一株产高分子量普鲁兰多糖的短梗霉YAT007菌株及其应用

一株产高分子量普鲁兰多糖的短梗霉yat007菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高分子量普鲁兰多糖的菌株筛选鉴定、制 备方法及应用。


背景技术：

2.普鲁兰多糖是一种由α-(1
→
4)糖苷键和α-(1
→
6)糖苷键交替连接形成的线性α-葡聚糖，这 种结构使普鲁兰多糖分子具有成膜性、无毒、无味、无免疫原性、无致癌性、可生物降解、 等优良性能，使其在食品工业、医药工业、化妆品等领域许多行业具有应用价值。2006年， 中华人民共和国卫生部第8号公告声明普鲁兰多糖安全无毒，可作为食品添加剂、成膜剂和 增稠剂。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。普 鲁兰多糖广泛的应用价值引起了国内外很多专家学者对高产普鲁兰多糖的菌株进行开发研 究。为了快速地获得高产普鲁兰多糖的菌株，一方面人们对不同生态环境中高产普鲁兰多糖 的野生型菌株进行筛选和鉴定；另一方面人们利用物理和化学诱变的方法筛选高产普鲁兰多 糖的菌株。2019年和2020年，chen等人利用基因敲除、回补和超表达以及异源表达手段， 发现了普鲁兰多糖合成酶amags2，完整的解析了产黑色素短梗霉p16菌株产普鲁兰多糖的 合成机制。
3.以普鲁兰多糖作为原材料可以制备软胶囊和硬胶囊，它的空气阻隔性极强，水分含量低， 韧性高，可有效包括内容物避免氧化变质，能够为药品提供更有效的保护；且稳定性强、与 药品配伍性良好，适应于各种药物的填充，不会发生美拉德、交联等反应。以普鲁兰多糖作 为原材料可以制备胶囊，因其纯天然植物来源，可满足素食的要求。动物来源的蛋白质产品 可能会携带病毒感染人类，所以用明胶制备的胶囊具有许多潜在的危险。由普鲁兰多糖和其 他胞外多糖制成的胶囊壳可以替代有诸多缺点的明胶胶囊，并且微生物产生的多糖是绿色安 全的。以普鲁兰多糖为原材料制备胶囊，要求普鲁兰多糖具有良好的稳定性和结构强度，这 都是由普鲁兰多糖的分子量(mw)决定的。普鲁兰多糖分子量(mw)越高，其强度和应用 性就越高；高分子量的普鲁兰多糖是作为药物胶囊制造和化妆品工业的重要材料之一，因此， 开发生产高分子量普鲁兰多糖的方法尤为重要。


技术实现要素：

4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：高分子量普鲁兰多糖的高产菌株，所述 高产菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)yat007，已保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号为cgmcc 40201。
5.产黑色素短梗霉yat007菌株的筛选方法，包括以下步骤：
6.于连云港海州湾燕尾港海域(34
°
29
′0″
n，119
°
47
′0″
e)采集海泥样品，称取1g海泥样 品，加入到9ml无菌水中，用玻璃棒搅拌约20min，使样品与无菌水充分混合，将其进行 10倍浓度梯度稀释，稀释为10-4
、10-5
、10-6
等不同的稀释度；
7.将稀释液倒到产黑色素pda培养基(加入100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml氯霉素)
上， 每种浓度分别涂布三个平板。培养3d后挑取在培养基上产生黑色素的菌株；
8.挑选的单菌落接种在ypd培养基和产黑色素pda培养基上并进行纯培养和复筛，在 28℃培养箱中培养2d后，移入4℃的冰箱内保存备用。
9.将待筛菌株活化后接种至种子培养基，在28℃和180rpm条件下培养24小时，然后将 2.5ml种子液接种至50ml产普鲁兰多糖筛选培养基中，在28℃和180rpm下摇瓶培养3-5 天，并观察菌落形态，筛选出产普鲁兰多糖最多的菌株，命名为yat007。
10.所述产黑色素短梗霉yat007菌株用于生产普鲁兰多糖。
11.利用所述产黑色素短梗霉yat007菌株生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：
12.(1)菌种活化：将4℃斜面保藏产黑色素短梗霉yat007菌株转接到pda培养基培养 活化；
13.(2)种子培养：将yat007菌株挑取单菌落接种于种子培养基培养获得种子液；
14.(3)发酵培养：按照10％(v/v)接种量将种子液转接至发酵培养基进行发酵培养；
15.(4)胞外多糖的提取和纯化：发酵结束后取酵液煮沸后离心，取上清液加入预冷的无水 乙醇，冷却过夜静置沉淀，离心后弃去上清液，收集沉淀，烘至恒重得到胞外多糖，将粗提 的胞外多糖加入无菌去离子水溶解后，重复乙醇进行沉淀提取纯化。
16.步骤(1)中菌种培养活化条件为28
±
2℃培养4～6天。
17.步骤(2)中种子培养条件为28℃，180rpm，培养24h。
18.步骤(3)中的接种比例为10％(v/v)，发酵产酶条件为28℃，180rpm条件下进行发 酵培养120小时。
19.优选地，步骤(4)中胞外多糖的提取和纯化的条件为：发酵结束后取酵液至离心管中， 12000
×
g离心10min，取上清于100℃煮沸15min后12000
×
g离心10min，冷却至室温， 取上清液于新的离心管中，加入预冷的无水乙醇，充分混匀，4℃过夜静置沉淀，9000
×
g， 4℃离心5min，弃上清液，80℃烘至恒重，将粗提的胞外多糖加入无菌去离子水溶解后，重 复乙醇进行沉淀提取纯化3次。
20.由所述的普鲁兰多糖制备而成的硬胶囊，包括以下组分：0.85份结冷胶，200份普鲁兰 多糖，17份甘油，1.3柠檬酸钾。
21.所述产黑色素短梗霉yat007菌株生产的普鲁兰多糖普用于制备结冷胶基硬胶囊的方 法，包括以下步骤：
22.将普鲁兰多糖用万能粉碎机粉碎、过筛、密封；
23.按照结冷胶浓度为0.85g/l，普鲁兰多糖浓度为200.0g/l，甘油浓度为17.0g/l，柠檬酸 钾浓度为1.3g/l，配制100ml混合胶液，将混合胶液进行超声脱气处理，于50℃条件下保 温30min；
24.在15℃条件下蘸胶后，于50℃干燥箱中干燥30min，进行拔壳、剪切、套合、储存即可 获得普鲁兰多糖-结冷胶基硬胶囊。
25.本发明的有益效果：相比之前报道的短梗霉菌株，yat007菌株胞外普鲁兰多糖浓度高且 分子量大；且yat007菌株产高分子普鲁兰多糖制备的普鲁兰多糖-结冷胶基硬胶囊具有良好 的性能，因此本研究筛选到的yat007菌株在胞外多糖的生产中有很好的应用前景。
附图说明
26.图1：产黑色素短梗酶yat007菌株的菌落与细胞形态(a：ypd培养基菌落形态；b： pda培养基菌落形态；c：细胞形态观察)
27.图2：yat007菌株与其他菌株的its序列比对结果
28.图3：产黑色素短梗酶yat007菌株胞外多糖的提取与纯化(a：乙醇沉淀；b纯化后普 鲁兰多糖；)
29.图4：产黑色素短梗酶yat007菌株胞外多糖酶解产物tlc图(1：葡萄糖标准品；2： 蔗糖标准品；3：麦芽糖标准品；4：麦芽三糖标准品；5：普鲁兰多糖标准品酶解产物；6： yat007菌株胞外多糖酶解产物)
30.图5：产黑色素短梗酶yat007菌株胞外多糖酶解产物hplc图
31.图6：yat007菌株胞外普鲁兰多糖为材料制备的胶囊
具体实施方式
32.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本 发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
33.实施例1yat007菌株的筛选
34.于连云港海州湾燕尾港海域(34
°
29
′0″
n，119
°
47
′0″
e)采集海泥样品，称取1g海泥样 品，加入到9ml无菌水中，用玻璃棒搅拌约20min，使样品与无菌水充分混合，将其进行 10倍浓度梯度稀释。稀释为10-4
、10-5
、10-6
等不同的稀释度后，将稀释液倒到产黑色素pda 培养基(加入100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml氯霉素)上，每种浓度分别涂布三个平板。 培养3d后挑取在培养基上产生黑色素的菌株。将单菌落接种在ypd培养基和产黑色素pda 培养基上并进行纯培养和复筛，在28℃培养箱中培养2d后，移入4℃的冰箱内保存备用。 将待筛菌株活化后接种至种子培养基，在28℃和180rpm条件下培养24小时，然后将2.5ml 种子液接种至50ml产普鲁兰多糖筛选培养基中，在28℃和180rpm下摇瓶培养3-5天，并 观察菌落形态，筛选出产普鲁兰多糖最多的菌株，命名为yat007。
35.ypd培养基：酵母粉10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，葡萄糖20.0g/l，固体培养基加入20.0 g/l的琼脂，蒸馏水配置，ph自然，115℃灭菌30min。
36.产黑色素pda固体培养基：马铃薯200.0g/l(煮沸20-30min，过滤使用)，葡萄糖20.0 g/l，琼脂20.0g/l，蒸馏水配置，ph自然，在115℃下灭菌30min。
37.产普鲁兰多糖筛选培养基：蔗糖80g/l，酵母粉3g/l，磷酸氢二钾5g/l，氯化钠1g/l， 七水硫酸镁0.2g/l，硫酸铵0.6g/l，蒸馏水配置，ph 7.0，在115℃下灭菌30分钟。
38.结果如图1所示，yat007菌株在ypd培养基菌落边缘为放射状，菌落挑起时有拉丝现 象；yat007菌株在pda培养基菌落明显发黑，有黑色素产生，菌落边缘为放射状，且菌落 表面有明显的粘稠状物质。yat007菌株在ypd液体培养基中的细胞为典型的酵母状，为卵 圆形。
39.实施例2yat007菌株的分子生物学鉴定
40.使用酵母基因组提取试剂盒提取yat007菌株的基因组，并利用its的通用引物(its-f： 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'；its-r：5'-tcctccgcttattgatatgc-3')，pcr扩 增菌株基因组dna中的its基因片段。将pcr验证正确的转化子提取质粒送至测序公司进 行测
序，并将测序结果在ncbi上进行blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)， 对结果进行分析。
41.如图2所示，yat007菌株的its基因序列比对结果显示该菌株属于短梗霉属，综合形 态学的结果初步鉴定为产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)。
42.实施例3yat007菌株胞外多糖的提取和纯化
43.将4℃斜面保藏产黑色素短梗霉yat007菌株转接到pda培养基，28
±
2℃培养4～6天。 挑取yat007单菌落接种于30ml种子培养基，28℃，180rpm，培养24h。按照10％(v/v) 接种量将种子液转接至50ml发酵培养基，28℃，180rpm，培养120h。发酵结束后取30ml 发酵液至50ml离心管中，12000
×
g离心10min，取上清于100℃煮沸15min后12000
×
g 离心10min，冷却至室温，取10ml上清液于新的50ml离心管中，加入20ml预冷的无水 乙醇，充分混匀，4℃过夜静置沉淀。9000
×
g，4℃离心5min，弃上清液，80℃烘至恒重。 将粗提的胞外多糖加入无菌去离子水溶解后，在反复使用乙醇进行沉淀提取进行纯化。
44.种子培养基(w/v)：2.0％蔗糖，0.3％酵母粉，0.06％(nh4)2so4，0.5％k2hpo4， 0.02％mgso4
·
7h2o，0.1％nacl，蒸馏水配制，115℃灭菌30min。
45.发酵培养基(w/v)：12.0％蔗糖，0.3％酵母粉，0.06％(nh4)2so4，0.5％k2hpo4， 0.02％mgso4
·
7h2o，0.1％nacl，蒸馏水配制，115℃灭菌30min。
46.如图3所示，加入无水乙醇后有白色的沉淀析出，反复溶解和沉淀后沉淀出来的多糖如 棉花状。
47.实施例4yat007菌株胞外多糖的tlc分析
48.配制1.0％(w/v)纯化后的胞外多糖溶液和1.0％(w/v)普鲁兰多糖标准品溶液各300.0 μl，添加30.0μl普鲁兰酶液和280.0μl 50.0mm的醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 4.5)，对照组 为1.0％(w/v)胞外多糖溶液300.0μl添加30.0μl普鲁兰酶灭活液和280.0μl 50mm的醋 酸-醋酸钠缓冲液(ph 4.5)，在60℃水浴条件下反应30min。反应结束后，沸水浴10min 灭活，冷却后12000
×
g，离心10min，收集上清液。
49.截取尺寸合适的硅胶板，在距离底部1.5cm处画一条直线，每隔1cm画点作为点样孔。 将配制的1.0％(w/v)葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖标准溶液和上述中所制备酶解上清液样品 进行点样分析，点样量为0.2μl，吹风机吹干，重复3次。在通风橱内，将硅胶板放入层析 缸中，确保展层剂液面在点样线以下。展层40min后，取出吹风机吹干。将显色剂均匀的喷 洒在硅胶板上，吹风机吹干，于80℃烘箱显色，并拍照。
50.如图4所示，在普鲁兰酶的催化下，纯化的胞外多糖水解释放出大量的还原糖，而通过 薄层层析tlc结果发现，经纯化的胞外多糖水解出的还原糖是麦芽三糖。
51.实施例5yat007菌株胞外多糖的hplc分析
52.称取一定量纯化的胞外多糖于安瓿瓶中，加入4ml 2m三氟乙酸(tfa)，氮吹后将安 瓿瓶密封置于110℃条件下反应6h，反应结束后冷却至室温，减压旋干tfa。加入1ml甲 醇重新溶解后旋蒸干，重复该操作三次。加入1ml的超纯水溶解蒸干的样品，12000
×
g，离 心10min，收集上清液过0.22μm滤膜后进行hplc分析。色谱系统：agilent-1200hplc系 统，示差折光检测器；色谱柱：hplc carbohydrate analysis column hpx-87c(250
×
4mm)； 流动相：超纯水；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl。
53.如图5所示，参照麦芽三糖标准品的出峰时间可以看出，yat007菌株所产胞外多糖
酶解 产物与麦芽三糖标准品或普鲁兰多糖酶解产物的出峰时间一直，综合tlc分析结果表明 yat007菌株所产胞外多糖为普鲁兰多糖。
54.实施例6yat007菌株普鲁兰多糖产量、菌体干重和普鲁兰多糖分子量的测定
55.(1)普鲁兰多糖浓度测定
56.将yat007菌株挑取单菌落接种于30ml种子培养基，28℃，180rpm，培养24h。按照 10％(v/v)接种量将种子液转接至50ml发酵培养基，28℃，180rpm，培养120h。发酵结 束后取30ml发酵液至50ml离心管中，12000
×
g离心10min，取上清于100℃煮沸15min 后12000
×
g离心10min，冷却至室温，取10ml上清液于新的50ml离心管中，加入20ml 预冷的无水乙醇，充分混匀，4℃过夜静置沉淀。9000
×
g，4℃离心5min，弃上清液，80℃ 烘至恒重。
57.(2)菌体干重测定
58.取30ml发酵液于50ml离心管中，12000
×
g离心10min，弃上清。用30ml蒸馏水清 洗菌体，12000
×
g离心10min，弃上清。重复1-2次后将菌体放于80℃烘箱至恒重。
59.(3)普鲁兰多糖分子量的测定
60.将普鲁兰多糖纯化冻干，溶于去离子水配制成浓度为5mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜 过滤。样品使用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography)对普鲁兰多糖的分子量进行 测定。标准品为相同浓度的普鲁兰多糖(sigma，美国)；凝胶色谱仪：wyatt dawn heleosii型模块式凝胶色谱仪；色谱柱：styagel r hmw 6e gpc柱。
61.如表1所示，将yat007菌株接种于50ml发酵培养基中，28℃，180rpm，摇瓶培养 120h，发酵结束后测定yat007菌株发酵液中普鲁兰多糖的浓度为83.55
±
4.7g/l，菌体干重 23.35
±
1.3g/l，普鲁兰多糖分子量为1.22
×
107da。之前报道的短梗霉菌株以蔗糖为碳源发酵 时，胞外多糖浓度普遍不高。yat007菌株胞外普鲁兰多糖浓度高且分子量大，因此本研究筛 选到的yat007菌株在胞外多糖的生产中有很好的应用前景。
62.表1yat007菌株普鲁兰多糖产量、菌体干重及普鲁兰多糖分子量
[0063][0064]
实施例7普鲁兰多糖-结冷胶基硬胶囊的制备
[0065]
将yat007菌株10-升发酵罐分批发酵的发酵液经12000
×
g离心10min后获得上清液， 上清液经石灰乳-磷酸法脱蛋白后收集的滤液与95％(v/v)的乙醇以1.0:2.0的体积比混合， 在4℃层析柜中沉淀过夜，将沉淀的普鲁兰多糖置于95.0％(v/v)的乙醇中脱水两次，无水 乙醇脱水一次，脱水后的普鲁兰多糖置于鼓风干燥箱中50℃干燥至重量恒定，将干燥的普鲁 兰多糖用万能粉碎机粉碎、过筛、密封。按照结冷胶浓度为0.85g/l，普鲁兰多糖浓度为200.0 g/l，甘油浓度为17.0g/l，柠檬酸钾浓度为1.3g/l，配制100ml混合胶液，将混合胶液进 行超声脱气处理，于50℃条件下保温30min，在15℃条件下蘸胶后，于50℃干燥箱中干燥30min，进行拔壳、剪切、套合、储存即可获得普鲁兰多糖-结冷胶基硬胶囊。
[0066]
如图6所示，以yat007菌株所产的普鲁兰多糖为原材料，按照比例配置混合胶液，胶 液经脱气和保温处理后，通过蘸胶、拔壳、剪切、套合、储存即可获得普鲁兰多糖/结冷胶基 胶囊，获得的以普鲁兰多糖为原材料制备的胶囊是透明、美观、光滑的，该结果与文献报
道 一致。