齐墩果酰-Leu-Asp-Val,其合成,活性和应用

齐墩果酰-leu-asp-val,其合成,活性和应用
技术领域
1.本发明涉及一种齐墩果酰-leu-asp-val及其制备方法,涉及它的抗肿瘤活性、抗肿瘤转移活性和对mmp-2的抑制活性。并进一步涉及它在制备具有抗肿瘤转移和抑制mmp-2表达双重作用的药物中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

2.齐墩果酸是中药女贞的活性成分之一,属于五环三萜型化合物,临床上用于急慢性肝炎的辅助治疗。不过,水溶性低限制了齐墩果酸临床应用。根据炎症和肿瘤转移的关系,尤其根据基质金属蛋白酶-2(mmp-2)在炎症和肿瘤转移中的作用,发明人认识到用leu-asp-val修饰齐墩果酸获得的齐墩果酰-leu-asp-val具有潜在的抗肿瘤转移活性。为了从理论上支撑这个认知,发明人通过discovery studio软件的cdocking模块将齐墩果酸和齐墩果酰-leu-asp-val与mmp-2(pdb序号：1hov)对接,完成了以虚拟筛选为基础的理论设计。说明书附图2是齐墩果酰-leu-asp-val及齐墩果酸对接到mmp-2的活性口袋的形貌及得分。
3.从附图2可以看出,和齐墩果酸相比齐墩果酰-leu-asp-val更适合进入mmp-2的活性口袋。也就是说,和齐墩果酸相比齐墩果酰-leu-asp-val更能抑制mmp-2。更进一步,齐墩果酰-leu-asp-val是潜在的抗肿瘤转移化合物,值得展开实验研究。于是发明人展开了齐墩果酰-leu-asp-val的实验研究。实验研究说明,齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤转移活性和抑制mmp-2确实优于齐墩果酸。因此，根据这些实验研究结果,发明人提出了本技术。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种具有下式结构的齐墩果酰-leu-asp-val，
[0005][0006]
本发明的第二个目的是提供具有上述结构的齐墩果酰-leu-asp-val的制备方法,该方法包括:
[0007]
1)合成boc-leu-asp(obzl)-val-obzl；
[0008]
2)合成hcl
·
leu-asp(obzl)-val-obzl；
[0009]
3)采用2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯为缩合剂,将齐墩果酸与hcl
·
leu-asp(obzl)-val-obzl缩合,制备齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl；
[0010]
4)采用h2/pb将齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl中的obzl脱保护基制备齐墩果酰-leu-asp-val。
[0011]
本发明所述的熊果酰-tyr-gly-phe-gly-gly的合成路线图如附图1所示。
[0012]
本发明的第三个目的是评价齐墩果酰-leu-asp-val在制备抗肿瘤转移药物中的作用。
[0013]
本发明的第四个目的是评价齐墩果酰-leu-asp-val在制备抑制肿瘤细胞迁移药物中的作用。
[0014]
本发明的第五个目的是评价齐墩果酰-leu-asp-val在制备抑制肿瘤细胞侵袭药物中的作用。
[0015]
本发明的第六个目的是评价齐墩果酰-leu-asp-val在制备mmp-2抑制剂中的作用。
附图说明
[0016]
图1为齐墩果酰-leu-asp-val的合成路线。图中：i)n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三唑(hobt),n-甲基吗啉,无水四氢呋喃；ii)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)；iii)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯,无水n,n-二甲基甲酰胺,无水n,n-二异丙基乙胺；iv)10％钯碳，氢气。
[0017]
图2为齐墩果酰-leu-asp-val及齐墩果酸对接到mmp-2的活性口袋的形貌及得分图，图2左为齐墩果酰-leu-asp-val对接到mmp-2活性口袋中的形貌图。图中-cdocker interaction energy 58.055kcal/mol；图2右齐墩果酸对接到mmp-2活性口袋中的形貌,图中-cdocker interaction energy 28.114kcal/mol。
具体实施方式
[0018]
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0019]
实施例1制备boc-asp(obzl)-val-obzl的合成
[0020]
称取1.6g(5.0mmol)boc-l-asp(obzl),0.7g(5.5mmol)1-羟基苯并三唑(hobt),50ml无水四氢呋喃及1.2g(6mmol)n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)于0℃搅拌0.5小时得到反应液a。往反应液a加1.3g(5mmol)hcl
·
l-val-obzl,0℃下用n-甲基吗啉(nmm)调ph值为9。之后，反应混合物室温搅拌4小时，tlc显示hcl
·
l-val-obzl消失，终止搅拌。反应混合物减压浓缩，残留物用100ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液过滤，滤液用30ml饱和nahco3溶液洗三次，用30ml饱和nacl溶液洗三次，用30ml 5％khso4溶液洗三次，用30ml饱和nacl溶液洗三次，用无水na2so4干燥12小时。滤除na2so4，滤液减压浓缩，得到2.2克(85％)boc-asp(obzl)-val-obzl，为无色固体。tlc(石油醚/乙酸乙酯，4/1；紫外显色；rf＝0.3)，esi-ms(m/e):513[m h]

。
[0021]
实施例2制备hcl
·
asp(obzl)-val-obzl
[0022]
将2.0g(3.9mmol)boc-asp(obzl)-val-obzl用30ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)溶解，0℃搅拌4小时tlc显示boc-asp(obzl)-val-obzl消失，终止搅拌。反应混合物减压浓缩，残留物用10ml无水乙酸乙酯溶解并减压浓缩。该操作重复3次。残留物混悬于10ml石油醚，悬浮物减压浓缩。该操作重复3次。得到1.5克(93％)hcl
·
asp(obzl)-val-obzl为淡黄色固体，直接用于后面的反应。esi-ms(m/e):413[m h]

。
[0023]
实施例3制备boc-leu-asp(obzl)-val-obzl
[0024]
按实施范例1的方案从1.0g(4.0mmol)boc-l-leu和1.7g(4mmol)hcl
·
asp(obzl)-val-obzl得1.6克(66％)boc-leu-asp(obzl)-val-obzl，为无色固体，tlc(石油醚/乙酸乙酯，1:1；紫外显色；rf＝0.3)，esi-ms(m/e):626[m h]

。
[0025]
实施例4制备hcl
·
leu-asp(obzl)-val-obzl
[0026]
采用实施2的方法从1.0g(1.6mmol)boc-leu-asp(obzl)-val-obzl得0.9克(100％)hcl
·
leu-asp(obzl)-val-obzl，为淡黄色固体，直接用于后面的反应。esi-ms(m/e):526[m h]

。
[0027]
实施例5制备齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl。
[0028]
采用实施例1的方法从1.7g(3.8mmol)齐墩果酸和2.8g(5.0mmol)hcl
·
leu-asp(obzl)-val-obzl制得2.06克(46％)齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl。为无色固体。esi-ms(m/e):965[m h]

。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ＝7.40-7.30(m,10h),7.27-7.28(m,2h),7.19-7.16(d,j＝8.4,1h),5.42(m,1h),5.23-5.09(m,4h),4.83-4.77(m,1h),4.53-4.46(m,2h),4.44-4.37(m,1h),3.06-2.99(m,1h),2.70-2.60(m,2h),2.02-1.97(m,1h),1.90-1.87(m,2h),1.80-1.76(m,1h),1.71-1.52(m,13h),1.48-1.44(m,21h),1.41-1.35(m,2h),1.24-1.18(m,3h),1.15(s,3h),1.10-1.02(m,3h),0.98(s,2h),0.96-0.95(m,3h),0.93(s,3h),0.93-0.92(m,7h),0.89(s,2h),0.87(s,6h),0.82-0.79(m,4h),0.68(s,3h)。
[0029]
实施例6制备齐墩果酰-leu-asp-val
[0030]
将0.1g(0.103mmol)齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl用10ml甲醇溶解。往得到的溶液中加10mg钯碳。得到的悬浮液抽去空气后室温搅拌并通氢气氢解12小时。tlc显示齐墩果酰-leu-asp(obzl)-val-obzl消失，终止氢解。悬浮液抽除钯碳，滤液减压浓缩，经十八烷基反向硅胶柱用90％甲醇洗脱得到0.07g(85％)齐墩果酰-leu-asp-val，为无色固体。esi-ms(m/e):783[m-h]-；mp:186.2-186.5℃；ir/cm-1
＝3379,2946,2873,1653,1476,1468,1384,1268,6531h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝12.4(s,1h),8.1(s,1h),7.49-7.47(d,j＝6hz,1h),7.22-7.21(d,j＝3hz,1h),5.14(s,1h)4.57-4.53(m,1h),4.25-4.21(m,2h),4.16-4.10(m,1h),2.98-2.95(m,1h),2.75-2.63(m,2h),2.45-2.44(m,1h),2.0-1.99(m,1h),1.95-1.89(m,1h),1.78-1.76(m,2h),1.65-1.60(m,3h),1.57-1.51(m,4h),1.45-1.34(m,9h),1.31-1.25(m,2h),1.06-1.02(m,5h),0.93-0.90(m,2h),0.87-0.80(m,27h),0.65(s,3h),0.62(s,3h)；
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ/ppm＝176.81,173.16,173.01,172.15,170.80,144.32,121.82,77.27,57.43,55.28,51.54,49.54,47.59,46.46,45.72,41.79,41.34,40.97,40.75,40.48,40.20,39.92,39.64,39.36,39.20,39.09,38.83,38.54,37.00,36.05,34.07,33.38,33.11,32.49,30.78,30.60,28.70,27.39,25.99,24.65,23.94,23.76,23.40,22.78,21.93,19.43,18.52,18.17,17.37,16.47,15.56。
[0031]
实施例7评价齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤细胞增殖作用
[0032]
本发明的齐墩果酰-leu-asp-val和齐墩果酸用含0.1％dmso的培养基配制成所需浓度。齐墩果酸购自上海麦克林生化科技有限公司。
[0033]
实验用的肿瘤细胞为a549(人非小细胞肺癌细胞)和hcclm3(人高转移肝癌细胞)。
[0034]
a549细胞选用rpmi-1640培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素。hcclm3细胞选用rpmi-dmem培养基,培养基中含10％经灭活的胎
牛血清和1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素。
[0035]
将生长状态良好处于对数生长期的细胞以3
×
104个/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl,置于37℃和5％co2的细胞孵育箱中培养4小时,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的齐墩果酰-leu-asp-val，arg-gly-asp-ser和齐墩果酸与含0.1％dmso的培养基配制成的溶液,每孔25μl,对照组加入等体积溶媒。继续培养48小时后,每孔加25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液,置于37℃和5％co2的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μl的dmso,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测o.d.值(吸光度),检测波长为490nm。按下式求出各个浓度下化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性:
[0036]
抑制率＝[(阴性对照组od值均数-受试化合物组od值均数)/阴性对照组od值均数]
×
100％
[0037]
表1的数据说明，齐墩果酸和齐墩果酰-leu-asp-val在100μm时抑制肿瘤细胞增殖的百分率小于55％。可见，齐墩果酸和齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤细胞迁移侵袭作用和抗肿瘤细胞增殖无关。表1的数据进一步说明，齐墩果酰-leu-asp-val在100μm时抑制肿瘤细胞增殖的百分率小于37％。可见，齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤细胞迁移侵袭作用和抗肿瘤细胞增殖更无关。
[0038]
表1 100μm齐墩果酰-leu-asp-val及齐墩果酸对肿瘤细胞增殖的抑制率
[0039][0040][0041]
实施例8评价齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤细胞迁移作用
[0042]
本发明的齐墩果酰-leu-asp-val和齐墩果酸用含0.1％dmso的培养基配制成20μm。
[0043]
将生长状态良好处于对数生长期的细胞以5
×
105个/ml的密度接种于transwell小室上室,每孔100μl,加齐墩果酰-leu-asp-val和齐墩果酸及含0.1％dmso的培养基25μl；下室加入600μl的含血清培养基(10％)，在37℃、5％co2培养箱中培养12h。吸去上室剩余液体，用棉签轻轻擦去未迁移的上室细胞，重复3次。吸去下室剩余液体，每孔加600μl 4％多聚甲醛，固定细胞30min,吸除固定液，用pbs洗3次，每孔加600μl结晶紫染液，染色15min,吸除染色液，小室用去离子水洗3次。在显微镜下，在每个小室选取5个位置大致相同且细胞分布均匀的视野拍照，计数(避免选小室最边缘细胞分布不均匀处)，实验数据统计均采用单因素方差分析检验，迁移细胞数以(均值
±
sd)表示。结果如表2所示，齐墩果酰-leu-asp-val显著性抑制a549细胞及hcclm3细胞迁移,显著优于齐墩果酸和阳性对照arg-gly-asp-ser。可见，本发明具有意想不到的抑制肿瘤细胞迁移的技术效果。
[0044]
表2齐墩果酰-leu-asp-val及齐墩果酸对肿瘤细胞迁移的影响
[0045][0046]
a)与空白对照组比p《0.01；b)与空白对照组比p《0.01,与齐墩果酸组比p《0.05,与arg-gly-asp-ser组比p《0.05；c)与空白对照组相比p《0.05,与齐墩果酸组比p》0.05；n＝2。
[0047]
实施例9评价齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤细胞侵袭作用
[0048]
采用实施例8的方案配置化合物，细胞。先将液态基质胶与无血清培养基1:9稀释，往transwell上室加100μl,孵育5h后，加入每孔加入50μl的无血清培养基，水化基底膜。之后将生长状态良好处于对数生长期的细胞以5
×
105个/ml的密度接种于transwell小室上室,其余操作同实施例8。结果如表3所示，齐墩果酰-leu-asp-val显著性抑制a549细胞及hcclm3细胞侵袭,活性优于齐墩果酸和阳性对照arg-gly-asp-ser。可见，本发明有意想不到的显著性抑制肿瘤细胞侵袭的技术效果。
[0049]
表3齐墩果酰-leu-asp-val及齐墩果酸对肿瘤细胞侵袭的影响
[0050][0051]
a)与空白对照组比p《0.01；b)与空白对照组比p《0.01,与齐墩果酸组比p《0.05,与arg-gly-asp-ser组比p《0.05；c)与空白对照组相比p《0.05,与arg-gly-asp-ser组比p》0.05；n＝2。
[0052]
实施例10评价齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤作用
[0053]
齐墩果酸购自上海麦克林生化科技有限公司，羧甲基纤维素钠均购自国药集团化学试剂有限公司，阿霉素购自北京华丰联合技术有限公司。spf级icr品系雄性小鼠(20
±
2g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用移植性小鼠s180肉瘤模型。
[0054]
因为使用s180小鼠肉瘤作为肿瘤模型是常规实验中一种普遍习惯，因此，发明人使用s180小鼠肉瘤实验例数据为代表来评价本发明的抑制肿瘤的活性。移植性小鼠s180肉瘤模型用的瘤源为s180小鼠肉瘤细胞,购自北京大学医学部动物实验中心,按悬浮细胞培养方法自行传代保留。取传代一周的荷s180腹水瘤spf级雄性icr小鼠,适量乙醚麻醉后断颈处死,浸泡于75％酒精中消毒1min,剖开腹腔,取腹水s180瘤液,经1000r/min
×
10min离
心,弃上清液,残留物以少量经冷却的生理盐水洗去非细胞碎片,组织及浮血,用台盼蓝染色标定细胞活力,结果显示细胞活度达95.0％。活细胞计数,悬浮于冷却的生理盐水中,使细胞密度为2
×
107个/ml,尽快用于接种。接种时左手固定小鼠,右手持1ml注射器刺入小鼠右侧腋下约2mm至皮下,轻轻钝性分离出一小空腔,注入0.2ml活细胞悬液。接种后每日观察小鼠,至大部分小鼠腋下可见绿豆粒大小实体瘤(接种第5天)时分组,每组10只小鼠,连续给10天齐墩果酰-leu-asp-val(口服剂量为2μmol/kg/天),连续给10天阿霉素(腹腔注射剂量为2μmol/kg/天),连续给10天cmcna，连续给10天齐墩果酸(口服剂量为2μmol/kg/天及20μmol/kg/天)。第11天称各组小鼠称重,以乙醚麻醉,颈椎脱臼处死,固定小鼠腋下实体瘤生长部位,取剪刀剪开皮肤,充分暴露瘤体,沿皮肤,上肢钝性分离取出肉瘤称重。原位瘤重以均值
±
sd g表示,sd值先经spss软件进行方差分析,检验方差齐性,单因素方差分析，进行组间统计学比较。具体数据见下表4。
[0055]
表4齐墩果酸及齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤活性
[0056][0057]
a)与空白对照组比p《0.05；b)与空白对照组比p》0.05,与齐墩果酸组比p《0.05,与arg-gly-asp-ser组比p《0.05；c)与空白对照组相比p》0.05；n＝10。
[0058]
表4的数据说明连续治疗10天齐墩果酰-leu-asp-val(口服剂量为2μmol/kg/天)没有抗肿瘤生长作用,因此表明，齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤转移作用和抑制肿瘤生长无关。
[0059]
实施例11评价齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤转移作用
[0060]
齐墩果酸购自上海麦克林生化科技有限公司，羧甲基纤维素钠均购自国药集团化学试剂有限公司，阿霉素购自北京华丰联合技术有限公司。spf级c57bl/6品系雄性小鼠(20
±
2g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用lewis肺癌自发转移模型。
[0061]
lewis肺癌细胞转移属于较难抑制的肿瘤细胞，所以在常规实验中普遍作为代表模型使用。因此，发明人使用lewis肺癌细胞实验例数据来评价本发明的抑制肿瘤转移的活性。lewis肺癌自发转移模型用的瘤源为llc鼠肺癌细胞,购自atcc,选取生长状态良好细胞，在灭菌的生物安全柜中弃去上清，用pbs缓冲液沿培养皿壁洗涤3次，每次1ml；加入1ml胰蛋白酶-edta消化液，置于孵箱中(37℃，5％co2)消化，细胞呈圆形状时，灭菌滴管吸取培养基吹打细胞；转移细胞液至15ml ep管中，3000rpm下离心3min。超净台弃去上清，用4℃生理盐水调整细胞浓度至2
×
107个/ml，台盼蓝染色计数。取近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％
乙醇消毒，于小鼠右前腋皮下注射细胞悬液(0.2ml/只)。接种后7天可见有实体瘤组织形成。第15天长出直径约2-3cm的实体瘤组织，作为瘤源备用。
[0062]
将瘤源荷瘤小鼠乙醚麻醉后，脱颈椎处死，用75％的乙醇消毒，钝性分离肿瘤瘤，剪碎，用玻璃组织匀浆器研磨，过200目细胞筛制成单细胞悬液，用生理盐水重悬，台盼蓝染色计数，密度1.9
×
107个/ml。
[0063]
取近交系c57bl/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前腋，右手持1ml无菌注射器于右前腋下注射制备的细胞悬液(0.2ml/只)。接种10天后肿瘤直径约1-2mm，模型建立，随机分组。然后开始给齐墩果酰-leu-asp-val(口服剂量为20μmol/kg/天),给cmcna,给齐墩果酸(口服剂量为20μmol/kg/天),给arg-gly-asp-ser(腹腔注射剂量20μmol/kg/天),给leu-asp-val(腹腔注射剂量20μmol/kg/天)。每天1次，共给10天。每隔两天测量并记录肿瘤体积。第25天小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死，分离肺组织，统计肺部转移的瘤结数。瘤结数以均值
±
sd个表示，后经单因素方差分析进行组间统计学比较。数据见表5。
[0064]
表5齐墩果酸及齐墩果酰-leu-asp-val的抗肿瘤转移活性
[0065][0066]
a)与cmcna比p《0.05；b)与cmcna比p《0.01,与齐墩果酸(20μmol/kg)比p《0.05,与leu-asp-val比p《0.05,与arg-gly-asp-ser比p》0.05；n＝10。
[0067]
表5的数据表明,在20μmol/kg/天口服剂量下齐墩果酰-leu-asp-val显著性抑制肿瘤转移。在抑制肿瘤转移层面,齐墩果酰-leu-asp-val的活性显著强于齐墩果酸及leu-asp-val。可见,本发明有意想不到的抑制肿瘤转移的技术效果。
[0068]
实施例12评价齐墩果酰-leu-asp-val对基质金属蛋白酶-2的影响
[0069]
本实验小鼠基质金属蛋白酶-2(mmp-2)酶联免疫分析试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。在评价小鼠肺癌转移的c57bl/6小鼠乙醚麻醉之后摘眼球法取血。血液离心(3000rpm,15min)取上清，按试剂盒操作进行测定，对所得数据进行统计分析，标准孔(n＝3)，取平均值进行计算，样品组(n＝6)进行测定，计算血液基质金属蛋白酶-2含量。数据见表6。
[0070]
表6齐墩果酰-leu-asp-val对小鼠mmp-2含量的影响
[0071][0072]
a)与健康小鼠比p《0.05；b)与健康小鼠比p》0.05，与cmcna比p《0.05，与齐墩果酸比p《0.05；c)与cmcna比p》0.05；n＝6
[0073]
表6的数据表明,在20μmol/kg/天口服剂量下齐墩果酰-leu-asp-val显著性抑制血液中基质金属蛋白酶-2含量。在抑制质金属蛋白酶-2表达层面,齐墩果酰-leu-asp-val的活性显著强于齐墩果酸。可见,本发明具有意想不到的抑制质金属蛋白酶-2的技术效果。