一种灭活型病毒保存液及其制备方法与流程

1.本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种灭活型病毒保存液及其制备方法。


背景技术：

2.病毒(virus)属无细胞结构的最小、最简单的微生物。病毒体(virion)是完整的成熟病毒颗粒，由核酸和蛋白质构成，其核心只有一种核酸(dna或rna),外被蛋白质衣壳构成核衣壳，有些病毒的核衣壳外还被有包膜。病毒必需在活细胞内寄生，并以复制的方式繁殖后代。在临床微生物感染症中，由病毒引起者约占75％，而且传染性强，传播迅速，流行广泛，死亡率高，后遗症严重，临床诊断和防治困难，有些病毒感染还与肿瘤和自身免疫病密切相关。故病毒在临床上具有重要意义。病毒引起的传染性疾病进行临床检测时，为防止病毒传染特别是一些高致病性的病毒传染，需要对样本进行灭活，灭活病毒的方式主要有：物理灭活(高温、紫外照射等)、化学灭活(消毒剂等)。通常灭活病毒的原理是通过破坏病毒的蛋白质和核酸而导致其死亡，蛋白的破坏会导致病毒核酸释放出来，无任何保护措施的情况下，也会导致病毒核酸(特别是rna病毒)的破坏，均不利于后续基于病毒核酸的分子生物学的检测。
3.因此，如何开发一种使病毒灭活且保证病毒核酸的完整性的灭活型病毒保存液，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种灭活型病毒保存液及其制备方法，不破坏病毒核酸的基础上提高灭活型病毒保存液的稳定性，进而提高下游针对病毒核酸的体外诊断检测性能。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.在本发明的第一方面，提供了一种灭活型病毒保存液，所述保存液包括以下终浓度的组分：异硫氰酸胍15～25g/l、蛋白酶k 4～6g/l、乙基苯基聚乙二醇1～2ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇1～10ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚1～10ml/l、乙二胺四乙酸0.1～0.2g/l、proclin 150 0.4ml/l、氯化钠9g/l、磷酸氢二钠2.9g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、1m氢氧化钠0.25ml/l和酚红0.04g/l。
7.进一步地，所述保存液包括以下终浓度的组分：氯化钠9g/l、异硫氰酸胍20g/l、蛋白酶k 5g/l、乙基苯基聚乙二醇1.5ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇2ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚2ml/l、乙二胺四乙酸0.15g/l、proclin 150 0.4ml/l、磷酸氢二钠2.9g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、1m氢氧化钠0.25ml/l和酚红0.04g/l。
8.在本发明的第二方面，提供了一种灭活型病毒保存液的制备方法，采用所述的配方配制而得。
9.进一步地，向1m氢氧化钠中加入酚红，配制酚红母液；
10.后向纯化水中依次加入氯化钠、异硫氰酸胍、蛋白酶k、乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯(20)十六烷基醚、乙二胺四乙酸、proclin 150、磷酸氢二钠、磷酸
二氢钾和所述酚红母液混匀。
11.在本发明的第三方面，提供了所述灭活型病毒保存液在保存病毒中的应用。
12.进一步地，所述应用中，待保存的病毒原液与灭活型病毒保存液的体积比为1：(6-10)。
13.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
14.本发明提供的一种灭活型病毒保存液，该灭活型病毒保存液的各组分协同配合使得在不破坏病毒核酸的基础上提高灭活型病毒保存液的稳定性，进而提高下游针对病毒核酸的体外诊断检测性能。特别地，活性剂乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇及聚氧乙烯(20)十六烷基醚的加入，大大增强了保存液对核酸的保护性作用。且乙基苯基聚乙二醇1～2ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇1～10ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚1～10ml/l的配比必须在此范围内，浓度过大或过小均不利于增强了保存液对核酸的保护性作用。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
16.图1为甲型流感病毒核酸保存效果验证结果；
17.图2为呼吸道合胞病毒核酸保存效果验证结果。
具体实施方式
18.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
19.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
20.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
21.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
22.根据本发明一种典型的实施方式，提供一种灭活型病毒保存液，所述保存液包括以下终浓度的组分：
23.异硫氰酸胍15～25g/l、蛋白酶k 4～6g/l、乙基苯基聚乙二醇1～2ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇1～10ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚1～10ml/l、乙二胺四乙酸0.1～0.2g/l、proclin 150 0.4ml/l、氯化钠9g/l、磷酸氢二钠2.9g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、1m氢氧化钠0.25ml/l和酚红0.04g/l。
24.本发明经过试验发现，活性剂乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇及聚氧乙烯(20)十六烷基醚的加入，大大增强了保存液对核酸的保护性作用。且乙基苯基聚乙二醇1～2ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇1～10ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚1～10ml/l的配比必
须在此范围内，浓度过大或过小均不利于增强了保存液对核酸的保护性作用。
25.此外，各组分协同配合：异硫氰酸胍为主要的灭活成分，可以使病毒的蛋白裂解，达到灭活效果，并同时能够抑制核酸酶活性；蛋白酶k具有降解蛋白质的能力，酶切割位点在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以用于所有蛋白质的降解；乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇及聚氧乙烯(20)十六烷基醚为表面活性剂，能够促进病毒包膜的裂解，同时抑制核酸酶活性，这三种活化剂的加入，大大增强了保存液对核酸的保护性作用；乙二胺四乙酸为金属螯合剂，起抑制核酸酶的作用；proclin 150作为常规的抑菌剂，抑制杂菌的生产；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠作为基础溶液的缓冲体系；1m氢氧化钠调整溶液ph值；酚红为显色剂。
26.作为一种优选的实施方式，经试验发现以下配方的保存液，保存时间更长。
27.氯化钠9g/l、异硫氰酸胍20g/l、蛋白酶k 5g/l、乙基苯基聚乙二醇1.5ml/l、辛基苯基-聚乙烯二醇2ml/l、聚氧乙烯(20)十六烷基醚2ml/l、乙二胺四乙酸0.15g/l、proclin 150 0.4ml/l、磷酸氢二钠2.9g/l、磷酸二氢钾0.27g/l、1m氢氧化钠0.25ml/l和酚红0.04g/l。
28.根据本发明一种典型的实施方式，提供一种灭活型病毒保存液的制备方法，采用所述的配方配制而得。
29.本发明的一种灭活型病毒保存液的使用方法为：
30.将待保存的病毒原液加入灭活型病毒保存液中，待保存的病毒原液与灭活型病毒保存液的体积比为1：(6-10)。
31.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本技术的灭活型病毒保存液进行详细说明。
32.实施例1
33.一、病毒保存液的配制
34.按照如下配方配制病毒保存液
[0035][0036]
配制时，首先向1m氢氧化钠中加入酚红，配制酚红母液。然后向纯化水中依次加入氯化钠、异硫氰酸胍、蛋白酶k、乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇、聚氧乙烯(20)十六烷基醚、乙二胺四乙酸、proclin 150、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、酚红母液，混匀。
[0037]
实施例2
[0038]
按照如下配方配制病毒保存液
[0039][0040][0041]
实施例3
[0042]
按照如下配方配制病毒保存液
[0043][0044]
对比例1
[0045]
该对比例不含辛基苯基-聚乙烯二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，具体按如下配方配制：
[0046][0047][0048]
对比例2
[0049]
该对比例不含乙基苯基聚乙二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，具体按如下配方配制：
[0050][0051]
对比例3
[0052]
该对比例不含乙基苯基聚乙二醇和辛基苯基-聚乙烯二醇，其他均同实施例1，具体按如下配方配制：
[0053][0054][0055]
对比例4
[0056]
该对比例不含乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，具体按如下配方配制：
[0057][0058]
实验例1、不同保存液保存效果验证
[0059]
选取甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒使用本发明病毒保存液、某商品化病毒保存液、对比例1病毒保存液、对比例2病毒保存液、对比例3病毒保存、对比例4病毒保存液进行处理，然后分别放置在37℃环境中，24h后进行荧光pcr法检测，以0h作为阳性对照，荧光pcr的ct值(总循环数45)结果如下：
[0060]
表1-甲型流感病毒核酸保存效果验证
[0061][0062]
表2-呼吸道合胞病毒核酸保存效果验证
[0063][0064][0065]
由表1和表2的结果可知：
[0066]
对比例1中，表面活性剂中只含乙基苯基聚乙二醇，不含辛基苯基-聚乙烯二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，甲型流感病毒核酸和呼吸道合胞病毒的保存效果与实施例1相比较差；
[0067]
对比例2中，表面活性剂中只含辛基苯基-聚乙烯二醇，不含乙基苯基聚乙二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，甲型流感病毒核酸和呼吸道合胞病毒的保存
效果与实施例1相比较差；
[0068]
对比例3中，表面活性剂中只含聚氧乙烯(20)十六烷基醚，不含乙基苯基聚乙二醇和辛基苯基-聚乙烯二醇，其他均同实施例1，甲型流感病毒核酸和呼吸道合胞病毒的保存效果与实施例1相比较差；
[0069]
对比例4中，不含乙基苯基聚乙二醇、辛基苯基-聚乙烯二醇和聚氧乙烯(20)十六烷基醚，其他均同实施例1，甲型流感病毒核酸和呼吸道合胞病毒的保存效果与实施例1相比差；
[0070]
与某商品化保存液相比，本发明实施例1的病毒保存液对核酸的保护效果更好。
[0071]
实验例2、病毒灭活效果的验证
[0072]
将制备好的鸡传染性支气管炎病毒ibv株种毒添加至实施例1的病毒保存液中，按1(病毒原液):9(病毒保存液)比例，置室温18-26℃灭活5min；将灭活好的病毒液接种spf鸡胚进行灭活检验，接种后于37℃培养箱中培养168h,每日观察记录鸡胚死亡情况，并于接种后168h剖检观察鸡胚病变情况并收获鸡胚尿囊液。
[0073]
对收获的鸡胚尿囊液进行鸡传染性支气管炎病毒核酸检测，检测方法参照gb/t23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术，使用rna提取试剂盒提取rna,并使荧光pcr法用进行病毒检测。具体见表3。
[0074]
表3-灭活保存液灭活效力试验分组
[0075][0076][0077]
由表3可知，灭活样品接种鸡胚后，每日照胚统计鸡压死亡情况，观察期内实验组、阴性对照组、病毒对照组样品接种鸡胚后无异常，各组鸡胚死亡情况，见表4；
[0078]
表4-灭活保存液灭活效力验证试验结果
[0079][0080]
由表4的数据可知，本发明实施例的细胞保存液(灭活型)可以完全灭活i bv病毒。
[0081]
实验例3、保存液在不同条件下对核酸的保护效果验证
[0082]
选取甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒使用实施例1的病毒保存液进行处理，然后分别放置在4、25、37℃环境中，之后分别在0h、2h、4h、6h、24h时间点进行荧光pcr法检测，并设置甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒存放于生理盐水中作为对照。
[0083]
表5-各组别实验设置
[0084][0085]
表6-呼吸道合胞病毒核酸保存效果验证
[0086][0087][0088]
由表6的试验结果表明，本发明实施例的病毒保存液可以确保病原体在4℃、25℃、37℃环境下稳定保存24小时，不影响后续的核酸检测。
[0089]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0090]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0091]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。