一种间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞，其来源广泛、免疫原性低，并具有多项分化、较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病。能促进造血恢复功能，显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果。也可以用于治疗骨和肌肉衰退性疾病，心脑血管疾病，肝病和老年痴呆等。但其发挥作用的机制目前还不明确。现在越来越多的研究认为间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。
3.如今，越来越多的研究表明间充质干细胞分泌的促血管生成因子可极大程度的帮助患者伤口创面及神经性系统的恢复。
4.现在大部分研究和实际应用中使用血清替代物培养间充质干细胞，以保证无动物源性成分的干扰，保证干细胞安全性。
5.但如今市面上缺乏能进一步促进细胞分泌促血管生成因子的培养体系，所以发明一种高效刺激间充质干细胞分泌促血管生成因子的msc培养基尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的无血清培养基，该培养基在常规的基础培养基与血清替代品之外，添加炎性细胞因子tnf-α或il-6，以及rock信号通路的激动剂卡巴胆碱，从而具有较高的刺激间充质干细胞分泌促血管生成因子的能力。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.一种间充质干细胞的无血清培养基，所述培养基由基础培养基、血清替代品和促因子分泌添加物组成。
9.作为优选地，所述基础培养基包括dmem、dmem/f12和α-mem中的任意一种。
10.上述dmem为dulbecco's modified eagle medium，达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基。
11.dmem/f12为dulbecco's modified eagle medium/ham
‘
s f 12nutrient medium。
12.α-mem为alpha minimal essential medium。
13.作为优选地，所述血清替代品为elitegrotm-adv、ultroser g和血小板裂解物中的任意一种。
14.上述elitegrotm-adv或ultroser g为常规市售血清替代物。
15.作为优选地，所述血清替代品的添加量为所述无血清培养基体积的1％-10％。
16.作为优选地，所述促因子分泌添加物包括炎性细胞因子和卡巴胆碱；
17.所述炎性细胞因子为肿瘤坏死因子α和/或白细胞介素6。
18.作为优选地，所述无血清培养基中肿瘤坏死因子α的含量为10～100ng/ml，所述无
血清培养基中白细胞介素6的含量为1pg/ml～100pg/ml；
19.所述无血清培养基中卡巴胆碱的含量为0.01μmol/l～6mmol/l，优选为2.6μmol/l。
20.作为优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
21.一种间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，所述方法包括选取基础培养基、血清替代品和促因子分泌添加物混匀。
22.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
23.(一)本发明提供了一种间充质干细胞的无血清培养基，该培养基中含有rock信号通路的激动剂卡巴胆碱和炎性细胞因子作为促因子分泌添加物使用，能够刺激细胞分泌促血管生成因子，同时使用血清替代物和基础培养基组成的产品。
24.(二)该无血清培养基是针对脐带间充质干细胞培养。
25.(三)该无血清培养基在培养后间充质干细胞维持其特征性表型，采用该培养液培养的间充质干细胞，其促血管形成相关生长因子，分泌促血管生成因子显著增加，如vegf、hgf、bfgf，分泌量会大幅提升，从而提升对血管相关疾病，例如糖尿病足、皮肤创面、心脑血管病等的治疗效果。
附图说明
26.图1为实验组间充质干细胞的形态示意图；
27.图2为对照组间充质干细胞的形态示意图；
28.图3为实验组的5个抗体流式检测阳性率示意图；
29.图4为实验组cd73抗体流式检测阳性率示意图；
30.图5为实验组cd90抗体流式检测阳性率示意图；
31.图6为实验组cd105抗体流式检测阳性率示意图。
32.图中：a-isotype，b-抗体。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.本发明的一种具体实施方式的技术方案为：
35.一种间充质干细胞的无血清培养基，所述培养基主要由基础培养基、血清替代品和促因子分泌添加物组成。
36.上述基础培养基包括dmem、dmem/12和α-mem中的任意一种。
37.作为优选地，所述血清替代品为elitegrotm-adv或ultroser g。
38.所述血清替代品的添加量为所述无血清培养基体积的1％-10％。
39.作为优选地，所述促因子分泌添加物包括炎性细胞因子和卡巴胆碱；
40.作为优选地，所述炎性细胞因子为tnf-α和/或il-6。
41.作为优选地，所述无血清培养基中的tnf-α含量为10～100ng/ml；所述无血清培养
基中il-6含量为1pg/ml～100pg/ml。
42.tnf-α，全称肿瘤坏死因子-α，tumor necrosis factor，是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。tnf-α是一种由激活的巨噬细胞产生的能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子。
43.作为优选地，所述无血清培养基中的卡巴胆碱的含量为0.01μmol/l～6mmol/l，优选为2.6μmol/l。
44.作为优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
45.一种间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，所述方法包括选取基础培养基、血清替代品和促因子分泌添加物混匀。
46.一种具体实施方式的配制促因子分泌添加物原液：
47.tnf-α原液：100μg的tnf-α粉末，加入溶剂(如无菌水)100μl，获得1000μg/ml的原液。
48.il-6原液：100μg的il-6粉末，加入溶剂(如无菌水)1000μl，获得100μg/ml的原液。
49.卡巴胆碱原液：1g的卡巴胆碱粉末，加入5.475ml去离子水，获得1mol/l的原液。
50.实施例1：
51.配制1000ml无血清培养基：
52.在无菌容器中，加入950mlα-mem培养基，加入50ml elitegrotm-adv，加入tnf-α原液100μl，卡巴胆碱原液2.6μl，混匀，最终获得培养基为：含有5％无血清添加物、100ng/ml的tnf-α、2.6μmol/l的卡巴胆碱的无血清培养基。
53.实施例2：
54.配制1000ml无血清培养基：
55.在无菌容器中，加入900mlα-mem培养基，加入100ml ultroser g，加入il-6原液1μl，卡巴胆碱原液2.6μl，混匀，最终获得培养基为：含有5％无血清添加物、100ng/ml的il-6、2.6μmol/l的卡巴胆碱的无血清培养基。
56.实验例：
57.一、间充质干细胞培养：
58.1、p3-p5间充质干细胞培养至细胞融合度80％时用于实验操作。
59.二、实验设计
60.1、实验组：采用上述实施例1制备得到的无血清培养基进行培养，形态示意图如图1所示。
61.2、对照组：采用上述实施例1制备方法中，各原料去除促因子分泌添加物，获得的培养基进行培养，形态示意图如图2所示。
62.三、实验操作
63.操作一：
64.将p5间充质干细胞接种在t75细胞培养瓶内，接种密度5*105/瓶；
65.实验组培养基：本技术实施例1培养基。
66.对照组培养基：本技术实施例1-促因子分泌添加物；
67.待细胞融合度达到80％时，进行流式检测和条件培养基中促血管生成因子浓度的
测定。
68.流式细胞术检测方法：
69.1)收集间充质干细胞，pbs洗涤后经400目滤网过滤。
70.2)将细胞分装6个流式管，每管细胞数1
×
106，分别标注：control、isotype、negative、cd73、cd90、cd105。
71.3)isotype管细胞悬液中加入：fitc isotype control antibody、pe isotype control antibody和apc isotype control antibody；negative管中加入cd19-fitc、cd45-fitc、cd34-fitc、cd11b-fitc、hla-dr-fitc抗体；cd73管加入cd73-fitc抗体，cd90管中加入cd90-pe抗体，cd105管中加入cd105-apc抗体。
72.4)加入抗体混匀后避光孵育20分钟。
73.5)洗涤细胞悬液2次，弃上清后重悬细胞，上机检测，所用流式细胞仪型号为bd facscalibur。
74.实验结果为：
75.(一)实验组与对照组的流式指标都符合间充质干细胞的指标：
76.1)cd73、cd90、cd105，不低于95％；
77.2)cd11b、cd19、cd34、cd45和hla-dr，不高于2％。
78.(二)条件培养基中促血管生成因子的浓度对比，如表1所示：
79.表1添加促因子分泌添加物后促血管生成因子的浓度对比变化表
[0080][0081]
由以上结果可以看出，经实施例1制备得到的培养基培养，是不会改变间充质干细胞的表型，可充分刺激细胞产生更高浓度的促血管生成因子，以更高效的促进创面的恢复及神经系统疾病的治疗。
[0082]
(三)如图3-6显示采用促分泌因子添加物后，间充质干细胞的cd19、cd45、cd34、cd11b、hla-dr、cd73、cd90、cd105的表达情况。
[0083]
a线条是同型isotype的峰线条。
[0084]
b的是抗体的峰图。
[0085]
二者比较之后，可以获得相对应抗体的阳性率。
[0086]
图中的cd19、cd45、cd73等表示该图是针对此抗体的阳性率进行的流式检测。
[0087]
具体的为：图3是抗体为cd19、cd45、cd34、cd11b、hla-dr，5个抗体的流式检测图。
[0088]
如图3所示结果，cd19、cd45、cd34、cd11b、hla-dr，5个抗体阳性率总和为0.59％。
[0089]
图4是抗体为cd73抗体的流式检测图。如图4所示结果，的阳性率是99.44％。
[0090]
图5是抗体为cd90抗体的流式检测图。如图5所示结果，的阳性率是99.58％。
[0091]
图6是抗体为cd105抗体的流式检测图。如图6所示结果，的阳性率是98.75％。
[0092]
对于间充质干细胞，目前的国际标准是：阳性标志物(cd73、cd90、cd105)阳性率超过95％，阴性标志物(cd19、cd45、cd34、cd11b、hla-dr)阳性率低于2％。所以上述细胞的检测结果完全符合间充质干细胞的表型质量标准。
[0093]
数据分析的原理说明：因为抗体和抗原是特异性结合，只要细胞结合了相应的抗体，那就说明细胞表达相应的抗原，如果数字是1％，那就说明有1％的细胞表达该抗原。对于阴性的5个标志物，因为5个标志物抗体一起加入到细胞悬液，每个细胞表面可以结合很多类型的抗体，所以代表了5个标志物的阳性率之和。
[0094]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
[0095]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。