联苯吡嗪喹唑啉二胺,其合成、活性及应用

1.本发明涉及一种n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺及其制备方法，涉及它的抗肿瘤生长作用、涉及它的抗肿瘤转移作用和涉及它对p97表达的抑制作用。此外，本发明涉及它在制备抗肿瘤药物中的应用、涉及它在制备抗肿瘤转移药物中的应用以及涉及它在制备p97抑制剂中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

[0002]
下面结构的工具药dbeq是atp竞争性的p97抑制剂。依据p97蛋白活性口袋的特征发明人推测，在用联苯-3-基替换dbeq的苯甲基的同时用吡嗪-2基-甲基替换dbeq的苯甲基(这两个替换导致本案的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺)，可以得到更优秀的p97抑制剂，进而可以得到优秀的抗肿瘤剂及抗肿瘤转移剂。
[0003][0004]
为了从理论是支撑推测的科学性，本案首先将dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺分别与p97蛋白活性口袋对接。完成了基于分子对接的理论设计。基于分子对接的理论设计表明，dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺二者都可进入p97蛋白活性口袋。基于分子对接的理论设计进一步表明，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺比dbeq更适应p97蛋白活性口袋得分显著高(见附图2)。dbeq的对接得分-cdocker interaction energy为34.84kcal/mol-cdocker interaction energy 34.84kcal/mol。n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的对接得分为联苯吡嗪喹唑啉-2胺的对接得分-cdocker interaction energy为45.07kcal/mol。后者显著高。基于分子对接的理论设计表明，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺有价值实施实验研究。发明人的实验研究发现，在抑制p97，抗肿瘤生长及抗肿瘤转移三个层面n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺都比dbeq优秀。根据在分子对接的理论设计中的发现及在实验研究中的发现，发明人提出了本发明。


技术实现要素：

[0005]
本发明的第一个目的是提供一种具有下式结构的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺，
[0006][0007]
本发明的第二个目的是提供具有上述结构的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的制备方法,该方法包括:
[0008]
1)合成2-氯-n
4-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺；
[0009]
2)合成n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺。
[0010]
本发明的第三个目的是评价具有上述结构的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤作用。
[0011]
本发明的第四个目的是评价具有上述结构的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤转移作用。
[0012]
本发明的第五个目的是评价具有上述结构的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对p97的抑制作用。
附图说明
[0013]
图1为n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的合成路线图
ⅰ
)2-胺甲基吡嗪，乙腈；
ⅱ
)3-胺基联苯，碳酸铯，2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯，三二亚苄基丙酮二钯，乙腈，95℃。
[0014]
图2为dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺分别与p97蛋白活性口袋对接图。其中，a为dbeq对接到p97蛋白活性口袋中的形貌,-cdocker interaction energy 34.84kcal/mol；b为n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对接到p97蛋白活性口袋中的形貌,-cdocker interaction energy 45.07kcal/mol。
具体实施方式
[0015]
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0016]
实施例1制备2-氯-n
4-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺
[0017]
称取66.0mg(0.33mmol)的2,4二氯喹唑啉用乙腈溶解，0℃下加入96μl(1.0mmol)2-甲氨基吡嗪，室温反应过夜，tlc监测2,4二氯喹唑啉消失。反应混合物过滤，滤饼用乙腈复发淋洗，得到的黄色固体用柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1洗脱)，最终得67.0mg(74％)标题化合物，为淡黄色固体。tlc(二氯甲烷/甲醇，10/1；紫外显色；rf＝0.3)，esi-ms(m/e)：272[m h]

，1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝9.42(t,1h),8.73(d,j＝1.0hz,1h),8.63
–
8.58(m,1h),8.55(d,j＝2.5hz,1h),8.33(d,j＝7.9hz,1h),7.83(t,j＝7.1hz,1h),7.65(d,j＝8.0hz,1h),7.58(t,j＝7.6hz,1h),4.88(d,j＝5.7hz,2h)。
[0018]
实施例2制备n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺
[0019]
称取575.9mg(3.4mmol)的3-氨基联苯及3195.0mg(9.8mmol)碳酸铯用乙腈溶解，95℃回流20分钟得到反应液a；称取275.0mg(0.58mmol)2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯，528.0mg(0.58mmol)三二亚苄基丙酮二钯及813.0mg(3.0mmol)2-氯-n-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺与乙腈混悬得到混悬液b。将混悬液b与反应液a混合，95℃回流反应。3小时后tlc显示2-氯-n-(吡嗪-2-基甲基)喹唑啉-4-胺消失。反应液趁热过滤，用乙腈淋洗滤饼，用二氯甲烷及甲醇多次淋洗滤饼至滤饼为灰白固体。滤液减压浓缩，得到的棕黑色浆状物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1～10/1)，最终得到297.0mg(25％)标题化合物,为乳白色固体。tlc(二氯甲烷/甲醇/冰醋酸，15/1/1滴；紫外显色；rf＝0.3)，hplc(％)：95.86，mp:205-206℃，ir(cm-1
)：3388,3278,3052,1572,1538,1520,1466,1447,1403,1326,1127,1018,754,697,678，ft-ms(m/e)：405.18439[m h]

，1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝9.16(s,1h),8.85(s,1h),8.74(s,1h),8.61(s,1h),8.54(d,j＝2.4hz,1h),8.16(d,j＝7.8hz,2h),7.82(d,j＝7.6hz,1h),7.69
–
7.56(m,3h),7.46(dd,j＝7.9,5.0hz,3h),7.39
–
7.31(m,1h),7.31
–
7.13(m,3h),4.94(d,j＝5.3hz,2h)，
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ/ppm＝160.63,156.95,154.65,144.52,144.12,143.71,142.09,141.12,140.82,133.42,129.35,127.75,127.00,123.36,122.35,119.66,118.27,117.55,112.03,55.38,40.81,40.53,40.25,39.97,39.69,39.42,39.14。
[0020]
实施例3评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制肿瘤细胞增殖活性
[0021]
1)dbeq购自medchemexpress，pbs及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(fbs)购自corning，二甲基亚砜(dmso)购自上海阿拉丁生化科技有限公司，四噻唑蓝(mtt)购自solarbio：溶于pbs溶液中，制成5mg/ml的溶液，过滤除菌后使用，避光保存；
[0022]
2)受试细胞系：s180(小鼠肉瘤细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)、rpmi8226(多发性骨髓瘤细胞)
[0023]
3)mcf-7细胞选用rpmi-1640培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素；s180细胞选用dmem培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素；rpmi8226细胞选用dmem培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1
×
105u/l青霉素和100mg/l链霉素。
[0024]
4)贴壁细胞mcf-7：将生长状态良好且处于对数生长期的贴壁细胞用pbs洗3次，胰酶消化至大部分细胞从瓶壁脱落，加入相应培养基终止消化，吹打至细胞完全脱落，转移至15ml离心管中，使用1000rpm离心3min,弃去上清液，加培养基吹打重悬，计数，细胞密度为3～4
×
104个/ml，接种于96孔板(corning 3599)中，每孔加入100μl(96孔板外围每孔加100μl pbs液封)；加dbeq或者n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺培养：在条件为37℃、5％co2的孵箱中孵育6小时，观察细胞贴壁情况，当贴壁率达到50％以上时每孔加25μl样品液，轻轻晃动均匀。孵箱培养48小时后，每孔加入25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，孵育4小时，吸去上清液，每孔加入100μl dmso，振荡15分钟充分溶解沉淀，5分钟内用酶标仪于570nm和490nm波长下测定每孔的吸光度。实验设置5个复孔，以抑制率对dbeq或者n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度作图，计算ic
50
值。
[0025]
对于悬浮细胞s180及rpmi8226：将生长状态良好且处于对数生长期的悬浮细胞转移至15ml离心管中，使用1000rpm离心3min,弃去上清液，加培养基吹打重悬，计数，细胞密度为3～4
×
104个/ml，接种于96孔板(corning 3799)中，每孔加入100μl(96孔板外围每孔加100μl pbs液封)，每孔加25μldbeq或者n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的溶液，轻轻晃动均匀。在孵箱中培养48小时后,每孔加入25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液,孵育4小时,3000rpm离心10分钟，吸去上清液，每孔加入100μl dmso,振荡15分钟充分溶解沉淀，5分钟内使用酶标仪于570nm和490nm波长下测定各孔的吸光度。实验设置5个复孔，以抑制率对dbeq或者n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度作图，计算ic
50
值。
[0026]
5)结果见表1
[0027]
结果表明dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对于三种肿瘤细胞增殖显示近似的抑制作用。该结果说明依据dbeq设计的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不是前药。
[0028]
表1 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺抑制肿瘤细胞增殖活性(ic
50
±
s dμm)*
[0029][0030]
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺,n＝5。
[0031]
实施例4评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的抗肿瘤生长活性
[0032]
dbeq购自medchemexpress，阿霉素购自国药集团化学试剂有限公司。spf级icr品系雄性小鼠(20
±
2g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验采用移植性小鼠s180肉瘤模型。
[0033]
dbeq的口服剂量为180μmol/kg/天，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的口服剂量为90μmol/kg/天，阳性对照阿霉素的腹腔注射剂量为2μmol/kg/天，阴性对照为生理盐水。
[0034]
s180小鼠肉瘤作为肿瘤模型是常规实验中一种普遍习惯，因此，发明人使用s180小鼠肉瘤实验例数据为代表来评价本发明的抑制肿瘤生长的活性。移植性小鼠s180肉瘤模型用的瘤源为s180小鼠肉瘤细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，按悬浮细胞培养方法自行传代保留。取传代一周的荷s180腹水瘤spf级雄性icr小鼠，适量乙醚麻醉后断颈处死，浸泡于75％酒精中消毒1分钟，剖开腹腔，取腹水s180瘤液,离心，弃上清液，残留物以少量经冷却的生理盐水洗去非细胞碎片，组织及浮血，活细胞计数，将活细胞悬浮于冷却的生理盐水中，使细胞密度为2
×
107个/ml，尽快用于接种。接种时左手固定小鼠，右手持1ml注射器刺入小鼠右侧腋下约2mm至皮下，轻轻钝性分离出一小空腔，注入0.2ml活细胞悬液。
[0035]
接种后每日观察小鼠，至大部分小鼠腋下可见绿豆粒大小实体瘤时分组，每组12只小鼠，连续给dbeq10天或者n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺10天或者阿霉素10天或者生理盐水10天。第11天称各组小鼠称重，以乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，固定小鼠腋下实体瘤生长部位，取剪刀剪开皮肤，充分暴露瘤体，沿皮肤上肢钝性分
离取出肉瘤称重。原位瘤重以均值
±
sd g表示,sd值先经spss软件进行方差分析,检验方差齐性,采用t-test检验,进行组间统计学比较。表2的数据说明，在剂量降为1/2时n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制肿瘤生长的活性与dbeq没有显著性差异。本发明有突出技术效果。
[0036]
表2 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对肿瘤生长的抑制作用
[0037][0038]
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与生理盐水比p＜0.05；b)与生理盐水比p＜0.01，与dbeq比p＞0.05；n＝11。
[0039]
实验例5评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对淋巴细胞及血小板的影响
[0040]
淋巴细胞数及血小板数都影响肿瘤患者的免疫功能。为考察n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对淋巴细胞及血小板的影响，本发明采用迈瑞全自动三分类血球分析仪bc3000测定了实验例4的s180小鼠血液中淋巴细胞及血小板数计数。表3的数据说明，dbeq显著性减少s180小鼠血液中淋巴细胞数量，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不减少s180小鼠血液中淋巴细胞数量。该结果说明依据dbeq设计的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺避免了dbeq降低免疫功能的副作用。本案有突出的技术效果。表3的数据还说明，dbeq显著性升高s180小鼠血液中血小板数量，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺不升高s180小鼠血液中淋巴细胞数量。该结果说明依据dbeq设计的n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺避免了dbeq对免疫功能的影响。本案有突出的技术效果。
[0041]
表3 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对血小板及淋巴细胞计数的影响
[0042][0043]
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与生理盐水比p＜0.05；n＝5。
[0044]
实验例6评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对肿瘤细胞迁移的影响
[0045]
dbeq购自medchemexpress，pbs及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(fbs)购自corning，二甲基亚砜(dmso)购自上海阿拉丁生化科技有限公司。受试细胞系为a549(人肺癌细胞)。dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度为5μm。
[0046]
在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞生长良好，形态延展饱满且折光性良好，均贴壁且无漂浮物，当细胞生长铺满培养瓶底面积的80％时视细胞处于对数生长期，在此状态下的细胞能够满足于实验要求。采用此时的细胞进行实验，弃去瓶内原有的培养基，每瓶加入1ml pbs缓冲液洗涤残留培养基2次后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液放入孵箱中进行消化，在倒置显微镜下观察细胞形态，直至大部分细胞变圆并能够从瓶壁上脱落时，加入1ml培养基终止消化，沿壁反复吹打细胞使其脱落并分散，转移到经过灭菌的15ml的离心管中，在1000rpm条件下离心3min，离心结束后弃去上清液，加入5ml不完全培养基，用吸管基吹打细胞使其均匀分散，吸取10μl细胞悬浮液于红细胞计数板上在倒置显微镜下进行计数，最后稀释细胞悬液使其分散均匀，使细胞浓度为2.5
×
105个/ml，然后将细胞悬液均匀接种于已在底部画好辅助线的六孔板中，各孔分别加入2ml细胞悬液，然后将六孔板置于孵箱中，先在37℃、5％co2的孵箱中孵育12小时。
[0047]
当细胞贴壁数量达到80％以上，用枪头和尺子对底部进行划线，每孔划3条直线，吸除培养基，用pbs洗去划掉的细胞，清洗两次，然后分别在不同孔中加入2ml含有dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的不完全培养基，各设2个复孔，每板均设置阳性对照及阴性对照孔。置于37℃5％co2的细胞孵箱内培养，在0小时划痕。然后在孵育0小时，12小时和孵育24小时三个时间点取出进拍照。用imagej对迁移面积进行统计，对同一视野的3个时刻的结果进行统计比较。表4的数据说明，n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺抑制a549细胞迁移活性显著性强于dbeq。本案有突出的技术效果。
[0048]
表4 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对a549细胞迁移的影响
[0049][0050]
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与培养基比p＜0.01，与dbeq组比p＜0.05；n＝5。
[0051]
实验例7评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对肿瘤细胞侵袭活性
[0052]
dbeq购自medchemexpress，pbs及培养基均购自江苏凯基生物技术股份有限公司，胎牛血清(fbs)购自corning，二甲基亚砜(dmso)购自上海阿拉丁生化科技有限公司，4％多聚甲醛固定液购自索莱宝，结晶紫购自beyotime。dbeq和n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺的浓度为5μm。
[0053]
将matrigel基质胶从-20℃取置4℃化成液态之后取150μl matrigel基质胶，加入1350μl的不完全培养基稀释，每孔上室加入100μl稀释液，将transwell板放入37℃、5％co2培养箱中培养5小时。吸除上室液体，加入50μl不完全培养基，将transwell板放入37℃、5％co2培养箱中培养30分钟。
[0054]
采用处于生长对数期的细胞进行实验，弃去瓶内原有的培养基，每瓶加入1ml pbs缓冲液洗涤残留培养基2次后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液放入孵箱中进行消化，在倒置显微镜下观察细胞形态，直至大部分细胞变圆并能够从瓶壁上脱落时，加入1ml培养基终止消化，沿壁反复吹打细胞使其脱落并分散，转移到经过灭菌的15ml的离心管中，在
1000rpm离心3分钟，弃上清液，加入5ml不完全培养基，用吸管吹打细胞使其均匀分散，在1000rpm离心3分钟，弃上清液，再加入5ml不完全培养基，用吸管吹打细胞使其均匀分散，吸取10μl细胞悬浮液于红细胞计数板上在倒置显微镜下进行计数，最后稀释细胞悬液使其分散均匀，使细胞浓度为2.5
×
105个/ml；吸除上室液体，在上室每孔加入100μl细胞液，下室加入600μl完全培养基。在相应的上室中加dbeq或n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺溶液25μl(两个复孔)，孵育15～18小时。将上室的液体吸出，加入100μl pbs清洗，棉签擦拭，重复2次，将下室液体吸出，加入600μl 4％的多聚甲醛固定液于4℃固定细胞30分钟后，吸出下室液体，清洗后，加入600μl结晶紫溶液，室温染色15分钟。染色后，回收结晶紫，将上室用蒸馏水清洗后晾干。
[0055]
在每个小室中选出细胞数目均一的9个视野拍照，用imagej数出9个视野内的细胞数，得到迁移的平均细胞数和sd，对其进行数据统计。数据见表5.
[0056]
表5 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对a549细胞侵袭的影响
[0057][0058]
*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与培养基比p＜0.01；b)与dbeq组比p＜0.01；n＝9。
[0059]
实验例8评价n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺对血清p97蛋白含量的影响
[0060]
小鼠含缬酪肽蛋白(vcp)酶联免疫分析(elisa)购自凡科维；小鼠血清为实施例4给药10天后的s180荷瘤小鼠。标准品孔各加不同浓度的标准品50μl，设置两个复孔。样品孔中加入40μl样品稀释液，空白孔不加，依次向样品孔中加入10μl血清或者肿瘤蛋白，空白孔不加。每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。表6的数据说明，在剂量降低至dbeq的1/2时n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺治疗的s180小鼠血清p97蛋白含量仍然显著地低。可见，本发明有突出的技术效果。
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表6 dbeq及联苯吡嗪喹唑啉-2胺对s180小鼠血清p97含量的影响
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*表中联苯吡嗪喹唑啉-2胺＝n
2-([1,1'-联苯]-3-基)-n
4-(吡嗪-2基-甲基)喹唑啉-2,4-二胺；a)与健康小鼠比p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.05；c)与dbeq比p＜0.05；n＝9。