一种源自白酒酿造窖泥的产丙酸型嗜蛋白菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种源自白酒酿造窖泥的产丙酸型嗜蛋白菌及其应用，属于酿造微生物技术领域。


背景技术：

2.白酒按照香型差异可分为浓香、酱香、清香等12大香型，其中浓香、酱香、芝麻香等八种香型均需要通过含有窖泥的生产容器(即窖池)进行发酵。浓香型白酒受众广泛，在我国消费量最大，销售收入最高的白酒产品之一，以其窖香为主的，舒适的复合香气的优点深受广大消费者的喜爱。窖泥微生物之间的相互作用产生了浓香型白酒风味中最主要且独特的风味物质，如丙酸、丁酸、己酸、辛酸及其酯类化合物，这些风味物质的种类、含量和比例对浓香型白酒的风味特征影响巨大，如不同酸酯比例可分为川派浓香和苏派浓香。白酒中的风味物质主要来源于窖泥多种微生物的共同作用组成，泥窖固态发酵是浓香型白酒独特的生产工艺，窖泥经过长期的连续的生产逐渐被驯化并趋于老熟稳定，但窖泥自然老熟过程较为缓慢，往往长达20～30年，严重制约着新建产能的优质品率提升。
3.老熟的浓香型白酒窖泥ph呈现中性或偏弱碱性的特征，ph为6～8；而酒醅为酸性，ph3.5～4.0。酒醅来源的乳酸、己酸等有机酸可以渗透于窖泥中，对窖泥微生物产生酸胁迫作用，因此窖泥维持ph稳态的核心机理在于其中的酸降解菌群(己酸降解菌群和产甲烷菌群)，即上述两类菌群分别需具有高效的己酸降解能力和甲烷产生能力。如何采用微生物干预方式，加速己酸降解是构建己酸降解菌群的关键技术。
4.窖池内的窖泥栖息着大量的厌氧微生物，其中细菌主要归属于厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)等，前者包括产己酸类型微生物，如oscillospiraceae sp.lbm10036、caproiciproducens sp.jnlz26等。虽然拟杆菌门微生物在窖泥中丰度较高(相对丰度11％左右)(illuminating anaerobic microbial community and cooccurrence patterns across a quality gradient in chinese liquor fermentation pit muds，hu et al.，2016，82，2506-2515)，但由于目前仍然非常缺乏对该类微生物菌群的菌种资源分离，以及拟杆菌门微生物在浓香型白酒酿造过程中起到何种作用仍然不清晰。在老熟窖泥中，嗜蛋白菌属为优势微生物，在窖泥中的相对丰度为5.15％左右(窖泥细菌群落结构与基酒挥发性组分相关性分析，曾丽云等，食品科技，2017，第42卷，第02期)。嗜蛋白属是拟杆菌门的一个代谢多元类群，即在多糖和蛋白质的水解、糖的发酵以及乙酸、丙酸、琥珀酸的生产都有着嗜蛋白属微生物的背影。
5.然而，窖泥微生物中被分离的纯培养微生物，大部分都属于厚壁菌门微生物，但由于窖泥主体拟杆菌门内的微生物因严格厌氧，纯培养条件不清晰，拟杆菌门内的嗜蛋白菌属微生物鲜有被分离纯培养。嗜蛋白菌属内的微生物因严格厌氧，纯培养条件不清晰。
6.因此，获得纯培养分离的窖泥主体嗜蛋白菌属微生物，解析其生理代谢特征，对于挖掘以及解析优质窖泥资源，开发新型白酒酿造和调控技术，有着重要的理论和应用价值。此外，获得性能优良的嗜蛋白菌属微生物，将科学有效地维持窖泥ph稳态、实现对窖泥质量
的调控。


技术实现要素：

7.本发明提供了一株源于白酒酿造窖泥主体拟杆菌门嗜蛋白属的新型微生物proteiniphilum sp.lbm11006及其应用。该菌株发酵可产挥发性脂肪酸丙酸，为白酒提供了重要风味化合物及相应酯类的前体物质。proteiniphilum sp.lbm11006菌株与窖泥的己酸降解菌群进行共培养时，可促进己酸的降解与甲烷的生成，有利于维持己酸降解菌群的ph稳态。
8.本发明的第一个目的是提供了一株产丙酸型嗜蛋白属菌株，分类学名称为proteiniphilum sp.，已于2021年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61649，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。本发明将其命名为嗜蛋白菌lbm11006(proteiniphilum sp.lbm11006)。
9.本发明的proteiniphilum sp.lbm11006，具有如下特性：
10.(1)从浓香型白酒酿造窖泥中筛选分离得到的，能够适应ph值为5.4-9.1的浓香型白酒酿造窖泥环境(老熟窖泥ph 7～8)。
11.(2)严格厌氧，菌落为透明光滑圆形，细胞为短杆状。
12.(3)代谢产物包括丙酸和乙酸，其中乙酸0.8～1g/l，丙酸0.2～0.25g/l。
13.(4)促进窖泥体系己酸降解及甲烷生成。
14.(5)16s rrna序列如seq id no:1所示。
15.所述嗜蛋白菌lbm11006的筛选，具体是：在mci培养基上进行富集，并进行菌株的纯培养分离纯化而得，通过对其16s rrna基因序列进行blast分析，将该菌种鉴定为拟杆菌门嗜蛋白属微生物。
16.本发明的第二个目的是提供含有所述嗜蛋白菌lbm11006的微生物菌剂。
17.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中含有嗜蛋白菌lbm11006的活细胞、冷冻干燥的菌体、固定化细胞中的一种或多种。
18.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
19.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的制备中，使用含有丙酮酸的培养基来促进嗜蛋白菌lbm11006的生长。
20.本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为微生物冻干菌粉。
21.本发明的一种实施方式中，所述冻干菌粉按下列步骤制备：将嗜蛋白菌lbm11006活化后，接种至含有丙酮酸的py培养基中，于35～38℃厌氧培养24～36h，后将得到的菌悬液离心收集菌体，根据菌体含量添加脱脂牛奶作为保护剂，进行冷冻干燥，获得冻干菌粉。
22.所述py培养基的成分为(l-1
)：酵母粉10～11g，蛋白胨5～6g，peptone 5～6g，盐溶液40～41ml，0.1％刃天青400～500μl，2.5％半胱氨酸溶液20～21ml，氯化血红素溶液10～11ml和vk1 200～300μl。其中，盐溶液配制如下(l-1
)：nahco
3 10～11g，nacl 2～3g，k2hpo
4 1～2g，kh2po
4 1～2g，mgso4·
7h2o 1～2g和cacl
2 0.2～0.3g。其中，氯化血红素配制如下：氯化血红素(ml-1
)50～60mg，naoh(1n)1～2ml，121℃高压灭菌20min。vk1配制如下：vk1 100～200μl和95％乙醇20～21ml，有机膜过膜除菌。ph为7.3～7.5。
23.本发明的第三个目的是提供所述嗜蛋白菌lbm11006在酿造领域中的应用。
24.在本发明的一种实施中，所述应用是将嗜蛋白菌lbm11006用于白酒酿造过程。
25.在本发明的一种实施中，所述应用是利用所述嗜蛋白菌lbm11006维持窖泥ph稳态。
26.在本发明的一种实施中，所述应用是将嗜蛋白菌lbm11006加入于窖泥混菌体系中。
27.在本发明的一种实施中，所述应用，具体是将嗜蛋白菌lbm11006与窖泥己酸降解菌群和甲烷生成体系进行共培养发酵，促进体系己酸降解及甲烷生成以至可维持窖泥ph稳态。
28.本发明的一种实施中，所述共培养发酵是：将于py培养基中培养到对数期的嗜蛋白菌lbm11006按10％的比例接种于窖泥富集体系，37℃厌氧培养18d。
29.本发明的第四个目的提供所述嗜蛋白菌lbm11006在发酵生产丙酸和乙酸中的应用。
30.在本发明的一种实施中，所述发酵具体是：将所述菌株嗜蛋白菌lbm11006在py培养基中培养到对数期后，接种于py的培养基中，37℃厌氧培养144～168h。
31.有益效果：
32.(1)本发明筛选的菌株嗜蛋白菌lbm11006，是窖泥中的主体拟杆菌门微生物，可以产生浓香型白酒重要风味化合物丙酸，该酸为重要风味化合物丙酸酯类的前体物质。
33.(2)本发明的嗜蛋白菌lbm11006，可以在丙酮酸的作用下促进生长；本发明的嗜蛋白菌lbm11006菌剂制备方法，通过添加丙酮酸，有效地提高了菌剂的制备效率。
34.(3)本发明筛选的菌株嗜蛋白菌lbm11006与窖泥富集体系共培养可以增强体系中己酸降解、甲烷的生成，从而促进窖泥产酸菌群的ph稳态维持，在改良窖泥质量和制作人工窖泥中具有重要潜在应用价值。
35.生物材料保藏
36.proteiniphilum sp.lbm11006，分类学名称为proteiniphilum sp.，已于2021年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61649，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
37.图1：菌株嗜蛋白菌lbm11006的形态。
38.图2：菌株嗜蛋白菌lbm11006的生长和丙酸、乙酸产生情况。
39.图3：培养基初始ph对菌株嗜蛋白菌lbm11006的生长影响。
40.图4：菌株嗜蛋白菌lbm11006的最适生长温度测定及其主要代谢产物。
41.图5：菌株嗜蛋白菌lbm11006以丙酮酸为碳源促进生物量的增加。
42.图6：菌株嗜蛋白菌lbm11006对窖泥微生物菌群的ph稳态维持功能。
具体实施方式
43.下面结合具体的实施例对本发明进行具体描述。
44.下述实施例中所涉及的培养基如下：
45.富集/筛菌用mci培养基(l-1
)：酵母粉1～2g，蛋白胨1～2g，矿物质元素溶液50～
60ml，微量元素溶液1～2ml，b族维生素溶液5～6ml和半胱氨酸溶液10～11ml。维生素、半胱氨酸溶液都灭菌后添加。微量元素溶液(l-1
)含znso4·
7h2o 0.1～0.2g，mncl
2 0.03～0.04g，h bo 0.3～0.4g，cocl2·
6h2o 0.2～0.3g，cacl
2 0.01～0.02g，nicl
·
6h o 0.02～0.03g，na moo 0.03～0.04g和fecl2·
4h2o 1.5～2g。矿物质元素溶液(l-1
)含kh2po
4 10～11g，mgcl2·
6h2o 6.6～7g，nacl 8～9g，nhcl
4 8～9g和cacl
2 1～2g。b族维生素溶液(l-1
)含烟酸20～21mg，钴胺素20～21mg，盐酸硫铵10～11mg，对氨基苯甲酸10～11mg，盐酸吡哆酸50～60mg和泛酸钙5～6mg。
46.mci固体培养基：以mci液体培养基为基础，添加2％的琼脂。
47.py培养基(l-1
)：酵母粉10～11g，蛋白胨5～6g，peptone 5～6g，盐溶液40～41ml，0.1％刃天青400～500μl，2.5％半胱氨酸溶液20～21ml，氯化血红素溶液10～11ml和vk1 200～300μl。其中，盐溶液配制如下(/l)：nahco
3 10～11g，nacl 2～3g，k2hpo
4 1～2g，kh2po
4 1～2g，mgso4·
7h2o 1～2g和cacl
2 0.2～0.3g；氯化血红素配制如下：氯化血红素50～60mg，naoh(1n)1～2ml和水99～100ml，121℃高压灭菌20min；vk1配制如下：vk1 100～200μl和95％乙醇20～21ml，有机膜过膜。ph为7.3～7.5。
48.py固体培养基：以py液体培养基为基础，添加2％的琼脂。
49.实施例1：窖泥主体拟杆菌门嗜蛋白属微生物菌株嗜蛋白菌lbm11006的分离与鉴定
50.(1)富集培养：利用mci培养基进行富集培养窖泥微生物，在100ml mci液体培养基中接种5～6％的窖泥，在37℃厌氧箱里富集培养7～14d，用于后续筛菌。
51.(2)筛菌：将富集培养的混菌体系，采用梯度稀释的方法(10
～2
，10
～3
，10
～4
，10
～5
)将获得的窖泥富集培养液涂布于mci固体培养基上，于37℃厌氧箱中培养7～14d后，对平板上不同形态的菌落进行挑选，并于mci液体培养基中进行培养72～84h。后在已培养72～84h的mci液体培养基中取1ml，12000rpm 2min离心取上清液，进行气相色谱检测，检测丙酸含量，进一步筛选丙酸含量在0.25g/l～0.5g/l的菌株进行下一步检测。
52.(3)菌株鉴定：
53.1)革兰氏染色
54.使用光学显微镜，通过革兰氏染色法对所获得的纯培养菌株进行鉴定后，确定为革兰氏阴性菌，且形状为短杆状(如图1)。
55.2)分子鉴定：通过细菌16s rrna基因的通用引物(27f/1492r)对所在液体培养基培养的微生物进行pcr扩增，后通过ncbi进行比对，确定其分类地位。
56.所用引物(seq id no:2、seq id no:3所示)：
57.27f：agagtttgatcctggctcag(seq id no:2)
58.1492r：ggttaccttgttacgactt(seq id no:3)
59.pcr扩增反应25μl体系：27f 0.5μl，1492r 0.5μl，高保真酶primer star 12.5μl，灭菌超纯水水10.5μl，菌液1μl。
60.pcr反应条件：预变性98℃2min；第一步变性95℃10s；第二步退火55℃30s；第三步产物延伸72℃1min；第一步至第三步循环30次；第四步产最后延伸72℃10min；第五步保持16℃4min。
61.纯化：根据pcr结果确定菌株分类学地位，将目标菌株培养液涂布于mci固体培养
基上，纯化获得单菌落。测序结果序列如seq id no:1所示。
62.按照上述方法，得到了窖泥中主体拟杆菌门嗜蛋白属微生物菌株嗜蛋白菌lbm11006(proteiniphilum sp.lbm11006)，并已于2021年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61649。
63.实施例2：菌株嗜蛋白菌lbm11006的发酵特性
64.(1)菌株嗜蛋白菌lbm11006的生长和发酵产酸性能
65.将实施例1筛到的纯嗜蛋白菌lbm11006菌株在py培养基中培养到对数期后在py培养基中进行发酵实验，设置三个平行。如图2所示，菌株嗜蛋白菌lbm11006在37℃厌氧箱中生长24～36h后，到达对数生长期，此时od
600
为0.15～0.2，生长到96～120h时，od
600
达最大，此时为0.36～0.39。菌株嗜蛋白菌lbm11006的代谢产物含有乙酸和丙酸，即发酵144～168h后，通过气相色谱检测可知乙酸产量0.8～1g/l，丙酸0.2～0.25g/l。该菌的产丙酸能力为浓香型酒醅中丙酸含量(0.12g/kg)的2倍(jiangjing gao et al.domination of pit mud microbes in the formation of diverse flavour compounds during chinese strong aroma-type baijiu fermentation.lwt-food science and technology,137(2021),110442.)，表明该菌株为在浓香型白酒酒醅风味强化方面具有重要潜力。
66.(2)菌株嗜蛋白菌lbm11006的生长谱对ph的适应性
67.将实施例1分离得到的菌株嗜蛋白菌lbm11006以py培养基作为基础，设置培养基初始ph为3.5、5.4、5.7、6.3、6.6、7.3、7.5、8.6、9.1、9.9，用5m hcl和naoh调节培养基的ph。
68.步骤如下：将不同ph培养基接入对数生长期菌液，每个ph梯度设置三个平行，37℃厌氧箱中培养，在0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h取样，分别检测嗜蛋白菌lbm11006在不同ph的生长情况即利用分光光度计测od
600
吸光值，从而确定嗜蛋白菌lbm11006的耐ph性能。
69.结果为：将实施例1分离得到的菌株嗜蛋白菌lbm11006在经过不同的ph培养基中培养后，如图3所示，菌株嗜蛋白菌lbm11006可在初始培养ph为5.4～9.1的py培养基中的生长，其中在ph为7.3～7.5的条件下，嗜蛋白菌lbm11006生长的最好。老熟窖泥以及优质窖泥的ph是属于中性或偏弱碱性即约7～8左右，该菌株的ph适应性与窖泥实际ph相适应，且该菌株在ph低至5.4和高至9.1时仍然具有一定的生长能力，表明该菌株对于窖泥ph变化具有从5.4到9.1的适应能力。
70.(3)菌株嗜蛋白菌lbm11006的耐温性能
71.将实施例1分离得到的嗜蛋白菌lbm11006以py培养基作为基础，温度设置为20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃。
72.步骤如下：在py培养基中接入对数生长期菌液，每个温度梯度设置三个平行，在厌氧箱中将每三个接入菌液的py培养基装入厌氧袋中，后在20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培养箱中培养120h。在0h、120h取样，利用分光光度计测od
600
吸光值，以及利用气相色谱测量不同温度发酵条件下的产物，从而确定菌株嗜蛋白菌lbm11006的耐温性能。
73.结果如图4所示，将实施例1分离得到的菌株嗜蛋白菌lbm11006在经过不同的温度培养箱培养后，经检测菌株嗜蛋白菌lbm11006可在20～45℃生长。在37℃的条件下，菌株嗜蛋白菌lbm11006生长得最好。浓香型白酒发酵体系温度最高不会超过40℃，顶温一般为30～35℃，因此该菌株的生长温度谱与发酵实际体系温度变化相适应。
74.实施例3：菌株嗜蛋白菌lbm11006的菌剂制备方法
75.本发明发现丙酮酸钠的添加可以促进嗜蛋白菌lbm11006生物量的增加，基于此发现可以提高菌剂的制备效率。具体而言，菌剂制备的步骤如下：
76.(1)菌株嗜蛋白菌lbm11006的活化：
77.将实施例1中的菌株嗜蛋白菌lbm11006在37℃厌氧箱中接种于py培养基中，培养24～36h后，得到一级种子液，活化后按照每代10％的接种比例逐级扩大培养到三代，即获得三级种子液。
78.(2)根据10％(v/v)接种比例，将三级种子液接种至100ml含丙酮酸(1％)的py培养基中，在37℃厌氧条件下，培养至对数生长期即培养72～96h获得活性较高的的菌悬液，此时菌株的od为0.6。当菌株在py培养基和加入丙酮酸的py培养基中分别培养120～144h后，菌株嗜蛋白菌lbm11006在py培养基中最大od为0.38，而在加丙酮酸的py培养基中最大od为1，生物量增加163％，故添加丙酮酸后可以促进生物量的增加(如图5所示)。即将在含丙酮酸的py培养基中培养72～96h后将菌悬液在4℃下8000rpm离心10min，收集菌体，后在厌氧箱里根据菌体含量添加脱脂牛奶，混匀后，后进行真空冷冻干燥，最后得到冻干菌生物菌剂。
79.具体菌剂制备方法为：将嗜蛋白菌lbm11006菌体与脱脂牛奶按照5:1的比例混匀，即500ml发酵液对应100ml脱脂牛奶，分装于玻璃培养皿中，每个培养皿分装100ml，使用保鲜膜封口，在-80℃预冻2h，预冻后使用真空冷冻干燥机，在66.66pa的真空度下，冷冻干燥24h，即得含嗜蛋白菌lbm11006的固体菌剂。
80.实施例4：菌株嗜蛋白菌lbm11006菌剂在促进窖泥微生物菌群ph稳态维持方面的应用
81.将实施例1筛到的菌株嗜蛋白菌lbm11006在mci培养基中进行与窖泥混菌富集共培养。
82.实验组和对照组设定：
83.对照组：将空白py培养基按10％接种量接种于mci窖泥混菌体系中。
84.实验组：在py培养基中培养到对数期的嗜蛋白菌lbm11006按10％接种量接种于mci窖泥混菌体系中。
85.所述mci窖泥混菌体系：将5％窖泥接种于mci液体培养基中，培养30d后，进行传代一次后得到mci窖泥混菌体系。
86.具体步骤如下：
87.(1)菌株嗜蛋白菌lbm11006的种子液的制备：
88.将实施例1中的菌株嗜蛋白菌lbm11006接种于py培养基中，在37℃厌氧箱中培养24～36h，得到一级种子液，活化后逐级扩大培养到三代，即获得三级种子液。
89.(2)根据10％(v/v)接种比例，将三级种子液接种至100ml装有mci窖泥混菌体系的血清瓶中，在37℃厌氧箱中培养18d，每隔两天进行取样，期间利用气相色谱对发酵体系的甲烷产量进行检测。整体发酵结束后利用气相色谱测定发酵液己酸降解情况。
90.结果如图6所示，对照组需6d后才观察到己酸的显著降解，而添加了嗜蛋白菌lbm11006菌剂的实验组在4d时已观察到显著的己酸降解，可见嗜蛋白菌lbm11006菌剂的添加显著促进了己酸的降解，且最终实验组在10d时己酸已经被完全降解，而对照组实现己酸
的完全降解则需要12d。结合加快的甲烷产生表型来看，嗜蛋白菌lbm11006菌剂的添加将甲烷产生提前了2d，与己酸降解表型相一致。以上结果表明，在窖泥体系中添加嗜蛋白菌lbm11006菌剂可以促进窖泥混菌培养体系中的己酸的降解与甲烷的生成，以利于窖泥己酸降解菌群的ph稳态。
91.本发明涉及的序列：
92.seq id no.1
93.atgaagagtttgatcctggctcaggatgaacgctagcgataggcctaacacatgcaagtcgaggggcatcacatgaagcagcaatgcagatggtggcgaccggcgcacgggtgagtaacacgtatgcaacctgccttcaacaagggaataacccgttgaaagacggactaataccctataacacaggggctccgcatggagatatttgttaaagattttatcggttgaagatgggcatgcgttccattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatggataggggaactgagaggtttatcccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtgaggaatattggtcaatggacgcaagtctgaaccagccacgtcgcgtgaaggaagacggccctacgggttgtaaacttcttttgtaagggaataaagtgattcacgtgtgtttcattgcatgtaccttacgaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatccgagcgttatccggatttattgggtttaaagggtgcgcaggcggaagattaagtcggcggtgaaattttgcagcttaactgtaaaagtgccttcgaaactggttttcttgagtgtagatgaagtaggcggaatttgtggtgtagcggtgaaatgcatagatatcacgaggaactcctattgcgcaggcagcttactaaactactactgacgctcatgcacgaaggcgtggggatcaaacaggattagataccctggtagtccacgcagtaaacgatgattactcgctgtttgcgatacactgtaagcggccaagcgaaagcgttaagtaatccacctggggagtacgttcgcaagaatgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggaggaacatgtggtttaattcgatgatacgcgaggaaccttacccgggcttgaaatgcatctggccggccgcgaaaacggccttcccttcggggcagatgtgtaggtgctgcatggttgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgtcggcttaagtgccataacgagcgcaaccctcatcgttagttaccatcaggtgaagctggggactctaacgagactgccatcgtaagatgcgaggaaggtggggatgacgtcaaatcagcacggcccttacgtccggggcgacacacgtgttacaatgggtggtacaaagggcagctacatggcgacatgatgctaatcttcaaaaccactctcagttcggatcggagtctgcaactcgactccgtgaagctggattcgctagtaatcgcgcatcagccacggcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatggaagccgggggtacctgaagtccgtaaccgtcaaggagcggcctagggtaaaactggtgactggggctaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggaacacctccttt
94.seq id no:2：agagtttgatcctggctcag
95.seq id no:3：ggttaccttgttacgactt
96.以上所述仅是本发明的优选实施方式，但其并非用于限定本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以做出若干改变或替换，这些改变或替换也应属于本发明的保护范围之内。