安测量和/或安培测量。通常，溶液的测量可能需要1至90分钟，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90分钟。
[0283]
在一个实施方案中，溶液的测量可能需要1至45分钟，例如1至30分钟，例如1至15分钟，例如5至10分钟。
[0284]
伏安法是电流作为施加电势的函数的研究。从而产生伏安图i＝f(e)曲线。通常在这样的测量中，电势是逐步或连续任意变化的，并且实际电流值作为因变量进行测量。与之相反的是安培法(amperometry)。曲线的形状取决于电势变化的速度(驱动力的性质)以及溶液是搅拌的还是静止的(质量转移)。
[0285]
对于定量，由于伏安法的时间分量，除了热力学之外，分析还需要考虑动力学。理想化的理论电化学热力学关系，例如nernst方程，是在没有时间分量的情况下建模的。尽管这些模型单独不足以描述伏安法的动态方面，但tafel方程和butler-volmer方程等模型为将理论与观察结果相关联的修正的伏安法关系奠定了基础。
[0286]
本发明第一个方面的具体实施方案
[0287]
本发明第一个方面的具体实施方案在以下编号的段落中提供。
[0288]
x1.一种测量溶液的ph的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0289]-提供包含其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物的溶液；
[0290]-将溶液应用于两电极或三电极电化学电池；
[0291]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0292]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0293]
x2.根据段落x1所述的方法，其中其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是儿茶酚、儿茶酚衍生物和/或包含儿茶酚基团的化合物。
[0294]
x3.根据任一前述段落所述的方法，其中其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是醌、醌衍生物或ph指示剂，或它们的组合。
[0295]
x4.根据任一前述段落所述的方法，其中所述化合物是醌或醌衍生物，所述醌或醌衍生物选自1,2-苯醌、1,4-苯醌、1,4-萘醌、9,10-蒽醌及其衍生物和组合。
[0296]
x5.根据任一前述段落所述的方法，其中其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物是ph指示剂，所述ph指示剂选自：孔雀石绿草酸盐、亮绿、黄色曙红、赤藓红b、甲基绿、甲基紫、苦味酸、甲酚红、结晶紫、间甲酚紫、百里酚蓝、对二甲酚蓝、(蓝色)曙红、喹哪啶红、2,4-二硝基苯酚、4-(二甲基氨基)偶氮苯、溴氯酚蓝、溴酚蓝、刚果红、甲基橙、溴甲酚绿、2,5-二硝基苯酚、茜素磺酸、甲基红、氯酚红、石蕊、溴甲酚紫、溴酚红、4-硝基苯酚、溴二甲酚蓝、溴百里酚蓝、酚红、3-硝基苯酚、中性红、甲酚红、1-萘酚酞、间甲酚紫、百里酚蓝、对二甲酚蓝、酚酞、百里酚酞、碱性蓝、茜素黄gg、靛洋红、依波西隆蓝、达旦黄，及它们的组合。
[0297]
x6.根据任一前述段落所述的方法，其中其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物溶解在该溶液中。
[0298]
x7.根据任一前述段落所述的方法，所测量的电化学电池的电化学反应是电化学电池的电势、电化学电池的电流、电化学电池的阻抗，或这些的组合。
[0299]
x8.根据段落x6所述的方法，其中电化学电池的电势通过循环方波伏安法、方波伏安法、线性扫描伏安法、循环伏安法或开路电势法测量。
[0300]
x9.根据任一前述段落所述的方法，其中其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物在溶液内的浓度为约1μm至约1000μm，例如约1μm至约500μm，例如约5μm至约250μm，尤其是约50μm至约200μm。
[0301]
x10.根据任一前述段落所述的方法，其中将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数的步骤是通过应用回归算法来进行的。
[0302]
x11.根据任一前述段落所述的方法，其中所述溶液包含缓冲液。
[0303]
x12.根据任一前述段落所述的方法，其中所述溶液包含样品，任选地其中所述样品包含人、动物植物、细菌、真菌或原生动物细胞。
[0304]
x13.根据任一前述段落所述的方法，其中所述溶液进一步包含样品，优选地其中所述样品选自鼻样品、咽喉样品、肛门样品、阴道样品、耳排出样品、皮肤表面拭子样品、尿液样品、全血样品、血清样品、血浆样品和淋巴引流样品。
[0305]
x14.根据任一前述段落所述的方法，其中所述溶液进一步包含引物和核酸扩增试剂，优选地其中核酸扩增试剂是lamp试剂。
[0306]
x15.根据段落x13所述的方法，其中核酸扩增试剂包含信号传导物质，或能够释放信号传导物质，或包含信号传导物质和能够释放信号传导物质的物质这两者。
[0307]
x16.根据段落x14所述的方法，其中信号传导物质是h

。
[0308]
x17.根据段落x13至x15中任一项所述的方法，其中所述方法包括进行核酸扩增步骤优选多个核酸扩增步骤的步骤。
[0309]
x18.根据段落x16所述的方法，其中核酸扩增步骤是环介导等温扩增(lamp)步骤。
[0310]
x19.根据段落x13至x17中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定溶液中靶多核苷酸的存在。
[0311]
x20.根据段落x18所述的方法，其中测量电化学电池的电化学反应的步骤包括测量由于信号传导物质的浓度变化而导致的电化学电池的电流和/或电势的变化。
[0312]
x21.根据段落x13至x19中任一项所述的方法，其中lamp试剂包含逆转录酶。
[0313]
x22.根据段落x13至x20中任一项所述的方法，其中引物包括正向内引物、反向内引物、正向外引物和反向外引物。
[0314]
x23.根据段落x21所述的方法，其中lamp扩增使用另外一对环引物例如正向环引物和/或反向环引物进行。
[0315]
x24.根据前述段落中任一项所述的方法，其中三电极电化学电池包括工作电极、参比电极和对电极。
[0316]
x25.根据段落x23所述的方法，其中工作电极包含离子选择性膜，对其定位以使溶液中的选定离子不接触工作电极。
[0317]
x26.根据段落x23或段落x24所述的方法，其中对工作电极的表面进行化学修饰以允许结合oh-和h3o

离子或对溶液的ph具有反应性。
[0318]
x27.根据段落x23至x25中任一项所述的方法，其中参比电极和对电极的材料为ag/agcl。
[0319]
x28.根据段落x23至x26中任一项所述的方法，其中工作电极的材料为碳。
[0320]
x29.根据前述段落中任一项所述的方法，其中电极包含金、银、碳、铂、二氧化钌或其组合或由金、银、碳、铂、二氧化钌或其组合组成。
[0321]
x30.根据前述段落中任一项所述的方法，其中电极的材料相同或不同。
[0322]
x31.根据前述段落中任一项所述的方法，其中两电极或三电极电化学电池的电极是膜电极，优选丝网印刷电极。
[0323]
x32.根据前述段落中任一项所述的方法，其中两电极或三电极电化学电池的电极是线电极。
[0324]
x33.根据前述段落中任一项所述的方法，其中两电极或三电极电化学电池包含电极位于其上的基底，并且其中所述基底的材料是化学惰性材料，例如氧化铝、陶瓷、玻璃或惰性塑料。
[0325]
x34.根据前述段落中任一项所述的方法，其中两电极或三电极电化学电池包含与电化学电池流体连接的用于接收溶液的微流体进口。
[0326]
x35.根据前述段落中任一项所述的方法，其中，在应用溶液之后，添加蒸汽屏障以防止溶液蒸发。
[0327]
x36.根据段落x33所述的方法，其中蒸汽屏障通过用物理盖、加热盖、矿物油和/或
石蜡流体密封三电极电化学电池的进口或微孔而形成。
[0328]
x37.根据前述段落中任一项所述的方法，其中亲水区将微流体进口和两电极或三电极电化学电池连接，例如用于毛细填充两电极或三电极电化学电池。
[0329]
x38.根据前述段落中任一项所述的方法，其中通过使用恒电势仪或类似电路来进行测量。
[0330]
x39.根据前述段落中任一项所述的方法，其中测量进行1分钟至90分钟的时间段。
[0331]
x40.根据前述段落中任一项所述的方法，其中核苷酸扩增在59至75℃、例如62至73℃、例如64至70℃、例如66至68℃范围内的恒定温度下进行。
[0332]
y.两电极或三电极电化学电池用于测量溶液的ph的用途，所述用途包括：
[0333]-提供包含其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物的溶液；
[0334]-将溶液应用于两电极或三电极电化学电池；
[0335]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0336]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0337]
y1.三电极电化学电池用于测量溶液的ph的用途，所述用途包括：
[0338]-提供包含其氧化态和/或结构构象能够随着溶液ph的变化而变化的化合物的溶液；
[0339]-将溶液应用于三电极电化学电池；
[0340]-测量电化学电池的电化学反应；和
[0341]-将溶液的ph定量为电化学电池的电化学反应的函数。
[0342]
y2.一种用于测量溶液的ph的系统，所述系统包括：
[0343]
b.包含恒电势仪的仪器；和
[0344]
v.包含三电极电化学电池的第一接受器和包含醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第二接受器，或
[0345]
vi.包含三电极电化学电池和醌、醌衍生物和/或ph指示剂的第一接受器，
[0346]
其中恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
[0347]
y3.根据权利要求39所述的系统，其中醌、醌衍生物和/或ph指示剂溶解在第一接受器或第二接受器中的水性溶液中。
[0348]
y4.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述恒电势仪被配置为测量电化学电池的电化学反应。
[0349]
y5.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中恒电势仪被配置为测量电化学反应，其中电化学反应代表第一接受器中醌、醌衍生物和/或ph指示剂的氧化态。
[0350]
y6.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包含加热单元，其被配置为将第一和/或第二接受器加热到例如59℃至75℃范围内的温度。
[0351]
y7.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中第一接受器容纳核酸扩增反应系统，例如被配置为侧翼是靶多核苷酸序列的至少四种引物和lamp试剂。
[0352]
y8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中第一接受器包含用于接收溶液和/或样品的微流体进口。
[0353]
y9.根据权利要求44所述的系统，其中微流体进口通过被配置为通过毛细作用运
输样品的亲水区例如多孔/纤维结构或亲水通道与电化学电池连接。
[0354]
y10.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中第一接受器和/或第二接受器是eppendorf管、微孔或培养瓶。
[0355]
y11.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中电极如本文中所定义。
[0356]
使用lamp对样品中的靶多核苷酸进行定量的具体方法
[0357]
在本发明的第二个方面，提供了一种对样品中的靶多核苷酸进行定量的方法，所述方法包括以下步骤：
[0358]
a.提供样品；
[0359]
b.将样品应用到包含具有多个膜电极的电化学电池的电化学装置；
[0360]
c.如果样品中存在靶多核苷酸，则进行多个等温lamp扩增，每个等温lamp扩增均包含样品；至少四种引物，每种引物的侧翼为靶多核苷酸；和lamp试剂，其包含信号传导物质和/或能够释放信号传导物质，其中每个lamp扩增释放或消耗信号传导物质；
[0361]
d.与步骤e.同时地，测量由于信号传导物质的浓度变化引起的电化学电池的电流和/或电势的变化；和
[0362]
e.通过电流和/或电势的变化速率推导扩增速率，从而定量样品中的靶多核苷酸。
[0363]
为避免疑义，本发明的第二个方面的任何方面可以与以上任何部分中详述的本发明的第一个方面的任何方面组合。
[0364]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，在将样品应用到电化学装置之前，将样品与引物和lamp试剂混合。
[0365]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，电化学装置包含引物和lamp试剂。
[0366]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，多个膜电极包括工作电极、参比电极和对电极。
[0367]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，工作电极包含离子选择性膜，对其定位以使溶液中的选定离子不接触工作电极。
[0368]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，对工作电极的表面进行化学修饰以允许结合oh-和h3o

离子或对溶液的ph具有反应性。
[0369]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，任何电极的表面包含氧化钌、石墨烯片或被氧化钌、石墨烯片化学修饰，或被化学修饰使得电极具有暴露的硫醇/羟基基团。
[0370]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，参比电极和对电极的材料是约60/40w/w比例的ag/agcl。
[0371]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，工作电极的材料是碳。
[0372]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，电极包含金、银、碳、铂、二氧化钌或它们的组合，或由金、银、碳、铂、二氧化钌或它们的组合组成。
[0373]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，电极的材料相同或不同。
[0374]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，膜电极是丝网印刷电极。
[0375]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，膜电极是线电极。
[0376]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，电化学装置包含电极位于其上的基底，并且其中所述基底的材料是化学惰性材料，例如氧化铝、陶瓷、玻璃或惰性塑料。
[0377]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，电化学装置包含与电化学电池流体连
接的用于接收样品的微流体进口。
[0378]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，在应用溶液之后，添加蒸汽屏障以防止溶液蒸发。
[0379]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，蒸汽屏障是通过用物理盖、加热盖、矿物油和/或石蜡流体密封电化学装置的进口或微孔而形成的。
[0380]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，亲水区将微流体进口和电化学电池连接，例如用于毛细填充电化学装置。
[0381]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，通过使用恒电势仪或类似电路来进行测量。
[0382]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，测量包括以下或由以下组成：电势测量、阻抗测量、库仑测量、伏安测量和/或安培测量。
[0383]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，在1至90分钟之间测量溶液。
[0384]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，lamp试剂包含逆转录酶。
[0385]
在本发明第二个方面的一个实施方案中，核苷酸扩增在59-75℃、例如62-73℃、例如64-70℃、例如66-68℃范围内的恒定温度下进行。
[0386]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，引物包括正向内引物、反向内引物、正向外引物和反向外引物。
[0387]
在本发明第二个方面的另一个实施方案中，lamp扩增是使用另外一对环引物例如正向环引物和/或反向环引物进行的。
[0388]
在另一个实施方案中，本发明涉及确定样品中靶多核苷酸的存在的方法。所述方法包括通过定量和/或确定多核苷酸扩增速率来区分靶多核苷酸阳性样品和靶多核苷酸阴性样品。
[0389]
序列
[0390]
seq id no:1
[0391]
sars-cov-2的orf1片段
[0392]
ccctatgtgttcatcaaacgttcggatgctcgaactgcacctcatggtcatgttatggttgagctggtagcagaactcgaaggcattcagtacggtcgtagtggtgagacacttggtgtccttgtccctcatgtgggcgaaataccagtggcttaccgcaaggttcttcttcgtaagaacggtaataaaggagctggtggccatagttacggcgccgatctaaagtcatttgacttaggcgacgagcttggcactgatccttatgaaga
[0393]
seq id no:2
[0394]
sars-cov-2的基因n片段
[0395]
atgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctac
[0396]
seq id no:3
[0397]
正向内引物(fip)
[0398]
aggtgagggttttctacatcactatattggaacaagcaaattctatgg
[0399]
seq id no:4
[0400]
反向内引物(bip)
[0401]
atgggttgggattatcctaaatgtgtgcgagcaagaacaagtg
[0402]
seq id no:5
[0403]
正向外引物(f3)
[0404]
ccactagaggagctactgta
[0405]
seq id no:6
[0406]
反向外引物(b3)
[0407]
tgacaagctacaacacgt
[0408]
seq id no:7
[0409]
正向环引物(fl)
[0410]
cagtttttaacatgttgtgccaacc
[0411]
seq id no:8
[0412]
反向环引物(bl)
[0413]
tagagccatgcctaacatgct
实施例
[0414]
实施例1
[0415]
通过lamp扩增对鼻拭子样品进行定量电分析测量
[0416]
材料和方法
[0417]
丝网印刷电极
[0418]
i.使用丝网印刷的ph敏感型3电极系统，所述系统包含3个丝网印刷电极，分别用作工作电极、参比电极和辅助电极。所述系统印刷在化学惰性氧化铝上。
[0419]
1.参比电极的材料是ag/agcl(60/40比例)，其具有为真参比电极测量提供固定浓度的氯离子的额外层。
[0420]
2.工作电极的材料是碳，其具有结合了氧化钴和氧化铱的固态膜的ph传感层。
[0421]
3.对电极的材料是ag/agcl电极(60/40比例)，其具有为真参比电极测量提供固定浓度的氯离子的额外层。
[0422]
ii.在电极上方叠加了微孔形式的微流体样品口
[0423]
iii.以物理盖的形式使用微孔的蒸汽屏障。
[0424]
引物
[0425]
含有在无核酸酶水(不是te)中的16μm fip、16μm bip、2μm f3、2μm b3、4μm loopf、4μm loopb的10x primer mix。反应开始前扩增反应混合物中的最终浓度为1.6μm fip、1.6μm bip、0.2μm f3、0.2μm b3、0.4μm loopf、0.4μm loopb。
[0426]
样品
[0427]
i.在80℃下热处理1分钟后，使用接种在病毒运输介质中的鼻拭子样品。使用的病毒运输介质的一个实例是无菌hanks平衡盐溶液(hbss)1x，含钙和镁离子，含或不含酚红，含2％v/v胎牛血清、100μg/ml硫酸庆大霉素和0.5μg/ml两性霉素b。
[0428]
扩增反应
[0429]
i.将2μl样品与以下混合
[0430]
a.2.5μl靶向目标基因组区域的25x lamp primer mix(最终浓度为1.6μm fip、1.6μm bip、0.2μm f3、0.2μm b3、0.4μm loop f、0.4μm loop b)，
[0431]
b.12.5μl来自new england biolabs inc.的warmstart colorimetric lamp 2x master mix，和
[0432]
c.无核酸酶水，至终体积为25μl。
[0433]
扩增条件和测定设计
[0434]
1.将扩增反应混合物(以及样品)在混合后立即添加到在65℃下预热、已连接至恒电势仪的ph传感器上。
[0435]
2.设置好蒸汽屏障以避免蒸发。
[0436]
3.实时运行电势测量，并且连续测量电压30分钟。
[0437]
解释
[0438]
i.在30分钟期间，通过ph的下降(ph感应)来指示核酸模板的存在。变化的时间差与核酸模板的数量相关。
[0439]
实施例2
[0440]
使用丝网印刷电极在低tris缓冲液中连续电化学实时定量监测环介导等温扩增
[0441]
材料和方法
[0442]
丝网印刷电极
[0443]
i.丝网印刷的ph敏感型3电极系统，包括3个丝网印刷电极，用作工作电极、参比电极和辅助电极，印刷在化学惰性基底如氧化铝或陶瓷或玻璃或惰性塑料基底上。
[0444]
ii.电极可以由相同或不同的材料如金、银、碳、铂、二氧化钌等制成。
[0445]
iii.工作电极可以包含一层离子选择性膜，和/或电极表面可以被修饰以允许结合oh-和h3o

离子，或者当通过直接接触暴露于溶液时对溶液的ph敏感。此类修饰可以包括氧化钌、石墨烯片、暴露的硫醇基团、暴露的羟基基团等。
[0446]
iv.设置：
[0447]
1.参比电极包含ag/agcl电极(60/40比例)和(可选的)为真参比电极测量提供固定浓度的氯离子的额外层。
[0448]
2.工作电极包含碳
[0449]
3.对电极包含ag/agcl电极(60/40比例)和(可选的)为真参比电极测量提供固定浓度的氯离子的额外层。
[0450]
v.在电极上方叠加形式为微孔(优选)的微流体样品口，或其他样品引入/容纳方法。
[0451]
vi.可以使用用于微孔的蒸汽屏障。替代物可包括物理盖、加热盖、矿物油蒸汽屏障、石蜡蒸汽屏障。
[0452]
引物
[0453]
含有在无核酸酶水(不是te)中的16μm fip、16μm bip、2μm f3、2μm b3、4μm loopf、4μm loopb的10x primer mix。反应开始前扩增反应混合物中的最终浓度为1.6μm fip、1.6μm bip、0.2μm f3、0.2μm b3、0.4μm loopf、0.4μm loopb。
[0454]
样品
[0455]
ii.接种在病毒运输介质中的鼻或咽拭子样品可以直接使用或在70-90℃下热处
理1分钟后使用。
[0456]
iii.接种在病毒运输介质中的肛门或阴道或耳排泄物或皮肤表面拭子样品可以直接使用或在70-90℃下热处理1分钟后使用。
[0457]
iv.尿液样品可以直接使用，或在70-90℃下热处理1分钟后使用。
[0458]
v.全血样品与抗凝剂如肝素、edta或柠檬酸钠等混合，任选地通过机械裂解、热裂解、声空化、渗透压冲击、酶裂解或化学裂解进行额外裂解。
[0459]
vi.淋巴引流样品或血清样品可以直接使用或在70-90℃下热处理1分钟后使用。
[0460]
vii.从生物样品或粗核酸提取物中纯化的核酸内容物
[0461]
扩增反应
[0462]
i.典型的扩增反应包含引物(例如，四种、五种或六种引物)、样品(其可以包含或可以不包含引物结合的模板)、核苷酸(对应于g、a、t和c)、缓冲剂(1mm至5mm tris或1.5mm至5mm tris或其等同缓冲液)、一种或多种盐(例如(nh)2so4、nacl、mgso4、mgcl2等)、细菌或古细菌聚合酶(其可以是或可以不是热稳定的，可以具有或可以不具有链置换活性)，以及任何必要的辅因子和可选的去污剂等。可用于pcr的热稳定聚合酶或用于等温扩增反应的聚合酶的实例包括但不限于taq、tfi、tzi、tth、pwo、pfu、聚合酶的实例包括但不限于taq、tfi、tzi、tth、pwo、pfu、onedeepklenow(exo-)、bst 2.0和bst 3.0(new england biolabs,ipswich,mass.)、(lucigen,middleton,wis.)、tin dna聚合酶、gspssd lf dna聚合酶、rsp(optigene,horsham,uk)和phi29聚合酶等。
[0463]
ii.优选的反应混合物：
[0464]
2μl样品(含有dna/rna或无模板对照；范围：1-5μl；如果使用运输介质，则超过2μl样品会抑制反应；少于2μl将意味着模板可能太少)与以下混合
[0465]
a.2.5μl靶向目标基因组区域的25x lamp primer mix(最终浓度为1.6μm fip、1.6μm bip、0.2μm f3、0.2μm b3、0.4μm loop f、0.4μm loop b)，
[0466]
b.12.5μl来自new england biolabs inc.的warmstart colorimetric lamp 2x master mix(也含有逆转录酶)，和
[0467]
c.无核酸酶水，至终体积为25μl。
[0468]
iii.可选的反应混合物：
[0469]
2μl样品(含有dna/rna或无模板对照；至多可为5μl)与以下混合
[0470]
a.2.5μl靶向目标基因组区域的25x lamp primer mix(最终浓度为1.6μm fip、1.6μm bip、0.2μm f3、0.2μm b3、0.4μm loop f、0.4μm loop b)，
[0471]
b.12.5μl来自new england biolabs inc.的warmstart lamp 2x master mix，和
[0472]
c.无核酸酶水，至终体积为25μl。
[0473]
扩增条件和测定设计
[0474]
i.优选的
[0475]
1.将扩增反应混合物(以及样品)在混合后立即添加到在59-75℃下预热的、已连接至恒电势仪或等效电路的ph传感器上。
[0476]
2.设置好蒸汽屏障以避免蒸发。
[0477]
3.实时运行电势测量，并且连续测量电压1至90分钟。
[0478]
4.可以对多个样品进行平行测定。
[0479]
ii.可选的
[0480]
1.可以使用移液器或微流体混合直接在芯片上进行样品与其余组分的混合。
[0481]
2.将扩增反应混合物(以及样品)添加到pcr或微量离心管中，并在59-75℃下加热。将样品在1至90分钟后等分，或以1至5分钟的间隔等分2至5次，并在室温下在已连接到恒电势仪或等效电路的ph传感器上测量ph。
[0482]
3.代替ph，可以在不使用任何额外的氧化还原探针或dna嵌入染料的情况下进行阻抗测量、库仑测量、安培测量。
[0483]
解释
[0484]
i.在1至90分钟之间通过以下来指示核酸模板的存在：
[0485]
i.ph的下降(ph感应)
[0486]
ii.电导率的下降(安培法)
[0487]
iii.阻抗的增加(阻抗法)
[0488]
iv.净电荷变化(库仑法)
[0489]
ii.此外，这种变化的时间差与核酸模板的数量相关
[0490]
实施例3
[0491]
一种监测含酚红的溶液的ph的三电极系统方法
[0492]
使用的参数
[0493]
在本实施例中，分析了50μl含有pbs、naoh或hcl(用于调节ph)、0.1m kcl作为支持电解质和100μm酚红作为ph探针的水性溶液。
[0494]
将水性溶液引入三电极电化学电池中，并采用以下参数在电化学电池上进行方波伏安法：
[0495]
a.相对于ag/agcl 0.5v处的峰。扫描范围相对于ag/agcl 0至0.6v；频率：10hz；电势阶跃：5mv；幅度：10mv。
[0496]
b.相对于ag/agcl-0.4至-0.55v之间的峰。扫描范围相对于ag/agcl 0至-0.7v；频率：10hz；电势阶跃：5mv；幅度：10mv。
[0497]
n2o
3-au一次性电极与anapot恒电势仪一起使用。
[0498]
将ph变化作为峰高(i)和由电势(e)定义的峰位置的函数进行分析：
[0499]
δph＝f(i*e) f(i) f(e)
[0500]
分析结果
[0501]
酚红是一种三醌结构的化学物质，其在-1v至1v的电势窗口中经历三电子转移(相对于ag/agcl，酚红的氧化还原峰的概述参见图3)。峰电流和峰电势均是依赖ph的。尽管其在ph 6至ph 8之间的可见光谱有限，但酚红的氧化还原电势和相应的峰电流能够识别整个ph范围。
[0502]
酚红是最简单的磺酞基团形式，并且是pka为7.9的弱酸，是最常用的ph指示剂之一。其化学结构和在水性溶液中的解离可参见以下示意图：
[0503][0504]
酚红的三芳族结构中的醌的甲基化物(quinone methide)的可电离部分赋予了丰富的氧化还原性质，这在各种应用中显示出有利的特征。结构中的醌的甲基化物部分是丰富的氧化还原化学的中心。图4显示了在pbs中在ph7.9下缓冲的溶液中，使用裸gc电极以不同的扫描速率扫描的酚红的循环伏安图。在图4中可以观察到六个显著波。通过将峰电流与扫描速率值和扫描速率的平方根值相关联，如图4的插图所示，发现波(b)、(c)、(d)和(f)可归类为酚红在电极界面处的氧化还原反应，因为峰电流显示与扫描速率的平方根成正比这一事实是扩散控制反应的特征。与之相比，由于峰电流与扫描速率呈线性关系，波(a)和(e)被归类为酚红在电极表面上的吸附过程。为了确定酚红的氧化还原对，在不同的切换电势下对酚红进行循环伏安扫描，其结果如图5所示。从1.5v在阴极上开始扫描分别至0.4、-0.2、-1.0和-1.5v的切换电势。看图5插图中曲线的最右侧，曲线(a)显示了两个还原峰以及仅一个显著氧化峰，而曲线(b)仅显示一个氧化还原对。曲线(a)的ipc/ipa比率为约2.8，且曲线(b)的ipc/ipa比率为2.3，表明在曲线(a)的过程中被还原的物质减少。
[0505]
以下两步还原可以解释这一发现：
[0506][0507]
在图5的插图的曲线(a)中，第一次还原的峰发生在-0.75v，然后第二次还原位于-1.12v。此外，歧化作用(disproportionation)将第一次还原的一部分自由基产物[c]消耗为碳负离子[d]和起始氧鎓离子[a]：
[0508][0509]
这导致曲线(a)和(b)中两个氧化峰都下降，因此导致i
pc
/i
pa
比率与一般可逆过程的偏差。此外，由于碳负离子物质的质子化是不可逆反应，与-0.75v处的第一还原峰相比，-1.12v处的第二还原峰要小得多。基于上述，解释了与曲线(b)的i
pc
/i
pa
相比，曲线(a)中的i
pc
/i
pa
相对较低。ph值对酚红还原和氧化的影响如图6所示，ph为3.9(曲线(a)和(a')，[a]是主要物质)、7.9(曲线(b)和(b')，两种形式的量相等)和11.9(曲线(c)和(c')，主要是
[b])的含酚红的溶液用pbs缓冲，并且在阳极和阴极方向上都进行了这些溶液的cv扫描。值得注意的是，由于峰电势对ph变化的依赖性，(a')至(c')的第一次还原包括一个电子和一个质子转移，而在无质子转移的情况下进行第二次还原。
[0510]
溶液(a)至(c)的相应阳极扫描对于曲线(a)和(b)显示出两个氧化峰，而对于(c)仅有一个氧化峰。对于(a)和(b)的情况，未质子化的酚红[b]经历第一次氧化，然后质子化对应物[a]在更高的正电势下进行另一次氧化，并伴有去质子化。为了阐明两次氧化之间的联系，如曲线(d)所示，进一步进行从第二次氧化的电势(0.90v)之前开始的扫描。结果表明，第二次氧化并非源自第一次氧化的产物。相比之下，曲线(c)中没有第二次氧化是由于碱性环境中[a]的不足。因此，从酚红的这两种物质的氧化会产生自由基正离子[e]，如以下路线所示：
[0511][0512]
使用方波伏安法进行信号识别，受益于与循环伏安法相比出色的信号增强，促进简单信号处理。观察到酚红的最佳浓度为约100μm。不希望受到理论的束缚，100μm给出了清晰的(well defined)氧化还原峰而不抑制核放大。然而，可以使用范围广泛的酚红浓度，而仍能实现信号识别。
[0513]
在6.5至8.5的ph范围内，在不同酚红浓度下对酚红进行方波伏安法的结果可以如图7所示。图7的下方两张图显示了峰位置(电压)和峰高(电流)与酚红浓度的关系。
[0514]
然后应用线性回归算法来获得准确的ph值，即，通过应用线性回归算法将获得的输出信号与ph值相关联。该算法通过将预测值与实际值拟合而得到验证，误差在0.05ph以内，其结果可以如图8所示。
[0515]
除了0至800mv之间扫描中的峰以外，还观察到另外两个峰(参见图9)。
[0516]
图9中突出显示的峰a)b)和c)是ph依赖性的。本研究集中在峰a)和b)，因为峰c)太接近于水解，其是不可逆的ec峰。峰a)：从高ph到低ph：转变为正电势；跨ph范围的1个电子转移(～50-60mv/ph)。峰b)：从高ph到低ph：转变为负电势；电子转移的数量取决于ph(～30-60mv/ph)。
[0517]
尽管所需的样品量非常小，该方法提供的ph定量的极高准确度具有许多应用，包括如实施例4中所示地高加速检测和定量小量样品的核酸扩增。