一种几丁寡糖的制备方法与流程

1.本发明涉及一种几丁寡糖的制备方法，特别涉及一种非特异性酶降解改性几丁质制备几丁寡糖的方法。


背景技术：

2.几丁质(chitin)，又名甲壳素，由n-乙酰-d-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成，是自然界中第二大丰富的多糖，仅次于纤维素，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物的外壳中。近年来，随着海鲜的加工和消费量的与日增长，虾蟹壳废弃物也逐年增多，尽管有小部分虾蟹壳废弃物被用于堆肥或者转换成其他附加值产品，也一定程度上为目前商品化几丁质开发提供来源，但由于受市场和技术的限制，大部分的虾蟹壳废弃物在未经处理的情况下直接堆弃在环境中，不仅严重污染环境，也极大浪费了几丁质资源。
3.几丁质因具有分子量大、结晶度高、分子内和分子间氢键较强等特点，使其不溶于水、稀酸、稀碱和一般的有机溶剂，酶促降解率低，商业应用受到严重限制。而几丁质的降解产物几丁寡糖，具有分子量低、水溶性好、易于分散和吸收等特点，已被广泛应用于食品、医药和农业等多种领域。目前几丁寡糖主要通过几丁质酶降解而得，几丁质酶来源广泛，如细菌、植物和真菌等。目前筛选出的产生几丁质酶的微生物有很多，如类芽孢杆菌属(paenibacillus)、链霉菌属(streptomyces)和芽胞杆菌属(bacillus)等，但是目前已报道的野生型菌株产几丁质酶活力较低，利用率不高，导致几丁寡糖制备成本高，产业化受限。因此寻找来源广、易获得且价格低廉和降解效率高的几丁质非特异性降解酶代替传统的几丁质酶，已成为几丁质加工行业中亟待解决的问题。
4.另外，几丁质改性作为几丁质酶促降解的前处理工艺，能够有效提高几丁质的降解效率，并且操作简单，目前，已有多种物理方法改性的报道，包括超微粉碎、蒸汽爆炸、瞬时弹射蒸汽爆炸、超声和高压均质等。此外，还有使用有机溶剂、离子液体和超临界水对几丁质进行化学预处理的报道。蒸汽爆破和瞬时弹射蒸汽爆炸原理相似，利用蒸汽强大的渗透力，破坏几丁质的晶体结构，但是，该方法对几丁质的乙酰化会造成极大地破坏。超声能够打破几丁质相对薄弱的氢键和范德华力，但是，经过冻干后，样品会恢复晶体结构，不能降低结晶度，甚至会稍微变大。有机溶剂本身就具有毒性，并且会对环境造成一定的污染。离子液体价格较为昂贵。超临界水对处理条件要求较高。而超微粉碎和高压均质可以克服几丁质对溶剂的需要，破坏几丁质的结晶度，削弱分子间的氢键网络，并且操作简单，成本较低。目前，关于超微粉碎和高压均质联合处理几丁质的报道较少。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种非特异性酶降解改性几丁质制备几丁寡糖的方法。
6.一种几丁寡糖的制备方法，按照如下步骤进行：
7.(1)采用超微粉碎和高压均质两种物理方法联合处理几丁质，得到改性几丁质；
8.(2)采用非特异性降解酶降解改性几丁质，得到几丁寡糖。
9.所述超微粉碎的操作步骤为：取几丁质装入研磨罐中，研磨罐中装入研磨球，进行研磨处理，转速为1000-2000rpm，时间为20-40min，得到超微粉碎几丁质。
10.研磨前将研磨罐、研磨球和几丁质于液氮中浸泡3-8min。
11.所述高压均质的操作步骤为：将超微粉碎的几丁质配制成20-40g/l的悬浊液，放入均质机中均质，调节均质机的压力为30-50mpa，均质时间为8-12min，收集均质后的悬浊液，真空冷冻干燥，得到高压均质几丁质。
12.所述非特异性降解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶、脂肪酶中的一种或几种。
13.优选的，所述非特异性降解酶为木瓜蛋白酶。
14.所述降解的操作步骤为：将改性几丁质配制成浓度为40-120mg/ml的底物溶液，调节ph为4.0-8.0，加入等体积的浓度为5-25mg/ml非特异性降解酶溶液，30-60℃条件下于100-250rpm水浴摇床中反应2-18h，反应结束后，煮沸灭活。
15.优选的，所述降解的操作步骤为：将改性几丁质配制成浓度为50mg/ml的底物溶液，调节ph为7.0，加入等体积的浓度为10mg/ml非特异性降解酶溶液，50℃条件下于180rpm水浴摇床中反应210min，反应结束后，煮沸灭活。
16.本发明的有益效果：
17.(1)本发明筛选出了一种来源广、易获得且价格低廉和降解效率高的几丁质非特异性降解酶代替传统的几丁质酶降解几丁质，不仅降低了提高了制备几丁寡糖效率，同时也降低了制备几丁寡糖的成本。
18.(2)本发明通过超微粉碎和高压均质联合改性几丁质，物理法不仅不会造成环境污染，并且有利于工业化操作，能够提高几丁质的可降解性。
19.(3)本发明将筛选出的非特异性酶酶解联合改性的几丁质，并优化了酶解工艺条件，得到了最优的酶解条件，为制备几丁寡糖提供了有利的条件。
附图说明
20.图1为不同非特异性酶降解几丁质的能力(a：每个酶活力单位产还原糖量；b：每100元的酶降解rc的还原糖产量)。
21.图2为木瓜蛋白酶降解改性几丁质的还原糖产量。
22.图3为不同温度下木瓜蛋白酶降解联合改性几丁质的还原糖产量。
23.图4为不同ph下木瓜蛋白酶降解联合改性几丁质的还原糖产量。
24.图5为不同添加量的木瓜蛋白酶降解联合改性几丁质的还原糖产量。
25.图6为木瓜蛋白酶降解联合改性几丁质过程中的还原糖产量变化。
26.图7为木瓜蛋白酶对联合改性几丁质的酶解产物的薄层色谱图。
27.图8为酶解产物的离子色谱图(a：标准品色谱图；b：样品色谱图)。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
29.实施例1
30.以原始几丁质(raw chitin，rc)为底物(50mg/ml)，分别使用商品化胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤维素酶，α-淀粉酶，果胶酶和脂肪酶于水浴摇床(180rpm)中酶解2h，测酶解液中的还原糖产量。七种非特异性酶的酶解条件如表1所示。
31.表1七种非特异性酶制剂酶解几丁质的酶解条件
[0032][0033][0034]
七种非特异性酶降解rc的还原糖产量结果如图1所示，图1a为在每个酶活力单位下，七种非特异性酶降解rc后的还原糖产量。从图中可以看出，木瓜蛋白酶降解rc转变成还原糖的能力最强，在每个酶活力单位下，还原糖产量达到70.16mg/ml，说明木瓜蛋白酶具有最强的rc降解能力；图1b中为每100元酶降解rc的还原糖产量，其中每100元的木瓜蛋白酶降解rc的产还原糖含量最高，产量达17.54mg/ml。结果表明，在七种非特异性降解酶中，木瓜蛋白酶不仅具有最高的降解rc的能力，同时具有最高的经济效益。据报道木瓜蛋白酶主要作用于glcnac和glcn之间的糖苷键，并优先作用于分子链较长的部分，这或许是其降解rc效率较高的原因，再加上该酶具有稳定性好，价格低廉等特点，因此选择该酶进行后续实验。
[0035]
实施例2
[0036]
分别取2g rc装入两个研磨腔室中，进行超微粉碎处理，转速为1400rpm，时间为30min，得到超微粉碎几丁质(ultra-micro grinding chitin，umgc)。研磨前将研磨罐、研磨球和rc于液氮中浸泡5min。
[0037]
将rc配制成悬浊液(30g/l)，进行hph处理，压力为40mpa，时间为10min，收集均质后的悬浊液，真空冷冻干燥，得到高压均质几丁质(high-pressure homogenization chitin，hphc)。
[0038]
首先将rc进行超微粉碎处理，然后将得到的umgc配制成悬浊液(30g/l)，再对其进行高压均质处理，收集均质后的悬浊液，真空冷冻干燥，得到超微粉碎-高压均质几丁质(ultra-micro grinding-high-pressure homogenization chitin，umg-hphc)。
[0039]
使用筛选出的木瓜蛋白酶分别降解rc、umgc、hphc和umg-hphc，将几丁质样品配制成底物溶液(50mg/ml，ph 7.0)。取1ml底物溶液，加入1ml木瓜蛋白酶溶液(10mg/ml)，于水浴摇床(37℃，180rpm)中反应210min。反应结束后，煮沸灭活。同时设有对照组，向1ml底物溶液中加入1ml预先灭活的木瓜蛋白酶溶液，其余处理同上。最后测酶解液中的还原糖产量。
[0040]
木瓜蛋白酶降解不同改性几丁质的还原糖产量结果如图2所示，木瓜蛋白酶降解4种几丁质后的还原糖产量依次为umg-hphc》hphc》umgc》rc。其中木瓜蛋白酶降解umg-hphc、
hphc和umgc的还原糖产量比对照(rc)提高了6.05、1.77和1.21mg/ml，结果表明超微粉碎和高压均质改性处理对木瓜蛋白酶降解几丁质具有积极作用，且超微粉碎和高压均质联合处理组较单独改性处理组的几丁质降解率更高。
[0041]
在不同温度下木瓜蛋白酶降解umg-hphc的还原糖产量结果如图3所示，在ph 5.0的条件下，随着温度的增加，还原糖的产量呈现先增加后降低的趋势，当温度达到50℃时，还原糖的产量最高；在不同ph下木瓜蛋白酶降解umg-hphc的还原糖产量结果如图4所示，在ph为4.0-8.0范围内，还原糖产量随着ph的加大先升高后略降低，在ph 7.0时还原糖产量达到最大值；在umg-hphc中分别添加不同量的木瓜蛋白酶，测得酶解后的还原糖产量，结果如图5所示，在几丁质底物浓度一定时，随着木瓜蛋白酶使用量的增加，还原糖产量也逐渐增加，但是当加酶量超过10mg/ml之后，还原糖产量的增加速率有所降低；探究不同反应时间，木瓜蛋白酶对umg-hphc的降解能力，在不同时间取样，并测定产物中的还原糖产量，绘制酶促反应进程图，结果如图6所示，随着反应时间的增加，还原糖的产量不断增加，14h之后还原糖产量基本保持不变化，表明14h时木瓜蛋白酶的降解反应达到平衡。
[0042]
薄层色谱法(图7)测定了木瓜蛋白酶降解几丁质初期的酶解产物为(glcnac)3、(glcnac)4、(glcnac)5和(glcnac)6，离子色谱法(图8)测定了木瓜蛋白酶降解几丁质平衡阶段的酶解产物为glcnac和(glcnac)2，浓度分别为：22.26mg/ml和58.75mg/ml。
[0043]
本发明采用超微粉碎和高压均质联合改性技术处理几丁质，提高了几丁质的可降解性，并筛选了廉价易得且降解效率高的非特异性酶代替昂贵的几丁质酶，并利用非特异性酶降解联合改性几丁质，提供了一种新型的、对环境友好的和成本较低的制备几丁寡糖的方法。
[0044]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。