糖类的纯化的制作方法

糖类的纯化
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技术领域
3.本发明涉及用于纯化细菌多糖，特别是用于从产生多糖的细菌的细胞裂解物中去除杂质的方法。


背景技术：

4.细菌多糖，特别是荚膜多糖，是在细菌表面发现的重要免疫原，与多种细菌性疾病有关。这导致它们成为疫苗设计的重要组成部分。它们已证明可用于引发免疫反应，尤其是与载体蛋白连接时。
5.细菌多糖通常通过细菌(例如链球菌(streptococci)(例如肺炎链球菌(s.pneumoniae)、化脓性链球菌(s.pyogenes)、无乳链球菌(s.agalactiae)或c和g组链球菌)、葡萄球菌(staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus))、嗜血杆菌(haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae))、奈瑟菌(neisseria)(例如脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis))、埃希氏杆菌(escherichia)(例如大肠杆菌(escherichia coli))和克雷伯菌(klebsiella)(例如肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae))的发酵产生。
6.通常，细菌多糖是使用复合培养基中的分批培养、给料分批培养或连续培养来产生的。
7.需要可以用于大规模生产发酵后细菌多糖的稳定且有效的纯化工艺。
8.还需要一种简化的纯化工艺以降低细菌裂解物中的可溶性蛋白质含量并消除当前纯化工艺的低效率以产生适合掺入疫苗中的基本纯化的细菌糖类。


技术实现要素：

9.本发明提供一种用于从包括源自细菌的糖类和发酵后污染物的溶液中纯化所述糖类的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)酸水解；(b)第一超滤/渗滤-(ufdf-1)；(b)碳过滤；(c)色谱法；和(d)第二超滤/渗滤-(ufdf-2)。在一个实施例中，所述方法进一步包括在步骤(a)的酸水解之后的絮凝步骤。
10.在上述方法的另一个实施例中，所述细菌是革兰氏阳性细菌。在一个方面中，细菌是链球菌属(streptococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、肠球菌属(enterococci)、芽孢杆菌属(bacillus)、棒状杆菌属(corynebacterium)、李斯特菌属(listeria)、丹毒丝菌属(erysipelothrix)或梭菌属(clostridium)中的任一种。在另一方面中，细菌是肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、c组和g组链球菌或金黄色葡萄球菌中的任一种。
11.在上述方法的另一个实施例中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。在一个方面中，细菌是嗜血杆菌属、奈瑟菌属、埃希氏杆菌属或克雷伯菌属中的任一种。在另一方面中，细菌是流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。
附图说明
12.图1描绘了o1v1变异体在培养液中释放后的k
p o-ag(顶部)和纯化的k
p o-ag(底部)的sec-hplc色谱图。
13.图2描绘了o1v2变异体在培养液中释放后的k
p o-ag(顶部)和纯化的k
p o-ag(底部)的sec-hplc色谱图。
14.图3描绘了o2v1变异体在培养液中释放后的k
p o-ag(顶部)和纯化的k
p o-ag(底部)的sec-hplc色谱图。
15.图4描绘了o2v2变异体在培养液中释放后的k
p o-ag(顶部)和纯化的k
p o-ag(底部)的sec-hplc色谱图。
具体实施方式
16.本发明提供一种用于从包括源自细菌的糖类和发酵后污染物的溶液中纯化所述糖类的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)酸水解；(b)第一超滤/渗滤-(ufdf-1)；(b)碳过滤；(c)色谱法；和(d)第二超滤/渗滤-(ufdf-2)。
17.在一个实施例中，所述方法进一步包括在步骤(a)的酸水解之后的絮凝步骤。
18.在上述方法的另一个实施例中，步骤(c)的色谱法包括iex膜色谱法或疏水相互作用色谱(hic)或两者。
19.在上述方法的另一个实施例中，所述细菌是革兰氏阳性细菌。在一个方面中，细菌是链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、李斯特菌属、丹毒丝菌属或梭菌属中的任一种。在另一方面中，细菌是肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、c组和g组链球菌或金黄色葡萄球菌中的任一种。
20.在上述方法的另一个实施例中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。在一个方面中，细菌是嗜血杆菌属、奈瑟菌属、埃希氏杆菌属或克雷伯菌属中的任一种。在另一方面中，细菌是流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。
21.在另一方面，细菌是包括具有选自以下中的任一者的结构的糖类的大肠杆菌：式o1、式o1a、式o1b、式o1c、式o2、式o3、式o4、式o4:k52、式o4:k6、式o5、式o5ab、式o5ac、式o6、式o6:k2；k13；k15、式o6:k54、式o7、式o8、式o9、式o10、式o11、式o12、式o13、式o14、式o15、式o16、式o17、式o18、式o18a、式o18ac、式o18a1、式o18b、式o18b1、式o19、式o20、式o21、式o22、式o23、式o23a、式o24、式o25、式o25a、式o25b、式o26、式o27、式o28、式o29、式o30、式o32、式o33、式o34、式o35、式o36、式o37、式o38、式o39、式o40、式o41、式o42、式o43、式o44、式o45、式o45、式o45rel、式o46、式o48、式o49、式o50、式o51、式o52、式o53、式o54、式o55、式o56、式o57、式o58、式o59、式o60、式o61、式o62、式62d1、式o63、式o64、式o65、式o66、式o68、式o69、式o70、式o71、式o73、式o73、式o74、式o75、式o76、式o77、式o78、式o79、式o80、式o81、式o82、式o83、式o84、式o85、式o86、式o87、式o88、式o89、式o90、式o91、式o92、式o93、式o95、式o96、式o97、式o98、式o99、式o100、式o101、式o102、式o103、式o104、式105、式
o106、式o107、式o108、式o109、式o110、式0111、式o112、式o113、式o114、式o115、式o116、式o117、式o118、式o119、式o120、式o121、式o123、式o124、式o125、式o126、式o127、式o128、式o129、式o130、式o131、式o132、式o133、式o134、式o135、式o136、式o137、式o138、式o139、式o140、式o141、式o142、式o143、式o144、式o145、式o146、式o147、式o148、式o149、式o150、式o151、式o152、式o153、式o154、式o155、式o156、式o157、式o158、式o159、式o160、式o161、式o162、式o163、式o164、式o165、式o166、式o167、式o168、式o169、式o170、式o171、式o172、式o173、式o174、式o175、式o176、式o177、式o178、式o179、式o180、式o181、式o182、式o183、式o184、式o185、式o186或式o187。
22.在另一方面，细菌是包括具有选自以下中的任一者的结构的糖类的肺炎克雷伯菌：式k.o1.1、式k.o1.2、式k.o1.3、式k.o1.4、式k.o2.1、式k.o2.2、式k.o2.3、式k.o2.4、式k.o3、式k.o4、式k.o5、式k.o7、式k.o12或式k.o8。
23.1.细菌多糖的纯化方法
24.1.1起始物质
25.本发明的方法可用于从包括所述多糖和污染物的溶液中纯化细菌多糖。
26.1.1.1.细菌细胞
27.根据本发明待纯化的细菌多糖的来源是细菌细胞，特别是病原菌。
28.根据本发明使用的革兰氏阳性细菌的非限制性实例是链球菌属(例如肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌或c组和g组链球菌)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌)、肠球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、李氏菌属、丹毒丝菌属和梭菌属。本发明使用的革兰氏阴性细菌的非限制性实例包含嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌属)、奈瑟菌属(例如脑膜炎奈瑟菌属)、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)和克雷伯菌属(例如肺炎克雷伯菌)。
29.在一实施例中，根据本发明使用的细菌多糖的来源选自由以下组成的群组：嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)及其它物种；炭疽杆菌(bacillus anthracis)；蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)；产生肉毒杆菌(botulinum)神经毒素的梭菌属物种；流产布鲁氏菌(brucella abortus)；马尔他布鲁氏菌(brucella melitensis)；猪布鲁氏菌(brucella suis)；鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderia mallei)(正式名称鼻疽假单胞菌(pseudomonas mallei))；类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei)(以前称为类鼻疽假单胞菌)；空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)；鹦鹉热衣原体(chlamydia psittaci)；沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、肉毒杆菌(clostridium botulinum)；艰难梭菌(clostridium dificile)；产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)；粗球孢子菌(coccidioides immitis)；波萨达斯球孢子菌(coccidioides posadasii)；反刍兽考德里氏体(cowdria ruminantium)(心水病)；贝氏柯克斯体(coxiella burnetii)；粪肠球菌(enterococcus faecalis)；致泻性大肠杆菌(enterovirulent escherichia coli)族(eec族)，如肠毒性大肠杆菌(etec)、肠病原性大肠杆菌(epec)、o157:h7肠出血性大肠杆菌(ehec)和肠侵袭性大肠杆菌(eiec)；埃利希氏体(ehrlichia)属，如查菲埃利希氏体(ehrlichia chajfeensis)；土拉热弗朗西斯氏菌(francisella tularensis)；嗜肺军团杆菌(legionella pneumophilia)；非洲黄龙病病原菌(liberobacter africanus)；亚洲黄龙病病原菌(liberobacter asiaticus)；产单核细胞李斯特氏菌(listeria monocytogenes)；肠内杂菌(miscellaneous enterics)，如克雷伯菌属、肠杆菌属
(enterobacter)、变形杆菌属(proteus)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、产气杆菌属(aerobacter)、普罗威登斯菌属(providencia)和沙雷氏菌属(serratia)；牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)；结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)；山羊支原体(mycoplasma capricolum)：丝状支原体丝状亚种(mycoplasma mycoides ssp mycoides)；菲律宾霜霉病菌(peronosclerosporaphilippinensis)；大豆锈菌(phakopsora pachyrhizi)；类志贺邻单胞菌(plesiomonas shigelloides)；青枯病病原细菌第3生理小种生物型2(ralstonia solanacearum race 3,biovar 2)；普氏立克次体(rickettsia prowazekii)；立氏立克次氏体(rickettsia rickettsii)；沙门氏菌属物种(salmonella spp.)；玉米褐条霜霉病菌(schlerophthora rayssiae var zeae)；志贺氏杆菌属物种(shigella spp.)；金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)；链球菌(streptococcus)；马铃薯癌肿病菌(synchytrium endobioticum)；非01型霍乱弧菌(vibrio cholerae non-01)；01型霍乱弧菌；副溶血弧菌(vibrio par ahaemo iy ticus)及其它弧菌属；创伤弧菌(vibrio vulnificus)；水稻细菌性条斑病菌(xanthomonas oryzae)；叶缘焦枯病菌(xylella fastidiosa)(柑橘斑驳黄化病菌株(citrus variegated chlorosis strain))；小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森氏菌(yersinia pseudotuberculosis)；和鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)。
30.需要纯化的多糖可以与细胞成分如细胞壁结合。与细胞壁结合意味着多糖是细胞壁本身的组成部分，和/或直接或通过中间分子间接附接在细胞壁上，或者是细胞壁的瞬时外层(例如，某些细菌菌株渗出荚膜多糖，在本领域中也称为
‘
胞外多糖’)。
31.在一些实施例中，从细菌中提取的多糖是荚膜多糖、荚膜下多糖或脂多糖。在一优选实施例中，多糖是荚膜多糖。
32.在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌。在另一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是致泻性大肠杆菌族(eec族)的大肠杆菌部分，如肠毒性大肠杆菌(etec)、肠病原性大肠杆菌(epec)、o157:h7肠出血性大肠杆菌(ehec)或肠侵袭性大肠杆菌(eiec)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是尿道致病性大肠杆菌(upec)。
33.在另一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是选自由血清型o157:h7、o26:h11、o111:h-和o103:h2组成的群组的大肠杆菌血清型。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是选自由血清型o6:k2:h1和o18:k1:h7组成的群组的大肠杆菌血清型。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是选自由血清型o45:k1、o17:k52:h18、o19:h34和o7:k1组成的群组的大肠杆菌血清型。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌血清型o104:h4。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌血清型o1:k12:h7。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌血清型o127:h6。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌血清型o139:h28。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是大肠杆菌血清型o128:h2。
34.在另一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组a(mena)、脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)、脑膜炎奈瑟菌血清组y(meny)、脑膜炎奈瑟菌血清组x(menx)或脑膜炎奈瑟菌血清组c(menc)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组a(mena)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组y(meny)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组
c(menc)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是脑膜炎奈瑟菌血清组x(menx)。
35.在另一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o1(o1)、肺炎克雷伯菌血清组o2(o2)、肺炎克雷伯菌血清组o2ac(o2ac)、肺炎克雷伯菌血清组o3(o3)、肺炎克雷伯菌血清组o4(o4)、肺炎克雷伯菌血清组o5(o5)、肺炎克雷伯菌血清组o7(o7)、肺炎克雷伯菌血清组o8(o8)或肺炎克雷伯菌血清组o9(o9)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o1(o1)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o2(o2)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o2ac(o2ac)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o3(o3)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o4(o4)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o5(o5)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o7(o7)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o8(o8)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o9(o9)。
36.1.1.2.细菌细胞生长
37.通常，多糖是通过在培养基(例如固体或优选液体培养基)中培养细菌来产生的。随后通过处理细菌细胞制备多糖。
38.因此，在一实施例中，本发明方法的起始物质是细菌培养物，且优选液体细菌培养物(例如发酵培养液)。
39.细菌培养物通常通过分批培养、给料分批培养或连续培养获得(参见例如wo 2007/052168或wo 2009/081276)。在连续培养期间，以固定速率将新鲜培养基添加到培养物中，并以保持恒定培养体积的速率去除细胞和培养基。
40.生物体的种群通常从种子小瓶扩大到种子瓶，并通过一或多个体积增加的种子发酵器传代，直到达到生产规模发酵体积。
41.1.1.3预处理细菌细胞以便获得起始物质
42.通常，在细菌生长期间，少量多糖会释放到培养基中，因此起始物质可以是来自离心细菌培养物的上清液。然而，通常，起始物质将通过处理细菌本身来制备，从而释放多糖。
43.任选地，在细胞生长后，对细菌细胞进行失活。当使用病原菌时尤其如此。合适的失活方法是例如用酚:乙醇处理，例如法顿(fattom)等人(1990)感染免疫(infect immun).58(7):2367-74中所描述。在以下实施例中，细菌细胞可以预先失活或不失活。
44.多糖可以通过各种方法从细菌中释放出来，包含化学、物理或酶处理(参见例如wo2010151544、wo 2011/051917或wo2007084856)。
45.在一实施例中，细菌细胞(失活或未失活)在其原始培养基中悬浮处理。因此，所述方法可以从悬浮在其原始培养基中的细胞开始。
46.在另一个实施例中，在释放荚膜多糖之前将细菌细胞离心。因此，所述方法可以从呈湿细胞糊状物形式的细胞开始。或者，将细胞以干燥形式处理。然而，通常，在离心之后，细菌细胞会再悬浮在适合于所述方法下一步的水性培养基中，例如在缓冲液或蒸馏水中。在再悬浮之前，可以用这种培养基洗涤细胞。
47.在一实施例中，细菌细胞(例如呈其原始培养基中的悬浮物形式、呈湿细胞糊状物的形式、呈干燥形式或在离心后再悬浮在水性培养基中)用溶解剂处理。“溶解剂”是有助于
细胞壁分解的任何试剂。在一实施例中，溶解剂是洗涤剂。如本文所使用，术语“洗涤剂”是指能够引起细菌细胞溶解的任何阴离子或阳离子洗涤剂。用于本发明方法的此类洗涤剂的代表性实例包含脱氧胆酸钠(doc)、n-月桂基肌氨酸(nls)、鹅脱氧胆酸钠和皂苷(参见wo 2008/118752第13页第14行至第14页第10行)。在本发明的一个实施例中，用于溶解细菌细胞的溶解剂是doc。
48.在一实施例中，溶解剂是非动物来源的溶解剂。在一个实施例中，非动物来源溶解剂选自由以下组成的群组：癸烷磺酸、叔辛基苯氧基5聚(氧乙烯)乙醇(例如igepal ca-630，cas编号：9002-93-1，购自西格玛阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯(sigma aldrich,st.louis,mo))、辛基苯酚环氧乙烷缩合物(例如triton x-100，购自西格玛阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯)、n-月桂基肌氨酸钠(nls)、月桂基亚氨基二丙酸盐、十二烷基硫酸钠、鹅脱氧胆酸盐、猪脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐和胆酸盐。在一实施例中，非动物来源的溶解剂是nls。
49.在一实施例中，对细菌细胞(例如呈其原始培养基中的悬浮物形式、呈湿细胞糊状物的形式、呈干燥形式或在离心后再悬浮在水性培养基中)进行酶处理，从而释放多糖。在一实施例中，用选自由以下组成的群组的酶处理细菌细胞：溶葡球菌酶、变溶菌素β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶以及变溶菌素和β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶的组合。这些作用于细菌肽聚糖以释放用于本发明的荚膜糖类，但也导致群特异性碳水化合物抗原的释放。在一实施例中，用ii型磷酸二酯酶(pde2)处理细菌细胞。
50.任选地，在多糖释放后，对酶进行失活。合适的失活方法是，例如热处理或酸处理。
51.在一实施例中，将细菌细胞(例如呈其原始培养基中的悬浮物形式、呈湿细胞糊状物的形式、呈干燥形式或在离心后再悬浮在水性培养基中)高压处理以释放多糖。
52.在另一实施例中，将细菌细胞(例如呈其原始培养基中的悬浮物形式、呈湿细胞糊状物的形式、呈干燥形式或在离心后再悬浮在水性培养基中)化学处理以释放多糖。在此类实施例中，化学处理可以是例如使用碱或酸水解(参见例如wo2007084856)。
53.在一实施例中，细菌细胞化学处理是碱萃取(例如使用氢氧化钠)。碱萃取可以裂解荚膜糖和肽聚糖骨架之间的磷酸二酯键。在一实施例中，碱选自由以下组成的群组：naoh、koh、lioh、nahco3、na2co3、kzco3、kcn、et3n、nh3、hzn2h2、nah、naome、naoet和kotbu。在碱处理之后，可以中和反应混合物。这可通过添加酸来实现。在一实施例中，在碱处理之后，通过选自由以下组成的群组的酸中和反应混合物：hcl、h3po4、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。
54.在一实施例中，细菌细胞化学处理是酸处理(例如硫酸)。在一实施例中，酸选自由以下组成的群组：hcl、h3po4、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。在酸处理之后，可以中和反应混合物。这可通过添加碱来实现。在一实施例中，在酸处理之后，通过选自由以下组成的群组的碱中和反应混合物：naoh、koh、lioh、nahco3、na2co3、kzco3、kcn、et3n、nh3、hzn2h2、nah、naome、naoet和kotbu。
55.1.2絮凝
56.本发明的方法包括絮凝步骤。诸位发明人发现所述工艺快速且简单，并产生具有低污染的纯化多糖。
57.因此，在本发明的方法中，通过上述1.1部分的任何方法获得的溶液通过絮凝处
理。
58.在本发明中，术语“絮凝”是指由于添加絮凝剂，胶体以絮凝物或薄片的形式从悬浮液中析出的工艺。
59.絮凝步骤包括将“絮凝剂”添加到包括细菌多糖和污染物的溶液中。在一实施例中，污染物包括细菌细胞碎片、细菌细胞蛋白质和核酸。在一实施例中，污染物包括细菌细胞蛋白质和核酸。
60.正如下文将进一步公开，絮凝步骤还可包含在添加絮凝剂之前或之后调节ph值。特别是可以酸化溶液。
61.此外，絮凝剂的添加和/或ph的调节可以在调节到所需水平的温度下进行。
62.以下步骤可以任何顺序进行：
[0063]-添加絮凝剂，随后调节ph，随后调节温度，或；
[0064]-添加絮凝剂，随后调节温度，随后调节ph，或；
[0065]-调节ph，随后添加絮凝剂，随后调节温度，或；
[0066]-调节ph，随后调节温度，随后添加絮凝剂，或；
[0067]-调节温度，随后添加絮凝剂，随后调节ph，或；
[0068]-调节温度，随后调节ph，随后添加絮凝剂。
[0069]
此外，在添加絮凝剂和/或调节ph后，溶液可以保持一段时间，以便在下游处理之前沉淀絮状物。
[0070]
在本发明中，“絮凝剂”是指能够在包括所关注多糖和污染物的溶液中通过使胶体及其它悬浮颗粒以絮凝物或薄片形式聚集，而所关注多糖留在溶液中，从而允许或促进絮凝的试剂。
[0071]
在本发明的一实施例中，絮凝剂包括多价阳离子。在一实施例中，絮凝剂是多价阳离子。在一优选实施例中，所述多价阳离子选自由铝、铁、钙和镁组成的群组。在一实施例中，絮凝剂是至少两种选自由以下组成的群组的多价阳离子的混合物：铝、铁、钙和镁。在一实施例中，絮凝剂是至少三种选自由铝、铁、钙和镁组成的群组的多价阳离子的混合物。在一实施例中，絮凝剂是由铝、铁、钙和镁组成的四种多价阳离子的混合物。
[0072]
在一实施例中，絮凝剂包括选自由以下组成的群组的试剂：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、聚乙烯亚胺(pei)、铝酸钠和硅酸钠。在一实施例中，絮凝剂选自由以下组成的群组：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。在一实施例中，絮凝剂是聚乙烯亚胺(pei)。在一实施例中，絮凝剂包括明矾。在一实施例中，絮凝剂是明矾。在一实施例中，絮凝剂包括钾明矾。在一实施例中，絮凝剂是钾明矾。在一实施例中，絮凝剂包括钠明矾。在一实施例中，絮凝剂是钠明矾。在一实施例中，絮凝剂包括铵明矾。在一实施例中，絮凝剂是铵明矾。
[0073]
在一实施例中，絮凝剂是选自由以下组成的群组的试剂(例如两种、三种或四种试剂)的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚
dadmac、聚乙烯亚胺(pei)、铝酸钠和硅酸钠。在一实施例中，絮凝剂选自由以下组成的群组：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。
[0074]
在一实施例中，絮凝剂是两种选自由以下组成的群组的试剂的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。在一实施例中，絮凝剂是至少三种选自由以下组成的群组的试剂的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。
[0075]
在一实施例中，絮凝剂包括选自由以下组成的群组的试剂：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树(nirmali nut tree))、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。在一实施例中，絮凝剂选自由以下组成的群组：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树)、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。
[0076]
絮凝剂的浓度可以取决于所用的试剂、所关注的多糖和絮凝步骤的参数(例如温度)。
[0077]
在絮凝剂包括明矾或絮凝剂是明矾的实施例中，可以使用介于约0.1％与20％(w/v)之间的絮凝剂浓度。优选地使用介于约0.5％与10％(w/v)之间的絮凝剂浓度。甚至更优选地使用介于约1％与5％(w/v)之间的絮凝剂浓度。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0078]
在一实施例中，使用约0.1％(w/v)、约0.25％(w/v)、约0.5％(w/v)、约1.0％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2.0％(w/v)、约2.5％(w/v)、约3.0％(w/v)、约3.5％(w/v)、约4.0％(w/v)、约4.5％(w/v)、约5.0％(w/v)、约5.5％(w/v)、约6.0％(w/v)、约6.5％(w/v)、约7.0％(w/v)、约7.5％(w/v)、约8.0％(w/v)、约8.5％(w/v)、约9.0％(w/v)、约9.5％(w/v)或约10％(w/v)的絮凝剂浓度。在一实施例中，使用约10.5％(w/v)、约11.0％(w/v)、约11.5％(w/v)、约12.0％(w/v)、约12.5％(w/v)、约13.0％(w/v)、约13.5％(w/v)、约14.0％(w/v)、约14.5％(w/v)、约15.0％(w/v)、约15.5％(w/v)、约16.0％(w/v)、约16.5％(w/v)、约17.0％(w/v)、约17.5％(w/v)、约18.0％(w/v)、约18.5％(w/v)、约19.0％(w/v)、约19.5％(w/v)或约20.0％(w/v)的絮凝剂浓度。在一实施例中，使用约0.5％(w/v)、约1.0％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2.0％(w/v)、约2.5％(w/v)、约3.0％(w/v)、约3.5％(w/v)、约4.0％(w/v)、约4.5％(w/v)或约5.0％(w/v)的絮凝剂浓度。在一实施例中，使用约1.0％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2.0％(w/v)、约2.5％(w/v)、约3.0％(w/v)、约3.5％(w/v)或约4.0％(w/v)的絮凝剂浓度。
[0079]
在本发明的一些实施例中，在一定时间段内添加絮凝剂。在本发明的一些实施例中，在介于数秒(例如1至10秒)与约一个月之间的时间段内添加絮凝剂。在一些实施例中，在介于约2秒与约两周之间的时间段内添加絮凝剂。在本发明的一些实施例中，在介于约1分钟与约一周之间的时间段内添加絮凝剂。在一些实施例中，在介于约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分
钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时与约两天之间的时间段内添加絮凝剂。
[0080]
因此，在某些实施例中，在介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间的时间段内添加絮凝剂。
[0081]
优选地，在介于约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间的时间段内添加絮凝剂。
[0082]
在某些实施例中，在介于约15分钟与约3小时之间的时间段内添加絮凝剂。在某些实施例中，在介于约30分钟与约120分钟之间的时间段内添加絮凝剂。
[0083]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0084]
在一实施例中，可以在约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天的时间段内添加絮凝剂。
[0085]
在一实施例中，在不搅拌的情况下添加絮凝剂。在另一实施例中，在搅拌的情况下添加絮凝剂。在另一实施例中，在温和搅拌下添加絮凝剂。在另一实施例中，在剧烈搅拌下添加絮凝剂。
[0086]
诸位发明人进一步出乎意料地注意到，当在酸性ph下进行时，絮凝得到改善。
[0087]
因此，在本发明的一实施例中，絮凝步骤在小于7.0、6.0、5.0或4.0的ph下进行。在本发明的一特定实施例中，絮凝步骤在介于7.0与1.0之间的ph下进行。在一实施例中，絮凝步骤在介于5.5与2.5、5.0与2.5、4.5与2.5、4.0与2.5、5.5与3.0、5.0与3.0、4.5与3.0、4.0与3.0、5.5与3.5、5.0与3.5、4.5与3.5或4.0与3.5之间的ph下进行。在一实施例中，絮凝步骤在约5.5、约5.0、约4.5、约4.0、约3.5、约3.0、约2.5、约2.0、约1.5或约1.0的ph下进行。在一实施例中，絮凝步骤在约4.0、约3.5、约3.0或约2.5的ph下进行。在一实施例中，絮凝步骤
在约3.5的ph下进行。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0088]
在一实施例中，所述酸性ph是通过用酸酸化通过以上1.1部分的任何方法获得的或如1.2部分公开的进一步澄清的溶液来获得的。在一实施例中，所述酸选自由以下组成的群组：hcl、h3po4、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。在一实施例中，所述酸是氨基酸。在一实施例中，所述酸是选自由以下组成的群组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸。在一实施例中，所述酸是hcl(氢氯酸)。在一实施例中，所述酸是硫酸。
[0089]
在一实施例中，在不搅拌的情况下添加酸。优选地，在搅拌下添加酸。在一实施例中，在温和搅拌下添加酸。在一实施例中，在剧烈搅拌下添加酸。
[0090]
在本发明的一些实施例中，在添加絮凝剂(和任选的酸化)后，使溶液保持一段时间，以便在下游处理之前沉淀絮状物。
[0091]
在本发明的一些实施例中，絮凝步骤以介于几秒(例如2至10秒)至约1分钟之间的沉淀时间进行。优选地，沉淀时间是至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155或至少约160分钟。优选地沉淀时间小于一周，然而沉淀时间可以更长。
[0092]
因此在某些实施例中，沉淀时间介于约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380、约1440分钟、约两天、约三天、约四天、约五天或约六天与1周之间。
[0093]
在本发明的一些实施例中，沉淀时间介于几秒(例如1至10秒)与约一个月之间。在一些实施例中，沉淀时间介于约2秒与约两周之间。在本发明的一些实施例中，沉淀时间介于约1分钟与约一周之间。在一些实施例中，沉淀时间介于约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时与约两天之间。
[0094]
因此，在某些实施例中，沉淀时间介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间。
[0095]
优选地，沉淀时间介于约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分
钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间。
[0096]
在某些实施例中，沉淀时间介于约15分钟与约3小时之间。在某些实施例中，沉淀时间介于约30分钟与约120分钟之间。
[0097]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0098]
在某些实施例中，沉淀时间是约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。
[0099]
优选地，沉淀时间介于约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380或约1440分钟与两天之间。在某些实施例中，沉淀时间介于约5分钟与约一天之间。在某些实施例中，沉淀时间介于约5分钟与约120分钟之间。
[0100]
沉淀时间可以是约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟。
[0101]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0102]
在一实施例中，任选的沉淀步骤在不搅拌的情况下进行。在一实施例中，任选的沉淀步骤在搅拌下进行。在另一实施例中，任选的沉淀步骤在温和搅拌下进行。在另一实施例中，任选的沉淀步骤在剧烈搅拌下进行。
[0103]
在本发明的一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。在一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。在一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在约20℃的温度下进行。诸位发明人出乎意料地注意到，当在高温下进行时，絮凝可以得到进一步改善。因此，在本发明的一特定实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。在一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的
温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。在一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，添加絮凝剂、沉淀溶液和/或调节ph在约50℃的温度下进行。
[0104]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0105]
在一实施例中，在任何上述温度下进行絮凝剂的添加。
[0106]
在一实施例中，在任何上述温度下进行添加絮凝剂后的溶液的沉淀。
[0107]
在一实施例中，在任何上述温度下进行ph的调节。
[0108]
在一实施例中，在任何上述温度下进行絮凝剂的添加和添加絮凝剂后的溶液的沉淀。
[0109]
在一实施例中，在任何上述温度下进行絮凝剂的添加和ph的调节。
[0110]
在一实施例中，在任何上述温度下进行絮凝剂的添加、添加絮凝剂后的溶液的沉淀和ph的调节。
[0111]
在一实施例中，絮凝步骤包括添加絮凝剂(如上文所公开)而不进行ph调节。
[0112]
在一实施例中，絮凝步骤包括添加絮凝剂和沉淀溶液(如上文所公开)而不进行ph调节。
[0113]
在一实施例中，絮凝步骤包括添加絮凝剂、调节ph和沉淀溶液(如上文所公开)。在一实施例中，在调节ph之前添加絮凝剂。在另一实施例中，在添加絮凝剂之前调节ph。
[0114]
在一实施例中，絮凝步骤包括添加絮凝剂、沉淀溶液和调节ph(如上文所公开)。在一实施例中，添加絮凝剂和沉淀溶液在调节ph之前进行。在另一实施例中，在添加絮凝剂和沉淀溶液之前调节ph。在一实施例中，添加絮凝剂和调节ph在沉淀溶液之前进行。在另一实施例中，在添加絮凝剂和沉淀溶液之前调节ph。
[0115]
在一实施例中，絮凝步骤包括添加絮凝剂、调节ph和调节温度(如上文所公开)。
[0116]
这些步骤可以任何顺序进行：
[0117]-添加絮凝剂，随后调节ph，随后调节温度，或；
[0118]-添加絮凝剂，随后调节温度，随后调节ph，或；
[0119]-调节ph，随后添加絮凝剂，随后调节温度，或；
[0120]-调节ph，随后调节温度，随后添加絮凝剂，或；
[0121]-调节温度，随后添加絮凝剂，随后调节ph，或；
[0122]-调节温度，随后调节ph，随后添加絮凝剂。
[0123]
此外，在添加絮凝剂和/或调节ph后，溶液可以保持一段时间，以便在下游处理之前沉淀絮状物。
[0124]
1.3.固/液分离
[0125]
可以通过任何合适的固/液分离方法将絮凝材料与所关注多糖分离。
[0126]
因此，在本发明的一实施例中，在絮凝之后，通过倾析、沉降、过滤或离心来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。在一实施例中，随后收集含多糖的溶液用于储存和/或额
外处理。
[0127]
本发明的一实施例中，在絮凝之后，通过倾析来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。倾析器用于分离液体，其中液体之间的密度差异足以使絮凝物沉淀。在运行中的倾析器中，将有三个不同的区域：澄清的重液、分离的分散液(分散区)和澄清的轻液。为了产生干净的溶液，通常必须将少量溶液留在容器中。倾析器可以被设计用于连续操作。
[0128]
本发明的一实施例中，在絮凝之后，通过沉降(沉淀)来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。沉降是通过重力沉淀将悬浮固体颗粒从液体混合物中分离成澄清液和较高固体含量的浆液。沉降可以在增稠器、澄清器或分级器中进行。由于在用来处理大量液体时增稠和澄清是相对便宜的工艺，因此它们可以用于对进料进行预浓缩以进行过滤。
[0129]
本发明的一实施例中，在絮凝之后，通过离心来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。在一实施例中，所述离心是持续离心。在一实施例中，所述离心是桶式离心。在一实施例中，随后收集含多糖的上清液用于储存和/或额外处理。
[0130]
在一些实施例中，悬浮液在约1,000g约2,000g、约3,000g、约4,000g、约5,000g、约6,000g、约8,000g、约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g、约25,000g、约30,000g、约35,000g、约40,000g、约50,000g、约60,000g、约70,000g、约80,000g、约90,000g、约100,000g、约120,000g、约140,000g、约160,000g或约180,000g下离心。在一些实施例中，悬浮液在约8,000g、约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g或约25,000g下离心。
[0131]
在一些实施例中，悬浮液在介于约5,000g与约25,000g之间下离心。在一些实施例中，悬浮液在介于约8,000g与约20,000g之间下离心。在一些实施例中，悬浮液在介于约10,000g与约15,000g之间下离心。在一些实施例中，悬浮液在介于约10,000g与约12,000g之间下离心。
[0132]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0133]
在一些实施例中，悬浮液在至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155或至少160分钟期间离心。优选地离心时间小于24小时。
[0134]
因此在某些实施例中，悬浮液在介于约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320或约1380分钟与1440分钟之间期间离心。
[0135]
优选地，悬浮液在介于约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约240、约300、约360、约420、约480或约540分钟与约600分钟之间期间离心。在某些实施例中，悬浮液在介于约5分钟与约3小时之间期间离心。在某些情况下，悬浮液在介于约5分钟与约120分钟之间期间离心。
[0136]
悬浮液可以在介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75
分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟或约155分钟与约160分钟之间期间离心。
[0137]
悬浮液可以在介于约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟或约55分钟与约60分钟之间期间离心。
[0138]
悬浮液可以在约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380分钟或约1440分钟期间离心。
[0139]
悬浮液可以在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟期间离心。
[0140]
悬浮液可以在介于约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟之间期间离心。
[0141]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0142]
在本发明的一实施例中，离心是持续离心。在所述实施例中，加料速率可以介于50-5000ml/min、100-4000ml/min、150-3000ml/min、200-2500ml/min、250-2000ml/min、300-1500ml/min、300-1000ml/min、200-1000ml/min、200-1500ml/min、400-1500ml/min、500-1500ml/min、500-1000ml/min、500-2000ml/min、500-2500ml/min或1000-2500ml/min之间。
[0143]
在一实施例中，加料速率可以是约10、约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1650约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3250、约3500、约3750约4000、约4250、约4500或约5000ml/min。
[0144]
本发明的一实施例中，在絮凝之后，通过过滤来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。在过滤中，通过使混合物通过多孔介质去除液体中的悬浮固体颗粒，所述多孔介质保留颗粒并通过澄清滤液。通过重力在筛网上或通过真空、压力或离心在过滤器上进行过滤。固体可以保留在过滤介质的表面，即滤饼过滤，或固体可以捕获在过滤介质内，即深层过滤。本一实施例中，在絮凝之后，通过微过滤来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。在一实施例中，微过滤是切向微过滤。在另一实施例中，微过滤是死端过滤(垂直过滤)。在一实施例中，微过滤是死端过滤，其中硅藻土(de)，也称为de硅藻土，用作助滤剂以促进和提高固/液分离的效率。因此在一实施例中，在絮凝之后，通过包括硅藻土(de)的死端微过滤来澄清悬浮液(如在上文1.2部分所获得)。de可以作为深度过滤器的组成部分浸渍(或结合)到死端过滤器中。
[0145]
在另一种形式中，de可以粉末形式添加到絮凝溶液中(如在1.2部分后所获得)。在
后一种情况下，de处理的絮凝溶液可以通过深度过滤进一步澄清。
[0146]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米之间的标称保留范围。
[0147]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[0148]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0149]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米的标称保留等级。
[0150]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.45微米的标称保留等级。
[0151]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-5000l/m2、200-5000l/m2、300-5000l/m2、400-5000l/m2、500-5000l/m2、750-5000l/m2、1000-5000l/m2、1500-5000l/m2、2000-5000l/m2、3000-5000l/m2或4000-5000l/m2之间的过滤能力。
[0152]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-2500l/m2、200-2500l/m2、300-2500l/m2、400-2500l/m2、500-2500l/m2、750-2500l/m2、1000-2500l/m2、1500-2500l/m2或2000-2500l/m2之间的过滤能力。
[0153]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1500l/m2、200-1500l/m2、300-1500l/m2、400-1500l/m2、500-1500l/m2、750-1500l/m2或1000-1500l/m2之间的过滤能力。
[0154]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1250l/m2、200-1250l/m2、300-1250l/m2、400-1250l/m2、500-1250l/m2、750-1250l/m2或1000-1250l/m2之间的过滤能力。
[0155]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1000l/m2、200-1000l/m2、300-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2之间的过滤能力。
[0156]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-750l/m2、200-750l/m2、300-750l/m2、400-750l/m2或500-750l/m2之间的过滤能力。
[0157]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-600l/m2、200-600l/m2、300-600l/m2、400-600l/m2或400-600l/m2之间的过滤能力。
[0158]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-500l/m2、200-500l/m2、300-500l/m2或400-500l/m2之间的过滤能力。
[0159]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0160]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约
1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800、约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500l/m2的过滤能力。
[0161]
上述固/液分离方法可以单独形式使用，或以两种任意顺序组合使用，或以三种任意顺序组合使用。
[0162]
1.4过滤(例如深度过滤)
[0163]
一旦溶液已通过上文1.2部分的絮凝步骤和/或通过上文1.3部分的固/液分离步骤处理，可以任选地进一步澄清含多糖的溶液(例如上清液)。
[0164]
在一实施例中，过滤溶液，从而产生进一步澄清的溶液。在一实施例中，过滤直接应用于通过以上1.2部分的任何方法获得的溶液。在一实施例中，过滤应用于通过如上文1.3部分所述的固/液分离步骤进一步澄清的溶液。
[0165]
在一实施例中，通过选自由以下组成的群组的过滤步骤处理溶液：深度过滤、活性碳过滤、尺寸过滤、渗滤和超滤。在一实施例中，通过渗滤步骤处理溶液，特别是通过切向流动过滤。在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液。
[0166]
深度过滤器使用多孔过滤介质将颗粒保留在整个介质中，而不仅仅是在介质表面。由于过滤介质的曲折和通道状性质，颗粒被保留在其结构内的整个介质中，而不是在表面上。
[0167]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器设计选自由以下组成的群组：盒、筒、深床(例如砂滤器)和透镜状过滤器。
[0168]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有介于约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米之间的标称保留范围。
[0169]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有介于约0.01-75微米、约0.05-75微米、约0.1-75微米、约0.2-75微米、约0.3-75微米、约0.4-75微米、约0.5-75微米、约0.6-75微米、约0.7-75微米、约0.8-75微米、约0.9-75微米、约1-75微米、约1.25-75微米、约1.5-75微米、约1.75-75微米、约2-75微米、约3-75微米、约4-75微米、约5-75微米、约6-75微米、约7-75微米、约8-75微米、约9-75微米、约10-75微米、约15-75微米、约20-75微米、约25-75微米、约30-75微米、约40-75微米或约50-75微米之间的标称保留范围。
[0170]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有介于约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米之间的标称保留范围。
[0171]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有介于约0.01-25
750l/m2、10-750l/m2、25-750l/m2、50-750l/m2、75-750l/m2、100-750l/m2、150-750l/m2、200-750l/m2、300-750l/m2、400-750l/m2或500-750l/m2的过滤能力。
[0182]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-500l/m2、5-500l/m2、10-500l/m2、25-500l/m2、50-500l/m2、75-500l/m2、100-500l/m2、150-500l/m2、200-500l/m2、300-500l/m2或400-500l/m2的过滤能力。
[0183]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-400l/m2、5-400l/m2、10-400l/m2、25-400l/m2、50-400l/m2、75-400l/m2、100-400l/m2、150-400l/m2、200-400l/m2或300-400l/m2的过滤能力。
[0184]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-300l/m2、5-300l/m2、10-300l/m2、25-300l/m2、50-300l/m2、75-300l/m2、100-300l/m2、150-300l/m2或200-300l/m2的过滤能力。
[0185]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-200l/m2、5-200l/m2、10-200l/m2、25-200l/m2、50-200l/m2、75-200l/m2、100-200l/m2或150-200l/m2的过滤能力。
[0186]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-100l/m2、5-100l/m2、10-100l/m2、25-100l/m2、50-100l/m2或75-100l/m2的过滤能力。
[0187]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中深度过滤器具有1-50l/m2、5-50l/m2、10-50l/m2或25-50l/m2的过滤能力。
[0188]
涵盖任何上述范围内的任何整数作为本公开的实施例。
[0189]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中加料速率介于1-1000lmh(升/m2/小时)、10-1000lmh、25-1000lmh、50-1000lmh、100-1000lmh、125-1000lmh、150-1000lmh、200-1000lmh、250-1000lmh、300-1000lmh、400-1000lmh、500-1000lmh、600-1000lmh、700-1000lmh、800-1000lmh或900-1000lmh之间。
[0190]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中加料速率介于1-500lmh、10-500lmh、25-500lmh、50-500lmh、100-500lmh、125-500lmh、150-500lmh、200-500lmh、250-500lmh、300-500lmh或400-500lmh之间。
[0191]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中加料速率介于1-400lmh、10-400lmh、25-400lmh、50-400lmh、100-400lmh、125-400lmh、150-400lmh、200-400lmh、250-400lmh或300-400lmh之间。
[0192]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中加料速率介于1-250lmh、10-250lmh、25-250lmh、50-250lmh、100-250lmh、125-250lmh、150-250lmh或200-250lmh之间。
[0193]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0194]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中加料速率是约1、约2、约5、约10、约25、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000lmh。
[0195]
1.5任选的进一步过滤
[0196]
一旦溶液已通过上文1.4部分的过滤步骤处理，所获得的溶液(即滤液)可以任选地进一步澄清。
[0197]
在一实施例中，对溶液进行微过滤。在一实施例中，微过滤是死端过滤(垂直过滤)。在一实施例中，微过滤是切向微过滤。
[0198]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米之间的标称保留范围。
[0199]
在一实施例中，通过深度过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[0200]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0201]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米的标称保留等级。
[0202]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.45微米的标称保留等级。
[0203]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-5000l/m2、200-5000l/m2、300-5000l/m2、400-5000l/m2、500-5000l/m2、750-5000l/m2、1000-5000l/m2、1500-5000l/m2、2000-5000l/m2、3000-5000l/m2或4000-5000l/m2之间的过滤能力。
[0204]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-2500l/m2、200-2500l/m2、300-2500l/m2、400-2500l/m2、500-2500l/m2、750-2500l/m2、1000-2500l/m2、1500-2500l/m2或2000-2500l/m2之间的过滤能力。
[0205]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1500l/m2、200-1500l/m2、300-1500l/m2、400-1500l/m2、500-1500l/m2、750-1500l/m2或1000-1500l/m2之间的过滤能力。
[0206]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1250l/m2、200-1250l/m2、300-1250l/m2、400-1250l/m2、500-1250l/m2、750-1250l/m2或1000-1250l/m2之间的过滤能力。
[0207]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-1000l/m2、200-1000l/m2、300-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2之间的过滤能力。
[0208]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-750l/m2、200-750l/m2、300-750l/m2、400-750l/m2或500-750l/m2之间的过滤能力。
[0209]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-600l/m2、200-600l/m2、300-600l/m2、400-600l/m2或400-600l/m2之间的过滤能力。
[0210]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于100-500l/m2、200-500l/m2、300-500l/m2或400-500l/m2之间的过滤能力。
[0211]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0212]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800、约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500l/m2的过滤能力。
[0213]
1.6超滤和/或渗滤
[0214]
一旦溶液已通过上文1.4部分的任何方法和/或通过上文1.5部分的过滤步骤过滤，所得溶液(即滤液)可以任选地通过超滤和/或渗滤进一步澄清。
[0215]
超滤(uf)是一种浓缩稀释产物流的工艺。uf基于膜孔径或截留分子量(mwco)分离溶液中的分子。
[0216]
在本发明的一实施例中，通过超滤处理溶液(例如在上文1.5或1.6部分获得的滤液)。
[0217]
在一实施例中，通过超滤处理溶液，且膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-750kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-500kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-300kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-100kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-50kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-30kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda、约10kda-1000kda、约20kda-1000kda、约30kda-1000kda、约40kda-1000kda、约50kda-1000kda、约75kda-1000kda、约100kda-1000kda、约150kda-1000kda、约200kda-1000kda、约300kda-1000kda、约400kda-1000kda、约500kda-1000kda或约750kda-1000kda之间的范围内。
[0218]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约5kda-500kda、约10kda-500kda、约20kda-500kda、约30kda-500kda、约40kda-500kda、约50kda-500kda、约75kda-500kda、约100kda-500kda、约150kda-500kda、约200kda-500kda、约300kda-500kda或约400kda-500kda之间的范围内。
[0219]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约约5kda-300kda、约10kda-300kda、约20kda-300kda、约30kda-300kda、约40kda-300kda、约50kda-300kda、约75kda-300kda、约100kda-300kda、约150kda-300kda或约200kda-300kda之间的范围内。
[0220]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约约5kda-100kda、约10kda-100kda、约20kda-100kda、约30kda-100kda、约40kda-100kda、约50kda-100kda或约75kda-100kda之间的范围内。
[0221]
在一实施例中，膜的截留分子量是约5kda、约10kda、约20kda、约30kda、约40kda、约50kda、约60kda、约70kda、约80kda、约90kda、约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约400kda、约500kda、约750kda或约1000kda。
[0222]
在一实施例中，超滤步骤的浓缩系数是约1.5至10。在一实施例中，浓缩系数是约2至8。在一实施例中，浓缩系数是约2至5。
[0223]
在一实施例中，浓缩系数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一实施例中，浓缩系数是约2、约3、约4、约5或约6。
[0224]
本发明的一实施例中，通过渗滤处理溶液(例如在上文1.4或1.5部分获得的滤液)。
[0225]
在本发明的一实施例中，如上文本部分中所公开的超滤(uf)之后获得的溶液进一步通过渗滤处理(uf/df处理)。
[0226]
渗滤(df)用于将产物交换到所需的缓冲溶液(或仅水)中。在一实施例中，渗滤用于在恒定体积下改变保留溶液的化学性质。不需要的颗粒穿过膜，同时通过添加替代溶液(缓冲溶液、盐水溶液、缓冲盐水溶液或水)将进料流的组成变为更理想的状态。
[0227]
在一实施例中，替代溶液是水。
[0228]
在一实施例中，替代溶液是生理盐水。在一些实施例中，盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施例中，盐是氯化钠。在一个实施例中，替代溶液是约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约110mm、约120mm、约130mm、约140mm、约150mm、约160mm、约170mm、约180mm、约190mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm或约500mm的氯化钠。在一个特定实施例中，替代溶液是约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约110mm、约120mm、约130mm、约140mm、约150mm、约160mm、约170mm、约180mm、约190mm、约200mm、约250mm或约300mm的氯化钠。
[0229]
在一实施例中，替代溶液是缓冲溶液。在一实施例中，替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自由以下组成的群组：n-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(aces)、乙酸的盐(醋酸盐)、n-(2-乙酰氨基)-亚胺二乙酸(ada)、2-氨基乙磺酸(aes，牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇ampd，氨甲基丙二醇(ammediol)、n-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(ampso)、n,n-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、n,n'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双-(2-羟基乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(bis-tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(bis-tris-丙烷)、硼酸、二甲基胂酸(二甲胂酸盐)、3-(环己基氨基)-丙磺酸(caps)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(capso)、碳酸钠(碳酸盐)、环己基氨基乙磺酸(ches)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[n-双(羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(dipso)、甲酸的盐(甲酸盐)、甘氨酸、双甘氨肽、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-乙磺酸(hepes)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-3-丙磺酸(hepps，epps)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-2-羟基丙磺酸(heppso)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、2-(n-吗啉基)-乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉基)-丙磺酸(mops)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙磺酸)(popso)、吡啶、丁二酸的盐(丁二酸盐)、3-{[三(羟基甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(taps)、3-[n-三(羟基甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)、三乙醇胺(tea)、2-[三(羟基甲基)-甲氨基]-乙磺酸(tes)、n-[三(羟基甲基)-甲基]-甘氨酸(麦黄酮)和三(羟基甲基)-氨基甲烷(tris)。
[0230]
在一实施例中，渗滤缓冲液选自由以下组成的群组：乙酸的盐(醋酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和丁二酸的盐(丁二酸盐)。在一实施例中，渗滤缓冲液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。在一实施例中，渗滤缓冲液是丁二酸的盐(丁二酸盐)。在一实施例中，所述盐是钠盐。在一实施例中，所述盐是钾盐。
[0231]
在一实施例中，渗滤缓冲液的ph介于约4.0-11.0之间、介于约5.0-10.0之间、介于约5.5-9.0之间、介于约6.0-8.0之间、介于约6.0-7.0之间、介于约6.5-7.5之间、介于约6.5-7.0之间或介于约6.0-7.5之间。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0232]
在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约6.5、约7.0或约7.5。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约7.0。
[0233]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-100mm之间、介于约0.1mm-100mm之间、介于约0.5mm-100mm之间、介于约1mm-100mm之间、介于约2mm-100mm之间、介于约3mm-100mm之间、介于约4mm-100mm之间、介于约5mm-100mm之间、介于约6mm-100mm之间、介于约7mm-100mm之间、介于约8mm-100mm之间、介于约9mm-100mm之间、介于约10mm-100mm之间、介于约11mm-100mm之间、介于约12mm-100mm之间、介于约13mm-100mm之间、介于约14mm-100mm之间、介于约15mm-100mm之间、介于约16mm-100mm之间、介于约17mm-100mm之间、介于约18mm-100mm之间、介于约19mm-100mm之间、介于约20mm-100mm之间、介于约25mm-100mm之间、介于约30mm-100mm之间、介于约35mm-100mm之间、介于约40mm-100mm之间、介于约45mm-100mm之间、介于约50mm-100mm之间、介于约55mm-100mm之间、介于约60mm-100mm之间、介于约65mm-100mm之间、介于约70mm-100mm之间、介于约75mm-100mm之间、介于约80mm-100mm之间、介于约85mm-100mm之间、介于约90mm-100mm之间或介于约95mm-100mm之间。
[0234]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-50mm之间、介于约0.1mm-50mm之间、介于约0.5mm-50mm之间、介于约1mm-50mm之间、介于约2mm-50mm之间、介于约3mm-50mm之间、介于约4mm-50mm之间、介于约5mm-50mm之间、介于约6mm-50mm之间、介于约7mm-50mm之间、介于约8mm-50mm之间、介于约9mm-50mm之间、介于约10mm-50mm之间、介于约11mm-50mm之间、介于约12mm-50mm之间、介于约13mm-50mm之间、介于约14mm-50mm之间、介于约15mm-50mm之间、介于约16mm-50mm之间、介于约17mm-50mm之间、介于约18mm-50mm之间、介于约19mm-50mm之间、介于约20mm-50mm之间、介于约25mm-50mm之间、介于约30mm-50mm之间、介于约35mm-50mm之间、介于约40mm-50mm之间或介于约45mm-50mm之间。
[0235]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-25mm之间、介于约0.1mm-25mm之间、介于约0.5mm-25mm之间、介于约1mm-25mm之间、介于约2mm-25mm之间、介于约3mm-25mm之间、介于约4mm-25mm之间、介于约5mm-25mm之间、介于约6mm-25mm之间、介于约7mm-25mm之间、介于约8mm-25mm之间、介于约9mm-25mm之间、介于约10mm-25mm之间、介于约11mm-25mm之间、介于约12mm-25mm之间、介于约13mm-25mm之间、介于约14mm-25mm之间、介于约15mm-25mm之间、介于约16mm-25mm之间、介于约17mm-25mm之间、介于约18mm-25mm之间、介于约19mm-25mm之间或介于约20mm-25mm之间。
[0236]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-15mm之间、介于约0.1mm-15mm之间、介于约0.5mm-15mm之间、介于约1mm-15mm之间、介于约2mm-15mm之间、介于约3mm-15mm之间、介于约4mm-15mm之间、介于约5mm-15mm之间、介于约6mm-15mm之间、介于约7mm-15mm之间、介于约8mm-15mm之间、介于约9mm-15mm之间、介于约10mm-15mm之间、介于约11mm-15mm之间、介于约12mm-15mm之间、介于约13mm-15mm之间或介于约14mm-15mm之间。
[0237]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-10mm之间、介于约0.1mm-10mm之间、介于约0.5mm-10mm之间、介于约1mm-10mm之间、介于约2mm-10mm之间、介于约3mm-10mm之间、介于约4mm-10mm之间、介于约5mm-10mm之间、介于约6mm-10mm之间、介于约7mm-10mm之间、介于约8mm-10mm之间或介于约9mm-10mm之间。
[0238]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0239]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[0240]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约0.1mm、约0.2mm、约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约30mm、约40mm或约50mm。
[0241]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约10mm。
[0242]
在一实施例中，替代溶液包括螯合剂。在一实施例中，替代溶液包括明矾螯合剂。在一些实施例中，螯合剂选自由以下组成的群组：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、乙二胺-n,n'-二丙酸二氢氯化物(eddp)、乙二胺-四(亚甲基磺酸)(edtpo)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ntpo)、亚氨基-二乙酸(ida)、羟亚氨基-二乙酸(hida)、氮基-三乙酸(ntp)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、二巯基丁二酸(dmsa)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(dmps)、α类脂酸(ala)、氮基三乙酸(nta)、硫胺四氢呋喃甲基二硫化物(ttfd)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(dfoa)、地拉罗司(deferasirox)、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[0243]
在一些实施例中，螯合剂选自由以下组成的群组：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[0244]
在一些实施例中，螯合剂是乙二胺四乙酸(edta)。
[0245]
在一些实施例中，螯合剂是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。在一些实施例中，螯合剂是柠檬酸钠。
[0246]
通常，以1至500mm的浓度使用螯合剂。在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是2至400mm。在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是10至400mm。在一实施例中，替代溶液
中螯合剂的浓度是10至200mm。在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是10至100mm。在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是10至50mm。在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是10至30mm。
[0247]
在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[0248]
在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm或约100mm。
[0249]
在一实施例中，替代溶液中螯合剂的浓度是约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm或约50mm。
[0250]
在一实施例中，渗滤缓冲溶液包括盐。在一些实施例中，盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施例中，盐是氯化钠。在一实施例中，渗滤缓冲溶液包括约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500mm的氯化钠。在一个特定实施例中，渗滤缓冲溶液包括约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mm的氯化钠。
[0251]
在本发明的一实施例中，渗滤体积(diavolume)数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。在本发明的一实施例中，渗滤体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。在本发明的一实施例中，渗滤体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。
[0252]
在本发明的一实施例中，超滤和渗滤步骤在约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[0253]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0254]
在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约
47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0255]
在本发明的一实施例中，渗滤步骤在约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，渗滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[0256]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0257]
在一实施例中，渗滤步骤在约约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0258]
在本发明的一实施例中，超滤步骤在约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，超滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0259]
在一实施例中，超滤步骤在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，超滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0260]
1.7活化碳过滤
[0261]
一旦溶液已通过上文1.2部分的絮凝步骤处理，含有多糖的溶液可以任选地通过活性碳过滤步骤进一步澄清。
[0262]
在一实施例中，通过1.3部分的固/液分离步骤进一步处理的1.2部分的溶液(例如上清液)通过活性碳过滤步骤进一步澄清。在一实施例中，通过上文1.4部分的任何方法和/或通过上文1.5部分的过滤步骤进一步过滤的溶液通过活性碳过滤步骤进一步澄清。在一实施例中，通过上文1.6部分的超滤和/或渗滤步骤进一步澄清的溶液通过活性碳过滤步骤进一步澄清。
[0263]
活性碳过滤步骤允许进一步去除宿主细胞杂质，如蛋白质和核酸以及有色杂质(参见wo2008/118752)。
[0264]
在一实施例中，将活性碳(也称为活性碳(active charcoal))以足以吸收大部分
蛋白质和核酸污染物的量添加到溶液中，并且然后在污染物被吸附到活性碳上后将其除去。在一实施例中，活性碳以粉末、粒状炭床、压制炭块或挤出炭块的形式添加(参见例如诺芮特(norit)活性碳)。在一实施例中，活性碳以约0.1％至20％(重量体积)、1％至15％(重量体积)、1％至10％(重量体积)、2％至10％(重量体积)、3％至10％(重量体积)、4％至10％(重量体积)、5％至10％(重量体积)、1％至5％(重量体积)或2％至5％(重量体积)的量添加。随后搅拌混合物并静置。在一实施例中，将混合物静置约5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240分钟或更长时间。随后去除活性碳。可以例如通过离心或过滤去除活性碳。
[0265]
在一优选实施例中，溶液通过固定在基质中的活性碳过滤。基质可以是溶液可渗透的任何多孔过滤介质。基质可以包括载体材料和/或粘合剂材料。载体材料可以是合成聚合物或天然来源的聚合物。合适的合成聚合物可以包含聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸甲酯，而天然来源的聚合物可以包含纤维素、多糖和葡聚糖、琼脂糖。通常，聚合物载体材料呈纤维网络形式以提供机械刚性。粘合剂材料可以是树脂。基质可以具有膜片的形式。在一实施例中，固定在基质中的活性碳采用流通式炭盒的形式。盒是一个独立的实体，含有固定在基质中并以膜片形式制备的粉末状活性碳。可以将膜片捕获在塑料可渗透支撑件中以形成圆盘。
[0266]
或者，膜片可以螺旋缠绕。为了增加过滤器表面积，可以将几个圆盘相互堆叠。特别是，彼此堆叠的圆盘具有中央芯管，用于收集炭处理过的样品并将其从过滤器中取出。堆叠圆盘的构形可以是透镜状。
[0267]
碳过滤器中的活性碳可以来自不同的原材料，例如泥炭、褐煤、木材或椰子壳。
[0268]
本领域已知的任何工艺，如蒸汽或化学处理，都可用于使炭活化(例如木基磷酸活性碳)。
[0269]
在本发明中，固定在基质中的活性碳可以放置在外壳中以形成独立的过滤单元。每个过滤单元都有自己的入口和出口，用于待净化的溶液。可用于本发明的过滤器单元的实例是来自坤诺公司(cuno inc.)(美国梅里登)或颇尔公司(pall corporation)(美国东山(east hill))的炭盒。特别地，cuno zetacarbon过滤器适用于本发明。这些碳过滤器包括纤维素基质，活性碳粉末被包裹在其中并在适当的位置进行树脂粘合。
[0270]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-100微米、约0.05-100微米、约0.1-100微米、约0.2-100微米、约0.3-100微米、约0.4-100微米、约0.5-100微米、约0.6-100微米、约0.7-100微米、约0.8-100微米、约0.9-100微米、约1-100微米、约1.25-100微米、约1.5-100微米、约1.75-100微米、约2-100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米之间的标称微米等级。
[0271]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米之间的标称微米等级。
[0272]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米之间的标称微米等级。
[0273]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米之间的标称微米等级。
[0274]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米之间的标称微米等级。
[0275]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米之间的标称微米等级。
[0276]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米之间的标称微米等级。
[0277]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称微米等级。
[0278]
在一实施例中，上文所公开的活性碳过滤器具有介于约0.05-50微米、0.1-25微米、0.2-10微米、0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米之间的标称微米等级。
[0279]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0280]
在一实施例中，以介于1-500lmh、10-500lmh、15-500lmh、20-500lmh、25-500lmh、30-500lmh、40-500lmh、50-500lmh、100-500lmh、125-500lmh、150-500lmh、200-500lmh、250-500lmh、300-500lmh或400-500lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0281]
在一实施例中，以介于1-200lmh、10-200lmh、15-200lmh、20-200lmh、25-200lmh、30-200lmh、40-200lmh、50-200lmh、100-200lmh、125-200lmh或150-200lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0282]
在一实施例中，以介于1-150lmh、10-150lmh、15-150lmh、20-150lmh、25-150lmh、30-150lmh、40-150lmh、50-150lmh、100-150lmh或125-150lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0283]
在一实施例中，以介于1-100lmh、10-100lmh、15-100lmh、20-100lmh、25-100lmh、30-100lmh、40-100lmh或50-100lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0284]
在一实施例中，以介于1-75lmh、5-75lmh、10-75lmh、15-75lmh、20-75lmh、25-75lmh、30-75lmh、35-75lmh、40-75lmh、45-75lmh、50-75lmh、55-75lmh、60-75lmh、65-75lmh或70-75lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0285]
在一实施例中，以介于1-50lmh、5-50lmh、7-50lmh、10-50lmh、15-50lmh、20-50lmh、25-50lmh、30-50lmh、35-50lmh、40-50lmh或45-50lmh之间的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0286]
涵盖任何上述范围内的任何整数作为本公开的实施例。
[0287]
在一实施例中，以约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约700、约800、约900、约950或约1000lmh的加料速率进行活性碳过滤步骤。
[0288]
在一实施例中，通过活性碳过滤器处理溶液，其中过滤器具有介于5-1000l/m2、10-750l/m2、15-500l/m2、20-400l/m2、25-300l/m2、30-250l/m2、40-200l/m2或30-100l/m2之间的过滤能力。
[0289]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0290]
在一实施例中，通过活性碳过滤器处理溶液，其中过滤器具有约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000l/m2的过滤能力。
[0291]
如果在第一个活性碳过滤步骤后污染物含量高于固定阈值，则可以重复所述步骤。在本发明的一实施例中，进行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个活性碳过滤步骤。
[0292]
在本发明的一实施例中，进行1、2或3个活性碳过滤步骤。在本发明的一实施例中，进行1或2个活性碳过滤步骤。
[0293]
在一实施例中，通过连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过2、3、4或5个连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过2个连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过3个连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过4个连续活性碳过滤器处理溶液。在一实施例中，通过5个连续活性碳过滤器处理溶液。
[0294]
在一实施例中，活性碳过滤步骤以单程模式进行。
[0295]
在另一个实施例中，活性碳过滤步骤以再循环模式进行。在所述实施例中(再循环模式)，进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次活性碳过滤循环。在另一个实施例中，进行2、3、4、5、6、7、8、9或10次活性碳过滤循环。在一实施例中，进行2或3次活性碳过滤循环。在一实施例中，进行2次活性碳过滤循环。
[0296]
1.8任选的进一步过滤
[0297]
一旦溶液已通过上文1.7部分的活性碳步骤处理，所获得的溶液(即滤液)可以任
选地进一步过滤。
[0298]
在一实施例中，对溶液进行微过滤。在一实施例中，微过滤是死端过滤(垂直过滤)。
[0299]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米之间的标称保留范围。
[0300]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[0301]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0302]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0微米的标称保留等级。
[0303]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.2微米的标称保留等级。
[0304]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有100-6000l/m2、200-6000l/m2、300-6000l/m2、400-6000l/m2、500-6000l/m2、750-6000l/m2、1000-6000l/m2、1500-6000l/m2、2000-6000l/m2、3000-6000l/m2或4000-6000l/m2的过滤能力。
[0305]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有100-4000l/m2、200-4000l/m2、300-4000l/m2、400-4000l/m2、500-4000l/m2、750-4000l/m2、1000-4000l/m2、1500-4000l/m2、2000-4000l/m2、2500-4000l/m2、3000-4000l/m2、3000-4000l/m2或3500-4000l/m2的过滤能力。
[0306]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有100-3750l/m2、200-3750l/m2、300-3750l/m2、400-3750l/m2、500-3750l/m2、750-3750l/m2、1000-3750l/m2、1500-3750l/m2、2000-3750l/m2、2500-3750l/m2、3000-3750l/m2、3000-3750l/m2或3500-3750l/m2的过滤能力。
[0307]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有100-1250l/m2、200-1250l/m2、300-1250l/m2、400-1250l/m2、500-1250l/m2、750-1250l/m2或1000-1250l/m2的过滤能力。
[0308]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0309]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约100、约200、约300、约400、约550、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5250、约5500、约5750或约6000l/m2的过滤能力。
[0310]
1.9疏水相互作用色谱(hic)
[0311]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如前级纯化步骤中残留的脂质多糖
(内毒素)。
[0312]
一旦溶液已通过上文1.2部分的絮凝步骤处理，含有多糖的溶液可以任选地通过hic步骤进一步纯化。
[0313]
在一实施例中，通过1.3部分的固/液分离步骤进一步处理1.2部分的溶液(例如上清液)通过hic步骤进一步纯化。在一实施例中，通过上文1.5部分的任何方法和/或通过上文1.4部分的过滤步骤进一步过滤的溶液通过hic步骤进一步纯化。在一实施例中，通过上文1.6部分的超滤和/或渗滤步骤进一步澄清的溶液通过hic步骤进一步纯化。在一实施例中，通过1.7部分的活性碳过滤步骤进一步澄清的溶液通过hic步骤进一步纯化。
[0314]
在一实施例中，通过上文1.6部分的超滤和/或渗滤步骤进一步澄清的溶液通过离子交换膜(iex)过滤步骤进一步纯化，且随后可以通过hic步骤进一步纯化。
[0315]
在一实施例中，hic步骤使用疏水吸附剂进行，所述疏水吸附剂选自但不限于由以下组成的群组：苯基膜、丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖、丁基-、苯基-、醚-、聚丙二醇-和己基有机聚合物树脂。
[0316]
在一实施例中，在hic步骤中使用的疏水吸附剂是苯基膜，如sartobind苯基膜或cytiva的苯基吸附剂膜。
[0317]
在一实施例中，在hic步骤中使用的疏水吸附剂是sartobind苯基膜。
[0318]
在一实施例中，来自前一步骤的材料(例如炭滤液)用平衡缓冲液处理以获得包括待纯化材料和所需盐浓度的操作缓冲液。在一实施例中，平衡缓冲液包括盐，且最终盐浓度(即操作缓冲液中)选自约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0m。在一个实施例中，操作缓冲液具有介于约4.0与约8.0之间的ph。在一个实施例中，操作缓冲液的ph是约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0。在一实施例中，平衡缓冲液包括选自以下的盐：硫酸铵(优选地呈操作缓冲液中0.5m-3.0m的最终浓度且ph 6.0
±
2.0)、磷酸钠(优选地呈操作缓冲液中0.5m-3.0m的最终浓度且ph 7.0
±
1.5)、磷酸钾(优选地呈操作缓冲液中0.5m-3.0m的最终浓度且ph 7.0
±
1.5)、硫酸钠(优选地呈操作缓冲液中0.1m-0.75m的最终浓度且ph 6.0
±
2.0)、柠檬酸钠(优选地呈操作缓冲液中0.1m-1.5m的最终浓度且ph 6.0
±
2.0)或氯化钠(优选地呈操作缓冲液中0.5m-5.0m的最终浓度且ph7.0
±
1.5)。
[0319]
在一实施例中，平衡缓冲液包括硫酸铵，且操作缓冲液中的最终盐浓度介于约1.0m与约2.0m之间，优选约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0m)。
[0320]
在一实施例中，疏水吸附剂使用操作缓冲液平衡，随后在操作缓冲液中待纯化的材料通过柱或膜运行。
[0321]
在一实施例中，疏水吸附剂是苯基膜并且流动速率介于每分钟约0.1与约20个膜体积、每分钟约0.1与约10个膜体积、每分钟约0.2与约10个膜体积、每分钟约0.2与约5个膜体积、每分钟约0.1与约1个膜体积之间。在一实施例中，疏水吸附剂是苯基膜并且流动速率介于每分钟约0.1与约1.0个膜体积之间，优选每分钟约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9或约1.0个膜体积。
[0322]
在一实施例中，hic膜随后用操作缓冲液冲洗，且还可以进一步用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0323]
1.10超滤/渗滤
[0324]
一旦溶液已通过上文1.9部分的hic步骤和/或通过上文1.8部分的进一步过滤步骤处理，所得溶液(即滤液)可以任选地通过超滤和/或渗滤进一步澄清。
[0325]
在本发明的一实施例中，通过超滤处理溶液(例如在上文1.9或1.8部分获得)。
[0326]
在一实施例中，通过超滤处理溶液，且膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-750kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-500kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-300kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-100kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-50kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约10kda-30kda之间的范围内。在一实施例中，膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda、约10kda-1000kda、约20kda-1000kda、约30kda-1000kda、约40kda-1000kda、约50kda-1000kda、约75kda-1000kda、约100kda-1000kda、约150kda-1000kda、约200kda-1000kda、约300kda-1000kda、约400kda-1000kda、约500kda-1000kda或约750kda-1000kda之间的范围内。
[0327]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约5kda-500kda、约10kda-500kda、约20kda-500kda、约30kda-500kda、约40kda-500kda、约50kda-500kda、约75kda-500kda、约100kda-500kda、约150kda-500kda、约200kda-500kda、约300kda-500kda或约400kda-500kda之间的范围内。
[0328]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约约5kda-300kda、约10kda-300kda、约20kda-300kda、约30kda-300kda、约40kda-300kda、约50kda-300kda、约75kda-300kda、约100kda-300kda、约150kda-300kda或约200kda-300kda之间的范围内。
[0329]
在一实施例中，膜的截留分子量在介于约5kda-100kda、约10kda-100kda、约20kda-100kda、约30kda-100kda、约40kda-100kda、约50kda-100kda或约75kda-100kda之间的范围内。
[0330]
在一实施例中，膜的截留分子量是约5kda、约10kda、约20kda、约30kda、约40kda、约50kda、约60kda、约70kda、约80kda、约90kda、约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约400kda、约500kda、约750kda或约1000kda。
[0331]
在一实施例中，超滤步骤的浓缩系数是约1.5至约10.0。在一实施例中，浓缩系数是约2.0至约8.0。在一实施例中，浓缩系数是约2.0至约5.0。
[0332]
在一实施例中，浓缩系数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一实施例
中，浓缩系数是约2.0、约3.0、约4.0、约5.0或约6.0。
[0333]
在本发明的一实施例中，通过渗滤处理溶液(例如在上文1.9或1.8部分获得的滤液)。
[0334]
在本发明的一实施例中，如上文本部分中所公开的超滤(uf)之后获得的溶液进一步通过渗滤处理(uf/df处理)。
[0335]
渗滤(df)用于将产物交换到所需的缓冲溶液(或仅水)中。在一实施例中，渗滤用于在恒定体积下改变保留溶液的化学性质。不需要的颗粒穿过膜，同时通过添加替代溶液(缓冲溶液、盐水溶液、缓冲盐水溶液或水)将进料流的组成变为更理想的状态。
[0336]
在一实施例中，替代溶液是水。
[0337]
在一实施例中，替代溶液是生理盐水。在一些实施例中，盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施例中，盐是氯化钠。在一实施例中，替代溶液是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约350、约400、约450或约500mm的氯化钠。在一个特定实施例中，替代溶液是约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mm的氯化钠。在一个特定实施例中，替代溶液是约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90或约100mm的氯化钠。
[0338]
在一实施例中，替代溶液是缓冲溶液。在一实施例中，替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自由以下组成的群组：n-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(aces)、乙酸的盐(醋酸盐)、n-(2-乙酰氨基)-亚胺二乙酸(ada)、2-氨基乙磺酸(aes，牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇ampd，氨甲基丙二醇(ammediol)、n-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(ampso)、n,n-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、n,n'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双-(2-羟基乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(bis-tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(bis-tris-丙烷)、硼酸、二甲基胂酸(二甲胂酸盐)、3-(环己基氨基)-丙磺酸(caps)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(capso)、碳酸钠(碳酸盐)、环己基氨基乙磺酸(ches)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[n-双(羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(dipso)、甲酸的盐(甲酸盐)、甘氨酸、双甘氨肽、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-乙磺酸(hepes)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-3-丙磺酸(hepps，epps)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-2-羟基丙磺酸(heppso)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、2-(n-吗啉基)-乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉基)-丙磺酸(mops)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙磺酸)(popso)、吡啶、丁二酸的盐(丁二酸盐)、3-{[三(羟基甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(taps)、3-[n-三(羟基甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)、三乙醇胺(tea)、2-[三(羟基甲基)-甲氨基]-乙磺酸(tes)、n-[三(羟基甲基)-甲基]-甘氨酸(麦黄酮)和三(羟基甲基)-氨基甲烷(tris)。
[0339]
在一实施例中，渗滤缓冲液选自由以下组成的群组：乙酸的盐(醋酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和丁二酸的盐(丁二酸盐)。在一实施例中，渗滤缓冲液是柠檬酸的
盐(柠檬酸盐)。在一实施例中，渗滤缓冲液是丁二酸的盐(丁二酸盐)。在一实施例中，渗滤缓冲液是磷酸的盐(磷酸盐)。在一实施例中，所述盐是钠盐。在一实施例中，所述盐是钾盐。
[0340]
在一实施例中，渗滤缓冲液的ph介于约4.0-11.0之间、介于约5.0-10.0之间、介于约5.5-9.0之间、介于约6.0-8.0之间、介于约6.0-7.0之间、介于约6.5-7.5之间、介于约6.5-7.0之间或介于约6.0-7.5之间。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0341]
在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph为约约6.5、约7.0或约7.5。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约6.0。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约6.5。在一实施例中，渗滤缓冲液的ph是约7.0。
[0342]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-100mm之间、介于约0.1mm-100mm之间、介于约0.5mm-100mm之间、介于约1mm-100mm之间、介于约2mm-100mm之间、介于约3mm-100mm之间、介于约4mm-100mm之间、介于约5mm-100mm之间、介于约6mm-100mm之间、介于约7mm-100mm之间、介于约8mm-100mm之间、介于约9mm-100mm之间、介于约10mm-100mm之间、介于约11mm-100mm之间、介于约12mm-100mm之间、介于约13mm-100mm之间、介于约14mm-100mm之间、介于约15mm-100mm之间、介于约16mm-100mm之间、介于约17mm-100mm之间、介于约18mm-100mm之间、介于约19mm-100mm之间、介于约20mm-100mm之间、介于约25mm-100mm之间、介于约30mm-100mm之间、介于约35mm-100mm之间、介于约40mm-100mm之间、介于约45mm-100mm之间、介于约50mm-100mm之间、介于约55mm-100mm之间、介于约60mm-100mm之间、介于约65mm-100mm之间、介于约70mm-100mm之间、介于约75mm-100mm之间、介于约80mm-100mm之间、介于约85mm-100mm之间、介于约90mm-100mm之间或介于约95mm-100mm之间。
[0343]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-50mm之间、介于约0.1mm-50mm之间、介于约0.5mm-50mm之间、介于约1mm-50mm之间、介于约2mm-50mm之间、介于约3mm-50mm之间、介于约4mm-50mm之间、介于约5mm-50mm之间、介于约6mm-50mm之间、介于约7mm-50mm之间、介于约8mm-50mm之间、介于约9mm-50mm之间、介于约10mm-50mm之间、介于约11mm-50mm之间、介于约12mm-50mm之间、介于约13mm-50mm之间、介于约14mm-50mm之间、介于约15mm-50mm之间、介于约16mm-50mm之间、介于约17mm-50mm之间、介于约18mm-50mm之间、介于约19mm-50mm之间、介于约20mm-50mm之间、介于约25mm-50mm之间、介于约30mm-50mm之间、介于约35mm-50mm之间、介于约40mm-50mm之间或介于约45mm-50mm之间。
[0344]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-25mm之间、介于约0.1mm-25mm之间、介于约0.5mm-25mm之间、介于约1mm-25mm之间、介于约2mm-25mm之间、介于约3mm-25mm之间、介于约4mm-25mm之间、介于约5mm-25mm之间、介于约6mm-25mm之间、介于约7mm-25mm之间、介于约8mm-25mm之间、介于约9mm-25mm之间、介于约10mm-25mm之间、介于约11mm-25mm之间、介于约12mm-25mm之间、介于约13mm-25mm之间、介于约14mm-25mm之间、介于约15mm-25mm之间、介于约16mm-25mm之间、介于约17mm-25mm之间、介于约18mm-25mm之间、介于约19mm-25mm之间或介于约20mm-25mm之间。
[0345]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-15mm之间、介于约0.1mm-15mm之间、介于约0.5mm-15mm之间、介于约1mm-15mm之间、介于约2mm-15mm之间、介于约3mm-15mm
之间、介于约4mm-15mm之间、介于约5mm-15mm之间、介于约6mm-15mm之间、介于约7mm-15mm之间、介于约8mm-15mm之间、介于约9mm-15mm之间、介于约10mm-15mm之间、介于约11mm-15mm之间、介于约12mm-15mm之间、介于约13mm-15mm之间或介于约14mm-15mm之间。
[0346]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-10mm之间、介于约0.1mm-10mm之间、介于约0.5mm-10mm之间、介于约1mm-10mm之间、介于约2mm-10mm之间、介于约3mm-10mm之间、介于约4mm-10mm之间、介于约5mm-10mm之间、介于约6mm-10mm之间、介于约7mm-10mm之间、介于约8mm-10mm之间或介于约9mm-10mm之间。
[0347]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0348]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[0349]
在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约0.1mm、约0.2mm、约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约40mm或约50mm。在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约30mm。在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约25mm。在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约20mm。在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约15mm。在一实施例中，渗滤缓冲液的浓度是约10mm。
[0350]
在一实施例中，渗滤缓冲溶液包括盐。在一些实施例中，盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施例中，盐是氯化钠。在一个特定实施例中，渗滤缓冲溶液包括约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mm的氯化钠。
[0351]
在本发明的一实施例中，渗滤体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。在本发明的一实施例中，渗滤体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。在本发明的一实施例中，渗滤体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。
[0352]
在本发明的一实施例中，超滤和渗滤步骤在介于约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0353]
在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约
58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，超滤和渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0354]
在本发明的一实施例中，渗滤步骤在约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，渗滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0355]
在一实施例中，渗滤步骤在约约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0356]
在本发明的一实施例中，超滤步骤在约20℃至约90℃之间的温度下进行。在一实施例中，超滤步骤在约35℃至约80℃之间的温度下、在约40℃至约70℃之间的温度下、在约45℃至约65℃之间的温度下、在约50℃至约60℃之间的温度下、在约50℃至约55℃之间的温度下、在约45℃至约55℃之间的温度下或在约45℃至约55℃之间的温度下进行。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0357]
在一实施例中，超滤步骤是在约约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。在一实施例中，超滤步骤在约50℃的温度下进行。
[0358]
1.11均匀化/大小设定
[0359]
在纯化程序中，多糖的大小可以略微减小。
[0360]
在一实施例中，本发明的多糖纯化溶液(例如通过1.10部分的超滤和/或渗滤获得)不经设定大小。
[0361]
在一实施例中，多糖可以通过大小设定技术进行均匀化。可以采用机械或化学大小设定。化学水解可以使用例如乙酸进行。可以使用高压均匀化剪切进行机械大小设定。
[0362]
因此，在一实施例中，将通过1.10部分的超滤和/或渗滤获得的多糖纯化溶液大小设定成目标分子量。
[0363]
如本文所用，术语多糖的“分子量”是指例如通过结合多角度激光散射检测器(malls)的尺寸排阻色谱法(sec)计算的分子量。
[0364]
在一些实施例中，纯化多糖大小设定成介于约5kda与约4,000kda之间的分子量。在其它此类实施例中，纯化多糖大小设定成介于约10kda与约4,000kda之间的分子量。在其
它此类实施例中，纯化多糖大小设定成介于约50kda与约4,000kda之间的分子量。在其它此类实施例中，多糖，纯化多糖大小设定成介于约50kda与约3,500kda之间、介于约50kda与约3,000kda之间、介于约50kda与约2,500kda之间、介于约50kda与约2,000kda之间、介于约50kda与约1,750kda之间、约介于约50kda与约1,500kda之间、介于约50kda与约1,250kda之间、介于约50kda与约1,000kda之间、介于约50kda与约750kda之间、介于约50kda与约500kda之间、介于约100kda与约4,000kda之间、介于约100kda与约3,500kda之间、介于约100kda与约3,000kda之间、约100kda与约2,500kda之间、约100kda与约2,250kda之间、介于约100kda与约2,000kda之间、介于约100kda与约1,750kda之间、介于约100kda与约1,500kda之间、介于约100kda与约1,250kda之间、介于约100kda与约1,000kda之间、介于约100kda与约750kda之间、介于约100kda与约500kda之间、介于约200kda与约4,000kda之间、介于约200kda与约3,500kda之间、介于约200kda与约3,000kda之间、介于约200kda与约2,500kda之间、介于约200kda与约2,250kda之间、介于约200kda与约2,000kda之间、介于约200kda与约1,750kda之间、介于约200kda与约1,500kda之间、介于约200kda与约1,250kda之间、介于约200kda与约1,000kda之间、介于约200kda与约750kda之间、或介于约200kda与约500kda之间的分子量。在其它此类实施例中，多糖，纯化多糖大小设定成介于约250kda与约3,500kda之间、介于约250kda与约3,000kda之间、介于约250kda与约2,500kda之间、介于约250kda与约2,000kda之间、介于约250kda与约1,750kda之间、约介于约250kda与约1,500kda之间、介于约250kda与约1,250kda之间、介于约250kda与约1,000kda之间、介于约250kda与约750kda之间、介于约250kda与约500kda之间、介于约300kda与约4,000kda之间、介于约300kda与约3,500kda之间、约300kda与约3,000kda之间、约300kda与约2,500kda之间、约300kda与约2,250kda之间、介于约300kda与约2,000kda之间、介于约300kda与约1,750kda之间、介于约300kda与约1,500kda之间、介于约300kda与约1,250kda之间、介于约300kda与约1,000kda之间、介于约300kda与约750kda之间、介于约300kda与约500kda之间、介于约500kda与约4,000kda之间、介于约500kda与约3,500kda之间、介于约500kda与约3,000kda之间、介于约500kda与约2,500kda之间、介于约500kda与约2,250kda之间、介于约500kda与约2,000kda之间、介于约500kda与约1,750kda之间、介于约500kda与约1,500kda之间、介于约500kda与约1,250kda之间、介于约500kda与约1,000kda之间、介于约500kda与约750kda之间、或介于约500kda与约600kda之间的分子量。
[0365]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0366]
在一些实施例中，纯化多糖大小设定成约5kda、约10kda、约15kda、约20kda、约25kda、约30kda、约35kda、约40kda、约45kda、约50kda、约75kda、约90kda、约100kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约350kda、约400kda、约450kda、约500kda、约550kda、约600kda、约650kda、约700kda、约750kda、约800kda、约850kda、约900kda、约950kda、约1000kda、约1250kda、约1500kda、约1750kda、约2000kda、约2250kda、约2500kda、约2750kda、约3000kda、约3250kda、约3500kda、约3750kda或约4,000kda的分子量。
[0367]
在一优选实施例中，纯化多糖是来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、10a、11a、12f、14、15a、15b、18c、19a、19f、22f、23f或33f的荚膜多糖，其中荚膜多糖的分子量在上述范围之一内或具有约如上文所述的大小。
[0368]
1.12无菌过滤
[0369]
在一实施例中，将本发明的多糖纯化溶液无菌过滤。
[0370]
因此，在一实施例中，1.10部分的超滤和/或渗滤步骤可以任选地后接有无菌过滤步骤。
[0371]
在一实施例中，如果进行1.11部分的均匀化/大小设定步骤，则可以任选地后接有无菌过滤步骤。
[0372]
在一实施例中，1.2至1.9部分的任何步骤可以任选地后接有无菌过滤步骤。
[0373]
在一实施例中，无菌过滤是死端过滤(垂直过滤)。在一实施例中，无菌过滤是切向过滤。
[0374]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有介于约0.01-0.2微米、约0.05-0.2微米、约0.1-0.2微米或约0.15-0.2微米之间的标称保留范围。
[0375]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0376]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.05、约0.1、约0.15或约0.2微米的标称保留范围。
[0377]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约0.2微米的标称保留范围。
[0378]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约25-1500l/m2、50-1500l/m2、75-1500l/m2、100-1500l/m2、150-1500l/m2、200-1500l/m2、250-1500l/m2、300-1500l/m2、350-1500l/m2、400-1500l/m2、500-1500l/m2、750-1500l/m2、1000-1500l/m2或1250-1500l/m2的过滤能力。
[0379]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约25-1000l/m2、50-1000l/m2、75-1000l/m2、100-1000l/m2、150-1000l/m2、200-1000l/m2、250-1000l/m2、300-1000l/m2、350-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2的过滤能力。
[0380]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有25-500l/m2、50-500l/m2、75-500l/m2、100-500l/m2、150-500l/m2、200-500l/m2、250-500l/m2、300-500l/m2、350-500l/m2或400-500l/m2的过滤能力。
[0381]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有25-300l/m2、50-300l/m2、75-300l/m2、100-300l/m2、150-300l/m2、200-300l/m2或250-300l/m2的过滤能力。
[0382]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有25-250l/m2、50-250l/m2、75-250l/m2、100-250l/m2或150-250l/m2、200-250l/m2的过滤能力。
[0383]
在一实施例中，通过无菌过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有25-100l/m2、50-100l/m2或75-100l/m2的过滤能力。
[0384]
涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0385]
在一实施例中，通过微过滤步骤处理溶液，其中过滤器具有约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400或约1500l/m2的过滤能力。
[0386]
1.13最终材料
[0387]
多糖最终可以制成液体溶液。多糖可以进一步处理(例如冻干为干燥粉末，参见wo2006/110381)。因此在一实施例中，多糖是干燥粉末。
[0388]
在一实施例中，多糖是冻干饼状物。
[0389]
2.纯化多糖的用途
[0390]
通过本发明的方法纯化的多糖可以用作抗原。纯多糖在疫苗中用作抗原(参见23价非结合肺炎球菌多糖疫苗pneumovax)。
[0391]
通过本发明的方法纯化的多糖也可以与载体蛋白缀合以获得糖缀合物。
[0392]
2.1.糖缀合物
[0393]
通过本发明的方法纯化的多糖可以与载体蛋白缀合以获得糖缀合物。
[0394]
出于本发明的目的，术语
‘
糖缀合物’表示与载体蛋白共价连接的糖类。在一个实施例中糖类直接与载体蛋白连接。在第二实施例中，糖类通过间隔基/连接基团与载体蛋白连接。
[0395]
一般来说，糖类与载体的共价结合增强了糖类的免疫原性，因为它将糖类从t非依赖性抗原转化为t依赖性抗原，从而引发免疫记忆。缀合对儿科疫苗特别有用。
[0396]
通过本发明的方法纯化的多糖可以被活化(例如化学活化)以使其能够反应(例如与连接基团或直接与载体蛋白)，且随后掺入糖缀合物中，如本文进一步描述。
[0397]
可以在缀合之前将纯化的多糖大小调整到目标分子量，例如通过上文1.11部分所公开的方法。因此，在一实施例中，纯化的多糖在缀合前设定大小。在一实施例中，如本文所公开的纯化多糖可以在缀合之前设定大小以获得寡糖。寡糖具有低数量的重复单元(通常为5-15个重复单元)并且通常通过多糖的大小设定(例如水解)而衍生。
[0398]
然而，优选地，用于缀合的糖类是多糖。由于抗原表面上存在的表位，高分子量多糖能够诱导某些抗体免疫反应。优选涵盖高分子量多糖的分离和纯化用于本发明的缀合物。
[0399]
因此，在一实施例中，多糖经设定大小并且保持为多糖。
[0400]
在一实施例中，多糖不经设定大小。
[0401]
在一些实施例中，缀合前的纯化多糖(在大小设定后或未经大小设定)具有介于5kda与4,000kda之间的分子量。在其它此类实施例中，纯化多糖具有介于10kda与4,000kda之间的分子量。在其它此类实施例中，纯化多糖具有介于50kda与4,000kda之间的分子量。在其它此类实施例中，多糖具有介于50kda与3,500kda之间、介于50kda与3,000kda之间、介于50kda与2,500kda之间、介于50kda与2,000kda之间、介于50kda与1,750kda之间、介于50kda与1,500kda之间、介于50kda与1,250kda之间、介于50kda与1,000kda之间、介于50kda与750kda之间、介于50kda与500kda之间、介于100kda与4,000kda之间、介于100kda与3,500kda之间、100kda与3,000kda之间、100kda与2,500kda之间、100kda与2,250kda之间、介于100kda与2,000kda之间、介于100kda与1,750kda之间、介于100kda与1,500kda之间、介于100kda与1,250kda之间、介于100kda与1,000kda之间、介于100kda与750kda之间、介于100kda与500kda之间、介于200kda与4,000kda之间、介于200kda与3,500kda之间、介于200kda与3,000kda之间、介于200kda与2,500kda之间、介于200kda与2,250kda之间、介于200kda与2,000kda之间、介于200kda与1,750kda之间、介于200kda与1,500kda之间、介于200kda与1,250kda之间、介于200kda与1,000kda之间、介于200kda与750kda之间或介于200kda与500kda之间的分子量。在其它此类实施例中，多糖具有介于250kda与3,500kda之间、介于250kda与3,000kda之间、介于250kda与2,500kda之间、介于250kda与2,000kda之间、介于250kda与1,750kda之间、介于250kda与1,500kda之间、介于250kda与1,250kda之
间、介于250kda与1,000kda之间、介于250kda与750kda之间、介于250kda与500kda之间、介于300kda与4,000kda之间、介于300kda与3,500kda之间、300kda与3,000kda之间、300kda与2,500kda之间、300kda与2,250kda之间、介于300kda与2,000kda之间、介于300kda与1,750kda之间、介于300kda与1,500kda之间、介于300kda与1,250kda之间、介于300kda与1,000kda之间、介于300kda与750kda之间、介于300kda与500kda之间、介于500kda与4,000kda之间、介于500kda与3,500kda之间、介于500kda与3,000kda之间、介于500kda与2,500kda之间、介于500kda与2,250kda之间、介于500kda与2,000kda之间、介于500kda与1,750kda之间、介于500kda与1,500kda之间、介于500kda与1,250kda之间、介于500kda与1,000kda之间、介于500kda与750kda之间或介于500kda与600kda之间的分子量。涵盖任何上述范围内的任何数字作为本公开的实施例。
[0402]
在一些实施例中，纯化多糖具有约5kda、10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、75kda、90kda、100kda、150kda、200kda、250kda、300kda、350kda、400kda、450kda、500kda、550kda、600kda、650kda、700kda、750kda、800kda、850kda、900kda、950kda、1000kda、1250kda、1500kda、1750kda、2000kda、2250kda、2500kda、2750kda、3000kda、3250kda、3500kda、3750kda或4,000kda的分子量。
[0403]
在一实施例中，纯化多糖是荚膜糖类(多糖或寡醣)。
[0404]
在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自致泻性大肠杆菌族(eec族)的大肠杆菌部分的荚膜多糖，所述大肠杆菌部分如肠毒性大肠杆菌(etec)、肠病原性大肠杆菌(epec)、o157:h7肠出血性大肠杆菌(ehec)或肠侵袭性大肠杆菌(eiec)。在一实施例中，纯化多糖是来自尿道致病性大肠杆菌(upec)的荚膜多糖。
[0405]
在一实施例中，纯化多糖是来自选自由以下组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖：血清型o157:h7、o26:h11、o111:h-和o103:h2。在一实施例中，纯化多糖是来自选自由血清型o6:k2:h1和o18:k1:h7组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自选自由血清型o45:k1、o17:k52:h18、o19:h34和o7:k1组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌血清型o104:h4的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌血清型o1:k12:h7的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌血清型o127:h6的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌血清型o139:h28的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自大肠杆菌血清型o128:h2的荚膜多糖。
[0406]
在另一实施例中，纯化多糖是来自脑膜炎奈瑟菌的荚膜多糖。在一实施例中，纯化多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(mena)、脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)、脑膜炎奈瑟菌血清组y(meny)、脑膜炎奈瑟菌血清组x(menx)或脑膜炎奈瑟菌血清组c(menc)的荚膜多糖。
[0407]
在另一实施例中，纯化多糖是来自肺炎克雷伯菌的荚膜多糖。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o1(o1)、肺炎克雷伯菌血清组o2(o2)、肺炎克雷伯菌血清组o2ac(o2ac)、肺炎克雷伯菌血清组o3(o3)、肺炎克雷伯菌血清组o4(o4)、肺炎克雷伯菌血清组o5(o5)、肺炎克雷伯菌血清组o7(o7)、肺炎克雷伯菌血清组o8(o8)或肺炎克雷伯菌血清组o9(o9)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o1(o1)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o2(o2)。在一实施例中，细菌荚膜
多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o2ac(o2ac)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o3(o3)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o4(o4)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o5(o5)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o7(o7)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o8(o8)。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是肺炎克雷伯菌血清组o9(o9)。
[0408]
可以使用任何合适的缀合反应，必要时使用任何合适的连接基团。参见例如wo2007116028第17-22页。
[0409]
本文所述的纯化寡糖或多糖被化学活化以使糖类能够与载体蛋白反应。
[0410]
在一实施例中，糖缀合物使用还原胺化制备。
[0411]
还原胺化涉及两个步骤，(1)纯化糖类的氧化(活化)，(2)活化糖类和载体蛋白(例如crm
197
、dt、tt或pd)的还原以形成糖缀合物(参见例如wo2015110941、wo2015110940)。
[0412]
如上所提及，在氧化之前，可以将多糖的大小设定成目标分子量(mw)范围。可以采用机械或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。在一实施例中，通过机械均匀化减小纯化多糖的大小。
[0413]
在一实施例中，纯化多糖或寡醣通过包括以下步骤的工艺与载体蛋白缀合：
[0414]
(a)使所述纯化多糖或寡醣与氧化剂反应；
[0415]
(b)任选地通过添加淬灭剂淬灭氧化反应；
[0416]
(c)将步骤(a)或(b)的活化多糖或寡糖与载体蛋白复合；和
[0417]
(d)使复合的活化多糖或寡糖和载体蛋白与还原剂反应以形成糖缀合物。
[0418]
在氧化步骤(a)之后，糖被称为被活化并且被称为“活化的多糖或寡糖”。
[0419]
氧化步骤(a)可涉及与高碘酸盐的反应。出于本发明的目的，术语“高碘酸盐”包含高碘酸盐和高碘酸；所述术语还包含偏高碘酸盐(io
4-)和原高碘酸盐(io
65-)以及各种高碘酸盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)。
[0420]
在一优选实施例中，氧化剂是高碘酸钠。在一实施例中，用来氧化的高碘酸盐是偏高碘酸盐。在一实施例中，用来氧化的高碘酸盐是偏高碘酸钠。
[0421]
氧化步骤(a)可涉及在氧化剂存在下与稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物如哌啶-n-氧基或吡咯烷-n-氧基化合物反应以选择性氧化所述多糖或寡糖的伯羟基以产生含有醛基的活化糖类(参见wo2014097099)。在一方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是如wo2014097099第3页第14行至第4页第7行所公开的任何一种，并且氧化剂是如wo2014097099第4页第8至15行所公开的任何一种。在一方面，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(tempo)并且氧化剂是n-氯代琥珀酰亚胺(ncs)。
[0422]
在一个实施例中，淬灭剂如wo2015110941中所公开的(参见第30页第3至26行)。
[0423]
在一实施例中，还原反应(d)在水性溶剂中进行。在一实施例中，还原反应(d)在非质子性溶剂中进行。在一实施例中，还原反应(d)在dmso(二甲亚砜)或dmf(二甲基甲酰胺))溶剂中进行。
[0424]
在一实施例中，还原剂是氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、在布朗斯台德(bronsted)酸或路易斯酸存在下的硼氢化钠或硼氢化锌、胺硼烷，如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼
烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-bumeiprn-bh3、苄胺-bh3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(pemb)。在一优选实施例中，还原剂是氰基硼氢化钠。
[0425]
在还原反应结束时，缀合物中可能残留未反应的醛基，这些可以使用合适的封端剂封端。在一个实施例中，此封端剂是硼氢化钠(nabh4)。
[0426]
在与载体蛋白缀合后，可以通过技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(就糖-蛋白质缀合物的量而言富集)。这些技术包含透析、浓缩/渗滤操作、切向流动过滤沉淀/洗脱、柱色谱(deae或疏水相互作用色谱)和深度过滤。
[0427]
在一实施例中，糖缀合物使用氰化化学方法制备。
[0428]
在一实施例中，纯化的多糖或寡糖用溴化氰活化。活化对应于多糖或寡糖的羟基的氰基化。随后将活化的多糖或寡糖直接或通过间隔(连接基团)基团偶联到载体蛋白上的氨基上。
[0429]
在一实施例中，纯化的多糖或寡糖用1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(cdap)活化以形成氰酸酯。随后将活化的多糖或寡糖直接或通过间隔(连接基团)基团偶联到载体蛋白上的氨基上。
[0430]
在一实施例中，间隔基团可以是胱胺或半胱胺以产生硫醇化多糖或寡糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用n-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]丁二酰亚胺酯(gmbs))或卤代乙酰化载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺、n-丁二酰亚氨基溴乙酸酯(sba；sib)、n-丁二酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(slab)、磺基丁二酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-siab)、n-丁二酰亚氨基碘乙酸酯(sia)或丁二酰亚氨基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯(sbap))反应后获得的硫醚键与载体偶联。优选地，氰酸酯(任选地通过cdap化学方法制备)与己二胺或己二酸二酰肼(adh)偶联，并且使用碳化二亚胺(例如edac或edc)化学方法经由蛋白质载体上的羧基将氨基衍生的糖类与载体蛋白(例如crm
197
)缀合。此类缀合物描述于例如wo 93/15760、wo 95/08348和wo 96/129094中。
[0431]
在一实施例中，糖缀合物通过使用如羰基二咪唑(cdi)或羰基二三唑(cdt)的双亲电子试剂来制备。在此类实施例中，缀合反应优选在如dmf或dmso的非质子溶剂中通过直接途径或使用双属连接基团(bigeneric linker)进行(参见例如wo2011041003)。
[0432]
在一实施例中，糖缀合物通过如wo2014027302中公开的制备糖缀合物的方法来制备。所得的糖缀合物包括通过二价异双官能间隔基团(2-((2-氧代乙基)硫基)乙基)氨基甲酸酯(etec)与载体蛋白共价缀合的糖类。或者，糖缀合物通过如wo2015121783中公开的制备糖缀合物的方法来制备。
[0433]
其它合适的缀合技术使用碳二酰亚胺(例如edc(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺氢氯化物、edc加磺基nhs、cmc(1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳化二亚胺)、dcc(n,n'-二环己基碳化二亚胺)或dic(二异丙基碳化二亚胺)。
[0434]
在一实施例中，多糖或寡糖通过连接基团，例如双官能连接基团与载体蛋白缀合。连接基团任选地是异双官能或同双官能的，具有例如反应性氨基和反应性羧酸基团、2个反应性氨基或两个反应性羧酸基团。连接基团具有例如介于4与20之间、4与12之间、5与10之间个碳原子。可能的连接基团是己二酸二酰肼(adh)。其它连接基团包含b-丙酰氨基(wo 00/10599)、硝基苯乙胺、卤代烷基卤化物)、糖苷键(us4673574、us4808700)、己二胺和6-氨基己酸(us4459286)。
[0435]
载体蛋白
[0436]
糖缀合物的组分是与纯化的多糖或寡糖缀合的载体蛋白。术语“蛋白质载体”或“载体蛋白”或“载体”在本文中可互换使用。载体蛋白应适用于标准缀合程序。
[0437]
在一优选实施例中，糖缀合物的载体蛋白选自由以下组成的群组：dt(白喉毒素)、tt(破伤风类毒素)或tt的片段c、crm
197
(一种无毒但抗原性相同的白喉毒素变体)、其它dt突变(如crm
176
、crm
228
、crm
45
(内田(uchida)等人(1973)生物化学杂志(j.biol.chem.)218:3838-3844)、crm9、crm
102
、crm
103
或crm
107
；以及尼克尔斯(nicholls)和尤乐(youle)在基因工程改造毒素(genetically engineered toxins)，编辑：弗兰克尔(frankel),马塞尔德克尔公司(maecel dekker inc.)(1992)中描述的其它突变；glu-148缺失或突变为asp、gln或ser和/或ala 158缺失或突变为gly以及美国专利第4,709,017和4,950,740号中公开的其它突变；至少一个或多个残基lys 516、lys 526、phe 530和/或lys 534的突变和美国专利第5,917,017和6,455,673号中公开的其它突变；或美国专利第5,843,711号中公开的片段，肺炎球菌溶血素(ply)(郭(kuo)等人(1995)感染免疫(infect immun)63:2706-2713)包含以某种方式解毒的ply，例如dply-gmbs(wo 2004/081515、wo 2006/032499)或dply-甲醛、phtx，包含phta、phtb、phtd、phte(phta、phtb、phtd或phte的序列公开于wo 00/37105和wo 00/39299中)pht蛋白的融合物，例如phtde融合物、phtbe融合物、pht a-e(wo 01/98334、wo 03/054007、wo 2009/000826)、ompc(脑膜炎球菌外膜蛋白)，其通常从脑膜炎奈瑟菌血清组b提取(ep0372501)，porb(来自脑膜炎奈瑟菌)，pd(流感嗜血杆菌蛋白d；参见例如ep0594610 b)，或其免疫功能等效物，合成肽(ep0378881、ep0427347)，热休克蛋白(wo 93/17712、wo 94/03208)，百日咳蛋白(wo 98/58668、ep0471177)，细胞介素，淋巴因子，生长因子或激素(wo 91/01146)，包括多种来自各种病原体衍生抗原的人cd4 t细胞表位的人工蛋白质(法卢吉(falugi)等人(2001)欧洲免疫学杂志(eur j immunol)31:3816-3824)，如n19蛋白(巴拉迪(baraldoi)等人(2004)感染免疫(infect immun)72:4884-4887)肺炎球菌表面蛋白pspa(wo 02/091998)，铁摄取蛋白(wo 01/72337)，艰难梭菌(clostridium difficile)的毒素a或b(wo 00/61761)，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌粘附蛋白(psaa)，重组铜绿假单胞菌外毒素a(特别是其无毒突变(如外毒素a具有谷氨酸553处的取代(道格拉斯(douglas)等人(1987)细菌学杂志(j.bacteriol.)169(11):4967-4971))。其它蛋白质，如卵清蛋白、匙孔螺血氰蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(ppd)也可以用作载体蛋白。其它合适的载体蛋白包含灭活的细菌毒素，如霍乱类毒素(例如，如wo 2004/083251中所述)、大肠杆菌lt、大肠杆菌st和来自铜绿假单胞菌的外毒素a。
[0438]
在一优选实施例中，糖缀合物的载体蛋白独立地选自由以下组成的群组：tt、dt、dt突变(如crm
197
)、流感嗜血杆菌蛋白d、phtx、phtd、phtde融合物(特别是wo 01/98334和wo 03/054007中描述的那些)、解毒的肺炎链球菌溶血素、porb、n19蛋白、pspa、ompc、艰难梭菌的毒素a或b和psaa。
[0439]
在一实施例中，糖缀合物的载体蛋白是dt(白喉类毒素)。在另一实施例中，糖缀合物的载体蛋白是tt(破伤风类毒素)。
[0440]
在另一实施例中，糖缀合物的载体蛋白是pd(流感嗜血杆菌蛋白d；参见例如ep0594610b)。
[0441]
在一优选实施例中，纯化多糖或寡醣与crm
197
蛋白缀合。crm
197
蛋白是白喉毒素的
无毒形式，但在免疫学上与白喉毒素无法区分。crm
197
由被非产毒噬菌体β197
tox-感染的白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae)产生，所述噬菌体由产毒棒状噬菌体β的亚硝基胍诱变产生(内田等人(1971)自然新生物学(nature new biology)233:8-11)。crm
197
蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但不同之处在于其结构基因中的单个碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)。这种单个碱基变化导致成熟蛋白质中的氨基酸取代(谷氨酸取代甘氨酸)并消除白喉毒素的毒性。crm
197
蛋白是一种安全有效的t细胞依赖性糖类载体。关于crm
197
及其产生的更多细节可以在例如美国专利第5,614,382号中找到。
[0442]
在一实施例中，纯化的多糖或寡糖与crm
197
蛋白或crm
197
的a链缀合(参见cn103495161)。在一实施例中，纯化的多糖或寡糖与通过基因重组大肠杆菌表达获得的crm
197
的a链缀合(参见cn103495161)。
[0443]
优选地，糖缀合物中载体蛋白与多糖或寡糖的比介于1:5与5:1之间；例如介于1:0.5与4:1之间、介于1:1与3.5:1之间、介于1.2:1与3:1之间、介于1.5:1与2.5:1之间；例如介于1:2与2.5:1之间或介于1:1与2:1之间(w/w)。在一实施例中，糖缀合物中载体蛋白与多糖或寡糖的比是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1。
[0444]
在与载体蛋白缀合后，可以通过技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(就糖-蛋白质缀合物的量而言富集)。这些技术包含透析、浓缩/渗滤操作、切向流动过滤沉淀/洗脱、柱色谱(deae或疏水相互作用色谱)和深度过滤。
[0445]
组合物可包含少量游离载体。当给定的载体蛋白在本发明的组合物中以游离和缀合形式存在时，非缀合形式优选不超过整个组合物中载体蛋白总量的5％，且更优选以少于2重量％存在。
[0446]
2.2免疫原性组合物
[0447]
在一实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括本文公开的任何纯化的多糖和/或糖缀合物。
[0448]
在一实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括本文公开的任何糖缀合物。
[0449]
在一实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括在2.1部分中公开的1至25种不同的糖缀合物。
[0450]
在一实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自不同肺炎链球菌血清型的1至25种糖缀合物(1至25种肺炎球菌缀合物)。在一个实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一个实施例中，免疫原性组合物包括来自16或20种不同肺炎链球菌血清型的糖缀合物。在一实施例中，免疫原性组合物是7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20价肺炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是14、15、16、17、18或19价肺炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是16价肺炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是19价肺炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是20价肺炎球菌缀合物组合物。
[0451]
在一实施例中，所述免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型4、6b、9v、14、18c、19f和23f的糖缀合物。
[0452]
在一实施例中，所述免疫原性组合物另外包括来自肺炎链球菌血清型1、5和7f的
糖缀合物。
[0453]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型6a和19a的糖缀合物。
[0454]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物。
[0455]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型22f和33f的糖缀合物。
[0456]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型8、10a、11a、12f和15b的糖缀合物。
[0457]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型2的糖缀合物。
[0458]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型9n的糖缀合物。
[0459]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型17f的糖缀合物。
[0460]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型20的糖缀合物。
[0461]
在一实施例中，本发明的免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌血清型8、10a、11a、12f、15b、22f和33f的糖缀合物。
[0462]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型2的糖缀合物。
[0463]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型9n的糖缀合物。
[0464]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型17f的糖缀合物。
[0465]
在一实施例中，上文免疫原性组合物中的任一种另外包括来自肺炎链球菌血清型20的糖缀合物。
[0466]
然而，在一优选实施例中，糖类各自单独与蛋白质载体的不同分子(蛋白质载体的每个分子仅具有一种类型的糖与其缀合)缀合。在所述实施例中，据称荚膜糖类单独与载体蛋白缀合。优选地，上文免疫原性组合物的所有糖缀合物单独与载体蛋白缀合。
[0467]
在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型22f的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型33f的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型15b的糖缀合物与crm197缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型12f的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型10a的糖缀合物与crm197缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型11a的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型8的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型4、6b、9v、14、18c、19f和23f的糖缀合物与crm
197
缀合。在任
何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型1、5和7f的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型6a和19a的糖缀合物与crm
197
缀合。在任何上述免疫原性组合物的一实施例中，来自肺炎链球菌血清型3的糖缀合物与crm
197
缀合。
[0468]
在一实施例中，任何上述免疫原性组合物的糖缀合物全部单独与crm
197
缀合。
[0469]
在一实施例中，任何上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6b、7f、9v、14和/或23f的糖缀合物单独与pd缀合。
[0470]
在一实施例中，任何上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型18c的糖缀合物与tt缀合。
[0471]
在一实施例中，任何上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型19f的糖缀合物与dt缀合。
[0472]
在一实施例中，任何上述免疫原性组合物的来自肺炎链球菌血清型1、4、5、6b、7f、9v、14和/或23f的糖缀合物单独与pd缀合，来自肺炎链球菌血清型18c的糖缀合物与tt缀合，且来自肺炎链球菌血清型19f的糖缀合物与dt缀合。
[0473]
在一实施例中，上述免疫原性组合物包括8至20种不同的肺炎链球菌血清型。
[0474]
在一实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自不同脑膜炎奈瑟菌血清组的1至5种糖缀合物(1至5种脑膜炎球菌缀合物)。在一个实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自1、2、3、4或5种不同脑膜炎奈瑟菌血清组的糖缀合物。在一个实施例中，免疫原性组合物包括4或5种不同脑膜炎奈瑟菌。在一实施例中，免疫原性组合物是1、2、3、4或5价脑膜炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是2价脑膜炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是4价脑膜炎球菌缀合物组合物。在一实施例中，免疫原性组合物是5价脑膜炎球菌缀合物组合物。
[0475]
在一实施例中，免疫原性组合物包括缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组y荚膜糖类(meny)和/或缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组c荚膜糖类(menc)。
[0476]
在一实施例中，免疫原性组合物包括缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组a荚膜糖类(mena)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组w135荚膜糖类(menw135)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组y荚膜糖类(meny)和/或缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组c荚膜糖类(menc)。
[0477]
在一实施例中，免疫原性组合物包括缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组w135荚膜糖类(menw135)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组y荚膜糖类(meny)和/或缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组c荚膜糖类(menc)。
[0478]
在一实施例中，免疫原性组合物包括缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组a荚膜糖类(mena)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组w135荚膜糖类(menw135)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组y荚膜糖类(meny)、缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组c荚膜糖类(menc)和/或缀合的脑膜炎奈瑟菌血清组x荚膜糖类(menx)。
[0479]
在一些实施例中，本文公开的免疫原性组合物还可包括至少一种、两种或三种佐剂。在一些实施例中，本文公开的免疫原性组合物还可包括一种佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。抗原可以主要作为一种递送系统，主要作为一种免疫调节剂，或者兼具两者的强大特征。合适的佐剂包括那些适用于包含人类的哺乳动物的佐剂。
[0480]
可用于人类的已知合适的递送系统类型佐剂的实例包含但不限于明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳液，如mf59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(吐温(tween)80)、0.5％w/v脱水山梨糖醇三油酸酯(span 85))，油包水乳液，如蒙塔尼德(montanide)，和聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plg)微粒或纳米颗粒。
[0481]
在一实施例中，本文公开的免疫原性组合物包括铝盐(明矾)作为佐剂(例如，磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)。在一优选实施例中，本文公开的免疫原性组合物包括磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂。
[0482]
增强如本文所公开的免疫原性组合物的有效性的其它示例性佐剂包含但不限于：(1)水包油乳液调配物(有或没有其它特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如(a)saf，含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普朗尼克(pluronic)嵌段聚合物l121和thr-mdp，微流化成亚微米乳液或涡旋以产生较大粒径的乳液，和(b)ribi
tm
佐剂系统(ras)，(瑞比免疫化学公司(ribi immunochem)，蒙大拿州汉密尔顿)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一或多种细菌细胞壁成分，如单磷酰脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)，优选mpl cws(detox
tm
)；(2)可以使用皂苷佐剂，如qs21、stimulon
tm
(剑桥生命科学(cambridge bioscience)，马萨诸塞州伍斯特)、(isconova公司，瑞典)或(联邦血清试验室(commonwealth serum laboratories)，澳大利亚)，或由其产生的颗粒，如iscoms(免疫刺激复合物)，其中iscoms可不含额外的洗涤剂(例如wo 00/07621)；(3)完全弗氏(freund's)佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)；(4)细胞介素，如白介素(例如，il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12(例如，wo 99/44636))、干扰素(例如，γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)等；(5)单磷酰脂质a(mpl)或3-o-去酰基化mpl(3dmpl)(参见例如，gb-2220221、ep0689454)，当与肺炎球菌糖类一起使用时，任选在基本上不存在明矾的情况下(参见例如，wo 00/56358)；(6)3dmpl与例如qs21和/或水包油乳液的组合(参见例如ep0835318、ep0735898、ep0761231)；(7)聚氧化乙烯醚或聚氧化乙烯酯(参见例如wo 99/52549)；(8)聚氧化乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇组合(例如，wo 01/21207)或聚氧化乙烯烷基醚或酯表面活性剂与如辛苯聚醇的至少一种另外的非离子表面活性剂组合(例如，wo 01/21152)；(9)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，cpg寡核苷酸)(例如，wo 00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(参见例如，wo 00/23105)；(11)皂苷和水包油乳液(例如，wo 99/11241)；(12)皂苷(例如，qs21) 3dmpl im2(任选地 固醇)(例如，wo 98/57659)；(13)其它作为免疫刺激剂以增强组合物功效的物质。胞壁酰肽包含n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰基-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-25乙酰基-去甲胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)、n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰氨基-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺mtp-pe)等。
[0483]
在本发明的一实施例中，如本文所公开的免疫原性组合物包括cpg寡核苷酸作为佐剂。
[0484]
免疫原性组合物可以配制成液体形式(即溶液或悬浮液)或冻干形式。液体调配物可以有利地直接从它们的包装形式给药，因此理想的用于注射，而不需要在水性介质中复水，如另外本发明的冻干组合物所需要。
[0485]
本公开的免疫原性组合物的调配可以使用本领域公认的方法来完成。举例来说，
单独的多糖和/或缀合物可以与生理学上可接受的媒剂一起调配以制备组合物。此类媒剂的例子包含但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
[0486]
本公开提供一种免疫原性组合物，其包括本文公开的多糖或糖缀合物的任何组合以及医药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。
[0487]
在一实施例中，本公开的免疫原性组合物为液体形式，优选为水性液体形式。
[0488]
本公开的免疫原性组合物可包括以下的一或多种：缓冲液、盐、二价阳离子、非离子洗涤剂、如糖的冷冻保护剂、和如自由基清除剂或螯合剂的抗氧化剂，或其任意多种组合。
[0489]
在一实施例中，本公开的免疫原性组合物包括缓冲液。在一实施例中，所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pka。在一些实施例中，缓冲液是磷酸盐、丁二酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在某些实施例中，缓冲液是最终浓度为1mm至10mm的丁二酸盐。在一个特定实施例中，丁二酸盐缓冲液的最终浓度是约5mm。
[0490]
在一实施例中，本公开的免疫原性组合物包括盐。在一些实施例中，盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。在一个特定实施例中，盐是氯化钠。在一个特定实施例中，本发明的免疫原性组合物包括150mm的氯化钠。
[0491]
在一实施例中，本公开的免疫原性组合物包括表面活性剂。在一实施例中，表面活性剂选自由以下组成的群组：聚山梨醇酯20(tween
tm
20)、聚山梨醇酯40(tween
tm
40)、聚山梨醇酯60(tween
tm
60)、聚山梨醇酯65(tween
tm
65)、聚山梨醇酯80(tween
tm
80)、聚山梨醇酯85(tween
tm
85)、triton
tm n-101、triton
tm x-100、辛苯醇醚(oxtoxynol)40、壬苯醇醚(nonoxynol)-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(peg-15、solutol h 15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(el)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆(poloxamer)。在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯80重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯80(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度是1％聚山梨醇酯80(w/w)。
[0492]
在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯20。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯20的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯20重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯20的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯20重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯20的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯20重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯20的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯20(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯20的最终浓度是1％聚山梨醇酯20(w/w)。
[0493]
在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯40。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯40的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯40重量比(w/w)。一些所述
实施例中，调配物中聚山梨醇酯40的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯40重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯40的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯40重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯40的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯40(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯40的最终浓度是1％聚山梨醇酯40(w/w)。
[0494]
在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯60。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯60的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯60重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯60的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯60重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯60的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯60重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯60的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯60(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯60的最终浓度是1％聚山梨醇酯60(w/w)。
[0495]
在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯65。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯65的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯65重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯65的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯65重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯65的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯65重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯65的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯65(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯65的最终浓度是1％聚山梨醇酯65(w/w)。
[0496]
在一个特定实施例中，表面活性剂是聚山梨醇酯85。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯85的最终浓度为至少0.0001％至10％聚山梨醇酯85重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯85的最终浓度为至少0.001％至1％聚山梨醇酯85重量比(w/w)。在一些所述实施例中，调配物中聚山梨醇酯85的最终浓度为至少0.01％至1％聚山梨醇酯85重量比(w/w)。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯85的最终浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％聚山梨醇酯85(w/w)。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯85的最终浓度是1％聚山梨醇酯85(w/w)。
[0497]
在某些实施例中，本公开的免疫原性组合物具有5.5至7.5的ph，更优选5.6至7.0的ph，甚至更优选5.8至6.0的ph。
[0498]
在一个实施例中，本公开提供一种容器，其装填有本文所公开的任何一种免疫原性组合物。在一个实施例中，容器选自由以下组成的群组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、袋子、罐子、安瓿、盒子和一次性笔。在某些实施例中，容器经硅化。
[0499]
在一实施例中，本公开的容器由玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)和/或聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)制成。在一实施例中，本公开的容器由玻璃制成。
[0500]
在一个实施例中，本公开提供一种注射器，其装填有本文所公开的任何一种免疫原性组合物。在某些实施例中，注射器经硅化和/或由玻璃制成。
[0501]
用于注射的本发明的免疫原性组合物的典型剂量具有0.1ml至2ml的体积，更优选0.2ml至1ml，甚至更优选约0.5ml的体积。
[0502]
2.3用作抗原
[0503]
通过本发明的方法纯化的多糖和本文公开的缀合物可以用作抗原。举例来说，它
们可以是疫苗的一部分。
[0504]
因此，在一实施例中，通过本发明的方法纯化的多糖或使用所述多糖获得的糖缀合物用于在个体中产生免疫反应。在一个方面，个体是哺乳动物，如人类、猫、羊、猪、马、牛或狗。在一个方面，个体是人类。
[0505]
在一实施例中，通过本发明的方法纯化的多糖、使用所述多糖获得的糖缀合物或本文所公开的免疫原性组合物用于疫苗中。
[0506]
在一实施例中，通过本发明的方法纯化的多糖、使用所述多糖获得的糖缀合物或本文所公开的免疫原性组合物用作药剂。
[0507]
本文所述的免疫原性组合物可用于各种治疗或预防性方法以预防、治疗或改善个体的细菌感染、疾病或病状。具体来说，本文所述的免疫原性组合物可用于预防、治疗或改善个体的肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌或肺炎克雷伯菌感染、疾病或病状。
[0508]
因此，在一个方面，本公开提供一种预防、治疗或改善个体中与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌或肺炎克雷伯菌相关的感染、疾病或病状的方法，其包括向个体投与免疫学有效量的本公开的免疫原性组合物(特别是包括相应多糖或其糖缀合物的免疫原性组合物)。
[0509]
在一实施例中，本公开提供一种诱发个体对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌或肺炎克雷伯菌的免疫反应的方法，其包括向个体投与免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物(特别是包括相应多糖或其糖缀合物的免疫原性组合物)。
[0510]
在一实施例中，本文所公开的免疫原性组合物用作疫苗。在此类实施例中，本文所述的免疫原性组合物可用于预防个体中的肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌或无乳链球菌感染。因此，在一个方面，本公开提供一种在个体中预防由肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌或肺炎克雷伯菌感染的方法，其包括向个体投与免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物。
[0511]
在一个方面，个体是哺乳动物，如人类、猫、羊、猪、马、牛或狗。在一个方面，个体是人类。
[0512]
本公开的免疫原性组合物可以用于保护或治疗易受肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、b型流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌或肺炎克雷伯菌感染的人，借助通过全身或粘膜途径投与免疫原性组合物。在一实施例中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径投与。在一实施例中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内、腹膜内、皮内或皮下注射投与。在一实施例中，本文公开的免疫原性组合物通过肌内或皮下注射投与。
[0513]
在一些情况下，只需要少到一剂根据本公开的免疫原性组合物，但在某些情况下，如免疫缺陷较大的情况，可以给予第二剂、第三剂或第四剂。在初次接种疫苗后，个体可以接受一或多次间隔充分的加强免疫。
[0514]
在一实施例中，根据本公开的免疫原性组合物的疫苗接种安排是单次剂量。
[0515]
在一实施例中，根据本公开的免疫原性组合物的疫苗接种安排是多剂量安排。
[0516]
3.来源于大肠杆菌的糖类
[0517]
在一个实施例中，糖类是在重组革兰氏阴性细菌中产生的。在一个实施例中，糖类是在重组大肠杆菌细胞中产生的。在一个实施例中，糖类是在重组沙门氏菌(salmonella)细胞中产生的。示例性细菌包含大肠杆菌o25k5h1、大肠杆菌bd559、大肠杆菌gar2831、大肠杆菌gar865、大肠杆菌gar868、大肠杆菌gar869、大肠杆菌gar872、大肠杆菌gar878、大肠杆菌gar896、大肠杆菌gar1902、大肠杆菌o25a etc nr-5、大肠杆菌o157:h7:k-、鼠伤寒血清型肠道沙门氏菌菌株lt2、大肠杆菌gar2401、肠炎血清型肠道沙门氏菌cvd 1943、鼠伤寒血清型肠道沙门氏菌cvd 1925、副伤寒血清型肠道沙门氏菌a cvd 1902和福氏志贺氏菌(shigella flexneri)cvd 1208s。在一个实施例中，细菌不是大肠杆菌gar2401。这种糖类生成的遗传方法允许有效产生o-多糖和o-抗原分子作为疫苗成分。
[0518]
如本文所用，术语“wzz蛋白”是指链长决定多肽，例如wzzb、wzz、wzz
sf
、wzz
st
、fepe、wzz
fepe
、wzzl和wzz2。示例性wzz基因序列的genbank登录号是af011910用于e4991/76，af011911用于f186，af011912用于m70/1-1，af011913用于79/311，af011914用于bi7509-41，af011915用于c664-1992，af011916用于c258-94，af011917用于c722-89，且af011919用于edl933。g7和bi316-41 wzz基因序列的genbank登录号分别为u39305和u39306。示例性wzz基因序列的其它genbank登录号是np_459581用于肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒血清型菌株lt2 fepe；aig66859用于大肠杆菌o157:h7菌株edl933 fepe；np_461024用于肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒血清型菌株lt2 wzzb，np_416531用于大肠杆菌k-12亚株mg1655 wzzb，np_415119用于大肠杆菌k-12亚株mg1655 fepe。在优选实施例中，wzz家族蛋白是wzzb、wzz、wzz
sf
、wzz
st
、fepe、wzz
fepe
、wzz1和wzz2中的任何一种，最优选wzzb，更优选fepe。
[0519]
示例性wzzb序列包含：
[0520]
》o25b 2401wzzb
[0521]
mrvennnvsgqnhdpeqidlidllvqlwrgkmtiiisvivaialaigylavakekwtstaiitqpdvgqiagynnamnviygqaapkvsdlqetligrfssafsalaetldnqeepekltiepsvknqqlpltvsyvgqtaegaqmklaqyiqqvddkvnqelekdlkdnialgrknlqdslrtqevvaqeqkdlrirqiqealqyanqeqvtkpqvqqtedvtqdtlfllgsealesmikheatrplvfssnyyqtrqnlldieslkvddldihayryvmkptlpirrdspkkaitlilavllggmvgagivlgrnalrnynak(seq id no:20)
[0522]
》o25a:k5:h1 wzzb
[0523]
mrvennnvsgqnndpeqidlidllvqlwrgkmtiiisvivaialaigylavakekwtstaiitqpdvgqiagynnamnviygqaapkvsdlqetligrfssafsalaetldnqdepekltiepsvknqqlpltvsyvgqtaegaqmklaqyiqqvddkvnqelekdlkdnialgrknlqdslrtqevvaqeqkdlrirqiqealqyanqaqvtkpqiqqtgeditqdtlfllgsealesmikheatrplvfspnyyqtrqnlldieslkvddldihayryvmkptlpirrdspkkaitlilavllggmvgagivlgrnalrnynak(seq id no:21)
[0524]
》o25a etec atcc wzzb
[0525]
mrvennnvsgqnhdpeqidlidllvqlwrgkmtiiisvvvaialaigylavakekwtstaiitqpdvgqiagynnamnviygqaapkvsdlqetligrfsfafsalaetldnqkepekltiepsvknqqlpltvsyvgqtaedaqmklaqyiqqvddkvnqelekdlkdnlalgrknlqdslrtqevvaqeqkdlrirqiqealqyanqaqvtkpqiqqtgeditqdtlfllgsealesmikheatrplvfspnyyqtrqnlldienlkvddldihayryvmkptlpirrdspkka
itlilavllggmvgagivlgrnalrnynsk(seq id no:22)
[0526]
》k12 w3110 wzzb
[0527]
mrvennnvsgqnhdpeqidlidllvqlwrgkmtiiisvivaialaigylavakekwtstaiitqpdvgqiagynnamnviygqaapkvsdlqetligrfssafsalaetldnqeerekltiepsvknqqlpltvsyvgqtaegaqmklaqyiqqvddkvnqelekdlkdnialgrknlqdslrtqevvaqeqkdlrirqiqealqyanqaqvtkpqiqqtgeditqdtlfllgsealesmikheatrplvfspnyyqtrqnlldieslkvddldihayryvmkpmlpirrdspkkaitlilavllggmvgagivlgrnalrnynak(seq id no:23)
[0528]
》沙门氏菌lt2 wzzb
[0529]
mtvdsntssgrgndpeqidlielllqlwrgkmtiivaviiaillavgylmiakekwtstaiitqpdaaqvatytnalnvlyggnapkisevqanfisrfssafsalsevldnqkerekltieqsvkgqalplsvsyvsttaegaqrrlaeyiqqvdeevakelevdlkdnitlqtktlqesletqevvaqeqkdlrikqieealryadeakitqpqiqqtqdvtqdtmfllgsdalksmiqneatrplvfspayyqtkqtlldiknlkvtadtvhvyryvmkptlpvrrdspktaitlvlavllggmigagivlgrnalrsykpkal(seq id no:24)
[0530]
示例性fepe序列包含：
[0531]
》o25b gar2401 fepe
[0532]
msslnikqgsdahfpdyplaspsnneidllnlisvlwrakktvmavvfafacagllisfilpqkwtsaavvtppepvqwqeleksftklrvldldikidrteafnlfikkfqsvslleeylrsspyvmdqlkeakideldlhraivalsekmkavddnaskkkdepslytswtlsftaptseeaqtvlsgyidyistlvvkeslenvrnkleiktqfekeklaqdriktknqldaniqrlnysldianaagikkpvysngqavkddpdfsislgadgierkleiekavtdvaelngelrnrqylveqltkahvndvnftpfkyqlspslpvkkdgpgkaiivilsaliggmvacggvllryamasrkqdammadhlv(seq id no:15)
[0533]
》o25a:k5:h1 fepe
[0534]
msslnikqgseahfpeyplaspsnneidllnlievlwrakktvmavvfafacagllisfilpqkwtsaavvtppepvqwqelektftklrvldldikidrteafnlfikkfqsvslleeylrsspyvmdqlkeakidpldlhraivalsekmkavddnaskkkdesalytswtlsftaptseeaqkvlagyidyisalvvkesienvrnkleiktqfekeklaqdriktknqldaniqrlnysldianaagikkpvysngqavkddpdfsislgadgierkleiekavtdvaelngelrnrqylveqltktnindvnftpfkyqlrpslpvkkdgqgkaiivilsalvggmvacggvllrhamasrkqdammadhlv(seq id no:16)
[0535]
》o25a etec atcc fepe
[0536]
msslnikqgsdahfpdyplaspsnneidllnlisvlwrakktvmavvfafacagllisfilpqkwtsaavvtppepvqwqeleksftklrvldldikidrteafnlfikkfqsvslleeylrsspyvmdqlkeakideldlhraivalsekmkavddnaskkkdepslytswtlsftaptseeaqtvlsgyidyistlvvkeslenvrnkleiktqfekeklaqdriktknqldaniqrlnysldianaagikkpvysngqavkddpdfsislgadgierkleiekavtdvaelngelrnrqylveqltkahvndvnftpfkyqlspslpvkkdgpgkaiivilsaliggmvacggvllryamasrkqdammadhlv(seq id no:17)
[0537]
》o157 fepe
[0538]
msslnikqgsdahfpdyplaspsnneidllnlisvlwrakktvmavvfafacagllisfilpqkwtsaavvtppepvqwqelektftklrvldldikidrteafnlfikkfqsvslleeylrsspyvmdqlkeakideldlhraivalsekmkavddnaskkkdepslytswtlsftaptseeaqtvlsgyidyisalvvkesienvrnkleiktqfeke
klaqdrikmknqldaniqrlnysldianaagikkpvysngqavkddpdfsislgadgierkleiekavtdvaelngelrnrqylveqltkanindvnftpfkyqlspslpvkkdgpgkaiivilsaliggmvacgsvllryamasrkqdammadhlv(seq id no:18)
[0539]
》沙门氏菌lt2 fepe
[0540]
mpslnvkqeknqsfagyslppansheidlfslievlwqakrrilatvfafacvglllsfllpqkwtsqaivtpaesvqwqglertltalrvldmevsvdrgsvfnlfikkfsspslleeylrsspyvmdqlkgaqideqdlhraivllsekmkavdsnvgkknetslftswtlsftaptreeaqkvlagyiqyisdivvketlenirnqleiktryeqeklamdrvrlknqldaniqrlhysleianaagikrpvysngqavkddpdfsislgadgisrkleiekgvtdvaeidgdlrnrqyhveqlaamnvsdvkftpfkyqlspslpvkkdgpgkaiiiilaaliggmmacggvllrhamvsrkmenalaiderlv(seq id no:19)
[0541]
在一些实施例中，可通过在革兰氏阴性细菌中表达(不必过表达)来自革兰氏阴性细菌的wzz家族蛋白(例如fepe)和/或通过关闭(即抑制、删除、去除)第二个wzz基因(例如wzzb)来产生修饰的糖类(与相应的野生型糖类相比被修饰)，以产生含有中等或长o-抗原链的高分子量糖类，如脂多糖。举例来说，修饰的糖类可以通过表达(不必过表达)wzz2和关闭wzz1来产生。或者，在替代方案中，修饰的糖类可以通过表达(不必过表达)wzzfepe和关闭wzzb来产生。在另一实施例中，修饰的糖类可以通过表达(不必过表达)wzzb但关闭wzzfepe来产生。在另一实施例中，修饰的糖类可以通过表达fepe来产生。优选地，wzz家族蛋白来源于与宿主细胞异源的菌株。
[0542]
在一个方面，本发明涉及通过在革兰氏阴性细菌中表达wzz家族蛋白，优选fepe以产生含有中等或长o-抗原链的高分子量糖类而产生的糖类，与相应的野生型o-多糖相比，其增加至少1、2、3、4或5个重复单元。在一个方面，本发明涉及由革兰氏阴性细菌在表达(不必过表达)来自革兰氏阴性细菌的wzz家族蛋白(例如wzzb)以产生含有中等或长o-抗原链的高分子量糖类的培养物中产生的糖类，与相应的野生型o-抗原相比，所述抗原链增加至少1、2、3、4或5个重复单元。与相应的野生型糖类相比，重复单元数量增加的其它示例性糖类参见下文对o-多糖和o-抗原的描述。所需链长是在给定疫苗构建体的情况下产生改善或最大免疫原性的链长。
[0543]
在另一实施例中，糖类包含选自表1的任何一个式，其中糖类中重复单元的数量n比相应的野生型o-多糖中的重复单元的数量大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型o-多糖相比，糖类包含增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元。确定糖类长度的方法是所属领域中已知的。此类方法包含核磁共振、质谱和尺寸排阻色谱。
[0544]
在一优选实施例中，本发明涉及在重组大肠杆菌宿主细胞中产生的糖类，其中用于内源性wzz o-抗原长度调节子的基因(例如wzzb)缺失并被来自与重组大肠杆菌宿主细胞异源的革兰氏阴性细菌(例如沙门氏菌fepe)的(第二)wzz基因取代，以产生高分子量糖类，如脂多糖，含有中等或长o-抗原链。在一些实施例中，重组大肠杆菌宿主细胞包含来自
沙门氏菌，优选来自肠道沙门氏菌的wzz基因。
[0545]
在一个实施例中，宿主细胞包含wzz家族蛋白的异源基因作为稳定维持的质粒载体。在另一实施例中，宿主细胞包含wzz家族蛋白的异源基因作为宿主细胞染色体dna中的整合基因。在大肠杆菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法和将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞染色体中的方法是所属领域中已知的。在一个实施例中，宿主细胞包含o-抗原的异源基因作为稳定维持的质粒载体。在另一实施例中，宿主细胞包含o-抗原的异源基因作为宿主细胞染色体dna中的整合基因。在大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌宿主细胞中稳定表达质粒载体的方法是所属领域中已知的。将异源基因整合到大肠杆菌宿主细胞和沙门氏菌宿主细胞的染色体中的方法是所属领域中已知的。
[0546]
在一个方面，重组宿主细胞在包括碳源的培养基中培养。用于培养大肠杆菌的碳源是所属领域中已知的。示例性碳源包含糖醇、多元醇、醛醇糖或酮糖，包含但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸、丁二酸盐和甲胺。在一优选实施例中，培养基包含葡萄糖。在一些实施例中，培养基包含多元醇或醛醇糖，例如甘露醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖和阿拉伯糖作为碳源。所有碳源可以在培养开始前添加到培养基中，或者可以在培养期间逐步添加或连续添加。
[0547]
用于重组宿主细胞的示例性培养基包含选自以下任一种的成分：kh2po4、k2hpo4、(nh4)2so4、柠檬酸钠、na2so4、天冬氨酸、葡萄糖、mgso4、feso
4-7h2o、na2moo
4-2h2o、h3bo3、cocl
2-6h2o、cucl
2-2h2o、mncl
2-4h2o、zncl2和cacl
2-2h2o。优选地，培养基包含kh2po4、k2hpo4、(nh4)2so4、柠檬酸钠、na2so4、天冬氨酸、葡萄糖、mgso4、feso
4-7h2o、na2moo
4-2h2o、h3bo3、cocl
2-6h2o、cucl
2-2h2o、mncl
2-4h2o、zncl2和cacl
2-2h2o。
[0548]
本文使用的培养基可以是固体或液体、合成的(即人造的)或天然的，并且可以包含用于培育重组宿主细胞的足够营养物。优选地，培养基是液体培养基。
[0549]
在一些实施例中，培养基还可包含合适的无机盐。在一些实施例中，培养基还可以包含微量营养素。在一些实施例中，培养基还可以包含生长因子。在一些实施例中，培养基还可以包含额外碳源。在一些实施例中，培养基还可以包含合适的无机盐、微量营养素、生长因子和补充碳源。适合于培养大肠杆菌的无机盐、微量营养素、生长因子和补充碳源是所属领域中已知的。
[0550]
在一些实施例中，培养基可视需要包含额外的组分，如蛋白胨、n-z胺、酶促大豆氢化物、额外的酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源和各种维生素。在一些实施例中，培养基不包含此类额外的组分，如蛋白胨、n-z胺、酶促大豆氢化物、额外的酵母提取物、麦芽提取物、补充碳源和各种维生素。
[0551]
合适的补充碳源的说明性实例包含但不限于其它碳水化合物，如葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物和糖蜜；有机酸，如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和富马酸；和醇类，如甘油、肌醇、甘露醇和山梨糖醇。
[0552]
在一些实施例中，培养基还包含氮源。适合于培养大肠杆菌的氮源是所属领域中已知的。合适的氮源的说明性实例包含但不限于氨，包含氨气和氨水；无机或有机酸的铵盐，如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐及其它含氮物质，包含纯或粗制的氨基酸、肉提取物、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼
水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇酵母馏出物、大豆粉、棉籽粉等。
[0553]
在一些实施例中，培养基包含无机盐。合适的无机盐的说明性实例包含但不限于钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、锰盐、铁盐、钴盐、锌盐、铜盐、钼盐、钨盐及其它微量元素盐，以及磷酸盐。
[0554]
在一些实施例中，培养基包含适当的生长因子。适当的微量营养素、生长因子等的说明性实例包含但不限于辅酶a、泛酸、吡哆醇-hcl、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、dl-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素b
12
、其它维生素、如半胱氨酸和羟脯氨酸的氨基酸、如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的碱、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸或r-氨基苯甲酸、烟酰胺、次氮基乙酸酯等，作为纯的或部分纯化的化合物或存在于天然材料中。可由所属领域技术人员根据所属领域中已知的方法和技术凭经验来确定量。
[0555]
在另一实施例中，本文所述的修饰的糖类(与相应的野生型糖类相比)是合成产生的，例如在体外。糖类的合成生成或合成可有助于避免成本和时间密集的生产工艺。在一个实施例中，糖类是以合成方式合成的，例如，通过使用顺序糖基化策略或顺序糖基化和[3 2]嵌段合成策略的组合，由适当保护的单糖中间体合成。举例来说，硫糖苷类和糖基三氯乙酰亚胺酯衍生物可用作糖基化中的糖基供体。在一个实施例中，以合成方式体外合成的糖类具有与通过重组方式，如通过操作上述wzz家族蛋白产生的糖类相同的结构。
[0556]
(通过重组或合成方式)产生的糖类包含来源于任何大肠杆菌血清型的结构，所述血清型包含例如以下大肠杆菌血清型中的任何一种：o1(例如o1a、o1b和o1c)、o2、o3、o4(例如o4:k52和o4:k6)、o5(例如o5ab和o5ac(菌株180/c3))、o6(例如o6:k2；k13；k15和o6:k54)、o7、o8、o9、o10、o11、o12、o13、o14、o15、o16、o17、o18(例如o18a、o18ac、o18a1、o18b和o18b1)、o19、o20、o21、o22、o23(例如o23a)、o24、o25(例如o25a和o25b)、o26、o27、o28、o29、o30、o32、o33、o34、o35、o36、o37、o38、o39、o40、o41、o42、o43、o44、o45(例如o45和o45rel)、o46、o48、o49、o50、o51、o52、o53、o54、o55、o56、o57、o58、o59、o60、o61、o62、62d1、o63、o64、o65、o66、o68、o69、o70、o71、o73(例如o73(菌株73-1))、o74、o75、o76、o77、o78、o79、o80、o81、o82、o83、o84、o85、o86、o87、o88、o89、o90、o91、o92、o93、o95、o96、o97、o98、o99、o100、o101、o102、o103、o104、o105、o106、o107、o108、o109、o110、0111、o112、o113、o114、o115、o116、o117、o118、o119、o120、o121、o123、o124、o125、o126、o127、o128、o129、o130、o131、o132、o133、o134、o135、o136、o137、o138、o139、o140、o141、o142、o143、o144、o145、o146、o147、o148、o149、o150、o151、o152、o153、o154、o155、o156、o157、o158、o159、o160、o161、o162、o163、o164、o165、o166、o167、o168、o169、o170、o171、o172、o173、o174、o175、o176、o177、o178、o179、o180、o181、o182、o183、o184、o185、o186和o187。
[0557]
通常通过所属领域中已知的方法，例如透析、浓缩操作、渗滤操作、切向流动过滤、沉淀、洗脱、离心、沉淀、超滤、深度过滤和/或柱色谱(离子交换色谱、多模式离子交换色谱、deae和疏水相互作用色谱)来纯化单独的多糖(就多糖-蛋白质缀合物的量而言富集)。优选地，通过包含切向流动过滤的方法纯化多糖。
[0558]
纯化的多糖可以被活化(例如，化学活化)以使其能够反应(例如，直接与载体蛋白反应或通过如etec间隔基团的连接基团)，且随后掺入本发明的糖缀合物中，如本文进一步描述。
[0559]
在一个优选实施例中，本发明的糖类来源于大肠杆菌血清型，其中血清型是o25a。
在另一个优选实施例中，血清型是o25b。在另一个优选实施例中，血清型是o1a。在另一个优选实施例中，血清型是o2。在另一个优选实施例中，血清型是o6。在另一个优选实施例中，血清型是o17。在另一个优选实施例中，血清型是o15。在另一个优选实施例中，血清型是o18a。在另一个优选实施例中，血清型是o75。在另一个优选实施例中，血清型是o4。在另一个优选实施例中，血清型是o16。在另一个优选实施例中，血清型是o13。在另一个优选实施例中，血清型是o7。在另一个优选实施例中，血清型是o8。在另一个优选实施例中，血清型是o9。
[0560]
如本文所用，提及上面列出的任何血清型，是指涵盖所属领域中已知的重复单元结构(o-单元，如下所述)并且对于相应的血清型是独特的血清型。举例来说，术语“o25a”血清型(在所属领域中也称为血清型“o25”)是指涵盖表1中所示的式o25的血清型。作为另一实例，术语“o25b”血清型是指涵盖表1中所示的式o25b的血清型。
[0561]
如本文所用，除非另有说明，否则血清型在本文中统称，例如，术语式“o18”一般指涵盖式o18a、式o18ac、式18a1、式o18b和式o18b1。
[0562]
如本文所用，术语“o1”一般指涵盖包含根据表1的式名称中通用术语“o1”的式的种类，如式o1a、式o1a1、式o1b和式o1c中的任一种，每一种在表1所示。因此，“o1血清型”一般指涵盖式o1a、式o1a1、式o1b和式o1c中的任一种的血清型。
[0563]
如本文所用，术语“o6”一般指包含根据表1的式名称中通用术语“o6”的式的种类，如式o6:k2、k13、k15和o6:k54中的任一种，每一种在表1所示。因此，“o6血清型”一般指涵盖式6:k2、k13、k15和o6:k54中任一种的血清型。
[0564]
一般指包含根据表1的式名称中通用术语的式的种类的术语的其它实例包含：“o4”、“o5”、“o18”和“o45”。
[0565]
如本文所用，术语“o2”是指表1中所示的式o2。术语“o2 o-抗原”是指涵盖表1中所示的式o2的糖类。
[0566]
如本文所用，提及来自上文所列的血清型的o-抗原是指涵盖用相应血清型名称标记的式的糖类。举例来说，术语“o25b o-抗原”是指涵盖表1中所示的式o25b的糖类。
[0567]
作为另一实例，术语“o1 o-抗原”一般是指涵盖包含术语“o1”的式的糖类，如式o1a、式o1a1、式o1b和式o1c，每一种在表1所示。
[0568]
作为另一实例，术语“o6 o-抗原”一般是指涵盖包含术语“o6”的式的糖类，如式o6:k2、式o6:k13、式o6:k15和式o6:k54，每一种在表1所示。
[0569]
o-多糖
[0570]
如本文所用，术语“o-多糖”是指包含o-抗原的任何结构，只要所述结构不包含全细胞或脂质a。举例来说，在一个实施例中，o-多糖包含脂多糖，其中不结合脂质a。去除脂质a的步骤是所属领域中已知的且包含例如添加酸的热处理。示例性方法包含在100℃下用1％乙酸处理90分钟。此方法与将脂质a在去除时分离的方法相结合。分离脂质a的示例性方法包含超离心法。
[0571]
在一个实施例中，o-多糖是指由o-抗原组成的结构，在这种情况下，o-多糖与术语o-抗原同义。在一个优选实施例中，o-多糖是指包含o-抗原的重复单元但没有核心糖的结构。因此，在一个实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r1核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r2核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r3核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r4核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌k12
核心部分。在另一个优选实施例中，o-多糖是指包含o-抗原和核心糖的结构。在另一实施例中，o-多糖是指包含o-抗原、核心糖和kdo部分的结构。
[0572]
从lps纯化包含核心寡糖的o-多糖的方法是所属领域中已知的。举例来说，在lps纯化后，纯化的lps可通过在1％(v/v)乙酸中在100摄氏度下加热90分钟，然后在4摄氏度下以142,000
×
g超速离心5小时来水解。将含有o-多糖的上清液冷冻干燥并储存在4摄氏度。在某些实施例中，描述了能够简单纯化o-多糖的荚膜合成基因的缺失。
[0573]
o-多糖可以通过包含但不限于温和酸水解以从lps中去除脂质a的方法分离。其它实施例可以包含使用肼作为制备o-多糖的试剂。lps的制备可以通过所属领域已知的方法完成。
[0574]
在某些实施例中，提供从表达(不必过表达)wzz蛋白(例如wzzb)的野生型、修饰的或减毒的革兰氏阴性细菌菌株纯化的o-多糖用于结合疫苗。在优选实施例中，o-多糖链从表达(不必过表达)wzz蛋白的革兰氏阴性细菌菌株中纯化以用作疫苗抗原，作为缀合物或复合疫苗。
[0575]
在一个实施例中，o-多糖的分子量相比于相应的野生型o-多糖增加了约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多。在一优选实施例中，与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖的分子量增加了至少1倍和至多5倍。在另一实施例中，与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖的分子量增加了至少2倍和至多4倍。与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖的分子量增加优选与o-抗原重复单元数量的增加有关。在一个实施例中，o-多糖的分子量增加是因为wzz家族蛋白。
[0576]
在一个实施例中，与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖的分子量增加了约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100kda或更多。在一个实施例中，与相应的野生型o-多糖相比，本发明的o-多糖的分子量增加了至少1和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少5和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少12和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少15和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少18和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少21和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少22和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少30和至多200kda。在一个实施例中，分子量增加了至少1和至多100kda。在一个实施例中，分子量增加了至少5和至多100kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多100kda。在一个实施例中，分子量增加了至少12和至多100kda。在一个实施
例中，分子量增加了至少15和至多100kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多100kda。在一个实施例中，分子量增加了至少1和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少5和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少12和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少15和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少18和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少30和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多90kda。在一个实施例中，分子量增加了至少12和至多85kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多75kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多70kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多60kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多50kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多49kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多48kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多47kda。在一个实施例中，分子量增加了至少10和至多46kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多45kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多44kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多43kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多42kda。在一个实施例中，分子量增加了至少20和至多41kda。与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖的所述分子量增加优选与o-抗原重复单元数量的增加有关。在一个实施例中，o-多糖的分子量增加是因为wzz家族蛋白。
[0577]
在另一实施例中，o-多糖包含选自表1的任何一个式，其中o-多糖中的重复单元的数量n比相应的野生型o-多糖中的重复单元的数量大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型o-多糖相比，糖类包含增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元。
[0578]
o-抗原
[0579]
o抗原是革兰氏阴性细菌外膜脂多糖(lps)的一部分。o抗原位于细胞表面，是一种可变的细胞成分。o抗原的可变性为革兰氏阴性细菌的血清分型提供了基础。当前大肠杆菌血清分型方案包含o-多糖1至181。
[0580]
o-抗原包含寡糖重复单元(o-单元)，其野生型结构通常含有来自广泛糖类的二至八个残基。示例性大肠杆菌o-抗原的o-单元在表1中展示。示例性肺炎克雷伯菌o-抗原的o-单元在表1a中展示。
[0581]
在一个实施例中，本发明的糖类可以是一个寡糖单元。在一个实施例中，本发明的糖类是相关血清型的一个重复寡糖单元。在此类实施例中，糖类可以包含选自式o8、式o9a、式o9、式o20ab、式o20ac、式o52、式o97和式o101中的任一种的结构。
[0582]
在一个实施例中，本发明的糖类可以是寡糖。寡糖具有低数量的重复单元(通常为5-15个重复单元)并且通常以合成方式或通过多糖的水解而衍生。在此类实施例中，糖类可以包含选自式o8、式o9a、式o9、式o20ab、式o20ac、式o52、式o97和式o101中的任一种的结构。
[0583]
优选地，本发明的所有糖类和本发明的免疫原性组合物中的所有糖类都是多糖。由于抗原表面上存在的表位，高分子量多糖可以诱导某些抗体免疫反应。优选涵盖高分子量多糖的分离和纯化用于本发明的缀合物、组合物和方法。
[0584]
在一些实施例中，每个单独的o-抗原聚合物中的重复o单元的数量(以及因此聚合物链的长度和分子量)取决于wzz链长调节子，一种内膜蛋白。不同的wzz蛋白赋予不同范围的模态长度(4至》100个重复单元)。术语“模态长度”是指重复o单元的数量。革兰氏阴性细菌通常具有两种不同的wzz蛋白，它们赋予两种不同的oag模态链长度，一种更长，且一种更短。wzz家族蛋白(例如wzzb)在革兰氏阴性细菌中的表达(不必过表达)可以允许操纵o抗原长度，改变或偏向细菌产生某些长度范围的o抗原，以及提高高产大分子量脂多糖的生成。在一个实施例中，如本文所用的“短”模态长度是指重复o-单元的低数量，例如1-20。在一个实施例中，如本文所用的“长”模态长度是指重复o-单元的数量大于20且至多为40。在一个实施例中，如本文所用的“非常长”模态长度是指大于40个重复o-单元。
[0585]
在一个实施例中，生成的糖类与相应的野生型o-多糖相比，增加了至少10个重复单元、15个重复单元、20个重复单元、25个重复单元、30个重复单元、35个重复单元、40个重复单元、45个重复单元、50个重复单元、55个重复单元、60个重复单元、65个重复单元、70个重复单元、75个重复单元、80个重复单元、85个重复单元、90个重复单元、95个重复单元或100个重复单元。
[0586]
在另一实施例中，本发明的糖类与相应的野生型o-多糖相比增加了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。优选地，与相应的野生型o-多糖相比，糖类包含增加至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复单元。
[0587]
确定糖中重复单元数目的方法也是所属领域中已知的。举例来说，重复单元的数量(或式中的“n”)可以通过将多糖的分子量(不含核心糖或kdo残基的分子量)除以重复单元的分子量(即相应式中结构的分子量，例如表1所示，理论上可以计算为式中每个单糖的分子量之和)来计算。式中每个单糖的分子量是所属领域中已知的。例如，式o25b的重复单元的分子量约为862da。例如，式o1a的重复单元的分子量约为845da。例如，式o2的重复单元的分子量约为829da。例如，式o6的重复单元的分子量约为893da。在确定缀合物中重复单元的数量时，载体蛋白分子量和蛋白质:多糖比被考虑到计算中。如本文所定义，“n”是指多糖分子中重复单元的数量(在表1的括号中表示)。如所属领域已知的，在生物大分子中，重复结构可以散布有不完美重复的区域，例如缺失的分支。此外，所属领域已知从如细菌的天然来源分离和纯化的多糖在大小和分支上可能是异质的。在这种情况下，n可以代表群体中分子的n平均值或中值。
[0588]
在一个实施例中，与相应的野生型o-多糖相比，o-多糖增加至少一个o-抗原重复单元。o-抗原的重复单元在表1和表1a中展示。在一个实施例中，o-多糖包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个总重复单元。优选地，糖类具有总共至少3至至多80个重复单元。在另一实施例中，o-多糖与相应野生型o-多糖相比增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个重复单元。在一个实施例中，糖类包含o-抗原，其中任何o-抗原式(例如，表1中所示的式)中的n是至少1、2、3、4、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和至多200、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50的整数。可以组合任何最小值和任何最大值来定义范围。示例性范围包含例如至少1至至多1000、至少10至至多500且至少20至至多80，优选至多90。在一个优选实施例中，n是至少31至至多90。在一优选实施例中，n是40至90，更优选60至85。
[0589]
在一个实施例中，糖类包含o-抗原，其中o-抗原式中任一种的n是至少1且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少5且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少10且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少25且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少50且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少75且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少100且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少125且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少150且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少175且至多200。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少1且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少5且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少10且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少25且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少50且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少75且至多100。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少1且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少5且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少10且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少20且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少25且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少30且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少40且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少50且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少30且至多90。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多85。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多75。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多70。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多60。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多50。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多49。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多48。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多47。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少35且至多46。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少36且至多45。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少37且至多44。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n
是至少38且至多43。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少39且至多42。在一个实施例中，o-抗原式中任一种的n是至少39且至多41。
[0590]
举例来说，在一个实施例中，糖类中的n是31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90，最优选40。在另一实施例中，n是至少35至至多60。举例来说，在一个实施例中，n是35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中任一个，优选50。在另一个优选实施例中，n是至少55至至多75。举例来说，在一个实施例中，n是55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69，最优选60。
[0591]
糖类结构可以通过所属领域已知的方法和工具来确定，例如nmr，包含1d、1h和/或13c、2d tocsy、dqf-cosy、noesy和/或hmqc。
[0592]
在一些实施例中，缀合前的纯化多糖具有介于5kda与400kda之间的分子量。在其它此类实施例中，糖类具有介于10kda与400kda之间、介于5kda与400kda之间、介于5kda与300kda之间、介于5kda与200kda之间、介于5kda与150kda之间、介于10kda与100kda之间、介于10kda与75kda之间、介于10kda与60kda之间、介于10kda与40kda之间、介于10kda与100kda之间、10kda与200kda之间、介于15kda与150kda之间、介于12kda与120kda之间、介于12kda与75kda之间、介于12kda与50kda之间、介于12与60kda之间、介于35kda与75kda之间、介于40kda与60kda之间、介于35kda与60kda之间、介于20kda与60kda之间、介于12kda与20kda之间或介于20kda与50kda之间的分子量。在其它实施例中，多糖具有介于7kda至15kda、8kda至16kda、9kda至25kda、10kda至100、10kda至60kda、10kda至70kda、10kda至160kda、15kda至600kda、20kda至1000kda、20kda至600kda、20kda至400kda、30kda至1,000kda、30kda至60kda、30kda至50kda或5kda至60kda的分子量。涵盖任何上述范围内的任何整数作为本公开的实施例。
[0593]
如本文所用，术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过结合多角度激光散射检测器(malls)的尺寸排阻色谱法(sec)计算的分子量。
[0594]
在正常的纯化程序中，多糖的大小可以略微减小。此外，如本文所述，多糖可以在缀合前进行大小设定技术。可以采用机械或化学大小设定。可以使用乙酸进行化学水解。可以使用高压均匀化剪切进行机械大小设定。上述分子量范围是指缀合前(例如活化前)的纯化多糖。
[0595]
表1：大肠杆菌血清组/血清型和o-单元部分
[0596]
[0597]
[0598]
[0599]
[0600]
[0601]
[0602]
[0603]
[0604][0605]
β-d-6dmanhep2ac是2-o-乙酰基-6-脱氧-β-d-甘露-吡喃庚糖基。
[0606]
β-d-xulf是β-d-苏戊呋喃糖基。
[0607]
核心寡醣
[0608]
核心寡糖位于野生型大肠杆菌lps中的脂质a和o抗原外部区域之间。更具体地说，核心寡糖是多糖的一部分，包含野生型大肠杆菌中o-抗原与脂质a之间的键。所述键包含最内层的3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(kdo))残基的半缩酮官能团与脂质a的glcnac残基的羟基之间的酮苷键。核心寡糖区域在野生型大肠杆菌菌株中显示出高度相似性。其通常包含有限数目的糖。核心寡醣包含内部核心区和外部核心区。
[0609]
更具体地说，内部核心主要由l-甘油-d-甘露-庚糖(庚糖)和kdo残基组成。内部核心高度保守。kdo残基包含下式kdo：
[0610][0611]
核心寡糖的外部区域比内部核心区域展现出更多的差异，且此区域的差别区分了大肠杆菌中的五种化学型：r1、r2、r3、r4和k-12。hepii是内部核心寡糖的最后一个残基。虽然所有外部核心寡糖都共享一个结构主题，具有(己糖)3碳水化合物主链和两个侧链残基，但主链中己糖的顺序以及侧链残基的性质、位置和键都可能不同。r1和r4外部核心寡糖的结构高度相似，仅在单个β-键联残基上有所不同。
[0612]
野生型大肠杆菌的核心寡糖在所属领域中根据远端寡糖的结构分为五种不同的化学型：大肠杆菌r1、大肠杆菌r2、大肠杆菌r3、大肠杆菌r4和大肠杆菌k12。
[0613]
在一优选实施例中，本文所述的组合物包含糖缀合物，其中o-多糖包含与o-抗原结合的核心寡糖。在一个实施例中，组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌r1、大肠杆菌r2、大肠杆菌r3、大肠杆菌r4和大肠杆菌k12中的至少任何一种的免疫反应。在另一实施例中，组合物诱导针对至少两种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一实施例中，组合物诱导针对至少三种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一实施例中，组合物诱导针对至少四种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。在另一实施例中，组合物诱导针对所有五种核心大肠杆菌化学型的免疫反应。
[0614]
在另一优选实施例中，本文所述的组合物包含糖缀合物，其中o-多糖不包含与o-抗原结合的核心寡糖。在一个实施例中，所述组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆
菌r1、大肠杆菌r2、大肠杆菌r3、大肠杆菌r4和大肠杆菌k12中至少任何一种的免疫反应，尽管糖缀合物具有不包含核心寡糖的o-多糖。
[0615]
大肠杆菌血清型可根据五种化学型之一进行表征。表2列举根据化学型表征的示例性血清型。粗体的血清型代表最常与指定的核心化学型相关的血清型。因此，在一优选实施例中，组合物诱导针对核心大肠杆菌化学型大肠杆菌r1、大肠杆菌r2、大肠杆菌r3、大肠杆菌r4和大肠杆菌k12中的至少任何一种的免疫反应，其包含针对任何一种相应的大肠杆菌血清型的免疫反应。
[0616]
表2：核心化学型和相关大肠杆菌血清型
[0617][0618]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有rl化学型的血清型的结构，例如，选自具有式o25a、式o6、式o2、式o1、式o75、式o4、式o16、式o8、式o18、式o9、式o13、式o20、式o21、式o91和式o163的糖类，其中n为1至100。在一些实施例中，所述组合物中的糖类更包含大肠杆菌r1核心部分。
[0619]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有rl化学型的血清型的结构，例如，选自具有式o25a、式o6、式o2、式o1、式o75、式o4、式o16、式o18、式o13、式o20、式o21、式o91和式o163的糖类，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施例中，所述组合物中的糖类在糖类中更包含大肠杆菌r1核心部分。
[0620]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有r2化学型的血清型的结构，例如，选自具有式o21、式o44、式o11、式o89、式o162和式o9的糖类，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施例中，所述组合物中的糖类更包含大肠杆菌r2核心部分。
[0621]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有r3化学型的血清型的结构，例如，选自具有式o25b、式o15、式o153、式o21、式o17、式o11、式o159、式o22、式o86和式o93的糖类，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施例中，所述组合物中的糖类更包含大肠杆菌r3核心部分。
[0622]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有r4化学型的血清型的结构，例如，选自具有式o2、式o1、式o86、式o7、式o102、式o160和式o166的糖类，其中n为1至100，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施例中，所述组合物中的糖类更包含大肠杆菌r4核心部分。
[0623]
在一些实施例中，组合物包含糖类，所述糖类包含衍生自具有k-12化学型的血清型的结构(例如，选自具有式o25b的糖类和具有式o16的糖类)，其中n为1至1000，优选31至100，更优选35至90，最优选35至65。在一些实施例中，所述组合物中的糖类更包含大肠杆菌k-12核心部分。
[0624]
在一些实施例中，糖类包含核心糖类。因此，在一个实施例中，o-多糖更包含大肠
杆菌r1核心部分。在另一实施例中，o-多糖更包含大肠杆菌r2核心部分。在另一实施例中，o-多糖更包含大肠杆菌r3核心部分。在另一实施例中，o-多糖更包含大肠杆菌r4核心部分。在另一实施例中，o-多糖更包含大肠杆菌k12核心部分。
[0625]
在一些实施例中，糖类不包含核心糖类。因此，在一个实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r1核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r2核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r3核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌r4核心部分。在另一实施例中，o-多糖不包含大肠杆菌k12核心部分。
[0626]
来源于肺炎克雷伯菌的糖类和/或多肽或其片段
[0627]
肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性病原体，已知会引起尿路感染、菌血症和败血症。在一个方面，本文公开的任何组合物可进一步包含至少一种糖类，其为或来源于至少一种选自o1(和d-gal-iii变体)、o2(和d-gal-iii变体)、o2ac、o3、o4、o5、o7、o8和o12的肺炎克雷伯菌血清型。在一优选实施例中，本文公开的任何组合物可进一步包含来源于肺炎克雷伯菌的多肽，所述多肽选自来源于肺炎克雷伯菌i型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段；和来源于肺炎克雷伯菌iii型菌毛蛋白的多肽或其免疫原性片段。
[0628]
如所属领域中已知，肺炎克雷伯菌o1和o2抗原含有均聚物半乳糖单元(或半乳聚糖)。肺炎克雷伯菌o1和o2抗原各含有d-半乳聚糖i单元(有时称为o2a重复单元)，但o1抗原的不同之处在于o1抗原具有d-半乳聚糖ii帽结构。d-半乳聚糖iii(d-gal-iii)是d-半乳聚糖i的变体。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o1的糖类包含[
→
3)-β-d-galf-(1
→
3)-α-d-galp-(1
→
]的重复单元。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o1的糖类包含[
→
3)-α-d-galp-(1
→
3)-β-d-galp-(1
→
]的重复单元。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o1的糖类包含[
→
3)-β-d-galf-(1
→
3)-α-d-galp-(1
→
]的重复单元和[
→
3)-α-d-galp-(1
→
3)-β-d-galp-(1
→
]的重复单元。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o1的糖类包含
→
3)-β-d-galf-(1
→
3)-[α-d-galp-(1
→
4)]-α-d-galp-(1
→
]的重复单元(被称作d-gal-iii重复单元)。
[0629]
在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o2的糖类包含[
→
3)-α-d-galp-(1
→
3)-β-d-galf-(1
→
]的重复单元(其可为肺炎克雷伯菌血清型o2a抗原的元素)。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o2的糖类包含[
→
3)-β-d-glcpnac-(1
→
5)-β-d-galf-(1
→
]的重复单元(其可为肺炎克雷伯菌血清型o2c抗原的元素)。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o2的糖类包含通过侧链添加(1
→
4)-键联galp残基的o2a重复单元修饰(其可为肺炎克雷伯菌o2afg抗原的元素)。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o2的糖类包含通过侧链添加(1
→
2)-键联galp残基的o2a重复单元修饰(其可为肺炎克雷伯菌o2aeh抗原的元素)。
[0630]
不受机制或理论的束缚，本领域公开肺炎克雷伯菌血清型o3和o5的o-抗原多糖结构分别与大肠杆菌血清型o9a(式o9a)和o8(式o8)的那些结构相同。
[0631]
在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o4的糖类包含[
→
4)-α-d-galp-(1
→
2)-β-d-ribf-(1
→
)]的重复单元。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o7的糖类包含[
→
2-a-l-rhap-(1
→
2)-β-d-ribf-(1
→
3)-α-l-rhap-(1
→
3)-α-l-rhap-(1
→
]的重复单元。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o8血清型的糖类包含与肺炎克雷伯菌o2a相同的重复单元结构，但非化学计量o-乙酰化。在一些实施例中，来源于肺炎克雷伯菌o12血清型的糖类包含[α-rhap-(1
→
3)-β-glcpnac]双糖重复单元的重复单元。
[0632]
表1a.肺炎克雷伯菌血清组/血清型和o-单元部分
[0633][0634][0635]
如本文所用，术语“约”是指在统计学上有意义的值范围内，如规定的浓度范围、时间范围、分子量、温度或ph。所述范围可以在给定值或范围的一个数量级之内，通常在20％之内，更通常在10％之内，甚至更通常在5％或1％之内。有时，所述范围可以在用于测量和/或确定给定值或范围的标准方法的典型实验误差内。术语“约”所涵盖的可允许变型将取决于研究下的特定系统，并且所属领域的一般技术人员可以容易地理解。每当在本技术中列
举范围时，所述范围内的每个数字也被认为是本公开的实施例。
[0636]
本文中的术语“包括(comprising/comprise/comprises)”由发明人意图在每种情况下任选地分别替换为术语“基本上由
……
组成(consisting essentially of/consist essentially of/consists essentially of)”、“由
……
组成”(consisting of/consist of/consists of)。
[0637]“免疫原性量”、“免疫学有效量”、“治疗有效量”、“预防有效量”或“剂量”，每一个在本文中可互换使用，通常是指足以引发免疫反应，细胞(t细胞)或体液(b细胞或抗体)反应，或两者兼有的抗原或免疫原性组合物的量，如通过所属领域技术人员已知的标准分析测量。
[0638]
涵盖本文件的任何范围内的任何整数作为本公开的实施例。
[0639]
本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请均以引用方式并入本文。
[0640]
本发明在所附实例中进行说明。除非另有详细描述，否则以下实例使用标准技术进行，这些技术对于所属领域技术人员来说是众所周知的并且是常规的。实例是说明性的，但不限制本发明。
[0641]
实例
[0642]
实例1：大肠杆菌和肠道沙门氏菌菌株
[0643]
临床菌株和衍生物列于表3。额外的参考菌株包含：o25k5h1，临床o25a血清型菌株；和肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型菌株lt2。
[0644]
构建了去除靶向开放阅读框但留下短疤痕序列的大肠杆菌菌株中的基因敲除。
[0645]
为简单起见，水解的o-抗原链和核心糖随后表示为o-多糖(ops)。
[0646][0647][0648]
实例2：用于wzzb、fepe和o-抗原基因簇克隆的寡核苷酸引物
[0649]
表4.寡核苷酸引物
[0650][0651]
实例3：质粒
[0652]
质粒载体和亚克隆列于表5。从纯化的基因组dna中扩增含有各种大肠杆菌和沙门氏菌wzzb和fepe基因的pcr片段，并亚克隆到茵维特罗根(invitrogen)blunt克隆试剂盒中提供的高拷贝数质粒中。此质粒基于puc复制子。引物p3和p4用于扩增带有天然启动子的大肠杆菌wzzb基因，并被设计为分别与编码udp-葡萄糖-6-脱氢酶和磷酸核糖基腺嘌呤核苷酸水解酶的近端和远端基因的区域结合(在genbank mg1655nc_000913.3中标注)。使用先前描述的引物扩增含有沙门氏菌fepe基因和启动子的pcr片段。类似的大肠杆菌fepe引物是基于可用的genbank基因组序列或内部生成的全基因组数据设计的(在gar2401和o25k5h1的情况下)。低拷贝数质粒pbad33用于在阿拉伯糖启动子的控制下表达o-抗原生物合成基因。首先对质粒进行修饰，以便于克隆(通过吉布森(gibson)方法)使用与5'启动子和3'6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd)基因表5同源的通用引物扩增的长pcr片段。
[0653]
表5.质粒
[0654][0655]
实例4：o-抗原纯化
[0656]
发酵培养液用乙酸处理至最终浓度为1％-2％(最终ph值为4.1)。通过将酸处理过的培养液加热到100℃2小时来实现oag的提取和脱脂。在酸水解结束时，将批料冷却至环境温度并添加14％nh4oh至最终ph值为6.1。将中和的培养液离心并收集离心液。向离心液中添加cacl2的磷酸钠溶液，将所得浆液在室温下培育30分钟。
[0657]
离心除去固体，且使用10kda膜将离心液浓缩12倍，然后对水进行两次渗滤。随后使用碳过滤器纯化含有oag的滞留物。用4.0m硫酸铵1:1(v/v)稀释炭滤液。最终硫酸铵浓度是2m。使用具有2m硫酸铵作为操作缓冲液的膜进一步纯化硫酸铵处理的炭滤液。在顺流中收集oag。对于长oag，将hic滤液浓缩，且随后使用5kda膜将缓冲液与水(20渗滤体积)交换。对于短(天然)oag多糖，进一步降低mwco以提高产量。
[0658]
在另一实施例中，通过离心去除固体，并使用10kda膜将离心液浓缩12倍，然后对水或含有20-25mm nacl ph 7.2-7的20-25mm tris缓冲液进行两次渗滤。随后使用碳过滤器纯化含有oag的滞留物。通过离子交换(iex)膜色谱法进一步纯化炭滤液。随后用4.0m硫酸铵1:1(v/v)稀释iex滤液。最终硫酸铵浓度是2m。使用具有2m硫酸铵作为操作缓冲液的hic膜进一步纯化硫酸铵处理的iex滤液。在顺流中收集oag。将hic滤液浓缩，且随后使用5kda膜将缓冲液与水(20渗滤体积)交换。
[0659]
实例5-17的背景：这里说明的实例展示了用于纯化可以含有内部/外部寡糖的o-抗原多糖(也指o-抗原或o-ag)所有血清型的基于平台的方法。
[0660]
本文描述的纯化方法适用于短链和长链o-ag多糖。本文给出的大多数实例都是针对长链o-ag，除了实例10和11，它们分别是大肠杆菌血清型o8和o9的短链o-ag。
[0661]
实例5：纯化大肠杆菌o-抗原多糖的方法
[0662]
1.释放o-抗原
[0663]
此方法开始于发酵完成后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。这是通过用乙
酸处理血清型o25b细胞培养物的粗悬浮液至最终浓度为1.0％(v/v)从而使ph值达到约4.0来实现的。然后将酸性培养液加热至温度100℃并培育2.0小时。产物释放后，将批料冷却至环境温度20-30℃。
[0664]
为了进一步优化o25b o-ag的释放条件，建立了实验设计(doe)以检测ph、温度和保持时间对％kdo、浓度、分子量(mw)和o-乙酸盐的影响。doe研究中检测的因素在表1-1中展示。请注意，对于此研究，初始浓度、kdo的上限和o-乙酸盐的上限分别设置为3.5mg/ml、2％和1.0mm。
[0665]
表1-1：o25b酸水解研究中检测的doe因素
[0666]
因素范围ph3.0-5.0温度(℃)80-100保持时间(小时)1.0-4.0
[0667]
分别评估了1.0、2.0、2.5和4.0小时时间点的浓度、％kdo和o-乙酸盐的预测响应。在所有条件下的分子量都是平稳的，大约为50-54kda，除了在80℃的温度条件下，其中mw较大。这可能是由于产物释放不完全，在这种情况下，o-ag可能与细胞成分或其它非特异性表面多糖结合。因此，doe模型无法在这些条件下提供mw的预测响应。在4.0小时时间点，无％kdo在范围内。
[0668]
基于此doe结果，酸水解的条件重新设定为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和2.0小时的保持时间。在随后的实例中，这些释放条件用于o-ag多糖的所有其它血清型。
[0669]
2.絮凝
[0670]
此步骤的主要目的是从含有释放产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清单元操作的效率。将步骤1产物释放后的酸化培养液用10％明矾溶液处理至最终浓度为2％(w/v)，并使用硫酸进一步将ph值调节至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。然后用0.2-μm过滤器或另一个合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。深度滤液进行ufdf-1的初步纯化。
[0671]
或者，将酸化的培养液中和至6.0-7.0的ph值。将中和的滤液以12,000g离心30分钟。通过0.2-μm过滤器过滤中和的上清液。中和后的滤液可在4℃下保存至少一周，对产物质量没有任何不良影响。当批料准备好进行纯化时，中和的滤液将进行上段所述的絮凝工艺。除非另有说明，否则此实例中说明的后续纯化步骤使用此絮凝方法。
[0672]
对含有产物的中和滤液和絮凝后深度滤液的sec-hplc色谱图谱进行了比较。从折射率(ri)和uv 280检测结果来看，絮凝步骤去除了从发酵培养基中继承的大量杂质。
[0673]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0674]
使用10-kda sartocon hydrosart膜通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤2的深度滤液。处理的深度滤液量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。两个渗滤步骤的渗滤体积数均为10。收集和分析来自ufdf的滞留物。ufdf运行期间的电导率和uv曲线表明，在第一次渗滤期间，大部分小mw以及
与uv相关的杂质被去除，渗透物的uv信号显著下降证明了这一点。分析了深度滤液和ufdf-1滞留物的sec-hplc色谱图比较，用于ri和uv检测。
[0675]
4.碳过滤
[0676]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积可从ufdf-1的滞留物中加载约150g o-ag。碳过滤器首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2过滤面积大约20升缓冲液。然后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。然后用缓冲液冲洗过滤器，且将含有产物的滤液，包含冲洗液，作为炭滤液收集。
[0677]
ufdf滞留物和炭滤液的sec-hplc色谱图表明，ri和uv280相关杂质被去除，且炭滤液在视觉上变得无色。
[0678]
5.iex膜色谱法
[0679]
此步骤最初是针对血清型o2和o6 o-抗原开发的，以去除非特异性带负电荷的杂质(参见实例6和15)。因此，通过使用离子交换(iex)膜色谱法探索这些分子的静电相互作用特性，可以去除来自非血清型特异性的细胞外或细胞内多糖的杂质。
[0680]
这里使用的iex膜是millipure的natriflo膜盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。除非另有说明，否则此处说明的所有实例均使用natriflo膜(或此后称为hd-q)进行iex膜色谱法。
[0681]
首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。将来自上一步的炭滤液以30-40ml/min的流速泵送通过膜，每ml mv炭滤液中含有约200-250mg o-ag。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。iex膜色谱运行的电导率和uv280曲线，在此曲线中，uv信号显示在高盐洗涤期间出现了一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电荷的杂质。
[0682]
炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱表明，高盐洗涤色谱在与产物峰相同的保留时间处显示出一个小峰。这表明这种未知物质具有比o25b o-ag更强的离子强度。
[0683]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0684]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。来自步骤4的炭滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵(as)的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的炭滤液以40ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。或者，也可以对来自步骤4的iex滤液进行此hic过滤步骤。
[0685]
分析了用于hic纯化运行的akta avant色谱。产物在流过的流出物中，且水洗中显示的峰是结合到hic膜上的非特定疏水相关杂质。炭滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明存在于炭滤液中的小的前肩杂质峰被hic过滤步骤去除。
[0686]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0687]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0688]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运
行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。分析了渗滤期间作为dv函数的渗透物的电导率和uv280信号。10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液更换完成。
[0689]
分析ufdf-2后hic滤液和最终纯化的o25b o-ag的sec-hplc色谱图比较。下文的表1-2概述了最终纯化的o25b o-ag的品质属性。
[0690]
表1-2纯化的o25b o-ag的品质属性的概述
[0691]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)44.0残余蛋白(％)0.21残余核酸(％)0.05内毒素(eu/mg)0.1nmr结构鉴别符合
[0692]
实例6.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o6
[0693]
1.释放o-抗原
[0694]
此方法开始于发酵工艺完成后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对o25b进行的doe研究(参见实例5)，用于酸水解的条件是ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和2.0小时的保持时间。使用乙酸，且此步骤在发酵罐中进行。
[0695]
2.絮凝
[0696]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。对实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0697]
分析了含有产物的酸化培养液和絮凝后深度滤液的sec-hplc色谱图谱的比较。折射率(ri)和uv 280检测均表明，絮凝步骤去除了从发酵培养基中继承的大量杂质。
[0698]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0699]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤2的深度滤液。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是20和10。深度滤液和ufdf-1滞留物的sec-hplc色谱图比较表明，在渗滤期间去除了大部分的小分子量杂质以及uv相关杂质。然而，在ri色谱图中，有一个与产物峰相关的大前肩杂质峰。
[0700]
4.碳过滤
[0701]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约150g o-ag。碳过滤器首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。然后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。然后用缓冲液冲洗过滤器，且收集含有产物的滤液/冲洗液。ufdf滞留物和炭滤液的sec-hplc色谱图表明，ri和uv280相关杂质被
去除，且炭滤液在字面上变得无色。然而，炭滤液中仍存在前肩杂质峰。
[0702]
5.iex膜色谱法
[0703]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡hd-q膜。随后将炭滤液以每ml的mv约100-250mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。
[0704]
炭滤液和iex滤液的sec-hplc色谱图表明与产物峰相关的大前肩峰已从炭滤液中去除。
[0705]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0706]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。来自前一步骤的iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速过滤通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0707]
hic滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明存在于炭滤液中的小的前肩杂质峰被hic过滤步骤去除。
[0708]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0709]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替来自先前hic纯化步骤的硫酸铵以进行缀合。此步骤使用来自赛多利斯的sartocon hydrosart的5-kda截留分子量的膜进行。
[0710]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。
[0711]
分析ufdf-2后hic滤液和最终纯化的o6 o-ag的sec-hplc色谱图比较。下文的表2-1概述了最终纯化的o6 o-ag的品质属性。
[0712]
表2-1纯化的o6 o-ag的品质属性的概述
[0713]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)45.5残余蛋白(％)0.2残余核酸(％)0.03内毒素(eu/mg)0.07nmr结构鉴别符合
[0714]
实例7.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o75
[0715]
1.释放o-抗原
[0716]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0717]
2.絮凝
[0718]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。此处对实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液
进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0719]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0720]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10和15。分析了中和的滤液、絮凝后的深度滤液和ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。ri和uv280色谱图证明了絮凝和ufdf-1去除宿主细胞蛋白和小mw杂质的有效性。
[0721]
4.碳过滤
[0722]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0723]
ufdf滞留物和炭滤液和炭本体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图，表明大量与uv相关的小mw杂质被去除。
[0724]
5.iex膜色谱法
[0725]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡iex膜。随后将炭滤液以每ml的mv约200-250mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。
[0726]
分析了iex膜色谱运行的电导率和uv曲线。在此曲线中，uv信号在高盐洗涤中显示出一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电杂质。
[0727]
炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱图表明，高盐洗脱样品在产物峰下方显示出双峰。
[0728]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0729]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0730]
iex滤液、hic滤液、hic水洗液和纯化的o75 o-ag的sec-hplc色谱图表明，水洗液样品也显示出与sec-hplc中的产物在相同滞留时间处洗脱的峰，表明iex滤液中可能存在少量具有较高疏水性的未知物质。
[0731]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0732]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0733]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-1的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o75 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表3-1概述了最终纯化的o75 o-ag的品质属性。
[0734]
表3-1纯化的o75 o-ag的品质属性的概述
[0735]
通过sec-hplc的纯度》99.0％分子量(kda)53.4残余蛋白(％)0.30残余核酸(％)0.04内毒素(eu/mg)0.12nmr结构鉴别符合
[0736]
实例8.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o1
[0737]
1.释放o-抗原
[0738]
此方法开始于发酵后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型所用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0739]
2.絮凝
[0740]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。此处对实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0741]
分析了中和的滤液和絮凝后的深度滤液的sec-hplc色谱图的比较。此数据表明通过絮凝步骤去除了大量杂质。
[0742]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0743]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10和15。分析深度滤液和ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。ri和uv280色谱图证明了絮凝和ufdf-1去除宿主细胞蛋白和小mw杂质的有效性。
[0744]
4.碳过滤
[0745]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。然后以50lmh(升/m2/小时)的流速
在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。过滤后，用缓冲液冲洗碳过滤器。将含有产物的滤液和冲洗液合并为炭滤液。
[0746]
ufdf滞留物和炭滤液和炭本体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图，表明ri色谱图没有太大变化，但大量的uv和颜色相关杂质被去除。
[0747]
5.疏水相互作用色谱(hic)
[0748]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，例如酸水解步骤中残留的脂质a，并确保内毒素水平将保持在最低水平。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。炭滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的炭滤液以40-60ml/min的流速过滤通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。炭滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明，基于sec-hplc曲线没有可检测到的改善，但内毒素水平显著降低(参见下表4-1)。
[0749]
6.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0750]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用来自赛多利斯的sartocon hydrosart 5-kda膜进行。
[0751]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-1的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o1 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表4-1概述了最终纯化的o1 o-ag的品质属性。
[0752]
表4-1纯化的o1 o-ag的品质属性的概述
[0753]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)38.0残余蛋白(％)0.33残余核酸(％)0.06内毒素(eu/mg)0.05nmr结构鉴别符合
[0754]
实例9.纯化大肠杆菌o-抗原血清型15
[0755]
1.释放o-抗原
[0756]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0757]
2.絮凝
[0758]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。此处用实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。分析中和的滤液和絮凝后的深度滤液的sec-hplc色谱图的比较。
[0759]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0760]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10。ufdf运行的实际实验表明，大部分小mw以及与uv相关的杂质在渗滤期间被去除，且这在ufdf-1后滞留物的sec-hplc色谱图中也得到了证明。ri和uv280色谱图证明了絮凝和ufdf-1去除宿主细胞蛋白和小mw杂质的有效性。
[0761]
4.碳过滤
[0762]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0763]
ufdf滞留物和炭滤液和炭本体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图，表明大量小mw杂质被去除。
[0764]
5.iex膜色谱法
[0765]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的25mm tris/25mm nacl ph 7.5平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约200-250mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用25mm tris/1.0m nacl ph 7.5的高盐缓冲液洗涤。
[0766]
分析了iex膜色谱运行的电导率和uv曲线。在此曲线中，uv信号在高盐洗涤期间显示出一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电杂质。炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱图表明，高盐洗脱样品在与产物类似的滞留时间显示出小双峰。
[0767]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0768]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析了hic膜过滤的uv和电导率的色谱图曲线。在水洗步骤中有一个可见的小峰，表明有痕量的未指定物质结合在hic膜上。
[0769]
iex滤液、hic滤液、hic水洗液和纯化的o15 o-ag的sec-hplc色谱图表明，水洗液样品在sec-hplc中显示出稍早于产物洗脱的双峰，表明hd-q流中存在一些未知物质。
[0770]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0771]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0772]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。渗滤期间渗透物的电导率和uv280信号作为dv的函数表明在10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液交换完成。分析了最终纯化的o15 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表5-1概述了最终纯化的o15 o-ag的品质属性。
[0773]
表5-1纯化的o15 o-ag的品质属性的概述
[0774][0775][0776]
实例10.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o8
[0777]
1.释放o-抗原
[0778]
血清型o8是一种短链o抗原，且分子量预计在10-15kda范围内。然而，概述的纯化工艺也适用于所有短链大肠杆菌o-ag。此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0779]
2.絮凝
[0780]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。此处用实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0781]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0782]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10。分析ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[0783]
4.碳过滤
[0784]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0785]
分析炭滤液的sec-hplc色谱图。碳过滤后产物峰降低的事实，表明碳过滤器设计用于非特异性吸附模式。尽管如此，与颜色有关的杂质大部分都被去除。
[0786]
5.iex膜色谱法
[0787]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo(hd-q)盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约200-250g o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。
[0788]
分析了iex膜色谱运行的电导率和uv曲线。在此曲线中，uv信号在高盐洗涤期间显示出一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电杂质。
[0789]
炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱图表明，高盐洗脱样品在与产物类似的滞留时间显示出小双峰。
[0790]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0791]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析了hic膜过滤的uv和电导率的色谱图曲线。在水洗步骤中有一个可见峰，表明有痕量的未指定疏水物质结合在hic膜上。
[0792]
iex滤液、hic滤液、hic水洗液和纯化的o8 o-ag的sec-hplc色谱图表明，水洗液样品在sec-hplc中显示出稍早于产物洗脱的双峰，表明hd-q流中存在仅极少量的未知物质。
[0793]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0794]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0795]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为200lmh和0.5巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o8 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表6-1概述了最终纯化的o8 o-ag的品质属性。
[0796]
表6-1纯化的o8 o-ag的品质属性的概述
[0797]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)11.5残余蛋白(％)0.08残余核酸(％)0.02内毒素(eu/mg)0.96nmr结构鉴别符合
[0798]
实例11.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o9
[0799]
1.释放o-抗原
[0800]
血清型o9也是一种短链o抗原，且分子量预计在10-15kda范围内。使用所概述的纯
化方法。此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0801]
2.絮凝
[0802]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。对实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。分析了中和的滤液和深度滤液的sec-hplc色谱图曲线的比较。
[0803]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0804]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10。分析ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[0805]
4.碳过滤
[0806]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0807]
分析炭滤液的sec-hplc色谱图。碳过滤后产物峰降低的事实，表明碳过滤器设计用于非特异性吸附模式。尽管如此，与颜色有关的杂质大部分都被去除。
[0808]
5.iex膜色谱法
[0809]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo(hd-q)盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约200-250mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。
[0810]
分析了iex膜色谱运行的电导率和uv曲线。在此曲线中，uv信号在高盐洗涤期间显示出一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电杂质。炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱图表明，高盐洗脱样品在与产物类似的滞留时间显示出小峰。
[0811]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0812]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为
hplc色谱图。ri和uv280色谱图证明了絮凝和ufdf-1去除宿主细胞蛋白和小mw杂质的有效性。
[0826]
4.碳过滤
[0827]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r55sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0828]
ufdf滞留物和炭滤液和炭本体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图，表明大量与uv相关的小mw杂质被去除。
[0829]
5.iex膜色谱法
[0830]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的25mm tris/25mm nacl ph7.5平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约150-200mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。膜用平衡缓冲液和两步洗涤冲洗，第一个用25mm tris/25mm nacl ph7.5缓冲液，第二个用高盐缓冲液，25mm tris/1.0m nacl ph 7.5。
[0831]
iex膜色谱运行的电导率和uv曲线表明，有一些未知的带负电荷的杂质结合在膜上，且它们随后在逐步洗脱期间被去除。
[0832]
炭滤液、iex滤液第1步和第2步洗涤洗脱液的sec-hplc色谱图分别表明，来自逐步洗涤样品的两种洗脱液显示出与产物不同的曲线(在ri和uv色谱图中)。
[0833]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0834]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析hic滤液的sec-hplc色谱图。
[0835]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0836]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0837]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。渗滤期间渗透物的电导率和uv280信号作为dv的函数表明在10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液交换完成。分析了最终纯化的o21 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表8-1概述了最终纯化的o21 o-ag的品质属性。
[0838]
表8-1纯化的o21 o-ag的品质属性的概述
[0839]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)37.8残余蛋白(％)0.36
残余核酸(％)0.16内毒素(eu/mg)《0.13nmr结构鉴别符合
[0840]
实例13.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o4
[0841]
1.释放o-抗原
[0842]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0843]
2.絮凝
[0844]
此步骤的主要目的是从含有产物的培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清工艺的效率。此处对实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。分析中和的滤液和深度滤液的sec-hplc色谱图。
[0845]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0846]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是25mm tris/25mm nacl ph 7.5的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是18。分析ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[0847]
4.碳过滤
[0848]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r55sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0849]
ufdf滞留物和炭滤液和炭本体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图，表明大量与uv相关的小mw杂质被去除。
[0850]
5.iex膜色谱法
[0851]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo(hd-q)盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约150-200mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。膜用平衡缓冲液和两步洗涤冲洗，第一个用20mm tris/25mm nacl ph7.5缓冲液，且第二个用高盐缓冲液，25mm tris/1.0m nacl ph 7.5。分析炭滤液和iex滤液的sec-hplc色谱图。
[0852]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0853]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0854]
hic膜色谱运行的电导率和uv曲线表明，疏水相关杂质结合到hic膜上，且随后被水洗掉。分析hic滤液和hic洗涤液的sec-hplc色谱图。
[0855]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0856]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0857]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o4 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表9-1概述了最终纯化的o4 o-ag的品质属性。
[0858]
表9-1纯化的o4 o-ag的品质属性的概述
[0859]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)52.6残余蛋白(％)0.17残余核酸(％)0.04内毒素(eu/mg)《0.19nmr结构鉴别符合
[0860]
实例14.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o2
[0861]
1.释放o-抗原
[0862]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0863]
2.絮凝
[0864]
从实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0865]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0866]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是25mm tris/25mm nacl ph 7.5的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是18。10-1显示了ufdf-1的uv和电导率曲线，可以看出大多数与uv相关的小分子量杂质在第一次渗滤期间被去除。分析
ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[0867]
4.碳过滤
[0868]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。3m碳过滤器是以每m2碳过滤器面积大约75-125g o-ag的载量使用。炭首先用水冲洗，随后用渗滤缓冲液以每m2膜面积大约20升缓冲液冲洗。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0869]
ufdf滞留物和炭滤液和炭块体(包含冲洗液)的sec-hplc色谱图表明，碳过滤在去除残留颜色和小mw杂质方面非常有效。
[0870]
5.iex膜色谱法
[0871]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约50-100mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。膜用平衡缓冲液和两步洗涤冲洗，第一个用25mm tris/25mm nacl ph7.5缓冲液，第二个用高盐缓冲液，25mm tris/1.0m nacl ph 7.5。分析了iex膜色谱的uv和电导率曲线。如其所描绘，在高盐洗涤循环中有一个峰洗脱出来，表明有少量杂质结合在膜上。分析炭滤液和iex滤液的sec-hplc色谱图。
[0872]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0873]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为1.2m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析hic滤液的sec-hplc色谱图。
[0874]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0875]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0876]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o2 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表10-1概述了最终纯化的o2 o-ag的品质属性。
[0877]
表10-1纯化的o2 o-ag的品质属性的概述
[0878]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)46.1残余蛋白(％)0.23残余核酸(％)0.05内毒素(eu/mg)3.2nmr结构鉴别符合
[0879]
实例15.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o11
[0880]
1.释放o-抗原
[0881]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0882]
2.絮凝
[0883]
从实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[0884]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0885]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是25mm tris/25mm nacl ph 7.5的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是18。ufdf-1的uv和电导率曲线表明，大多数与uv相关的小分子量杂质在第一次渗滤期间被去除。分析ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[0886]
4.碳过滤
[0887]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r55sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。ufdf滞留物和炭滤液和炭主体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图表明，碳过滤在去除残留颜色和小mw杂质方面非常有效。
[0888]
5.iex膜色谱法
[0889]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的25mm tris/25mm nacl ph 7.5平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约100-125mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。膜用平衡缓冲液和两步洗涤冲洗，第一个用25mm tris/25mm nacl ph7.5缓冲液，第二个用高盐缓冲液，25mm tris/1.0m nacl ph 7.5。分析了iex膜色谱的uv和电导率曲线。如其所描绘，在高盐洗涤步骤中有一个峰洗脱出来，表明有未知的杂质结合在膜上。分析炭滤液、iex滤液和2个高盐洗涤样品的sec-hplc色谱图。
[0890]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0891]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与冲洗液一起收集
为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析hic滤液的sec-hplc色谱图。
[0892]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0893]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0894]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后渗滤进渗滤体积(dv)数约20的水中。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o11o-ag的sec-hplc曲线。下文的表11-1概述了最终纯化的o11 o-ag的品质属性。
[0895]
表11-1纯化的o11 o-ag的品质属性的概述
[0896]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)40.2残余蛋白(％)0.35残余核酸(％)0.14内毒素(eu/mg)0.36nmr结构鉴别符合
[0897]
实例16.纯化大肠杆菌o-抗原血清型o18
[0898]
1.释放o-抗原
[0899]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0900]
2.絮凝
[0901]
从实例5中“絮凝”部分所述酸水解后中和的滤液进行絮凝。向中和的滤液中添加10％明矾溶液至终浓度为2％(w/v)，且用硫酸进一步调节ph至3.2。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。12-1显示中和的滤液和絮凝后的深度滤液的sec-hplc色谱图。
[0902]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0903]
使用10-kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积20-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是25mm tris/25mm nacl ph 7.5的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是18。分析深度滤液和ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图的比较。
[0904]
4.碳过滤
[0905]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r55sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约200-250g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[0906]
ufdf滞留物和炭滤液和炭主体，包含冲洗液的sec-hplc色谱图表明，碳过滤在去
除残留颜色和小mw杂质方面非常有效。
[0907]
5.iex膜色谱法
[0908]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里使用的iex膜是millipure的natriflo盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约100-150mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。膜用平衡缓冲液和两步洗涤冲洗，第一个用25mm tris/25mm nacl ph7.4缓冲液，且第二个用高盐缓冲液，25mm tris/1.0m nacl ph 7.4。分析了iex滤液的sec-hplc色谱图(顶部色谱图)。
[0909]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[0910]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析了hic色谱运行的电导率和uv280曲线。少量疏水物质结合在hic膜上，且随后被水洗掉。分析hic滤液和hic洗涤液的sec-hplc色谱图。
[0911]
7.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0912]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[0913]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为300lmh和0.5-1.0巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。分析了最终纯化的o18 o-ag的sec-hplc曲线。下文的表12-1概述了最终纯化的o18 o-ag的品质属性。
[0914]
表12-1纯化的o18 o-ag的品质属性的概述
[0915]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)52.9残余蛋白(％)0.38残余核酸(％)0.04内毒素(eu/mg)《0.024nmr结构鉴别符合
[0916]
实例17.无絮凝的情况下纯化大肠杆菌o-抗原
[0917]
为了进一步证明前面12个实例中描述的大肠杆菌o-抗原多糖纯化方法的稳健性，我们在此展示了相同的纯化方法在不使用明矾溶液作为絮凝剂的情况下对进料流同样有效。o2和o6和o25b o-ag的血清型用于证明这一澄清工艺。
[0918]
1.释放o-抗原
[0919]
此方法开始于发酵工艺后的酸水解，以从脂多糖(lps)中释放o-ag。基于对血清型o25b o-ag进行的doe结果(参见实例5)，所有o-抗原血清型使用的酸水解条件为ph 3.8
±
0.1、温度95
±
5℃和培育时间2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。
[0920]
2.血清型o25b的酸处理
[0921]
酸水解后，将批料冷却至环境温度。使用硫酸将ph值进一步调节至3.2，将所述批料在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。与絮凝批料相比，上清液呈现轻微的混浊，然后通过0.2-μm过滤器过滤混浊的上清液。所得深度滤液目视澄清，并进行随后的纯化处理步骤，包含实例5-16中描述的ufdf-1、碳过滤、iex膜色谱法、hic过滤和ufdf-2。
[0922]
表13-1显示了使用和不使用明矾絮凝步骤纯化的o25b o-ag的品质属性比较。
[0923]
表13-1使用和不使用明矾絮凝步骤纯化的o25b o-ag的品质属性概述。
[0924][0925][0926]
3.血清型o2和o6的酸处理
[0927]
对中和的滤液进行血清型o2和o6 o-ag的酸处理，所述滤液通过实例5第一部分中所述的方法获得。将中和滤液的ph值调节至3.2，然后将批料在环境温度下培育1.0小时，然后在12,000-14,000g下离心30分钟。与各自的絮凝溶液相比，两种血清型的上清液再次显示出轻微的混浊。然而，上清液通过0.2-μm过滤器过滤后，所得滤液在视觉上变得清晰。然后将深度滤液进行随后的纯化处理步骤，包含实例5-16中描述的ufdf-1、碳过滤、iex膜色谱法、hic过滤和ufdf-2。
[0928]
表13-2和13-3分别显示了使用和不使用明矾絮凝步骤纯化的o2和o6 o-ag的品质属性比较。
[0929]
表13-2纯化的o2 o-ag的品质属性的概述
[0930] 用明矾纯化不用明矾纯化通过sec-hplc的纯度》99.9％》99.9％分子量(kda)46.146.2残余蛋白(％)0.230.15残余核酸(％)0.050.023内毒素(eu/mg)3.22.19nmr结构鉴别符合符合
[0931]
表13-3纯化的o6 o-ag的品质属性的概述
[0932] 用明矾纯化不用明矾纯化通过sec-hplc的纯度》99.9％》99.9分子量(kda)45.546.0残余蛋白(％)0.2《0.18残余核酸(％)0.030.036内毒素(eu/mg)0.070.17nmr结构鉴别符合符合
[0933]
实例18：纯化脑膜炎奈瑟菌血清组a多糖(nm-a多糖)的方法
[0934]
1.絮凝和澄清
[0935]
所述方法从脑膜炎奈瑟菌细胞培养物开始，将其热处理至55℃一小时以从细胞表面释放多糖。然后将含有释放产物的细胞培养液进行絮凝。此步骤的主要目的是从培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清单元操作的效率。
[0936]
絮凝是通过将5m cacl2溶液添加到发酵培养液中达到最终cacl2浓度为0.2m来实现的。将cacl2处理过的溶液在50-70℃下培育一小时，同时轻轻混合。培育后，将批料冷却至环境温度，且随后在20℃下以15,000
×
g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或另一个合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对澄清的滤液进行ufdf-1的初步纯化。
[0937]
2.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0938]
使用10-kda sartocon hydrosart膜通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤1的澄清滤液。处理的澄清滤液的量通常为每m2膜面积约55g多糖。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-15倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。在此步骤中使用的缓冲液是25mm柠檬酸盐/50m nacl ph 6.0用于第一次渗滤，且在此之后使用20mm tris-hcl ph 8.0进行第二次渗滤。两个渗滤步骤的渗滤体积(dv)数分别为10和20。收集和分析来自ufdf的滞留物。ufdf运行期间的电导率和uv曲线表明，大部分小mw以及与uv相关的小分子量杂质在渗滤期间被去除，渗透物的uv信号显著下降以及澄清滤液和ufdf-1的滞留物的sec-hplc色谱图证明了这一点。
[0939]
3.碳过滤
[0940]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积可从ufdf-1的滞留物中加载大约300-600g的nm-a多糖。用20mm tris-hcl ph 8.0的渗滤缓冲液冲洗碳过滤器，每m2过滤面积大约20升。然后通过碳过滤器以50-75lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。然后用缓冲液冲洗过滤器，且将含有产物的滤液，包含冲洗液，作为炭滤液收集。
[0941]
ufdf滞留物和炭滤液的sec-hplc色谱图表明，ri和uv280相关的杂质被去除，且炭滤液在视觉上变得无色。
[0942]
4.疏水相互作用色谱(hic)
[0943]
此单元操作去除了任何具有疏水特性的杂质，例如残留的脂质多糖(内毒素)。sartobind苯基膜用于hic步骤。来自步骤3的炭滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为1.5m。首先用1.5m硫酸铵(as)的操作缓冲液平衡苯基膜。以每分钟0.2-1.0膜体积(mv)的流速将经as处理的炭滤液推过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，接着用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0944]
分析了用于hic纯化运行的akta avant色谱。产物在流过的流出物中，且水洗中显示的峰是结合到hic膜上的非特定疏水相关杂质。炭滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明疏水杂质已通过hic过滤步骤去除。
[0945]
5.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0946]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀
合。此步骤使用10-kda截留分子量(mwco)sartocon hydrosart膜盒进行。
[0947]
将hic滤液浓缩约10-15倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约10-20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为100-500lmh和0.5-1.5巴。分析了渗滤期间作为dv函数的渗透物的电导率和uv280信号。10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液更换完成。
[0948]
hic滤液和最终纯化的nm_a多糖在ufdf-2进行0.2-μm过滤后的sec-hplc色谱图比较。表14概述最终纯化的nm_a多糖的品质属性。
[0949]
表14.纯化的nm_a多糖的品质属性的概述
[0950]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)33.8残余蛋白(％)0.0残余核酸(％)0.0内毒素(eu/mg)0.87eu/mg
[0951]
实例19：纯化脑膜炎奈瑟菌血清组c多糖(nm-c多糖)的方法
[0952]
1.絮凝和澄清
[0953]
所述方法从脑膜炎奈瑟菌细胞培养物开始，将其热处理至55℃一小时以从细胞表面释放多糖。然后将含有释放产物的细胞培养液进行絮凝。此步骤的主要目的是从培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清单元操作的效率。
[0954]
这是通过将浓缩的cacl2溶液添加到发酵培养液中并将最终的cacl2浓度调整到0.3m来实现的。将cacl2处理过的溶液在50℃下培育一小时，同时轻轻混合。培育后，将批料冷却至环境温度，且随后在20℃下以12,000-14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或另一个合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对澄清的滤液进行ufdf-1的初步纯化。
[0955]
2.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0956]
使用10-kda sartocon hydrosart膜通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤1的澄清滤液。处理的澄清滤液的量通常为每m2膜面积约40g多糖。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-15倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是25mm柠檬酸盐/50m nacl ph 6.0，然后是水或其它所需缓冲液的第二次渗滤。两个渗滤步骤的渗滤体积数为10-20。收集并分析来自ufdf的滞留物。回顾ufdf运行期间的电导率和uv曲线以验证在第一次渗滤期间，大部分小mw以及与uv相关的杂质被去除，渗透物的uv信号显著下降证明了这一点。分析澄清滤液和ufdf-1滞留物的sec-hplc色谱图比较，用于ri和uv检测。
[0957]
3.离子交换色谱(iex)
[0958]
这里使用的iex膜是millipure的natriflo膜盒。或者，也可以使用来自赛多利斯斯泰帝(sartorius stedim)的sartobind q膜。
[0959]
首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris ph 8.0平衡膜。将来自上一步的炭滤液调节至20mm tris浓度，并以0.2-1.0mv/min的流速泵送通过膜，其中每ml mv约70mg多糖。随后用10-30mv的平衡缓冲液冲洗膜。用线性梯度进行洗脱，在约13mv中直至50％的高盐缓冲液20mm tris/1.0m nacl ph 8.0，然后用15mv至100％的高盐缓冲液。分别合并对应
于两个洗脱峰的洗脱份并通过sec-hplc分析。ufdf-1中显示的高分子量杂质被iex膜捕获并在第一次洗脱期间被去除。第二个洗脱部分主要含有产物。
[0960]
4.疏水相互作用色谱(hic)
[0961]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，例如残留的脂质多糖(内毒素)。sartobind苯基膜用于hic步骤。来自iex色谱法的洗脱液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为1.5m。首先用1.5m硫酸铵(as)的操作缓冲液平衡苯基膜。以每分钟0.2-1.0膜体积(mv)的流速将经as处理的iex洗脱液推过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，接着用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0962]
分析了用于hic纯化运行的akta avant色谱。产物在流过的流出物中，且水洗中显示的峰是结合到hic膜上的非特定疏水相关杂质。
[0963]
5.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0964]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用10-kda截留分子量(mwco)sartocon hydrosart膜盒进行。
[0965]
将hic滤液浓缩约10-15倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置在100-500lmh和0.5-1.5巴。分析了渗滤期间作为dv函数的渗透物的电导率和uv280信号。10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液更换完成。ufdf-2后最终纯化的nm_c多糖进行0.2-μm过滤。表15概述最终纯化的nm_c多糖的品质属性。
[0966]
表15.纯化的nm_c多糖的品质属性的概述
[0967]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)154.9残余蛋白(％)0.0残余核酸(％)0.0内毒素(eu/mg)0.18
[0968]
实例20：纯化脑膜炎奈瑟菌血清组w多糖(nm-w多糖)的方法
[0969]
1.絮凝和澄清
[0970]
所述方法从脑膜炎奈瑟菌细胞培养物开始，将其热处理至55℃一小时以从细胞表面释放多糖。然后将含有释放产物的细胞培养液进行絮凝。此步骤的主要目的是从培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清单元操作的效率。
[0971]
这是通过将5m cacl2溶液添加到发酵培养液中以将最终cacl2浓度调整至0.2m来实现的。将cacl2处理过的溶液在50℃下培育一小时，同时轻轻混合。培育后，将批料冷却至环境温度，且随后在20℃下以14,000g离心30分钟。用0.2-μm过滤器或另一个合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对澄清的滤液进行ufdf-1的初步纯化。
[0972]
2.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0973]
使用10-kda sartocon hydrosart膜通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤1的澄清滤液。处理的澄清滤液的量为每m2膜面积约84g多糖。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-15倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是25mm柠檬酸盐/50m nacl ph 6.0，然后是用水或其它所
需缓冲液的第二次渗滤。第一次渗滤的渗滤体积数和第二次渗滤的渗滤体积数分别是10和20。收集和分析来自ufdf的滞留物。ufdf运行期间的电导率和uv曲线表明，在第一次渗滤期间，大部分小mw以及与uv相关的杂质被去除，渗透物的uv信号显著下降证明这一点。
[0974]
3.碳过滤
[0975]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积从ufdf-1的滞留物中加载大约1,000g的nm-w多糖。碳过滤器首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2过滤面积大约20升缓冲液。然后以60lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。然后用缓冲液冲洗过滤器，且将含有产物的滤液，包含冲洗液，作为炭滤液收集。
[0976]
ufdf滞留物和炭滤液的sec-hplc色谱图表明，ri、uv280相关和小分子量杂质被碳过滤器去除。炭滤液视觉上变成无色。
[0977]
4.疏水相互作用色谱(hic)
[0978]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，例如残留的脂质多糖(内毒素)。sartobind苯基膜用于hic步骤。来自步骤3的炭滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为1.5-2.0m。加载到hic膜上的nm_w多糖的量约为每ml膜体积(mv)30-116mg。首先用硫酸铵(as)的操作缓冲液平衡苯基膜。以每分钟0.2-1.0膜体积(mv)的流速将经as处理的炭滤液推过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，接着用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0979]
分析了用于hic纯化运行的akta avant色谱。产物在流过的流出物中，且水洗中显示的峰是结合到hic膜上的非特定疏水相关杂质。炭滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明疏水杂质已通过hic过滤步骤去除。
[0980]
5.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0981]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用10-kda截留分子量(mwco)sartocon hydrosart膜盒进行。
[0982]
将hic滤液浓缩约10-15倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约10-20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置在100-500lmh和0.5-1.5巴。分析了渗滤期间作为dv函数的渗透物的电导率和uv280信号。10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液更换完成。
[0983]
hic滤液和最终纯化的nm_w多糖在ufdf-2进行0.2-μm过滤后的sec-hplc色谱图比较。表16概述最终纯化的nm_w多糖的品质属性。
[0984]
表16.纯化的nm_w多糖的品质属性的概述
[0985]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)216.8残余蛋白(％)0.0残余核酸(％)0.0内毒素(eu/mg)0.07eu/mg
[0986]
实例21：纯化脑膜炎奈瑟菌血清组y多糖(nm-y多糖)的方法
[0987]
1.絮凝和澄清
[0988]
所述方法从脑膜炎奈瑟菌细胞培养物开始，将其热处理至55℃一小时以从细胞表
面释放多糖。然后将含有释放产物的细胞培养液进行絮凝。此步骤的主要目的是从培养液中沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。它还提高了下游澄清单元操作的效率。
[0989]
这是通过将5m cacl2溶液添加到发酵培养液中以将最终cacl2浓度调整至0.2m来实现的。将cacl2处理过的溶液在50-70℃下培育一小时，同时轻轻混合。培育后，将批料冷却至环境温度，且随后在20℃下以15,000g离心40分钟。用0.2-μm过滤器或另一个合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对澄清的滤液进行ufdf-1的初步纯化。
[0990]
2.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[0991]
使用10-kda sartocon hydrosart膜通过超滤和渗滤(ufdf)进一步纯化来自上文步骤1的澄清滤液。处理的澄清滤液的量为每m2膜面积约20g多糖。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-15倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是25mm柠檬酸盐/50m nacl ph 6.0，然后是用20mm tris-hcl/0.1m nacl ph 8.0的第二次渗滤。第一次渗滤的渗滤体积数和第二次渗滤的渗滤体积数分别是12和25。收集和分析来自ufdf的滞留物。ufdf运行期间的电导率和uv曲线表明，在第一次渗滤期间，大部分小mw以及与uv相关的杂质被去除，渗透物的uv信号显著下降证明这一点。
[0992]
3.碳过滤
[0993]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m r32sp碳过滤器时，每m2碳过滤器面积从ufdf-1的滞留物中加载大约885g的nm-y多糖。碳过滤器首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2过滤面积大约20升缓冲液。然后以72lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。然后用缓冲液冲洗过滤器，且将含有产物的滤液，包含冲洗液，作为炭滤液收集。
[0994]
ufdf滞留物和炭滤液的sec-hplc色谱图表明，ri、uv280相关和小分子量杂质被碳过滤器去除。炭滤液视觉上变成无色。
[0995]
4.疏水相互作用色谱(hic)
[0996]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，例如残留的脂质多糖(内毒素)。sartobind苯基膜用于hic步骤。来自步骤3的炭滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为1.75m。加载到hic膜上的nm_y多糖的量约为每ml膜体积(mv)40mg。首先用硫酸铵(as)的操作缓冲液平衡苯基膜。以每分钟0.2-1.0膜体积(mv)的流速将经as处理的炭滤液推过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，接着用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。
[0997]
分析了用于hic纯化运行的akta avant色谱。产物在流过的流出物中，且水洗中显示的峰是结合到hic膜上的非特定疏水相关杂质。炭滤液和hic滤液的sec-hplc色谱图表明疏水相关杂质已通过hic过滤步骤去除。
[0998]
5.超滤/渗滤-(ufdf-2)
[0999]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用10-kda截留分子量(mwco)sartocon hydrosart膜盒进行。
[1000]
将hic滤液浓缩约10-15倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约25的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置在300-400lmh和0.5-1.5巴。分析了渗滤期间作为dv
函数的渗透物的电导率和uv280信号。10dv后，电导率达到稳定状态，表明缓冲液更换完成。
[1001]
hic滤液和最终纯化的nm_y多糖在ufdf-2进行0.2-μm过滤后的sec-hplc色谱图比较。表17概述最终纯化的nm_y多糖的品质属性。
[1002]
表17.纯化的nm_y多糖的品质属性的概述
[1003]
通过sec-hplc的纯度》99.9％分子量(kda)247.0残余蛋白(％)0.0残余核酸(％)0.0内毒素(eu/mg)0.35eu/mg
[1004]
实例22：纯化克雷伯菌o-抗原多糖的描述
[1005]
1.释放o-抗原
[1006]
克雷伯菌o1和o2 o-抗原(kleb o-ag)是短链o-抗原，且分子量预计在8.0-16.0kda范围内。实例5-17中描述的大肠杆菌o-ag的纯化方法也适用于kleb o-ag。发酵后，克雷伯菌o1和o2 o-抗原通过酸水解从脂多糖(lps)中释放出来，所述酸水解ph值为3.8
±
0.1，温度为95℃
±
5℃，且培育时间为2.0小时。此步骤在发酵罐中进行。此条件将裂解脂质-a和lps的核心寡糖之间的酸不稳定键(参见实例5)。
[1007]
2.絮凝
[1008]
在上文步骤1中描述的kleb o-ag释放后，将培养液冷却至环境温度并用10％明矾溶液处理至最终浓度为2.0％(w/v)，并将ph值进一步调节至3.2。此絮凝步骤将沉淀细胞碎片、宿主细胞蛋白和核酸。将絮凝的浆液在环境温度下培育1.0小时，然后以12,000-14,000g离心30分钟。通过0.2-μm过滤器或其它合适的深度过滤器过滤上清液，以去除可能跳入溶液中的任何小颗粒。对深度滤液进行下一步骤ufdf-1。
[1009]
3.超滤/渗滤-(ufdf-1)
[1010]
使用5-kda或10kda sartocon hydrosart膜盒通过超滤和渗滤(ufdf)从深度滤液(来自上文步骤2)开始纯化。处理的材料量通常为每m2膜面积15-30升。此操作的目的是：(i)通过将溶液浓缩10-20倍来减少体积，和(ii)通过渗滤用所需缓冲液替换发酵培养基来交换缓冲液。此步骤中使用的缓冲液是20mm柠檬酸盐/0.1m nacl ph 6.0，然后是20mm tris/20mm nacl ph 7.2的第二缓冲液。每个渗滤步骤的渗滤体积数分别是10-18。分析ufdf-1后的滞留物的sec-hplc色谱图。
[1011]
4.碳过滤
[1012]
此单元操作降低了如蛋白质和核酸的宿主细胞杂质以及有色杂质的含量(参见wo2008118752)。使用3m碳过滤器时，每m2碳过滤器面积加载大约100-150g o-ag。炭首先用水冲洗，然后是渗滤缓冲液，每m2膜面积大约20升缓冲液。随后以50lmh(升/m2/小时)的流速在单程模式下过滤来自ufdf-1的滞留物。随后用缓冲液冲洗碳过滤器。收集含有产物的滤液和缓冲液冲洗液。
[1013]
分析炭滤液的sec-hplc色谱图。碳过滤后产物峰降低的事实，表明碳过滤器设计用于非特异性吸附模式。尽管如此，与颜色有关的杂质大部分都被去除。
[1014]
5.iex膜色谱法
[1015]
开发此步骤以去除非特异性带负电杂质(参见实例5中的iex膜色谱法部分)。这里
使用的iex膜是millipure的natriflo(hd-q)盒。或者，也可以使用赛多利斯斯泰帝的sartobind q膜或3m的emphaze aex混合型纯化器(hybrid purifier)。首先用通常为20-30膜体积(mv)的20mm tris/20mm nacl ph 7.2平衡膜。随后将炭滤液以每ml的mv约75-250mg o-ag加载到膜上。收集含有产物的流出物或滤液。用平衡缓冲液冲洗膜，并且随后用20mm tris/1.0m nacl ph 7.2的高盐缓冲液洗涤。
[1016]
分析了iex膜色谱运行的电导率和uv曲线。在此曲线中，uv信号在高盐洗涤期间显示出一个峰，表明炭滤液中存在未知的带负电杂质。炭滤液、iex滤液和高盐洗涤流出物的sec-hplc色谱图表明，高盐洗脱样品高盐洗涤样品含有大分子量杂质。
[1017]
6.疏水相互作用色谱(hic)
[1018]
此单元操作去除任何具有疏水特性的杂质，如酸水解步骤留下的残留脂质a。sartobind苯基150-ml膜用于hic步骤。iex滤液用4.0m硫酸铵(as)溶液处理至最终浓度为2.0m。首先用2.0m硫酸铵的操作缓冲液平衡苯基膜。经as处理的iex滤液以40-60ml/min的流速通过hic膜。随后用操作缓冲液冲洗hic膜，然后用水洗涤。将流出液与缓冲液冲洗液一起收集为hic滤液，且同样收集水洗液用于分析。分析了hic膜过滤的uv和电导率的色谱图曲线。
[1019]
iex滤液、hic滤液、hic水洗液和纯化的o8 o-ag的sec-hplc色谱图表明，水洗液样品在ri检测中没有显示可见峰，表明iex流中不存在疏水相关物质。
[1020]
7.超滤/渗滤(ufdf-2)
[1021]
此单元操作将产物浓缩至所需浓度，并用所需的缓冲液或水代替硫酸铵以进行缀合。此步骤使用5-kda截留分子量过滤器进行。
[1022]
将hic滤液浓缩约10倍，且随后使用渗滤体积(dv)数约20的水进行渗滤。ufdf-2运行的交叉流速和tmp通常分别设置为200lmh和0.5巴。收集来自ufdf-2的滞留物以及冲洗液。最终池通过0.2-μm过滤器过滤。
[1023]
培养液中释放后的o-ag和纯化后四种变体的最终纯化k
p o-ag的sec-hplc色谱图表明，为大肠杆菌o-ag开发的基于平台的纯化方法可有效生成高质量产物(图1-4)。
[1024]
表18提供由天然k
p
菌株产生的纯化k
p o-ag的品质属性的概述。
[1025]
表18.纯化的o1和o2克雷伯菌o-ag的品质属性的概述
[1026] o1v1o1v2o2v1o2v2通过sec-hplc的纯度》99.9》99.9》99.9》99.9分子量(kda)8.616.18.012.1残余蛋白(％)0.430.131.190.76残余核酸(％)0.140.050.140.06内毒素(eu/mg)4.31.10.380.15nmr结构鉴别符合符合符合符合
[1027]
本发明的其它实施例在以下编号的条款中阐述：
[1028]
条款1.一种从包括多糖以及污染物的溶液中纯化所述细菌多糖的方法，其中所述方法包括絮凝步骤。
[1029]
条款2.根据条款1所述的方法，其中絮凝剂包括多价阳离子。
[1030]
条款3.根据条款2所述的方法，其中所述多价阳离子选自由铝、铁、钙和镁组成的
群组。
[1031]
条款4.根据条款2所述的方法，其中所述絮凝剂是至少两种选自由铝、铁、钙和镁组成的群组的多价阳离子的混合物。
[1032]
条款5.根据条款2所述的方法，其中所述絮凝剂是至少三种选自由铝、铁、钙和镁组成的群组的多价阳离子的混合物。
[1033]
条款6.根据条款2所述的方法，其中所述絮凝剂是由铝、铁、钙和镁组成的四种多价阳离子的混合物。
[1034]
条款7.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括选自由以下组成的群组的试剂：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、聚乙烯亚胺(pei)、铝酸钠、氯化钙和硅酸钠。
[1035]
条款8.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂选自由以下组成的群组：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。
[1036]
条款9.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是聚乙烯亚胺(pei)。
[1037]
条款10.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括明矾。
[1038]
条款11.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是明矾。
[1039]
条款12.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括钾明矾。
[1040]
条款13.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是钾明矾。
[1041]
条款14.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括钠明矾。
[1042]
条款15.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是钠明矾。
[1043]
条款16.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括铵明矾。
[1044]
条款17.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是铵明矾。
[1045]
条款18.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是两种选自由以下组成的群组的试剂的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、聚乙烯亚胺(pei)、铝酸钠和硅酸钠。在一实施例中，所述絮凝剂选自由以下组成的群组：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。
[1046]
条款19.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是三种选自由以下组成的群组的试剂的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、聚乙烯亚胺(pei)、铝酸钠和硅酸钠。
[1047]
条款20.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是四种选自由以下组成的群组的试剂的混合物：明矾(例如钾明矾、钠明矾或铵明矾)、氯化铝水合物、硫酸铝、氧化钙、氢氧化钙、硫酸铁(ii)(硫酸亚铁)、氯化铁(iii)(三氯化铁)、聚丙烯酰胺、改性聚丙烯酰胺、聚dadmac、铝酸钠和硅酸钠。
[1048]
条款21.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂包括选自由以下组成的群组的试剂：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树(nirmali nut tree))、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。在一实施例中，所述絮凝剂选自由以下组成的群组：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树)、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。
[1049]
条款22.根据条款1所述的方法，其中所述絮凝剂是选自由以下组成的群组的试剂：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树)、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。在一实施例中，所述絮凝剂选自由以下组成的群组：壳聚糖、云母、辣木种子(辣根树)、明胶、马兜铃种子(马兜铃坚果树)、瓜尔豆胶和海藻酸盐(例如褐海藻提取物)。
[1050]
条款23.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度介于约0.1％与约20％(w/v)之间。
[1051]
条款24.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度介于约0.5％与约10％(w/v)之间。
[1052]
条款25.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度介于约1％与约5％(w/v)之间。
[1053]
条款26.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度是约0.1％、约0.25％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约7.5％、约8.0％、约8.5％、约9.0％、约9.5％或约10％(w/v)。
[1054]
条款27.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度是约10.5％、约11.0％、约11.5％、约12.0％、约12.5％、约13.0％、约13.5％、约14.0％、约14.5％、约15.0％、约15.5％、约16.0％、约16.5％、约17.0％、约17.5％、约18.0％、约18.5％、约19.0％、约19.5％或约20.0％(w/v)。
[1055]
条款28.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中絮凝剂的浓度是约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％或约5.0％(w/v)。
[1056]
条款29.根据条款1至22中任一条款所述的方法，其中使用约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％或约4.0％(w/v)的絮凝剂浓度。
[1057]
条款30.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于几秒(例如1至10秒)与约一个月之间的时间段内添加。
[1058]
条款31.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约2秒与约两周之间的时间段内添加。
[1059]
条款32.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约1分钟与约一周之间的时间段内添加。
[1060]
条款33.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约
11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时与约两天之间的时间段内添加。
[1061]
条款34.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间的时间段内添加。
[1062]
条款35.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间的时间段内添加。
[1063]
条款36.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约15分钟与约3小时之间的时间段内添加。
[1064]
条款37.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在介于约30分钟与约120分钟之间的时间段内添加。
[1065]
条款38.根据条款1至29中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在约2秒、约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3.0小时、约3.5小时、约4.0小时、约4.5小时、约5.0小时、约5.5小时、约6.0小时、约6.5小时、约7.0小时、约7.5小时、约8.0小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天的时间段内添加。
[1066]
条款39.根据条款1至38中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在无搅拌下添加。
[1067]
条款40.根据条款1至38中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在搅拌下添加。
[1068]
条款41.根据条款1至38中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在温和搅拌下添加。
[1069]
条款42.根据条款1至38中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂在剧烈搅拌下添加。
[1070]
条款43.根据条款1至42中任一条款所述的方法，其中溶液保持一段时间，以便在下游处理之前沉淀絮状物。
[1071]
条款44.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于几秒
(例如2至10秒)至约1分钟之间的沉淀时间进行。
[1072]
条款45.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155或至少约160分钟的沉淀时间进行。
[1073]
条款46.根据条款1至43所述的方法，其中所述沉淀时间小于一周。
[1074]
条款47.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380、约1440分钟、约两天、约三天、约四天、约五天或约六天与1周之间的沉淀时间进行。
[1075]
条款48.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于几秒(例如1至10秒)与约一个月之间的沉淀时间进行。
[1076]
条款49.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约2秒与约两周之间的沉淀时间进行。
[1077]
条款50.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约1分钟与约一周之间的沉淀时间进行。
[1078]
条款51.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时或约24小时与约两天之间的沉淀时间进行。
[1079]
条款52.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约一天之间的沉淀时间进行。
[1080]
条款53.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时或约12小时与约
一天之间的沉淀时间进行。
[1081]
条款54.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约15分钟与约3小时之间的沉淀时间进行。
[1082]
条款55.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约30分钟与约120分钟之间的沉淀时间进行。
[1083]
条款56.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以约10秒、约30秒、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟、约160分钟、约170分钟、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天的沉淀时间进行。
[1084]
条款57.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320、约1380或约1440分钟和两天的沉淀时间进行。
[1085]
条款58.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约5分钟与约一天之间的沉淀时间进行。
[1086]
条款59.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以介于约5分钟与约120分钟之间的沉淀时间进行。
[1087]
条款60.根据条款1至43中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤以约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约130分钟、约135分钟、约140分钟、约145分钟、约150分钟、约155分钟或约160分钟的沉淀时间进行。
[1088]
条款61.根据条款43至60中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤在无搅拌下进行。
[1089]
条款62.根据条款43至60中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤在搅拌下进行。
[1090]
条款63.根据条款43至60中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤在温和搅拌下进行。
[1091]
条款64.根据条款43至60中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤在剧烈搅拌下进行。
[1092]
条款65.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在酸性ph下进行。
[1093]
条款66.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在低于7.0、6.0、5.0或4.0的ph下进行。
[1094]
条款67.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在介于7.0与1.0之间的ph下进行。
[1095]
条款68.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在介于5.5与2.5、5.0与2.5、4.5与2.5、4.0与2.5、5.5与3.0、5.0与3.0、4.5与3.0、4.0与3.0、5.5与3.5、5.0与3.5、4.5与3.5或4.0与3.5之间的ph下进行。
[1096]
条款69.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在约5.5、约5.0、约4.5、约4.0、约3.5、约3.0、约2.5、约2.0、约1.5或约1.0的ph下进行。
[1097]
条款70.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在约4.0、约3.5、约3.0或约2.5的ph下进行。
[1098]
条款71.根据条款1至64中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤在约3.5的ph下进行。
[1099]
条款72.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸性ph通过用酸酸化溶液来获得。
[1100]
条款73.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸性ph通过用选自由以下组成的群组的酸酸化溶液来获得：hcl、h3po4、柠檬酸、乙酸、亚硝酸和硫酸。
[1101]
条款74.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸性ph通过用氨基酸酸化溶液来获得。
[1102]
条款75.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸性ph通过用选自由甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸组成的群组的氨基酸酸化溶液来获得。
[1103]
条款76.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸性ph通过用硫酸酸化溶液来获得。
[1104]
条款77.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸在搅拌下添加。
[1105]
条款78.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸在温和搅拌下添加。
[1106]
条款79.根据条款65至71中任一条款所述的方法，其中所述酸在剧烈搅拌下添加。
[1107]
条款80.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1108]
条款81.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1109]
条款82.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在约20℃的温度下进行。
[1110]
条款83.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1111]
条款84.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温
度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1112]
条款85.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1113]
条款86.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加在约50℃的温度下进行。
[1114]
条款87.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1115]
条款88.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1116]
条款89.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在约20℃的温度下进行。
[1117]
条款90.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1118]
条款91.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1119]
条款92.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1120]
条款93.根据条款43至86中任一条款所述的方法，其中所述沉淀步骤如果存在则在约50℃的温度下进行。
[1121]
条款94.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1122]
条款95.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1123]
条款96.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则
在约20℃的温度下进行。
[1124]
条款97.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1125]
条款98.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1126]
条款99.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1127]
条款100.根据条款72至93中任一条款所述的方法，其中所述酸化步骤如果存在则在约50℃的温度下进行。
[1128]
条款101.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1129]
条款102.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1130]
条款103.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在约20℃的温度下进行。
[1131]
条款104.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1132]
条款105.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1133]
条款106.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1134]
条款107.根据条款1至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和沉淀步骤如果存在则在约50℃的温度下进行。
[1135]
条款108.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1136]
条款109.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1137]
条款110.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在约20℃的温度下进行。
[1138]
条款111.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1139]
条款112.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1140]
条款113.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1141]
条款114.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加和所述酸化步骤在约50℃的温度下进行。
[1142]
条款115.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在介于约4℃与约30℃之间的温度下进行。
[1143]
条款116.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃的温度下进行。
[1144]
条款117.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在约20℃的温度下进行。
[1145]
条款118.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在介于约30℃至约95℃之间的温度下进行。
[1146]
条款119.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1147]
条款120.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述
沉淀和酸化步骤在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1148]
条款121.根据条款72至79中任一条款所述的方法，其中所述絮凝剂的添加、所述沉淀和酸化步骤在约50℃的温度下进行。
[1149]
条款122.根据条款1至71、80至93或101至107中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤包括在无ph调节的情况下添加絮凝剂。
[1150]
条款123.根据条款1至122中任一条款所述的方法，其中所述絮凝步骤包括添加絮凝剂、调节ph和沉淀溶液。
[1151]
条款124.根据条款123所述的方法，其中所述絮凝剂在调节ph之前添加。
[1152]
条款125.根据条款123所述的方法，其中ph在添加所述絮凝剂之前调节。
[1153]
条款126.根据条款123所述的方法，其中在添加所述絮凝剂和沉淀所述溶液之前调节ph。
[1154]
条款127.根据条款123所述的方法，其中在调节ph之前添加所述絮凝剂和沉淀所述溶液。
[1155]
条款128.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过倾析、沉降、过滤或离心来澄清悬浮液。
[1156]
条款129.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过倾析来澄清悬浮液。
[1157]
条款130.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过水力旋流器来澄清悬浮液。
[1158]
条款131.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过沉降来澄清悬浮液。
[1159]
条款132.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过浮动来澄清悬浮液。
[1160]
条款133.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过过滤来澄清悬浮液。
[1161]
条款134.根据条款1至127中任一条款所述的方法，其中在絮凝之后，通过离心来澄清悬浮液。
[1162]
条款135.根据条款127至134中任一条款所述的方法，其中收集含有多糖的溶液用于储存。
[1163]
条款136.根据条款127至134中任一条款所述的方法，其中收集含有多糖的溶液用于额外处理。
[1164]
条款137.根据条款127至134中任一条款所述的方法，其中储存含有多糖的溶液且随后额外处理。
[1165]
条款138.根据条款134至137中任一条款所述的方法，其中所述离心是持续离心。
[1166]
条款139.根据条款134至137中任一条款所述的方法，其中所述离心是桶式离心。
[1167]
条款140.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以约1,000g、约2,000g、约3,000g、约4,000g、约5,000g、约6,000g、约8,000g、约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g、约25,000g、约30,000g、约35,000g、约40,000g、约50,000g、约60,000g、约70,000g、约80,000g、约90,000g、约100,000g、约120,000g、约140,000g、约160,000g或约180,000g离心。
[1168]
条款141.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以约8,000g、约9,000g、约10,000g、约11,000g、约12,000g、约13,000g、约14,000g、约15,000g、约16,000g、约17,000g、约18,000g、约19,000g、约20,000g或约25,000g离心。
[1169]
条款142.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以介于约5,000g与约25,000g之间离心。
[1170]
条款143.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以介于约8,000g与约20,000g之间离心。
[1171]
条款144.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以介于约10,000g与约15,000g之间离心。
[1172]
条款145.根据条款134至139中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液以介于约10,000g与约12,000g之间离心。
[1173]
条款146.根据条款134至145中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155或至少160分钟期间离心。
[1174]
条款147.根据条款146中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在少于24小时期间离心。
[1175]
条款148.根据条款134至145中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在介于约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约140、约160、约180、约220、约240、约300、约360、约420、约480、约540、约600、约660、约720、约780、约840、约900、约960、约1020、约1080、约1140、约1200、约1260、约1320或约1380分钟与1440分钟之间期间离心。
[1176]
条款149.优选地，悬浮液在介于约5、约10、约15、约20、约25、约30、约60、约90、约120、约180、约240、约300、约360、约420、约480或约540分钟与约600分钟之间期间离心。
[1177]
条款150.根据条款134至145中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在介于约5分钟与约3小时之间期间离心。
[1178]
条款151.根据条款134至145中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在介于约5分钟与约120分钟之间期间离心。
[1179]
条款152.根据条款134至145中任一条款所述的方法，其中所述悬浮液在介于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约105分钟、约110分钟、约115分钟、约120分钟、约125分钟、约
100微米、约3-100微米、约4-100微米、约5-100微米、约6-100微米、约7-100微米、约8-100微米、约9-100微米、约10-100微米、约15-100微米、约20-100微米、约25-100微米、约30-100微米、约40-100微米、约50-100微米或约75-100微米之间的标称保留范围。
[1192]
条款165.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-75微米、约0.05-75微米、约0.1-75微米、约0.2-75微米、约0.3-75微米、约0.4-75微米、约0.5-75微米、约0.6-75微米、约0.7-75微米、约0.8-75微米、约0.9-75微米、约1-75微米、约1.25-75微米、约1.5-75微米、约1.75-75微米、约2-75微米、约3-75微米、约4-75微米、约5-75微米、约6-75微米、约7-75微米、约8-75微米、约9-75微米、约10-75微米、约15-75微米、约20-75微米、约25-75微米、约30-75微米、约40-75微米或约50-75微米之间的标称保留范围。
[1193]
条款166.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-50微米、约0.05-50微米、约0.1-50微米、约0.2-50微米、约0.3-50微米、约0.4-50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米之间的标称保留范围。
[1194]
条款167.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米之间的标称保留范围。
[1195]
条款168.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米之间的标称保留范围。
[1196]
条款169.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米之间的标称保留范围。
[1197]
条款170.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米之间的标称保留范围。
[1198]
条款171.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米之间的标称保留范围。
[1199]
条款172.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[1200]
条款173.根据条款158至159或162至163中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有介于约介于约0.05-50微米、0.1-25微米0.2-10微米、0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米之间的标称保留范围。
[1201]
条款174.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-2500l/m2、5-2500l/m2、10-2500l/m2、25-2500l/m2、50-2500l/m2、75-2500l/m2、100-2500l/m2、150-2500l/m2、200-2500l/m2、300-2500l/m2、400-2500l/m2、500-2500l/m2、750-2500l/m2、1000-2500l/m2、1500-2500l/m2或2000-2500l/m2的过滤能力。
[1202]
条款175.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-1000l/m2、5-1000l/m2、10-1000l/m2、25-1000l/m2、50-1000l/m2、75-1000l/m2、100-1000l/m2、150-1000l/m2、200-1000l/m2、300-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2的过滤能力。
[1203]
条款176.根据条款155至156或159至170中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-750l/m2、5-750l/m2、10-750l/m2、25-750l/m2、50-750l/m2、75-750l/m2、100-750l/m2、150-750l/m2、200-750l/m2、300-750l/m2、400-750l/m2或500-750l/m2的过滤能力。
[1204]
条款177.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-500l/m2、5-500l/m2、10-500l/m2、25-500l/m2、50-500l/m2、75-500l/m2、100-500l/m2、150-500l/m2、200-500l/m2、300-500l/m2或400-500l/m2的过滤能力。
[1205]
条款178.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-400l/m2、5-400l/m2、10-400l/m2、25-400l/m2、50-400l/m2、75-400l/m2、100-400l/m2、150-400l/m2、200-400l/m2或300-400l/m2的过滤能力。
[1206]
条款179.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-300l/m2、5-300l/m2、10-300l/m2、25-300l/m2、50-300l/m2、75-300l/m2、100-300l/m2、150-300l/m2或200-300l/m2的过滤能力。
[1207]
条款180.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-200l/m2、5-200l/m2、10-200l/m2、25-200l/m2、50-200l/m2、75-200l/m2、100-200l/m2或150-200l/m2的过滤能力。
[1208]
条款181.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过滤器具有1-100l/m2、5-100l/m2、10-100l/m2、25-100l/m2、50-100l/m2或75-100l/m2的过滤能力。
[1209]
条款182.根据条款158至159或162至173中任一条款所述的方法，其中所述深度过
滤器具有1-50l/m2、5-50l/m2、10-50l/m2或25-50l/m2的过滤能力。
[1210]
条款183.根据条款158至159或162至182中任一条款所述的方法，其中所述加料速率介于1-1000lmh(升/m2/小时)、10-1000lmh、25-1000lmh、50-1000lmh、100-1000lmh、125-1000lmh、150-1000lmh、200-1000lmh、250-1000lmh、300-1000lmh、400-1000lmh、500-1000lmh、600-1000lmh、700-1000lmh、800-1000lmh或900-1000lmh之间。
[1211]
条款184.根据条款158至159或162至182中任一条款所述的方法，其中所述加料速率介于1-500lmh、10-500lmh、25-500lmh、50-500lmh、100-500lmh、125-500lmh、150-500lmh、200-500lmh、250-500lmh、300-500lmh或400-500lmh之间。
[1212]
条款185.根据条款158至159或162至182中任一条款所述的方法，其中所述加料速率介于1-400lmh、10-400lmh、25-400lmh、50-400lmh、100-400lmh、125-400lmh、150-400lmh、200-400lmh、250-400lmh或300-400lmh之间。
[1213]
条款186.根据条款158至159或162至182中任一条款所述的方法，其中所述加料速率介于1-250lmh、10-250lmh、25-250lmh、50-250lmh、100-250lmh、125-250lmh、150-250lmh或200-250lmh之间。
[1214]
条款187.根据条款158至159或162至182中任一条款所述的方法，其中所述加料速率是约1、约2、约5、约10、约25、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240约250、约260、约270、约280、约290、约300、约310、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000lmh。
[1215]
条款188.根据条款158至187中任一条款所述的方法，其中对滤液进行微过滤。
[1216]
条款189.根据条款188所述的方法，其中所述微过滤是死端过滤。
[1217]
条款190.根据条款188所述的方法，其中所述微过滤是切向微过滤。
[1218]
条款191.根据条款188至190中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米之间的标称保留范围。
[1219]
条款192.根据条款188至190中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[1220]
条款193.根据条款188至190中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2微米的标称保留范围。
[1221]
条款194.根据条款188至190中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有约0.45微米的标称保留。
[1222]
条款195.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-5000l/m2、200-5000l/m2、300-5000l/m2、400-5000l/m2、500-5000l/m2、750-5000l/
m2、1000-5000l/m2、1500-5000l/m2、2000-5000l/m2、3000-5000l/m2或4000-5000l/m2之间的过滤能力。
[1223]
条款196.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-2500l/m2、200-2500l/m2、300-2500l/m2、400-2500l/m2、500-2500l/m2、750-2500l/m2、1000-2500l/m2、1500-2500l/m2或2000-2500l/m2之间的过滤能力。
[1224]
条款197.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-1500l/m2、200-1500l/m2、300-1500l/m2、400-1500l/m2、500-1500l/m2、750-1500l/m2或1000-1500l/m2之间的过滤能力。
[1225]
条款198.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-1250l/m2、200-1250l/m2、300-1250l/m2、400-1250l/m2、500-1250l/m2、750-1250l/m2或1000-1250l/m2之间的过滤能力。
[1226]
条款199.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-1000l/m2、200-1000l/m2、300-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2之间的过滤能力。
[1227]
条款200.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-750l/m2、200-750l/m2、300-750l/m2、400-750l/m2或500-750l/m2之间的过滤能力。
[1228]
条款201.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-600l/m2、200-600l/m2、300-600l/m2、400-600l/m2或400-600l/m2之间的过滤能力。
[1229]
条款202.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于100-500l/m2、200-500l/m2、300-500l/m2或400-500l/m2之间的过滤能力。
[1230]
条款203.根据条款188至194中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1050、约1100、约1150、约1200、约1250、约1300、约1350、约1400、约1450、约1500、约1550、约1600、约1650、约1700、约1750、约1800、约1850、约1900、约1950、约2000、约2050、约2100、约2150、约2200、约2250、约2300、约2350、约2400、约2450或约2500l/m2的过滤能力。
[1231]
条款204.根据条款158至203中任一条款所述的方法，其中通过超滤和/或渗滤进一步处理所述滤液。
[1232]
条款205.根据条款158至203中任一条款所述的方法，其中通过超滤进一步处理所述滤液。
[1233]
条款206.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda之间的范围内。
[1234]
条款207.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约10kda-750kda之间的范围内。
[1235]
条款208.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约10kda-500kda之间的范围内。
[1236]
条款209.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约10kda-300kda之间的范围内。
[1237]
条款210.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在
介于约10kda-100kda之间的范围内。
[1238]
条款211.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约10kda-50kda之间的范围内。
[1239]
条款212.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约10kda-30kda之间的范围内。
[1240]
条款213.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约约5kda-1000kda、约10kda-1000kda、约20kda-1000kda、约30kda-1000kda、约40kda-1000kda、约50kda-1000kda、约75kda-1000kda、约100kda-1000kda、约150kda-1000kda、约200kda-1000kda、约300kda-1000kda、约400kda-1000kda、约500kda-1000kda或约750kda-1000kda之间的范围内。
[1241]
条款214.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约5kda-500kda、约10kda-500kda、约20kda-500kda、约30kda-500kda、约40kda-500kda、约50kda-500kda、约75kda-500kda、约100kda-500kda、约150kda-500kda、约200kda-500kda、约300kda-500kda或约400kda-500kda之间的范围内。
[1242]
条款215.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中分子在5kda-300kda、约10kda-300kda、约20kda-300kda、约30kda-300kda、约40kda-300kda、约50kda-300kda、约75kda-300kda、约100kda-300kda、约150kda-300kda或约200kda-300kda。
[1243]
条款216.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量在介于约5kda-100kda、约10kda-100kda、约20kda-100kda、约30kda-100kda、约40kda-100kda、约50kda-100kda或约75kda-100kda之间的范围内。
[1244]
条款217.根据条款204至205中任一条款所述的方法，其中超滤膜的截留分子量是约5kda、约10kda、约20kda、约30kda、约40kda、约50kda、约60kda、约70kda、约80kda、约90kda、约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约400kda、约500kda、约750kda或约1000kda。
[1245]
条款218.根据条款204至217中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩系数是约1.5至约10。
[1246]
条款219.根据条款204至217中任一条款所述的方法，其中所述浓缩系数是约2至约8。
[1247]
条款220.根据条款204至217中任一条款所述的方法，其中所述浓缩系数是约2至约5。
[1248]
条款221.根据条款204至217中任一条款所述的方法，其中所述浓缩系数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。
[1249]
条款222.根据条款204至217中任一条款所述的方法，其中所述浓缩系数是约2、约3、约4、约5或约6。
[1250]
条款223.根据条款204至222中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在介于约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1251]
条款224.根据条款204至222中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65
℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1252]
条款225.根据条款204至222中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤是在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1253]
条款226.根据条款204至222中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在约50℃的温度下进行。
[1254]
条款227.根据条款158至226中任一条款所述的方法，其中通过渗滤处理超滤滤液。
[1255]
条款228.根据条款227所述的方法，其中替代溶液是水。
[1256]
条款229.根据条款227所述的方法，其中替代溶液是生理盐水。
[1257]
条款230.根据条款229所述的方法，其中所述盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
[1258]
条款231.根据条款229所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
[1259]
条款232.根据条款229所述的方法，其中替代溶液是约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约110mm、约120mm、约130mm、约140mm、约150mm、约160mm、约170mm、约180mm、约190mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm或约500mm的氯化钠。
[1260]
条款233.根据条款227所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液。
[1261]
条款234.根据条款227所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自由以下组成的群组：n-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(aces)、乙酸的盐(醋酸盐)、n-(2-乙酰氨基)-亚胺二乙酸(ada)、2-氨基乙磺酸(aes，牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇ampd，氨甲基丙二醇(ammediol)、n-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(ampso)、n,n-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、n,n'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双-(2-羟基乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(bis-tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(bis-tris-丙烷)、硼酸、二甲基胂酸(二甲胂酸盐)、3-(环己基氨基)-丙磺酸(caps)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(capso)、碳酸钠(碳酸盐)、环己基氨基乙磺酸(ches)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[n-双(羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(dipso)、甲酸的盐(甲酸盐)、甘氨酸、双甘氨肽、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-乙磺酸(hepes)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-3-丙磺酸(hepps，epps)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-2-羟基丙磺酸(heppso)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、2-(n-吗啉基)-乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉基)-丙磺酸(mops)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙磺酸)(popso)、吡啶、丁二酸的盐(丁二酸盐)、3-{[三(羟基甲基)-甲
50mm之间、介于约2mm-50mm之间、介于约3mm-50mm之间、介于约4mm-50mm之间、介于约5mm-50mm之间、介于约6mm-50mm之间、介于约7mm-50mm之间、介于约8mm-50mm之间、介于约9mm-50mm之间、介于约10mm-50mm之间、介于约11mm-50mm之间、介于约12mm-50mm之间、介于约13mm-50mm之间、介于约14mm-50mm之间、介于约15mm-50mm之间、介于约16mm-50mm之间、介于约17mm-50mm之间、介于约18mm-50mm之间、介于约19mm-50mm之间、介于约20mm-50mm之间、介于约25mm-50mm之间、介于约30mm-50mm之间、介于约35mm-50mm之间、介于约40mm-50mm之间或介于约45mm-50mm之间。
[1274]
条款247.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-25mm之间、介于约0.1mm-25mm之间、介于约0.5mm-25mm之间、介于约1mm-25mm之间、介于约2mm-25mm之间、介于约3mm-25mm之间、介于约4mm-25mm之间、介于约5mm-25mm之间、介于约6mm-25mm之间、介于约7mm-25mm之间、介于约8mm-25mm之间、介于约9mm-25mm之间、介于约10mm-25mm之间、介于约11mm-25mm之间、介于约12mm-25mm之间、介于约13mm-25mm之间、介于约14mm-25mm之间、介于约15mm-25mm之间、介于约16mm-25mm之间、介于约17mm-25mm之间、介于约18mm-25mm之间、介于约19mm-25mm之间或介于约20mm-25mm之间。
[1275]
条款248.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-15mm之间、介于约0.1mm-15mm之间、介于约0.5mm-15mm之间、介于约1mm-15mm之间、介于约2mm-15mm之间、介于约3mm-15mm之间、介于约4mm-15mm之间、介于约5mm-15mm之间、介于约6mm-15mm之间、介于约7mm-15mm之间、介于约8mm-15mm之间、介于约9mm-15mm之间、介于约10mm-15mm之间、介于约11mm-15mm之间、介于约12mm-15mm之间、介于约13mm-15mm之间或介于约14mm-15mm之间。
[1276]
条款249.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-10mm之间、介于约0.1mm-10mm之间、介于约0.5mm-10mm之间、介于约1mm-10mm之间、介于约2mm-10mm之间、介于约3mm-10mm之间、介于约4mm-10mm之间、介于约5mm-10mm之间、介于约6mm-10mm之间、介于约7mm-10mm之间、介于约8mm-10mm之间或介于约9mm-10mm之间。
[1277]
条款250.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[1278]
条款251.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约0.1mm、约0.2mm、约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约30mm、约40mm或约50mm。
[1279]
条款252.根据条款233至244中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约10mm。
[1280]
条款253.根据条款233至252中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括螯合剂。
[1281]
条款254.根据条款233至252中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括明矾
螯合剂。
[1282]
条款255.根据条款233至252中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括选自由以下组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n
′
,n
′‑
四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、乙二胺-n,n'-二丙酸二氢氯化物(eddp)、乙二胺-四(亚甲基磺酸)(edtpo)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ntpo)、亚氨基-二乙酸(ida)、羟亚氨基-二乙酸(hida)、氮基-三乙酸(ntp)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、二巯基丁二酸(dmsa)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(dmps)、α类脂酸(ala)、氮基三乙酸(nta)、硫胺四氢呋喃甲基二硫化物(ttfd)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(dfoa)、地拉罗司(deferasirox)、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[1283]
条款256.根据条款233至255中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括选自由以下组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[1284]
条款257.根据条款233至254中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括乙二胺四乙酸(edta)作为螯合剂。
[1285]
条款258.根据条款233至254中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括柠檬酸的盐(柠檬酸盐)作为螯合剂。
[1286]
条款259.根据条款233至254中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括柠檬酸钠作为螯合剂。
[1287]
条款260.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是1至500mm。
[1288]
条款261.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是2至400mm。
[1289]
条款262.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至400mm。
[1290]
条款263.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至200mm。
[1291]
条款264.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至100mm。
[1292]
条款265.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至50mm。
[1293]
条款266.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至30mm。
[1294]
条款267.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂
的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[1295]
条款268.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm或约100mm。
[1296]
条款269.根据条款253至258中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm或约50mm。
[1297]
条款270.根据条款233至269中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括盐。
[1298]
条款271.根据条款270所述的方法，其中所述盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
[1299]
条款272.根据条款270所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
[1300]
条款273.根据条款270至272中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括1、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mm的氯化钠。
[1301]
条款274.根据条款227至273中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。
[1302]
条款275.根据条款227至273中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。
[1303]
条款276.根据条款227至273中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。
[1304]
条款277.根据条款227至276中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在介于约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1305]
条款278.根据条款227至276中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1306]
条款279.根据条款227至276中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤是在约约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、
约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1307]
条款280.根据条款227至276中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[1308]
条款281.根据条款204至277中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1309]
条款282.根据条款204至277中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1310]
条款283.根据条款204至277中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1311]
条款284.根据条款204至277中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约50℃的温度下进行。
[1312]
条款285.根据条款1至284中任一条款所述的方法，其中含有多糖的溶液(例如上清液、滤液或滞留物)通过活性碳过滤步骤处理。
[1313]
条款286.根据条款285中任一条款所述的方法，其中活性碳以粉末、粒状炭床、压制炭块或挤出炭块的形式添加(参见例如诺芮特(norit)活性碳)。
[1314]
条款287.根据条款286所述的方法，其中所述活性碳以约0.1％至20％(重量体积)、1％至15％(重量体积)、1％至10％(重量体积)、2％至10％(重量体积)、3％至10％(重量体积)、4％至10％(重量体积)、5％至10％(重量体积)、1％至5％(重量体积)或2％至5％(重量体积)的量添加。
[1315]
条款288.根据条款286至287中任一条款所述的方法，其中搅拌混合物并静置。
[1316]
条款289.根据条款286至287中任一条款所述的方法，其中搅拌混合物并静置约5、约10、约15、约20、约30、约45、约60、约90、约120、约180、约240分钟或更多分钟。
[1317]
条款290.根据条款286至289中任一条款所述的方法，其中随后去除活性碳。
[1318]
条款291.根据条款286至290中任一条款所述的方法，其中通过离心或过滤去除活性碳。
[1319]
条款292.根据条款285所述的方法，其中通过固定在基质中的活性碳过滤溶液。
[1320]
条款293.根据条款285所述的方法，其中所述基质是溶液可渗透的多孔过滤介质。
[1321]
条款294.根据条款292至293中任一条款所述的方法，其中所述基质包括载体材料。
[1322]
条款295.根据条款292至293中任一条款所述的方法，其中所述基质包括粘合剂材
50微米、约0.5-50微米、约0.6-50微米、约0.7-50微米、约0.8-50微米、约0.9-50微米、约1-50微米、约1.25-50微米、约1.5-50微米、约1.75-50微米、约2-50微米、约3-50微米、约4-50微米、约5-50微米、约6-50微米、约7-50微米、约8-50微米、约9-50微米、约10-50微米、约15-50微米、约20-50微米、约25-50微米、约30-50微米、约40-50微米或约50-50微米之间的标称微米等级。
[1341]
条款314.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-25微米、约0.05-25微米、约0.1-25微米、约0.2-25微米、约0.3-25微米、约0.4-25微米、约0.5-25微米、约0.6-25微米、约0.7-25微米、约0.8-25微米、约0.9-25微米、约1-25微米、约1.25-25微米、约1.5-25微米、约1.75-25微米、约2-25微米、约3-25微米、约4-25微米、约5-25微米、约6-25微米、约7-25微米、约8-25微米、约9-25微米、约10-25微米、约15-25微米或约20-25微米之间的标称微米等级。
[1342]
条款315.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-10微米、约0.05-10微米、约0.1-10微米、约0.2-10微米、约0.3-10微米、约0.4-10微米、约0.5-10微米、约0.6-10微米、约0.7-10微米、约0.8-10微米、约0.9-10微米、约1-10微米、约1.25-10微米、约1.5-10微米、约1.75-10微米、约2-10微米、约3-10微米、约4-10微米、约5-10微米、约6-10微米、约7-10微米、约8-10微米或约9-10微米之间的标称微米等级。
[1343]
条款316.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-8微米、约0.05-8微米、约0.1-8微米、约0.2-8微米、约0.3-8微米、约0.4-8微米、约0.5-8微米、约0.6-8微米、约0.7-8微米、约0.8-8微米、约0.9-8微米、约1-8微米、约1.25-8微米、约1.5-8微米、约1.75-8微米、约2-8微米、约3-8微米、约4-8微米、约5-8微米、约6-8微米或约7-8微米之间的标称微米等级。
[1344]
条款317.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-5微米、约0.05-5微米、约0.1-5微米、约0.2-5微米、约0.3-5微米、约0.4-5微米、约0.5-5微米、约0.6-5微米、约0.7-5微米、约0.8-5微米、约0.9-5微米、约1-5微米、约1.25-5微米、约1.5-5微米、约1.75-5微米、约2-5微米、约3-5微米或约4-5微米之间的标称微米等级。
[1345]
条款318.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米、约1.75-2微米、约2-2微米、约3-2微米或约4-2微米之间的标称微米等级。
[1346]
条款319.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称微米等级。
[1347]
条款320.根据条款285至311中任一条款所述的方法，其中所述活性碳过滤器具有介于约0.05-50微米、0.1-25微米、0.2-10微米、0.1-10微米、0.2-5微米或0.25-1微米之间的标称微米等级。
[1348]
条款321.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-500lmh、10-500lmh、15-500lmh、20-500lmh、25-500lmh、30-500lmh、40-500lmh、50-500lmh、100-500lmh、125-500lmh、150-500lmh、200-500lmh、250-500lmh、300-500lmh或400-500lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1349]
条款322.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-200lmh、10-200lmh、15-200lmh、20-200lmh、25-200lmh、30-200lmh、40-200lmh、50-200lmh、100-200lmh、125-200lmh或150-200lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1350]
条款323.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-150lmh、10-150lmh、15-150lmh、20-150lmh、25-150lmh、30-150lmh、40-150lmh、50-150lmh、100-150lmh或125-150lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1351]
条款324.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-100lmh、10-100lmh、15-100lmh、20-100lmh、25-100lmh、30-100lmh、40-100lmh或50-100lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1352]
条款325.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-75lmh、5-75lmh、10-75lmh、15-75lmh、20-75lmh、25-75lmh、30-75lmh、35-75lmh、40-75lmh、45-75lmh、50-75lmh、55-75lmh、60-75lmh、65-75lmh或70-75lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1353]
条款326.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以介于1-50lmh、5-50lmh、7-50lmh、10-50lmh、15-50lmh、20-50lmh、25-50lmh、30-50lmh、35-50lmh、40-50lmh或45-50lmh之间的加料速率运行活性碳过滤器。
[1354]
条款327.根据条款285至320中任一条款所述的方法，其中以约1、约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约700、约800、约900、约950或约1000lmh的加料速率运行活性碳过滤器。
[1355]
条款328.根据条款285至327中任一条款所述的方法，其中通过活性碳过滤器处理溶液，其中所述过滤器具有介于5-1000l/m2、10-750l/m2、15-500l/m2、20-400l/m2、25-300l/m2、30-250l/m2、40-200l/m2或30-100l/m2之间的过滤能力。
[1356]
条款329.根据条款285至327中任一条款所述的方法，其中通过活性碳过滤器处理溶液，其中所述过滤器具有约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000l/m2的过滤能力。
[1357]
条款330.根据条款285至329中任一条款所述的方法，其中进行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次活性碳过滤步骤。
[1358]
条款331.根据条款285至329中任一条款所述的方法，其中进行1、2或3次活性碳过滤步骤。
[1359]
条款332.根据条款285至329中任一条款所述的方法，其中进行1或2次活性碳过滤步骤。
[1360]
条款333.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过连续活性碳过滤处
理溶液。
[1361]
条款334.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次连续活性碳过滤处理溶液。
[1362]
条款335.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过2、3、4或5次连续活性碳过滤处理溶液。
[1363]
条款336.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过2次连续活性碳过滤处理溶液。
[1364]
条款337.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过3次连续活性碳过滤处理溶液。
[1365]
条款338.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过4次连续活性碳过滤处理溶液。
[1366]
条款339.根据条款285至332中任一条款所述的方法，其中通过5次连续活性碳过滤处理溶液。
[1367]
条款340.根据条款285至339中任一条款所述的方法，其中在单程模式下进行活性碳过滤步骤。
[1368]
条款341.根据条款285至339中任一条款所述的方法，其中在再循环模式下进行活性碳过滤步骤。
[1369]
条款342.根据条款341所述的方法，其中进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次活性碳过滤循环。
[1370]
条款343.根据条款341所述的方法，其中进行2、3、4、5、6、7、8、9或10次活性碳过滤循环。
[1371]
条款344.根据条款341所述的方法，其中进行2或3次活性碳过滤循环。
[1372]
条款345.根据条款341所述的方法，其中进行2次活性碳过滤循环。
[1373]
条款346.根据条款285至345中任一条款所述的方法，其中进一步过滤滤液。
[1374]
条款347.根据条款285至345中任一条款所述的方法，其中对滤液进行微过滤。
[1375]
条款348.根据条款347所述的方法，其中所述微过滤是死端过滤(垂直过滤)。
[1376]
条款349.根据条款347所述的方法，其中所述微过滤是切向微过滤。
[1377]
条款350.根据条款347至349中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于约0.01-2微米、约0.05-2微米、约0.1-2微米、约0.2-2微米、约0.3-2微米、约0.4-2微米、约0.45-2微米、约0.5-2微米、约0.6-2微米、约0.7-2微米、约0.8-2微米、约0.9-2微米、约1-2微米、约1.25-2微米、约1.5-2微米或约1.75-2微米之间的标称保留范围。
[1378]
条款351.根据条款347至349中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有介于约0.01-1微米、约0.05-1微米、约0.1-1微米、约0.2-1微米、约0.3-1微米、约0.4-1微米、约0.45-1微米、约0.5-1微米、约0.6-1微米、约0.7-1微米、约0.8-1微米或约0.9-1微米之间的标称保留范围。
[1379]
条款352.根据条款347至349中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.45、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0微米的标称保
留范围。
[1380]
条款353.根据条款343至345中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有约0.2微米的标称保留范围。
[1381]
条款354.根据条款347至353中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有100-6000l/m2、200-6000l/m2、300-6000l/m2、400-6000l/m2、500-6000l/m2、750-6000l/m2、1000-6000l/m2、1500-6000l/m2、2000-6000l/m2、3000-6000l/m2或4000-6000l/m2的过滤能力。
[1382]
条款355.根据条款347至353中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有100-4000l/m2、200-4000l/m2、300-4000l/m2、400-4000l/m2、500-4000l/m2、750-4000l/m2、1000-4000l/m2、1500-4000l/m2、2000-4000l/m2、2500-4000l/m2、3000-4000l/m2、3000-4000l/m2或3500-4000l/m2的过滤能力。
[1383]
条款356.根据条款347至353中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有100-3750l/m2、200-3750l/m2、300-3750l/m2、400-3750l/m2、500-3750l/m2、750-3750l/m2、1000-3750l/m2、1500-3750l/m2、2000-3750l/m2、2500-3750l/m2、3000-3750l/m2、3000-3750l/m2或3500-3750l/m2的过滤能力。
[1384]
条款357.根据条款347至353中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有100-1250l/m2、200-1250l/m2、300-1250l/m2、400-1250l/m2、500-1250l/m2、750-1250l/m2或1000-1250l/m2的过滤能力。
[1385]
条款358.根据条款347至353中任一条款所述的方法，其中所述微过滤过滤器具有约100、约200、约300、约400、约550、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5250、约5500、约5750或约6000l/m2的过滤能力。
[1386]
条款359.根据条款1至358中任一条款所述的方法，其中含有多糖的溶液或滤液通过疏水相互作用色谱进一步纯化。
[1387]
条款360.根据条款359所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱使用选自由以下组成的群组的疏水吸附剂进行：苯基膜、丁基-琼脂糖、苯基-琼脂糖、辛基-琼脂糖、丁基有机聚合物树脂、苯基有机聚合物树脂、醚有机聚合物树脂、聚丙二醇有机聚合物树脂和己基有机聚合物树脂。
[1388]
条款361.根据条款360所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱使用苯基膜进行。
[1389]
条款362.根据条款361所述的方法，其中所述疏水相互作用色谱使用苯基膜或苯基吸附剂膜进行。
[1390]
条款363.根据条款359至362中任一条款所述的方法，其中用包括盐的平衡缓冲液处理含有多糖的溶液或滤液，以获得盐浓度选自以下的操作缓冲液：约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、
约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0m。
[1391]
条款364.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液的ph是约4.0至约8.0。
[1392]
条款365.根据条款364所述的方法，其中所述操作缓冲液的ph是约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0。
[1393]
条款366.根据条款363至365的方法，其中所述盐是选自硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钠或氯化钠。
[1394]
条款367.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 6.0
±
2.0下包括介于约0.5m与约3.0m之间的浓度的硫酸铵。
[1395]
条款368.根据条款367所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph约6.0下包括介于约1.0m与2.0m之间的浓度的硫酸铵。
[1396]
条款369.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 7.0
±
1.5下包括介于约0.5m与约3.0m之间的浓度的磷酸钠。
[1397]
条款370.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 7.0
±
1.5下包括介于约0.5m与约3.0m之间的浓度的磷酸钾。
[1398]
条款371.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 6.0
±
2.0下包括介于约0.1m与约0.75m之间的浓度的硫酸钠。
[1399]
条款372.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 6.0
±
2.0下包括介于约0.1m与约1.5m之间的浓度的柠檬酸钠。
[1400]
条款373.根据条款363所述的方法，其中所述操作缓冲液在ph 7.0
±
1.5下包括介于约0.5m与约5.0m之间的浓度的氯化钠。
[1401]
条款374.根据条款363至373中任一条款所述的方法，其中用操作缓冲液平衡所述疏水吸附剂。
[1402]
条款375.根据条款360至374中任一条款所述的方法，其中所述疏水吸附剂是苯基膜并且流动速率介于每分钟约0.1与约20个膜体积、每分钟约0.1与约10个膜体积、每分钟约0.2与约10个膜体积、每分钟约0.2与约5个膜体积或每分钟约0.1与约1个膜体积之间。
[1403]
条款376.根据条款375所述的方法，其中流动速率介于每分钟约0.1与约1.0个膜体积之间。
[1404]
条款377.根据条款376所述的方法，其中流动速率是每分钟约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9或约1.0个膜体积。
[1405]
条款378.根据条款363至375中任一条款所述的方法，其中用操作缓冲液洗涤所述疏水吸附剂。
[1406]
条款379.根据条款285至378中任一条款所述的方法，其中通过超滤和/或渗滤进一步澄清所述滤液。
[1407]
条款380.根据条款285至378中任一条款所述的方法，其中通过超滤进一步澄清所述滤液。
[1408]
条款381.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda之间的范围内。
[1409]
条款382.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约10kda-750kda之间的范围内。
[1410]
条款383.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约约10kda-500kda之间的范围内。
[1411]
条款384.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约10kda-300kda之间的范围内。
[1412]
条款385.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约10kda-100kda之间的范围内。
[1413]
条款386.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约10kda-50kda之间的范围内。
[1414]
条款387.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约10kda-30kda之间的范围内。
[1415]
条款388.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约5kda-1000kda、约10kda-1000kda、约20kda-1000kda、约30kda-1000kda、约40kda-1000kda、约50kda-1000kda、约75kda-1000kda、约100kda-1000kda、约150kda-1000kda、约200kda-1000kda、约300kda-1000kda、约400kda-1000kda、约500kda-1000kda或约750kda-1000kda之间的范围内。
[1416]
条款389.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约5kda-500kda、约10kda-500kda、约20kda-500kda、约30kda-500kda、约40kda-500kda、约50kda-500kda、约75kda-500kda、约100kda-500kda、约150kda-500kda、约200kda-500kda、约300kda-500kda或约400kda-500kda之间的范围内。
[1417]
条款390.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约5kda-300kda、约10kda-300kda、约20kda-300kda、约30kda-300kda、约40kda-300kda、约50kda-300kda、约75kda-300kda、约100kda-300kda、约150kda-300kda或约200kda-300kda之间的范围内。
[1418]
条款391.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量在介于约5kda-100kda、约10kda-100kda、约20kda-100kda、约30kda-100kda、约40kda-100kda、约50kda-100kda或约75kda-100kda之间的范围内。
[1419]
条款392.根据条款379或380的方法，其中所述超滤膜的截留分子量是约5kda、约10kda、约20kda、约30kda、约40kda、约50kda、约60kda、约70kda、约80kda、约90kda、约100kda、约110kda、约120kda、约130kda、约140kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约400kda、约500kda、约750kda或约1000kda。
[1420]
条款393.根据条款379至381中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩系数是约1.5至约10.0。
[1421]
条款394.根据条款379至381中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩系数是约2.0至约8.0。
[1422]
条款395.根据条款379至381中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩系
数是约2.0至约5.0。
[1423]
条款396.根据条款379至381中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤的浓缩系数是约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。在一实施例中，浓缩系数是约2.0、约3.0、约4.0、约5.0或约6.0。
[1424]
条款397.根据条款379至396中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在介于约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1425]
条款398.根据条款379至396中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1426]
条款399.根据条款379至396中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤是在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1427]
条款400.根据条款379至396中任一条款所述的方法，其中所述超滤步骤在约50℃的温度下进行。
[1428]
条款401.根据条款379至396中任一条款所述的方法，其中通过渗滤处理超滤滤液。
[1429]
条款402.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是水。
[1430]
条款403.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是生理盐水。
[1431]
条款404.根据条款403所述的方法，其中所述盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
[1432]
条款405.根据条款403所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
[1433]
条款406.根据条款403所述的方法，其中替代溶液是约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约110mm、约120mm、约130mm、约140mm、约150mm、约160mm、约170mm、约180mm、约190mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm或约500mm的氯化钠。
[1434]
条款407.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液。
[1435]
条款408.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自由以下组成的群组：n-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸(aces)、乙酸的盐(醋酸盐)、n-(2-乙酰氨基)-亚胺二乙酸(ada)、2-氨基乙磺酸(aes，牛磺酸)、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇ampd，氨甲基丙二醇(ammediol)、n-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(ampso)、n,n-双-(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、碳酸氢钠(碳酸氢盐)、n,n'-双(2-羟乙基)-甘氨酸(二甘氨酸)、[双-(2-羟基乙基)-亚氨基]-三-(羟甲
基甲烷)(bis-tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(bis-tris-丙烷)、硼酸、二甲基胂酸(二甲胂酸盐)、3-(环己基氨基)-丙磺酸(caps)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(capso)、碳酸钠(碳酸盐)、环己基氨基乙磺酸(ches)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、3-[n-双(羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(dipso)、甲酸的盐(甲酸盐)、甘氨酸、双甘氨肽、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-乙磺酸(hepes)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-3-丙磺酸(hepps，epps)、n-(2-羟基乙基)-哌嗪-n'-2-羟基丙磺酸(heppso)、咪唑、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、2-(n-吗啉基)-乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉基)-丙磺酸(mops)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)、磷酸的盐(磷酸盐)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)、哌嗪-n,n'-双(2-羟基丙磺酸)(popso)、吡啶、丁二酸的盐(丁二酸盐)、3-{[三(羟基甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸(taps)、3-[n-三(羟基甲基)-甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)、三乙醇胺(tea)、2-[三(羟基甲基)-甲氨基]-乙磺酸(tes)、n-[三(羟基甲基)-甲基]-甘氨酸(麦黄酮)和三(羟基甲基)-氨基甲烷(tris)。
[1436]
条款409.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液选自由以下组成的群组：乙酸的盐(醋酸盐)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)、甲酸的盐(甲酸盐)、苹果酸的盐(苹果酸盐)、顺丁烯二酸的盐(顺丁烯二酸盐)、磷酸的盐(磷酸盐)和丁二酸的盐(丁二酸盐)。
[1437]
条款410.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是柠檬酸的盐(柠檬酸盐)。
[1438]
条款411.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是丁二酸的盐(丁二酸盐)。
[1439]
条款412.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是磷酸的盐(磷酸盐)。
[1440]
条款413.根据条款408至412中任一条款所述的方法，所述盐是钠盐。
[1441]
条款414.根据条款408至412中任一条款所述的方法，所述盐是钾盐。
[1442]
条款415.根据条款401所述的方法，其中替代溶液是缓冲溶液，其中缓冲液是磷酸钾。
[1443]
条款416.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph介于约4.0-11.0之间、介于约5.0-10.0之间、介于约5.5-9.0之间、介于约6.0-8.0之间、介于约6.0-7.0之间、介于约6.5-7.5之间、介于约6.5-7.0之间或介于约6.0-7.5之间。
[1444]
条款417.根据条款401至415所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0、约10.5或约11.0。
[1445]
条款418.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5或约9.0。
[1446]
条款419.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是约6.5、约7.0或约7.5。
[1447]
条款420.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是约6.0。
[1448]
条款421.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是
约6.5。
[1449]
条款422.根据条款401至415中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的ph是约7.0。
[1450]
条款423.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-100mm之间、介于约0.1mm-100mm之间、介于约0.5mm-100mm之间、介于约1mm-100mm之间、介于约2mm-100mm之间、介于约3mm-100mm之间、介于约4mm-100mm之间、介于约5mm-100mm之间、介于约6mm-100mm之间、介于约7mm-100mm之间、介于约8mm-100mm之间、介于约9mm-100mm之间、介于约10mm-100mm之间、介于约11mm-100mm之间、介于约12mm-100mm之间、介于约13mm-100mm之间、介于约14mm-100mm之间、介于约15mm-100mm之间、介于约16mm-100mm之间、介于约17mm-100mm之间、介于约18mm-100mm之间、介于约19mm-100mm之间、介于约20mm-100mm之间、介于约25mm-100mm之间、介于约30mm-100mm之间、介于约35mm-100mm之间、介于约40mm-100mm之间、介于约45mm-100mm之间、介于约50mm-100mm之间、介于约55mm-100mm之间、介于约60mm-100mm之间、介于约65mm-100mm之间、介于约70mm-100mm之间、介于约75mm-100mm之间、介于约80mm-100mm之间、介于约85mm-100mm之间、介于约90mm-100mm之间或介于约95mm-100mm之间。
[1451]
条款424.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-50mm之间、介于约0.1mm-50mm之间、介于约0.5mm-50mm之间、介于约1mm-50mm之间、介于约2mm-50mm之间、介于约3mm-50mm之间、介于约4mm-50mm之间、介于约5mm-50mm之间、介于约6mm-50mm之间、介于约7mm-50mm之间、介于约8mm-50mm之间、介于约9mm-50mm之间、介于约10mm-50mm之间、介于约11mm-50mm之间、介于约12mm-50mm之间、介于约13mm-50mm之间、介于约14mm-50mm之间、介于约15mm-50mm之间、介于约16mm-50mm之间、介于约17mm-50mm之间、介于约18mm-50mm之间、介于约19mm-50mm之间、介于约20mm-50mm之间、介于约25mm-50mm之间、介于约30mm-50mm之间、介于约35mm-50mm之间、介于约40mm-50mm之间或介于约45mm-50mm之间。
[1452]
条款425.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-25mm之间、介于约0.1mm-25mm之间、介于约0.5mm-25mm之间、介于约1mm-25mm之间、介于约2mm-25mm之间、介于约3mm-25mm之间、介于约4mm-25mm之间、介于约5mm-25mm之间、介于约6mm-25mm之间、介于约7mm-25mm之间、介于约8mm-25mm之间、介于约9mm-25mm之间、介于约10mm-25mm之间、介于约11mm-25mm之间、介于约12mm-25mm之间、介于约13mm-25mm之间、介于约14mm-25mm之间、介于约15mm-25mm之间、介于约16mm-25mm之间、介于约17mm-25mm之间、介于约18mm-25mm之间、介于约19mm-25mm之间或介于约20mm-25mm之间。
[1453]
条款426.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度介于约0.01mm-15mm之间、介于约0.1mm-15mm之间、介于约0.5mm-15mm之间、介于约1mm-15mm之间、介于约2mm-15mm之间、介于约3mm-15mm之间、介于约4mm-15mm之间、介于约5mm-15mm之间、介于约6mm-15mm之间、介于约7mm-15mm之间、介于约8mm-15mm之间、介于约9mm-15mm之间、介于约10mm-15mm之间、介于约11mm-15mm之间、介于约12mm-15mm之间、介于约13mm-15mm之间或介于约14mm-15mm之间。
[1454]
条款427.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度
介于约0.01mm-10mm之间、介于约0.1mm-10mm之间、介于约0.5mm-10mm之间、介于约1mm-10mm之间、介于约2mm-10mm之间、介于约3mm-10mm之间、介于约4mm-10mm之间、介于约5mm-10mm之间、介于约6mm-10mm之间、介于约7mm-10mm之间、介于约8mm-10mm之间或介于约9mm-10mm之间。
[1455]
条款428.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[1456]
条款429.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约0.1mm、约0.2mm、约1mm、约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约30mm、约40mm或约50mm。
[1457]
条款430.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约30mm。
[1458]
条款431.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约25mm。
[1459]
条款432.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约20mm。
[1460]
条款433.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约15mm。
[1461]
条款434.根据条款407至422中任一条款所述的方法，其中所述渗滤缓冲液的浓度是约10mm。
[1462]
条款435.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括螯合剂。
[1463]
条款436.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括明矾螯合剂。
[1464]
条款437.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括选自由以下组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n
′
,n
′‑
四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、乙二胺-n,n'-二丙酸二氢氯化物(eddp)、乙二胺-四(亚甲基磺酸)(edtpo)、次氮基三(亚甲基膦酸)(ntpo)、亚氨基-二乙酸(ida)、羟亚氨基-二乙酸(hida)、氮基-三乙酸(ntp)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、二巯基丁二酸(dmsa)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(dmps)、α类脂酸(ala)、氮基三乙酸(nta)、硫胺四氢呋喃甲基二硫化物(ttfd)、二巯基丙醇、青霉胺、去铁胺(dfoa)、地拉罗司(deferasirox)、膦酸盐、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[1465]
条款438.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括选自由以下组成的群组的螯合剂：乙二胺四乙酸(edta)、n-(2-羟基乙基)乙二胺-n,n',n'-三乙
酸(edta-oh)、羟基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)、1,2-环己二胺-n,n,n',n'-四乙酸(cydta)、二亚乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸(dtpa)、1,3-二氨基丙-2-醇-n,n,n',n'-四乙酸(dpta-oh)、乙二胺-n,n'-双(2-羟基苯乙酸)(eddha)、柠檬酸的盐(柠檬酸盐)和这些的组合。
[1466]
条款439.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括乙二胺四乙酸(edta)作为螯合剂。
[1467]
条款440.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括柠檬酸的盐(柠檬酸盐)作为螯合剂。
[1468]
条款441.根据条款401至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括柠檬酸钠作为螯合剂。
[1469]
条款442.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是1至500mm。
[1470]
条款443.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是2至400mm。
[1471]
条款444.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至400mm。
[1472]
条款445.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至200mm。
[1473]
条款446.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至100mm。
[1474]
条款447.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至50mm。
[1475]
条款448.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是10至30mm。
[1476]
条款449.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是约0.01mm、约0.05mm、约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95或约100mm。
[1477]
条款450.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm或约100mm。
[1478]
条款451.根据条款435至441中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液中螯合剂的浓度是约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm或约50mm。
[1479]
条款452.根据条款407至451中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括盐。
[1480]
条款453.根据条款452所述的方法，其中所述盐选自由以下组成的群组：氯化镁、氯化钾、氯化钠及其组合。
[1481]
条款454.根据条款452所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
[1482]
条款455.根据条款432至434中任一条款所述的方法，其中所述替代溶液包括1、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250或约300mm的氯化钠。
[1483]
条款456.根据条款401至455中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50。
[1484]
条款457.根据条款401至455中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100。
[1485]
条款458.根据条款401至455中任一条款所述的方法，其中渗滤体积数是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。
[1486]
条款459.根据条款401至458中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在介于约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1487]
条款460.根据条款401至458中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1488]
条款461.根据条款401至458中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤是在约约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1489]
条款462.根据条款401至458中任一条款所述的方法，其中所述渗滤步骤在约50℃的温度下进行。
[1490]
条款463.根据条款379至458中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约20℃至约90℃之间的温度下进行。
[1491]
条款464.根据条款379至458中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在介于约35℃至约80℃之间的温度下、在介于约40℃至约70℃之间的温度下、在介于约45℃至约65℃之间的温度下、在介于约50℃至约60℃之间的温度下、在介于约50℃至约55℃之间的温度下、在介于约45℃至约55℃之间的温度下或在介于约45℃至约55℃之间的温度下进行。
[1492]
条款465.根据条款379至458中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、
约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃的温度下进行。
[1493]
条款466.根据条款379至458中任一条款所述的方法，其中所述超滤和渗滤步骤如果都进行，则在约50℃的温度下进行。
[1494]
条款467.根据条款379至466中任一条款所述的方法，其中所述纯化的多糖溶液通过大小设定来均匀化。
[1495]
条款468.根据条款379至466中任一条款所述的方法，其中对所述纯化的多糖溶液进行机械大小设定。
[1496]
条款469.根据条款379至466中任一条款所述的方法，其中对所述纯化的多糖溶液进行高压均匀化剪切。
[1497]
条款470.根据条款379至466中任一条款所述的方法，其中对所述纯化的多糖溶液进行化学水解。
[1498]
条款471.根据条款379至470中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成目标分子量。
[1499]
条款472.根据条款379至471中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成介于约5kda与约4,000kda之间的分子量。
[1500]
条款473.根据条款379至471中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成介于约10kda与约4,000kda之间的分子量。
[1501]
条款474.根据条款379至471中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成介于约50kda与约4,000kda之间的分子量。
[1502]
条款475.根据条款379至471中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成介于约50kda与约3,500kda之间、介于约50kda与约3,000kda之间、介于约50kda与约2,500kda之间、介于约50kda与约2,000kda之间、介于约50kda与约1,750kda之间、约介于约50kda与约1,500kda之间、介于约50kda与约1,250kda之间、介于约50kda与约1,000kda之间、介于约50kda与约750kda之间、介于约50kda与约500kda之间、介于约100kda与约4,000kda之间、介于约100kda与约3,500kda之间、约100kda与约3,000kda之间、约100kda与约2,500kda之间、约100kda与约2,250kda之间、介于约100kda与约2,000kda之间、介于约100kda与约1,750kda之间、介于约100kda与约1,500kda之间、介于约100kda与约1,250kda之间、介于约100kda与约1,000kda之间、介于约100kda与约750kda之间、介于约100kda与约500kda之间、介于约200kda与约4,000kda之间、介于约200kda与约3,500kda之间、介于约200kda与约3,000kda之间、介于约200kda与约2,500kda之间、介于约200kda与约2,250kda之间、介于约200kda与约2,000kda之间、介于约200kda与约1,750kda之间、介于约200kda与约1,500kda之间、介于约200kda与约1,250kda之间、介于约200kda与约1,000kda之间、介于约200kda与约750kda之间、或介于约200kda与约500kda之间的分子量。在其它此类实施例中，将多糖，纯化的多糖大小设定成介于约250kda与约3,500kda之间、介于约250kda与约3,000kda之间、介于约250kda与约2,500kda之间、介于约250kda与约2,000kda之间、介于约250kda与约1,750kda之间、约介于约250kda与约1,500kda之间、介于约250kda与约1,
250kda之间、介于约250kda与约1,000kda之间、介于约250kda与约750kda之间、介于约250kda与约500kda之间、介于约300kda与约4,000kda之间、介于约300kda与约3,500kda之间、约300kda与约3,000kda之间、约300kda与约2,500kda之间、约300kda与约2,250kda之间、介于约300kda与约2,000kda之间、介于约300kda与约1,750kda之间、介于约300kda与约1,500kda之间、介于约300kda与约1,250kda之间、介于约300kda与约1,000kda之间、介于约300kda与约750kda之间、介于约300kda与约500kda之间、介于约500kda与约4,000kda之间、介于约500kda与约3,500kda之间、介于约500kda与约3,000kda之间、介于约500kda与约2,500kda之间、介于约500kda与约2,250kda之间、介于约500kda与约2,000kda之间、介于约500kda与约1,750kda之间、介于约500kda与约1,500kda之间、介于约500kda与约1,250kda之间、介于约500kda与约1,000kda之间、介于约500kda与约750kda之间或介于约500kda与约600kda之间的分子量。
[1503]
条款476.根据条款379至471中任一条款所述的方法，其中将所述纯化的多糖溶液大小设定成约5kda、约10kda、约15kda、约20kda、约25kda、约30kda、约35kda、约40kda、约45kda、约50kda、约75kda、约90kda、约100kda、约150kda、约200kda、约250kda、约300kda、约350kda、约400kda、约450kda、约500kda、约550kda、约600kda、约650kda、约700kda、约750kda、约800kda、约850kda、约900kda、约950kda、约1000kda、约1250kda、约1500kda、约1750kda、约2000kda、约2250kda、约2500kda、约2750kda、约3000kda、约3250kda、约3500kda、约3750kda或约4,000kda的分子量。
[1504]
条款477.根据条款1至746中任一条款所述的方法，其中所述纯化的多糖溶液经无菌过滤。
[1505]
条款478.根据条款477所述的方法，其中所述无菌过滤是死端过滤。
[1506]
条款479.根据条款477所述的方法，其中所述无菌过滤是切向过滤。
[1507]
条款480.根据条款477至479中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有介于约0.01-0.2微米、约0.05-0.2微米、约0.1-0.2微米或约0.15-0.2微米之间的标称保留范围。
[1508]
条款481.根据条款477至479中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有约0.05、约0.1、约0.15或约0.2微米的标称保留范围。
[1509]
条款482.根据条款477至479中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有约0.2微米的标称保留范围。
[1510]
条款483.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有约25-1500l/m2、50-1500l/m2、75-1500l/m2、100-1500l/m2、150-1500l/m2、200-1500l/m2、250-1500l/m2、300-1500l/m2、350-1500l/m2、400-1500l/m2、500-1500l/m2、750-1500l/m2、1000-1500l/m2或1250-1500l/m2的过滤能力。
[1511]
条款484.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有约25-1000l/m2、50-1000l/m2、75-1000l/m2、100-1000l/m2、150-1000l/m2、200-1000l/m2、250-1000l/m2、300-1000l/m2、350-1000l/m2、400-1000l/m2、500-1000l/m2或750-1000l/m2的过滤能力。
[1512]
条款485.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有过滤能力，25-500l/m2、50-500l/m2、75-500l/m2、100-500l/m2、150-500l/m2、200-500l/m2、250-500l/m2、300-500l/m2、350-500l/m2或400-500l/m2的过滤能力。
[1513]
条款486.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有25-300l/m2、50-300l/m2、75-300l/m2、100-300l/m2、150-300l/m2、200-300l/m2或250-300l/m2的过滤能力。
[1514]
条款487.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有25-250l/m2、50-250l/m2、75-250l/m2、100-250l/m2或150-250l/m2、200-250l/m2的过滤能力。
[1515]
条款488.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有25-100l/m2、50-100l/m2或75-100l/m2的过滤能力。
[1516]
条款489.根据条款477至482中任一条款所述的方法，其中所述过滤器具有约25、约50、约75、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400或约1500l/m2的过滤能力。
[1517]
条款490.根据条款1至489中任一条款所述的方法，其中获得的纯化多糖呈液体溶液形式。
[1518]
条款491.根据条款1至489中任一条款所述的方法，其中获得的纯化多糖呈干燥粉末形式。
[1519]
条款492.根据条款1至489中任一条款所述的方法，其中获得的纯化多糖溶液经冻干。
[1520]
条款493.根据条款1至489或492中任一条款所述的方法，其中获得的纯化多糖溶液是冻干饼。
[1521]
条款494.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是荚膜多糖、荚膜下多糖或脂多糖。
[1522]
条款495.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是荚膜多糖。
[1523]
条款496.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自金黄色葡萄球菌的荚膜多糖。
[1524]
条款497.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自金黄色葡萄球菌5型的荚膜多糖。
[1525]
条款498.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自金黄色葡萄球菌8型的荚膜多糖。
[1526]
条款499.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自粪肠球菌的荚膜多糖。
[1527]
条款500.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖。
[1528]
条款501.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌的荚膜多糖。
[1529]
条款502.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(mena)、脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)、脑膜炎奈瑟菌血清组y(meny)、脑膜炎奈瑟菌血清组x(menx)或脑膜炎奈瑟菌血清组c(menc)的荚膜多糖。
[1530]
条款503.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(mena)的荚膜多糖。
[1531]
条款504.根据条款1至493中任一条款，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)的荚膜多糖。
[1532]
条款505.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(meny)的荚膜多糖。
[1533]
条款506.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(menx)的荚膜多糖。
[1534]
条款507.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(menc)的荚膜多糖。
[1535]
条款508.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌的荚膜多糖。
[1536]
条款509.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自无乳链球菌(b组链球菌(gbs))的荚膜多糖。
[1537]
条款510.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是选自由以下组成的群组的荚膜多糖：来自gbs ia型、ib型、ii型、iii型、iv型、v型、vi型、vii型和viii型的荚膜多糖。
[1538]
条款511.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自致泻性大肠杆菌族(eec族)的大肠杆菌菌株部分的荚膜多糖。
[1539]
条款512.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自致泻性大肠杆菌族(eec族)的大肠杆菌菌株部分，如肠毒性大肠杆菌(etec)、肠病原性大肠杆菌(epec)、o157:h7肠出血性大肠杆菌(ehec)或肠侵袭性大肠杆菌(eiec)的荚膜多糖。在一实施例中，细菌荚膜多糖的来源是尿道致病性大肠杆菌(upec)。
[1540]
条款513.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由以下组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖：血清型o157:h7、o26:h11、o111:h-和o103:h2。
[1541]
条款514.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由血清型o6:k2:h1和o18:k1:h7组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖。
[1542]
条款515.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由血清型o45:k1、o17:k52:h18、o19:h34和o7:k1组成的群组的大肠杆菌血清型的荚膜多糖。
[1543]
条款516.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型o104:h4的荚膜多糖。
[1544]
条款517.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型o1:k12:h7的荚膜多糖。
[1545]
条款518.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型o127:h6的荚膜多糖。
[1546]
条款519.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型o139:h28的荚膜多糖。
[1547]
条款520.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自大肠杆菌血清型o128:h2的荚膜多糖。
[1548]
条款521.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌的荚膜多糖。
[1549]
条款522.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由以下组成的群组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：血清型1、2、3、4、5、6a、6b、6c、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、14、15a、15b、15c、16f、17f、18c、19a、19f、20、22f、23a、23b、23f、24b、24f、29、31、33f、34、35b、35f、38、72和73。
[1550]
条款523.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由以下组成的群组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9v、9n、10a、11a、12f、14、15a、15b、15c、16f、17f、18c、19a、19f、20、22f、23a、23b、23f、24f、29、31、33f、35b、35f、38、72和73。
[1551]
条款524.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自选自由以下组成的群组的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：血清型8、10a、11a、12f、15b、22f和33f。
[1552]
条款525.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型1的荚膜多糖。
[1553]
条款526.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型2的荚膜多糖。
[1554]
条款527.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型3的荚膜多糖。
[1555]
条款528.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型4的荚膜多糖。
[1556]
条款529.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型5的荚膜多糖。
[1557]
条款530.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6a的荚膜多糖。
[1558]
条款531.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6b的荚膜多糖。
[1559]
条款532.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型6c的荚膜多糖。
[1560]
条款533.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型7f的荚膜多糖。
[1561]
条款534.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型8的荚膜多糖。
[1562]
条款535.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型9v的荚膜多糖。
[1563]
条款536.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型9n的荚膜多糖。
[1564]
条款537.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型10a的荚膜多糖。
[1565]
条款538.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型11a的荚膜多糖。
[1566]
条款539.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型12f的荚膜多糖。
[1567]
条款540.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型14的荚膜多糖。
[1568]
条款541.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15a的荚膜多糖。
[1569]
条款542.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15b的荚膜多糖。
[1570]
条款543.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型15c的荚膜多糖。
[1571]
条款544.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型16f的荚膜多糖。
[1572]
条款545.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型17f的荚膜多糖。
[1573]
条款546.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型18c的荚膜多糖。
[1574]
条款547.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型19a的荚膜多糖。
[1575]
条款548.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型19f的荚膜多糖。
[1576]
条款549.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20的荚膜多糖。
[1577]
条款550.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20a的荚膜多糖。
[1578]
条款551.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型20b的荚膜多糖。
[1579]
条款552.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型22f的荚膜多糖。
[1580]
条款553.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23a的荚膜多糖。
[1581]
条款554.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23b的荚膜多糖。
[1582]
条款555.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型23f的荚膜多糖。
[1583]
条款556.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型24b的荚膜多糖。
[1584]
条款557.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎
链球菌血清型24f的荚膜多糖。
[1585]
条款558.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型29的荚膜多糖。
[1586]
条款559.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型31的荚膜多糖。
[1587]
条款560.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型33f的荚膜多糖。
[1588]
条款561.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型34的荚膜多糖。
[1589]
条款562.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型35b的荚膜多糖。
[1590]
条款563.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型35f的荚膜多糖。
[1591]
条款564.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型38的荚膜多糖。
[1592]
条款565.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型72的荚膜多糖。
[1593]
条款566.根据条款1至493中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自肺炎链球菌血清型73的荚膜多糖。
[1594]
条款567.一种纯化的细菌多糖，其通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得。
[1595]
条款568.一种纯化的细菌多糖，其可通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得。
[1596]
条款569.一种通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得的纯化的细菌多糖，其用作抗原。
[1597]
条款570.一种通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得的纯化的细菌多糖，其与载体蛋白缀合。
[1598]
条款571.一种通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得的纯化的细菌多糖，其进一步与载体蛋白缀合。
[1599]
条款572.一种纯化的细菌多糖的糖缀合物，其通过根据条款1至566中任一条款所述的方法获得。
[1600]
条款573.一种免疫原性组合物，其包括根据条款567至568中任一条款所述的纯化多糖中的任一种。
[1601]
条款574.一种免疫原性组合物，其包括根据条款571至572中任一条款所述的糖缀合物。
[1602]
条款575.一种免疫原性组合物，其包括本文所公开的糖缀合物中的任一种。
[1603]
条款576.一种免疫原性组合物，其包括本文所公开的糖缀合物的组合中的任一种。
[1604]
条款577.一种用于从包括多糖以及污染物的溶液中纯化来自脑膜炎奈瑟菌血清
组a(mena)、脑膜炎奈瑟菌血清组w135(menw135)、脑膜炎奈瑟菌血清组y(meny)、脑膜炎奈瑟菌血清组x(menx)或脑膜炎奈瑟菌血清组c(menc)的所述荚膜多糖的方法，其中所述方法包括絮凝步骤和色谱法步骤。
[1605]
条款578.一种根据条款577所述的方法，其中所述色谱法步骤是疏水相互作用色谱(hic)步骤。
[1606]
条款579.一种根据条款578所述的方法，其中所述hic步骤如条款359至378中所定义。
[1607]
条款580.一种根据条款578和根据条款2至493中任一条款所述的方法。
[1608]
条款581.一种根据条款578至5809中任一条款所述的方法，其中所述细菌多糖是来自脑膜炎奈瑟菌血清组a(menc)的荚膜多糖。
[1609]
条款582.一种根据条款581所述的方法，其中所述方法进一步包括hic步骤前的离子交换色谱法步骤。
[1610]
条款583.一种根据条款582所述的方法，其中所述方法不包括活性碳过滤步骤。