MBL基因单核苷酸多态性在检测风湿性关节炎中的应用

mbl基因单核苷酸多态性在检测风湿性关节炎中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物和遗传学领域，具体涉及mbl基因单核苷酸多态性在检测风湿性关节炎中的应用。


背景技术：

2.甘露糖结合凝集素(mannan-binding lectin，mbl)，又称甘露糖结合蛋白(mannan-bindingprotein,mbp)，是一种肝源性血清c型凝集素，属ca
2
依赖型凝集素家族成员，广泛存在于多种哺乳动物血液循环中，在天然免疫中起重要作用。其主要生理功能有：
①
识别糖配体，mbl能选择性地与多种细菌、病毒、真菌以及某些肿瘤细胞表面的甘露聚糖残基结合，进而启动机体的天然免疫机制，在免疫功能发挥和稳定中起重要作用；
②
启动补体系统活化，mbl是目前发现的唯一能活化补体系统的胶凝素，clr是其主要的效应功能区；
③
促进吞噬、免疫调节作用；
④
抑制、中和病毒作用；
⑤
精卵识别的信号受体之一。
3.mbl基因具有多态性，其主要的多态性位点包括：启动子区的mbl-221位y/x、mbl-550位h/l、mbl-70位s/t、mbl-349位f/g、mbl-427位v/w、mbl-336位j/k和一个六碱基缺失mbl-del6m/n；转录起始区的mbl 4位p/q；外显子ⅰ的mbl52位a/d、mbl54位a/b和mbl57位a/c密码子突变。不同的启动子基因型调控mbl基因转录水平，结合结构基因的突变体，使得不同种族人群间，甚至同一种族不同个体间的mbl血清水平相差很大，严重和反复感染人群mbl基因突变的频率显著高于普通人群，而血清mbl水平低下可导致免疫缺损。
4.类风湿性关节炎(ra)，强直性脊柱炎，属中医痹证范畴，俗有骨痹、历节风之称。是一种以慢性多关节炎症为主要表现的全身性疾病，多以手足小关节起病，常呈对称性，早期症状为受累关节的疼痛、肿胀、活动困难及发僵，长久不愈的晚期症状则为关节畸形。本病在我国人中患病率为0.3％，是造成我国人群丧失劳动力与致残的主要病因之一。本病可见于任何年龄，发病一般随着年龄增长而增加，发病的高峰年龄20-40岁,而女性则在40-60岁，类风湿关节炎以女性多发，女性患者是男性患者的2-3倍。
5.有研究显示ra对mbl合成的影响是有限的。在疾病活动期mbl血清学水平过低，并非代谢消耗，而是ra病人产生mbl的能力下降。不同基因型对ra病人的发病存在影响。mbl缺失可能通过以下机制与ra发病关联，第一：免疫复合物介导的炎性变化可用少解释ra患者的关节病变，虽然mbl对关节中免疫复合物的清除作用仍未证实，但mbl缺失导致免疫复合物清除能力下降，可能是ra患者关节损害的机制之一；第二：ra可能是病原微生物：如链球菌、f13病毒、微小病毒、逆转录酶病毒等的变态免疫应答的结果。其可能原因是mbl缺失导致感染个体暴露于潜在的致病微生物而与ra易感相关；第三：有报道ra与无乳型1gg的显著增加有关，mbl可识别n-乙酞氨基葡萄糖，后者可能是mbl的配体，mbl与病人关节中的免疫球蛋白1gg作用激活补体导致ra病人关节损伤，然而这一机制似乎是不正确的。
6.尚有报道显示了mbl缺失与ra的无相关性，mbl在ra的发病中并无重要作用。因此对于mbl基因单核苷酸多态性分布与ra易感性的相关性有待进一步研究。


技术实现要素：

7.为了解决背景技术中存在的问题，本技术提供mbl基因单核苷酸多态性在检测风湿性关节炎中的应用。
8.本技术提供mbl基因单核苷酸多态性在检测风湿性关节炎中的应用，其特征在于，所述应用包括：
9.用于检测mbl基因自5'末端起的第-70位点、第-336位点、第-349位点、第-427位点、第 4位点和/或del6位点的单核苷酸多态性的物质在制备评价或辅助评价待测人患风湿性关节炎的风险性的试剂盒中的应用。
10.所述待测人为宁夏人群。
11.人mbl基因组位于10号染色体的长臂上(10q11.2-q21)，具有4个编码区(exon1～4)，各为251bp、117bp、69bp和3.1kb长，分别编码n-端富含半胱氨酸区、胶原样区(cld)、颈区和c末端c型糖识别区(crd)。在mbl基因组的5＇-端含有急性期反应蛋白元件，包括一个热休克蛋白元件、三个糖皮质激素应答元件和一个血清淀粉样a蛋白元件。在应激状态下，血清急性期反应蛋白浓度升高，mbl也升高，如手术感染时，血中急性期反应蛋白浓度升高(10～20倍)，mbl水平也相应增高(3倍)。
12.mbl的蛋白质是多个亚单位的聚合体，每一亚单位由3条完全相同的肽链(每条链分子量为28～32kd)构成。各肽链均为4个区域：
①
n-端富含胱氨酸区：含20～21个氨基酸，其中胱氨酸参与亚单位间n-二硫键形成；
②
胶原区：含18～20个gly-xaa-yaa序列，为典型的胶原三螺旋结构，参与免役调理和补体活化过程；
③
颈区：位于胶原区与糖识别区之间，功能尚不清楚，可能与亚单位的稳定有关；
④
糖识别区：含120氨基酸(其中17～18个保守氨基酸和14个可变氨基酸，保守氨基酸是维持蛋白质特殊的疏水核心所必需)，呈一花蕾样结构。花蕾中三花瓣彼此间相距54a，瓣尖平面为一正三角形，此结构为mbl蛋白质发挥生理效应的基础。
13.通常mbl与masp(mbl-associaed serine protease—一种mbl相关丝氨酸蛋白激酶)结合，以复合物形式存在。此时的mbl胶原样区被masp封闭，无法参加免役调理作用。只有当mbl的胶原样区暴露，才能激发免役调理功能。使mbl的胶原样区暴露的机制研究尚不充分，推测与α2-巨球蛋白和masp参与补体活化有关。
14.在一些实施方案中，第-70位点的碱基为c或t，所述第-336位点的碱基为a或g，所述第-349位点的碱基为a或g，所述第-427位点的碱基为a或c，所述第 4位点的的碱基为c或t，所述del6位点为六个碱基缺失的位点或无碱基缺失，六个碱基为aaagag。
15.在一些实施方案中，所述试剂盒包括：扩增用的特异性引物，dntp，用于pcr反应的taq dna聚合酶以及缓冲液；
16.所述试剂盒包括：扩增用的特异性引物，dntp，用于pcr反应的taq dna聚合酶以及缓冲液。
17.所述引物包括：
18.扩增第-70位点的引物：f:5'
–
atgacccatccctggcctctagccg-3'，
19.r:5'
–
agtcttccagcagcaacg-3'；
20.扩增第-336位点的引物：f:5'
–
tctgtgcatgtcctcttcgggtcca-3'，
21.r:5'
–
attctgggctgggttggt-3'；
22.扩增第-349位点的引物：f:5'
–
tgggttggtgactaaggt-3'，
23.r:5'
–
ggtaggcactatgatgagc-3'；
24.扩增第-427位点的引物：f:5'
–
tcaccagctttcagaacagggcctg-3'，
25.r:5'-gagaatgagtggaaaccc-3；
26.扩增第 4位点的引物：f:5'
–
cagattgtaggacagagggcaagct-3'，
27.r:5'aagacgctgccaccatac3'；
28.扩增del6位点的引物：f:5'
–
gcctgccaatgagtaaat-3'，r:5'-gagaatgagtggaaaccc-3'。
29.需要说明的是本技术涉及的用于pcr反应的taq dna聚合酶以及缓冲液，为常规taq dna聚合酶以及缓冲液，具体为lataq dna聚合酶(购自北京博大泰克公司)，缓冲液(购自北京博大泰克公司)为下述提到的5
×
pcr反应液。
附图说明
30.下面对说明书附图所表达的内容做简要说明：
31.图1为宁夏ra患者与健康对照基因型频率的比较图；
32.图2为宁夏ra患者与健康对照等位基因频率的比较图；
33.图3为不同年龄组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间基因型频率的比较图；
34.图4为不同年龄组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间基因型频率的比较图；
35.图5为不同年龄组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间等位基因频率的比较图；
36.图6为不同年龄组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间等位基因频率的比较图；
37.图7为不同性别组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间基因型频率的比较图；
38.图8为不同性别组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间基因型频率的比较图；
39.图9为不同性别组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间等位基因频率的比较图；
40.图10为不同性别组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间等位基因频率的比较图；
41.图11为健康人群与ra患者单倍型分析结果图；
42.图12为健康汉族男性与ra汉族男性单倍型分析结果图；
43.图13为健康汉族女性与ra汉族女性单倍型分析结果图；
44.图14为健康回族男性与ra回族男性单倍型分析结果图；
45.图15为健康回族女性与ra回族女性单倍型分析结果图；
46.图16为健康汉族与ra汉族年龄≥45岁群体单倍型分析结果图；
47.图17为健康汉族与ra汉族年龄＜45岁群体单倍型分析结果图；
48.图18为健康回族与ra回族年龄≥45岁群体单倍型分析结果图；
49.图19为健康回族与ra回族年龄＜45岁群体单倍型分析结果图。
具体实施方式
50.下面将结合本发明实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本技术保护的范围。
51.mbl的基因扩增
52.mbl基因具有多态性，由于不同的启动子区基因型对mbl的基因转录进行调控，从而使不同种族人群间，甚至同一种族不同个体间的mbl血清水平相差很大。启动子区极其复杂，现已证实启动子有7个点突变和1个六碱基缺失，分别为:mbl-550位h/l(g/c)、mbl-221位x/y(g/c)、mbl-427位(a/c)、mbl-349位f/g(a/g)、mbl-336位j/k(a/g)、mbl-70位(c/t)、mbl-329～-324位六碱基缺失m/n(aaagag/)和mbl 4位p/q(g/a)。已证明启动子的单倍型hy、ly和lx可分别代表血清mbl高、中和低水平；外显子多态性位点与启动子区多态位点之间存在连锁不平衡:b、c常与ly连锁，而d则常与hy连锁；已发现的七种单倍型(lypa、lypb、hypa、hypd、lxpa、lyqa、lyqc)与某些疾病如系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)以及病毒感染性疾病如人免疫缺陷病(hiv)、乙型肝炎(hbv)等存在相关性。
53.如表1所示，为针对mbl基因的6个位点设计的引物序列。
54.表-1-mbl基因6个位点的引物序列
[0055][0056]
样本采集
[0057]
宁夏回、汉族健康样本的采集
[0058]
选择宁夏不同地区，无血缘关系的健康个体，年龄在7岁～73岁之间，共378例；其中回族222例(男99例，女123例)，汉族156例(男80例，女76例)。以上研究个体均无血缘关系,追溯3代均为同一民族个体，且在宁夏地区居住三代以上。根据知情同意原则，抽取所选择个体的外周静脉血2ml，加入0.2ml acd抗凝剂，充分混匀。
[0059]
宁夏回、汉族类风湿性关节炎(ra)患者样本的采集
[0060]
选择宁夏不同地区的ra患者280例，年龄在7岁～77岁之间，其中回族80例(男28例，女52例)，汉族200例(男69例，女131例)。以上研究个体均无血缘关系，追溯3代均为同一民族个体，且在宁夏地区居住三代以上。ra的诊断以美国风湿病学会(ara)1987年修订的ra分类标准为依据，根据知情同意原则，常规抽取外周静脉血2ml加入0.2ml acd抗凝剂，充分混匀。
[0061]
dna提取
[0062]
(1)取1.5ml灭菌eppendorf管，加入300μl抗凝血，然后加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，静置2分钟；
[0063]
(2)15000rpm离心40秒，弃去上清液；
[0064]
(3)再加入500μl红细胞裂解液洗涤沉淀；
[0065]
(4)15000rpm离心40秒，弃去上清液；
[0066]
(5)在沉淀中加入100μl红细胞裂解液，反复吹打成细胞悬液；
[0067]
(6)加入300μl白细胞裂解液，吹打混匀，室温过夜；
[0068]
(7)加入100μl蛋白沉淀液，用振荡器振荡以充分混匀，15000rpm离心3分钟；
[0069]
(8)将上清液转移至一新的1.5ml灭菌eppendorf管中；
[0070]
(9)沿管壁小心加入900μl预冷的无水乙醇，冰浴2分钟，然后轻轻颠倒混匀，至白色絮状dna析出；
[0071]
(10)10000rpm离心1分钟，弃去上清液，用500ul 75％的乙醇小心冲洗沉淀块；
[0072]
(11)室温下晾干，加入100μl的dna水化液完全溶解dna，4℃保存备用。
[0073]
pcr扩增
[0074]
pcr反应体系
[0075][0076]
将pcr反应体系中的各组成成分依次加入到灭菌的pcr用八联管中，稍加混匀，放入pcr仪中，进入预先设定的pcr扩增程序，进行目的片断的扩增。
[0077]
pcr反应条件
[0078]
94℃预变性4分钟后进入循环，每个循环为：
[0079]
变性：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
94℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30秒；
[0080]
退火：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
55-65℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30秒；
[0081]
延伸：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
72℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.5分钟；
[0082]
共循环30个周期，最后在72℃延伸10分钟。
[0083]
pcr产物的检测
[0084]
(1)扩增反应结束后，取pcr产物3μl与0.5μl电泳上样缓冲液混匀后，依次上样于2％的琼脂糖凝胶中，以markerⅰ、2000bp dna marker做参照，按5v/cm的电压在1
×
tae缓冲液中电泳30分钟后停止电泳；
[0085]
(2)将琼脂糖凝胶用0.5μg/ml的溴化乙锭染色15-20分钟，然后用蒸馏水漂洗2次；
[0086]
(3)用生物电泳图像分析仪分析凝胶电泳结果，检测pcr扩增情况。
[0087]
限制性内切酶酶切
[0088][0089]
37℃水浴酶切1～2h。酶切产物经8％～12％非变性凝胶电泳分离。
[0090]
聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色
[0091]
8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(rflp-pcr)
[0092]
(1)取垂直电泳用170
×
170mm玻璃平板两块，洗净、垫入0.8mm垫条、常规封边；
[0093]
(2)配制35ml8％非变性聚丙烯酰胺凝胶：
[0094]
双蒸水18.445ml；
[0095]5×
tbe 7ml；
[0096]
丙烯酰胺溶液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
9.31ml；
[0097]
10％过硫酸铵
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
245μl；
[0098]
temed
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
12.25μl；
[0099]
充分混匀后快速灌制凝胶。
[0100]
(3)凝胶在室温下聚合后，将其固定于垂直电泳槽中，在上、下槽中分别加入1
×
tbe电泳缓冲液，并用缓冲液反复冲洗点样孔。
[0101]
(4)取限制性内切酶酶切产物3μl与1μl上样缓冲液,混匀后点样。
[0102]
(5)200v电压稳压电泳1.5～2小时。
[0103]
12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测-336位(rflp-pcr)
[0104]
(1)取垂直电泳用170
×
170mm玻璃平板两块，洗净、垫入0.8mm垫条、常规封边；
[0105]
(2)配制35ml 12％非变性聚丙烯酰胺凝胶：
[0106]
双蒸水14ml；
[0107]5×
tbe 7ml；
[0108]
丙烯酰胺溶液14ml；
[0109]
10％过硫酸铵245μl；
[0110]
temed12.25μl；
[0111]
充分混匀后快速灌制凝胶。
[0112]
(3)凝胶在室温下聚合后，将其固定于垂直电泳槽中，在上、下槽中分别加入1
×
tbe电泳缓冲液，并用缓冲液反复冲洗点样孔。
[0113]
(4)取限制性内切酶酶切产物3μl与1μl上样缓冲液,混匀后点样。
[0114]
(5)250v电压稳压电泳1.5～2小时。
[0115]
6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测-del6位(sscp-pcr)
[0116]
(1)取垂直电泳用170
×
170mm玻璃平板两块，洗净、垫入0.8mm垫条、常规封边；
[0117]
(2)配制35ml 6％变性聚丙烯酰胺凝胶：
[0118]
丙烯酰胺溶液(加尿素)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
35ml；
[0119]
10％过硫酸铵175μl；
[0120]
temed17.5μl；
[0121]
充分混匀后快速灌制凝胶。
[0122]
(3)凝胶在室温下聚合后，将其固定于垂直电泳槽中，在上、下槽中分别加入0.5
×
tbe电泳缓冲液，并用缓冲液反复冲洗点样孔。
[0123]
(4)取限制性内切酶酶切产物15μl与40ul变性上样缓冲液混匀，95℃变性后迅速点样。
[0124]
(5)500v电压稳压电泳1.5～2小时。
[0125]
硝酸银染色
[0126]
(1)取下胶板，小心将凝胶和胶板分离。
[0127]
(2)将凝胶置于200ml固定液中，室温下固定5分钟。
[0128]
(3)加入2ml agno3染色液，室温下染色15-20分钟，再用双蒸水漂洗3次。
[0129]
(4)加入200ml显色液，室温下显色至在凝胶上显示出清晰的dna条带后，用双蒸水漂洗终止显色。
[0130]
(5)用生物电泳图像分析仪记录并分析电泳结果。
[0131]
2％琼脂糖凝胶电泳检测-550位基因型(ssp-pcr)
[0132]
(1)扩增反应结束后，取pcr产物5μl与0.5μl电泳上样缓冲液混匀后，依次上样于2％的琼脂糖凝胶中，以2000bp dna marker做参照，按5v/cm的电压在1
×
tae缓冲液中电泳30分钟后停止电泳；
[0133]
(2)将琼脂糖凝胶用0.5μg/ml的溴化乙锭染色15-20分钟，然后用蒸馏水漂洗2次；
[0134]
(3)用生物电泳图像分析仪分析凝胶电泳结果，检测-550位基因型。
[0135]
基因型的记录和分析
[0136]
mbl5个多态位点经不同限制性内切酶酶切后产生不同大小的片段如表2所示，将酶切产物与dna marker同步进行电泳，确定每个酶切片断大小，并记录其基因型。
[0137]
表-2-经限制性内切酶酶切后各基因型产生的酶切片断大小(bp)
[0138][0139]
统计学计算
[0140]
mbl基因型与等位基因频率采用频率计数法计算，研究对象与hardy-weinberg平衡的符合程度用χ2检验；组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验；均应用国际通用的spss统计软件包进行统计。mbl基因单倍型频率的比较，采用shesis在线单倍型分析软件(http://202.120.7.14/analysis/myanalysis.php)(shi&he,2005)。
[0141]
基因频率和基因型频率的计算
[0142]
(1)基因型频率的计算：将每个待测样本进行电泳后，对照等位片段分型标准物，直接记录每个个体的基因型，然后计算样本中出现的每种基因型的频率，计算公式为：
[0143]
[0144]
(2)基因频率的计算：计算样本中出现的每种等位基因的频率，计算公式为：
[0145][0146]
hardy-weinberg吻合度检测
[0147]
分别计算样本中各基因型频率的观察值和期望值，然后对基因型的分布进行χ2检验。计算公式为：
[0148][0149]
其中χ2检测的自由度为：d＝表现型的类型数－某基因座上的等位基因数目。
[0150]
组间基因型及等位基因频率差异性的χ2检验：
[0151]
利用spss软件进行组间基因型及等位基因频率差异性χ2检验。
[0152]
组间单倍型差异性的χ2检验：
[0153]
采用shesis在线单倍型分析软件进行组间单倍型频率差异性χ2检验和odds rates(or值)和95％可信区间(95％ci)。
[0154]
实验结果
[0155]
mbl-336位1例多态变异发生于ra回族患者；
[0156]
如图1所示，在宁夏ra患者与健康对照基因型频率的比较中，ra患者mbl-427位点基因型频率分布在ra患者和对照组中存在统计学上的显著性差异(p值均小于0.05)；而在-70位点-349位点、 4位点及-del6位点的基因型频率分布在两组间均无统计学差异(p值均大于0.05)。
[0157]
如图2所示，在宁夏ra患者与健康对照等位基因频率的比较中，mbl-70位点、-349位点、-427位点、 4位点、-del6位点的等位基因频率分布在ra患者和健康对照间无统计学差异(p值均大于0.05)。
[0158]
如图3所示，在不同年龄组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间基因型频率的比较中，健康汉族≥45岁组和ra汉族≥45岁组间，mbl-349位、-427位、 4位、的基因型频率分布无统计学差异(p值均大于0.05)。mbl-70位的基因型频率分布差异显著(p＞0.05)，而mbl-del6位基因型频率分布差异极显著(p＜0.01)。
[0159]
在健康汉族＜45岁组和ra汉族＜45岁组间，mbl-70位、-349位、 4位、-del6位的基因型频率分布无统计学差异(p＞0.05)；而mbl-427位基因型频率分布差异显著(χ2＝6.719,p＝0.035)。
[0160]
如图4所示，在不同年龄组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间基因型频率的比较中，健康回族≥45岁组与ra回族≥45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位的基因型频率分布无统计学差异(p＞0.05)；mbl-del6位基因型频率分布差异显著(χ2＝4.328,p＝0.037)。
[0161]
在健康回族＜45岁组和ra回族＜45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的基因型频率分布无统计学差异(p＞0.05)；mbl 4位、-del6位等位基因频率分布差异显著(p＜0.05)。
[0162]
如图5所示，在不同年龄组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间等位基因频率的比较中，健康汉族≥45岁组和ra汉族≥45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、的基因
型频率分布无统计学差异(p＞0.05)；mbl 4位和-del6位等位基因频率分布差异显著(p＜0.05)，在健康汉族＜45岁组和ra汉族＜45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的等位基因频率分布均无统计学差异(p＞0.05)。
[0163]
如图6所示，在不同年龄组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间等位基因频率的比较中，健康回族≥45岁组与ra回族≥45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、的等位基因频率分布无统计学差异(p＞0.05)；mbl-del6位等位基因频率分布差异显著(χ2＝3.865,p＝0.049)。
[0164]
在健康回族＜45岁组和ra回族＜45岁组间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的等位基因频率分布无统计学差异(p＞0.05)。
[0165]
如图7所示，在不同性别组宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间基因频率的比较中，健康汉族男性与ra汉族男性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的基因型频率分布无统计学差异(p＞0.05)。
[0166]
健康汉族女性与ra汉族女性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的基因型频率分布无统计学差异(p＞0.05)。
[0167]
如图8所示，在不同性别组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间基因频率的比较中，健康回族男性与ra回族男性之间，以及健康回族女性与ra回族女性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的基因型频率分布均无统计学差异(p＞0.05)。
[0168]
如图9所示，在不同性别宁夏汉族ra患者与汉族健康对照之间等位基因频率的比较中，健康汉族男性与ra汉族男性之间，mbl-70位、-349位、 4位、-del6位的等位基因频率分布均无统计学差异(p＞0.05)；mbl-427位c等位基因在ra汉族男性中的分布显著高于健康汉族男性对照，等位基因频率分布在两组间差异显著(χ2＝3.892,p＝0.049)。
[0169]
健康汉族女性与ra汉族女性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位的等位基因频率分布均无统计学差异(p＞0.05)。
[0170]
如图10所示，在不同性别组宁夏回族ra患者与回族健康对照之间等位基因频率的比较中，健康回族男性与ra回族男性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位等位基因频率分布无统计学差异(p＞0.05)。健康回族女性与ra回族女性之间，mbl-70位、-349位、-427位、 4位、-del6位等位基因频率分布在两组间无统计学差异(p＞0.05)。
[0171]
如图11所示，对ra患者与健康对照的单倍型分析中共检出五种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在ra患者与健康对照间的分布差异极显著(χ2＝64.498,p＝0.000)。
[0172]
如图12所示，对ra汉族男性与健康汉族男性对照的单倍型分析中共检出六种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、plxtjfvmaba、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康汉族男性和ra汉族男性间的分布差异显著(or[95％ci]：χ2＝11.467,p＝0.043)。
[0173]
如图13所示，对ra汉族女性与健康回族女性对照的单倍型分析中共检出五种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康汉族女性与ra汉族女性间的分布差异显著(χ2＝10.944,p＝0.027)。
[0174]
如图14所示，对ra回族男性与健康回族男性对照的单倍型分析中共检出五种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、physjfvmaaa、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康回族男性与ra回族男性间的分布无统计学差异(χ2＝4.621,p＝0.328)。
[0175]
如图15所示，对ra回族女性与健康回族女性对照的单倍型分析中共检出六种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、phxsjfvmaba、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康回族女性与ra回族女性间的分布差异极显著(χ2＝16.750,p＝0.005)。
[0176]
如图16所示，对ra汉族和健康对照汉族年龄≥45岁组的单倍型分析中共检出六种单倍型：plysjfvmaaa、plytjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康汉族≥45岁组与ra汉族年龄≥45岁组间的分布差异显著(χ2＝11.885,p＝0.036)。
[0177]
如图17所示，对ra汉族和健康对照汉族年龄＜45岁群体的单倍型分析中共检出七种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaba、plxtjfvmaba、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa、qlxtjgwnaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康汉族＜45岁组与ra汉族＜45岁组间的分布无统计学差异(χ2＝9.276,p＝0.159)。
[0178]
如图18所示，对ra回族和健康回族年龄≥45岁群体的单倍型分析中共检出五种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、phxsjfvmaba、phxsjfvmaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高，各单倍型在健康回族≥45岁组与ra回族≥45岁组间的分布差异显著(χ2＝12.702,p＝0.013)。
[0179]
如图19所示，对ra回族和健康回族年龄＜45岁群体的单倍型分析中共检出八种单倍型：plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa、plxtjfvmaaa、phxsjfvmaba、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa、qlxtjgvnaaa，以单倍型phxsjfvmaaa分布频率最高。
[0180]
mbl-427位c等位基因可能是宁夏汉族男性患ra疾病的危险因子。单倍型plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa可能是宁夏人群患ra疾病的危险因子。单倍型plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxsjfvmaaa可能是宁夏汉族男性患ra疾病的危险因子。单倍型plxsjfvmaaa、phxsjfvmaaa、phxtjfvmaaa可能是宁夏汉族女性患ra疾病的危险因子。单倍型plxsjfvmaaa、phxsjfvmaaa可能是宁夏汉族年龄≥45岁人群患ra疾病的危险因子。单倍型plxsjfvmaba、plxsjfvmaba、qlxtjgwnaaa可能是宁夏汉族年龄＜45岁人群患ra疾病的危险因子。单倍型plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、phxsjfvmaba可能是宁夏回族年龄≥45岁群体患ra疾病的危险因子。单倍型plysjfvmaaa、plxsjfvmaba、plxtjfvmaaa、qlxtjgvnaaa可能是宁夏回族年龄＜45岁群体患ra疾病的危险因子。
[0181]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。