一种快速核酸PCR扩增和荧光检测的离心式微流控芯片的制作方法

一种快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片
技术领域
1.本公开涉及生物检测领域，特别是一种快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片。


背景技术：

2.微流控(microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术，在生物医学、分析化学、疾病诊断、药物筛选等领域有广泛的应用。微流控技术的应用极大促进了临床上的病原菌检测效率，使得基于核酸的“即时检验(point-of-care，poc)”成为可能。
3.从血液、唾液、细菌中提取的核酸量少，核酸检测必须经过扩增使得检测目标dna/rna数量达到要求。目前核酸扩增技术主要包括常规pcr、实时荧光定量pcr和等温核酸扩增技术。实时荧光定量pcr是使用与核酸特异性结合后荧光增强的染料实现被扩增核酸的相对定量，在核酸扩增领域有着不可替代的影响。但其需要在变性、退火和延伸三个温区循环交替，这对加热装置有着严格的要求，而且极消耗时间。等温核酸扩增技术虽然在速度上有绝对的优势，但其需要设计4-6中引物，这种复杂程度不适合初学者。并且基于等温扩增技术的新核酸方法可以真正减少测试时间，但它们不能取代基于pcr的方法，并且由于其复杂的反应系统和非特异性扩增，它们也缺乏在单个反应中检测多个靶标的能力。
4.核酸检验人都知道在核酸检测实验室内样本的制备、扩增过程中都会产生各种污染，比如样本交叉污染、试剂仪器交叉污染、克隆质粒污染、pcr扩增产物污染、还有极容易忽视的气溶胶污染，气溶胶是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，在空气与液体面摩擦时，比如在核酸提取制备模板时，反复吹吸/混匀震荡反应液，以及pcr体系配液时充分震荡反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。dna/rna 气溶胶污染的问题，很严重，广泛分布在样本容器、实验室台面，试剂溶液中、仪器表面、内管附着等等，极其微量的气溶胶污染即可造成假阳性的结果，进而可能引起整个pcr实验室的污染，严重的甚至要关闭实验室，严重影响实验工作，甚至耽误疫情防控工作的开展。
5.因此需要开发一种快速、精准核酸扩增的装置，体积小，满足大规模制造需求，且密封性良好，不会出现污染问题。


技术实现要素：

6.为了解决相关技术中的问题，本公开提供了一种快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片。
7.本公开中的快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片,包括：基层，其中所述基层包括进样口、推杆导轨、可压缩气囊腔、第一流道、弧形腔室、荧光检测腔、排气孔、第二流道，其中所述推杆导轨与可压缩气囊腔连通，所述第一流道的一端与设置在可压缩气囊处的可压缩气囊连通，另一端与所述荧光检测腔连通，弧形腔室的一端与所述荧光检
测腔连通，另一端与所述进样口连通，所述排气孔通过第二流道与所述进样口连通；
8.顶层，所述顶层包括罩盖腔、顶层排气孔以及荧光检测盲孔，其中所述顶层排气孔与基层的排气孔对应，罩盖腔与所述推杆导轨对应，荧光检测孔与所述荧光检测腔对应，
9.以及罩盖组件，所述罩盖组件包括罩盖以及滑动推杆，其中所述罩盖组件经罩盖腔安装在所述基层上。
10.作为示例性的，所述基层与顶层为扇形。
11.作为示例性的，所述弧形腔室由首尾连接的多段弧形流道组成。
12.作为示例性的，每段弧形流道为四分之一圆弧。
13.作为示例性的，荧光检测腔与第一流道连接处镶嵌疏水薄膜修饰。
14.作为示例性的，可压缩气囊可压缩体积大于所述弧形腔室体积，但小于所述弧形腔室和所述荧光检测腔的体积之和。
15.作为示例性的，所述快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片的近圆心端有加热模块，远圆心端有冷却模块。
16.作为示例性的，所述加热模块中采用热电偶贴片加热。
17.作为示例性的，罩盖以及滑动推杆通过倾斜件连接起来。
18.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
19.结合附图，通过以下非限制性实施方式的详细描述，本公开的其它特征、目的和优点将变得更加明显。以下是对附图的说明。
20.图1示出根据本公开的芯片的装配图。
21.图2示出根据本公开的基层结构示意图。
22.图3示出根据本公开的顶层结构示意图。
23.图4示出根据本公开的罩盖组件机构示意图。
24.图5示出根据本公开的基层的温度分布图。
25.图6示出根据本公开的基层又一结构示意图。
26.图7a示出本公开的芯片的前视图。
27.图7b示出本公开的芯片的后视图。
28.应当明白，附图中所示出的各个部件的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。此外，相同或类似的参考标记表示相同或类似的构件。
具体实施方式
29.下文中，将参考附图详细描述本公开的示例性实施例，以使本领域技术人员可容易地实现它们。此外，为了清楚起见，在附图中省略了与描述示例性实施例无关的部分。
30.在本公开中，应理解，诸如“包括”或“具有”等的术语旨在指示本说明书中所公开的特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合的存在，并且不欲排除一个或多个其他特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合存在或被添加的可能性。
31.本公开的附图中相同或相似的附图标记对应相同或相似的部件；在本公开的描述
中，需要理解的是，若有术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用于仅用于示例性说明，不能理解为对本公开的限制，对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于对部件的区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
32.本公开的描述中，还需要说明的是，除非另有明确规定和限定，术语“设置”、“安装”、“连接”、“相连”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体式连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以是通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本公开中的具体含义。
33.另外还需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本公开。
34.前文已提及，需开发一种快速、精准核酸扩增的装置，体积小，满足大规模制造需求，且密封性良好，不会出现污染问题。本公开提供了一种快速核酸 pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片。
35.参考图1-3，根据本公开提供的快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片，包括基层100、顶层200以及罩盖组件300。
36.基层100包括进样口101、推杆导轨102、可压缩气囊腔103、第一流道104、弧形腔室105、荧光检测腔106、排气孔107、第二流道108，其中所述推杆导轨102与可压缩气囊腔连通，所述第一流道104的一端与设置在可压缩气囊103 处的可压缩气囊连通，另一端与所述荧光检测腔106连通，弧形腔室105的一端与所述荧光检测腔连通，另一端与所述进样口101连通，所述排气孔107通过第二流道108与所述进样口101连通。
37.顶层200包括罩盖腔201、顶层排气孔202以及荧光检测盲孔203，其中所述顶层排气孔201与基层100的排气孔107对应，罩盖腔201与所述推杆导轨 102对应，荧光检测孔203与所述荧光检测腔106对应；
38.罩盖组件300包括罩盖301以及滑动推杆302，其中所述罩盖组件300经罩盖腔201安装在所述基层100上。
39.具体的，芯片基层100与顶层200贴合形成一体，如可采用键合的方式贴合。罩盖组件300的滑动推杆302安装在推杆导轨102内，且可以在推杆导轨 102内滑动，而罩盖301则安装在罩盖腔201进而对进样口101进行密封。罩盖 301可以在推杆导轨102内滑动，罩盖301可以在罩盖腔201内滑动。使用时，可以通过推动罩盖301来带动滑动推杆302在推杆导轨102内滑动，进而滑动推杆302可以压缩安装在可压缩气囊腔103内的可压缩气囊。例如，将滑动推杆302向靠近压缩气囊的方向滑动可以压缩可压缩气囊，向远离可压缩气囊的方向移动可以释放可压缩气囊，可压缩气囊在自身弹性作用下恢复原状。
40.在本公开中，荧光检测盲孔203与荧光检测腔106相隔一定的距离，如2mm。通过设置荧光检测盲孔203，一方面可以密封荧光检测腔106，另一方面由于荧光检测盲孔的厚度较薄，有利于荧光透射，提高准确性。
41.本公开的芯片加样后迅速关闭罩盖，且所有溶液均保持在芯片内，可以避免环境
污染问题。该芯片使用时只需一次加入样本溶液和反应液，然后关闭进样口罩盖，整个核酸扩增反应与荧光检测环节都在芯片内完成，减少气溶胶污染等问题。
42.作为示例性的，基层100与顶层200为扇形，由此整个芯片的形状为扇形。芯片近圆心端较小面积加热，远圆心端较大面积散热，可以实现近圆心端高温区递减到远圆心端低温区，而不需要外加隔热片等操作，且转动时，空气在芯片表面流动，有利于芯片温度分布均匀。作为示例性的，扇形可以为四分之一圆，因此转盘最多可以装载4个芯片，能够实现多通道多靶向目标同时检测的要求。
43.作为示例性的，参考图2，弧形腔室由首尾连接的多段弧形流道组成，通过将弧形腔室设置成由首尾连接的多段弧形流道组成，有利于离心时液体在弧形腔室内的流动。作为示例性的，每段弧形流道为四分之一圆弧。在本公开中，如图6所示，每段弧形流道由近圆心弧向远心弧斜度都向外扩张了预定的尺寸l，如2mm，作为示例性的，弧形腔室横截面为0.5x0.2mm。
44.作为示例性的，荧光检测腔106与第一流道104连接处镶嵌疏水薄膜修饰。疏水薄膜可以让空气通过，隔绝水溶液，由此保证液体不进入可压缩气囊内。
45.作为示例性的，可压缩气囊可压缩体积大于所述弧形腔室体积，但小于所述弧形腔室和所述荧光检测腔的体积之和。在此设置下，可压缩气囊可压缩体积能够保证混合液能够从进样口负压作用力下，经过弧形腔室，到达荧光检测腔室；而体积小于所述弧形腔室和荧光检测腔的体积之和，则可以保证混合液全部到达荧光检测腔室后，可压缩气囊恢复原始状态，不能形成负压，避免吸收太多的空气。
46.作为示例性的，参考图7a-图7b所示，快速核酸pcr扩增和荧光检测的离心式微流控芯片的近圆心端40有加热模块，远圆心端41有冷却模块(图中未示出)。作为示例性的，加热模块中采用热电偶贴片加热，当然本领域技术人员也可以理解采用其他的方式进行加热。冷却模块可以采用任何的可以与本公开匹配的现有冷却装置，如空气冷却装置如风扇或半导体冷却装置等。在本公开中，加热模块控制芯片近圆心端的温度为变性温度如95℃，散热模块控制芯片远圆心端的温度为退火温度如60℃，中间的温度为延伸温度如72℃。图5示出了芯片的温度分布图。在本公开中，温度精准分布在芯片上，只需一个加热模块和冷却组件如风扇等，就能实现芯片上有三个稳定的温区，且无需对芯片反复地加热和降温，就能满足pcr核酸扩增三个环节，极大地减少等待时间。
47.前文已提及，罩盖组件300包括罩盖301以及滑动推杆302，作为示例性的，罩盖301以及滑动推杆302可以通过倾斜件303连接起来，当然本领域技术人员可以理解，罩盖301以及滑动推杆302可以直接连接起来。
48.下面详细阐述本公开的芯片使用方法以方便本领域技术人员更好的理解本发明。
49.1)向靠近可压缩气囊的方向(为方便表述，后续均简称为向左滑动)罩盖 301，与罩盖相连的滑动推杆压缩可压缩气囊，可压缩气囊处于被压缩的状态；
50.2)使用注射枪向进样口注射待测核酸溶液50μl，再向进样口注射反应液 50μl，所述反应试剂主要包括五种即引物、酶、dntp、模板、缓冲液和荧光探针等；
51.3)将罩盖向远离可压缩气囊的方向(为方便表述，后续均简称为向右滑动) 并盖在进样口上，气囊恢复原始形态；
52.4)同时地，待测核酸溶液和反应液结合成的混合液在可压缩气囊的负压状态下，
经过弧形腔室运动到荧光检测腔室；
53.5)同时地，分别上位机控制加热模块和冷却模块，使近圆心端的弧形腔室的温度控制为95℃，使远圆心端的温度控制为60℃，温区波动范围不超过1℃；
54.6)驱动模块自动控制负载芯片的转盘转动，芯片中的混合溶液在离心的作用下，从近圆心弧形腔室到远圆心腔室端到达进样口，可压缩气囊的压强逐渐变为负压状态；
55.7)芯片停止转动后，处于负压状态的可压缩气囊又再次把混合溶液经弧形腔室105驱动到荧光检测腔室106；
56.8)这样的循环重复30-40次即可完成指定样品的核酸扩增环节；
57.9)最终混合溶液到达荧光扩增腔室106，在荧光检测装置下观测溶液中的荧光强度，并定量分析核酸浓度。
58.以上描述仅为本公开的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。