韩国假单胞菌及应用

1.本发明属于微生物领域，涉及一种韩国假单胞菌及应用。


背景技术：

2.农作物生长过程中会受到一系列环境因素的影响，其中干旱、盐分以及低温等是导致农作物产量下降的主要因素。干旱胁迫严重影响植物的生长、发育和繁殖，导致农作物大量减产。据统计，干旱可造成高达90％的农业经济损失，是最为严重的自然灾害之一。我国是世界上严重缺水的国家之一，干旱土壤面积占国土面积的1/2以上，土壤水资源十分缺乏，作物栽培时常面临着干旱胁迫的风险。干旱胁迫直接影响植物生长发育的各个时期，对植物在生理生化水平上造成一系列的负面影响。例如，干旱胁迫引起植物细胞膜通透性增加、激素失衡、活性氧大量积累、植物光合效率降低以及养分代谢紊乱等，最终植物生长受到抑制、产量降低。而植物生物量、水分利用效率、光合能力、渗透调节能力、细胞膜的稳定性、抗氧化系统的防御能力及激素水平等指标的变化，常被用来判断植物抵御干旱胁迫能力的标准。除干旱胁迫以外，低温胁迫也是作物栽培中常常遇到的一种灾害，它不仅会导致植物产量降低，严重时还会造成植株死亡。据统计，世界每年因低温造成的损失达2000亿美元。因此提高作物抗低温胁迫，减少低温对作物的不利影响在农业生产中至关重要。按照低温的不同程度，植物的低温伤害可分为冷害(chilling injury；零上低温对植物的伤害)和冻害(freezing injury；零下低温对植物的伤害)两大类。其中低温胁迫中冷害的发生地区更加普遍，冷害伤害了细胞的正常功能和结构，特别是细胞质膜和细胞器膜系遭到破坏，或干扰正常活动，导致代谢发生紊乱，不仅功能上受到干扰，结构和组织方面也常遭到破坏，进而在形态上很快出现伤痕。引起冷害的低温胁迫在植株整个生育过程中均能造成不利的影响，如种子萌发、植株生长、光合、坐果、产量和品质形成等过程。而冷害造成的结果是苗弱、植株生长迟缓、萎蔫、黄化、局部坏死、坐果率低、产量降低和品质下降等。研究者们在冷害对植物生理生化影响的研究基础上已经尝试通过不同手段提高作物农作物的抗冷性。番茄(lycopersicon esculentum mill.)是我国普遍种植的一种蔬菜，具有重要的经济价值。番茄为一年生或多年生草本植物，果实中富含多种矿质元素、胡萝卜素、b和c族维生素等。番茄对干旱胁迫非常敏感，缺水会严重影响番茄的产量。研究发现，水分胁迫会抑制番茄幼苗的萌发以及胚根和胚轴的生长，降低番茄幼苗的生物量。此外，干旱胁迫下，番茄在细胞、器官、个体和群体各个水平上均会出现相应的负面表征，番茄生长发育受到抑制，果实产量降低。
3.目前一般通过提高农艺措施减轻冷害对作物的危害，如冬季采用温室大棚种植、覆膜种植等方式来提高土壤温度，改善作物生长环境；采用杂交育种或基因工程来培育抗冷品种，减少低温的不利影响。但改善农艺措施费时费工，另外由于植物的抗冷性是一种综合性的表现，而并非由单个基因表达而引起，其包括植物细胞其他的一些特性的变化，如细胞膜流动性、低分子量或高分子量低温保护物质合成及积累等，因此通过传统育种手段或转基因技术来获得抗低温植物品种并没有获得突破性进展。提高作物抗冷性的简单易行途
径就是通过一些外源物质，包括植物生长调节物质，如激素类物质脱落酸、芸苔素内酯及水杨酸等；渗透调节物质如可溶性糖、甜菜碱等；无机盐离子如ca

，k

等诱导因素提高作物抗冷性。有益微生物也可提高植物抗冷性，而且有益微生物可稳定定植于植物根际，并且具有改善土壤结构、保水及促进植物对矿物质营养吸收等功能来促进植物生长，因此应用有益微生物在提高作物抗冷性方面将会具有重要的作用。
4.除抗旱以外，近年来研究发现，有益微生物可促进植物在干旱条件的生长。根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，pgpr)可产生吲哚乙酸、细胞分裂素等激素类物质促进植物根系生长，增加次生根和根毛数量，有利于植物对水分和养分吸收，促进植物生长和增强植物对干旱、病原菌侵染等逆境的耐受能力。有益微生物还可诱导增强植物的干旱耐受性，调节植物抗旱相关生理生化过程。例如，根际细菌bacillus amyloliquefaciens可显著提高植物体内抗氧化相关酶活性，降低活性氧和丙二醛含量，减轻干旱胁迫造成的氧化损伤；密旋链霉菌act12能增加小麦生物量，提高水溶性总糖含量，调节脯氨酸和谷胱甘肽含量，且可以通过aba依赖性信号的传导，增强小麦的干旱耐受性；b.subtilis gb03可诱导植物体内积累更多的脯氨酸和甜菜碱等渗透调节物质，缓解干旱胁迫对植物细胞膜和生物大分子造成的损害。
5.假单胞菌隶属于假单胞菌科革兰氏阴性菌，其广泛分布于土壤、淡水、海水以及生物体中。假单胞菌的适应温度范围较广，可在4-43℃下生长，最适生长温度为30℃左右。该类菌生长的适宜酸碱度范围在ph 7.0-8.5，大多数不能在ph 6或6以下的环境中生长。非致病假单胞菌活跃于植物根际，是最主要的pgpr之一。荧光假单胞菌属于薄壁菌门假单胞菌科假单胞菌属，其广泛分布于植物根际土壤和果蔬表面，许多菌株能在有效抑制病原物的同时，促进了果蔬的生长和增产，因而受到各国研究者的关注，也是国内外研究最早、报道最多的一类生防菌和根际促生菌。荧光假单胞菌可以通过产生生长素，增强土壤中磷、钾的有效性，促进植物叶绿素含量的增加，及产生谷胱甘肽、acc脱氨酶等方式促进植物的生长。此外，荧光假单胞菌还可以提高植物体抵抗病虫害侵入的能力。研究发现荧光假单胞菌在植物体内外对根结线虫具有抑制作用，能抑制绿豆根结线虫病的发病率进而提高绿豆的籽粒产量；荧光假单胞菌菌株ps170和ps117产生的硝吡咯菌素和吡咯霉素在防治梨火疫病菌(erwinia amylovora)方面有着巨大潜力。韩国假单胞菌(pseudomonas koreensis)是荧光假单胞菌的一个亚种，然而，韩国假单胞菌应用于提高植物抗逆性机制的研究却鲜有报道。


技术实现要素：

6.为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可改善干旱胁迫条件下番茄植株的生长状况，提高番茄抗性酶活，降低细胞mda含量，提高番茄耐旱性的韩国假单胞菌及应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种韩国假单胞菌，其特征在于：所述韩国假单胞菌是pseudomonas koreensis gs，该菌已于2021年9月22日向中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)提交保藏，保藏编号是no.23459。
9.如前所述的韩国假单胞菌，其特征在于：所述韩国假单胞菌分离自为黑龙江省小兴安岭南麓，地理坐标是46
°
57
′
n，128
°
16
′
e。
10.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在植物促生中的应用。
11.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在番茄促生中的应用。
12.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在胁迫条件下对番茄促生的应用。
13.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在干旱胁迫下或冷害胁迫下对番茄促生的应用。
14.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在干旱胁迫下或冷害胁迫下促进番茄种子萌发的应用。
15.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在干旱胁迫下或冷害胁迫下促进番茄植株生长的应用。
16.如前所述的韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs在提高番茄耐旱性的应用或在增强番茄耐冷害的应用。
17.本发明的优点是：
18.本发明以番茄和p.koreensis gs为发明对象，通过皿内和盆栽试验，分别采用添加聚乙二醇及控制浇水量的方法进行干旱胁迫，从番茄生物形态、生理生化指标测定揭示p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄植株的促生和耐旱性的作用效果。在皿内发芽试验中，p.koreensis gs发酵滤液可提高番茄种子的萌发速率，同时显著提高番茄幼苗的株高、根长、鲜重和茎粗，其增幅分别为9.5％、29.08％、7.74％和28.96％；干旱胁迫下，p.koreensis gs发酵滤液处理对番茄幼苗有显著的促生效果，其株高、根长、鲜重和干重显著提高了1.05％、14.86％、16.99％、6.10％。在盆栽试验中，p.koreensis gs发酵滤液处理后盆栽番茄(30d)的株高、鲜重、干重、根长、根干重和叶绿素相对含量(spad)分别显著提高了4.75％、4.15％、1.81％、23.25％、9.83％和9.89％；干旱胁迫处理下，盆栽番茄(30d)的株高、根长、鲜重、干重、spad值和根干重分别显著提高了1.56％、9.82％、11.05％、3.77％、13.60％和1.69％。因此，p.koreensis gs发酵滤液改善了干旱胁迫处理下番茄的生长状况，提高番茄的耐旱性。此外，皿内发芽试验表明，p.koreensis gs发酵滤液处理后，皿内幼苗过氧化物酶(peroxidase，pod)、过氧化氢酶(catalase，cat)活性在非干旱条件下分别显著提高了11.85％和97.07％；皿内番茄幼苗cat酶活性在干旱胁迫下显著提高了50.16％；而在盆栽试验中，p.koreensis gs发酵滤液处理的番茄植株(30d)叶片cat酶活性在非干旱条件下显著上升了27.30％，叶片pod、cat酶活性在干旱胁迫下分别显著增加了64.51％和358.25％；番茄植株(30d)叶片内抗渗透调节物质脯氨酸和丙二醛(malondialdehyde，mda)含量在非干旱条件下无明显变化，而在干旱胁迫下mda含量(代表膜脂过氧化程度)显著降低了38.30％、脯氨酸含量显著提高了2.59％。本发明表明，p.koreensis gs可改善干旱胁迫条件下番茄植株的生长状况，提高作物抗性酶活，降低细胞mda含量，进而提高了番茄的耐旱性。此外，p.koreensis gs无细胞发酵液可以促进番茄幼苗株高的增长，在冷害条件下也有明显的促生作用，能够显著提高番茄幼苗叶片中各类叶绿素的含量，在冷害胁迫下，能够提高番茄幼苗的光合作用；p.koreensis gs无细胞发酵滤液能够提高番茄幼苗防御酶sod、pod的活性，增强番茄幼苗耐冷害的特性。
附图说明
19.图1是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄皿内发芽率的影响柱状图(不同字母表示差异显著(p《0.05))；
20.图2是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄植株生物学指标的影响的盆栽对比图；
21.图3是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理后对番茄幼苗防御酶活影响的柱状图(不同字母表示差异显著(p《0.05))；
22.图4是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理时对番茄植株生物学指标的影响的盆栽对比图；
23.图5是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理后对番茄植株防御酶活性的影响(不同字母表示差异显著(p《0.05))；
24.图6是干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄植株脯氨酸和mda含量的影响(不同字母表示差异显著(p《0.05))；
25.图7是冷害及适温条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄幼苗株高的影响；
26.图8是冷害及适温条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄幼苗生长的影响。
具体实施方式
27.本发明提供了一种韩国假单胞菌及应用，尤其是在干旱胁迫下韩国假单胞菌对促进番茄生长、提高番茄抗旱性的应用。
28.1、本发明通过以下试验对技术方案进行详细说明
29.(1)干旱胁迫下pseudomonas koreensis gs(以下简称为p.koreensis gs)发酵滤液对番茄种子发芽状况的影响
30.通过聚乙二醇皿内模拟干旱胁迫试验，揭示p.koreensis gs无细胞发酵滤液浸种后对番茄响应干旱胁迫的影响。
31.(2)干旱胁迫下p.koreensis gs发酵滤液对番茄幼苗生长形态和耐旱性指标的影响
32.(3)冷害胁迫下p.koreensis gs发酵滤液对番茄幼苗生长形态和耐冷性的影响。
33.以番茄为供试植株，通过营养钵干旱胁迫试验，控制浇水量为胁迫手段，揭示p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄生物学性状(株高、根长、鲜重、干重、茎粗等)、生理生化性状(丙二醛、脯氨酸、抗氧化酶等)的影响。
34.本发明通过皿内发芽和盆栽试验，探究在干旱胁迫条件下，p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄生长、耐旱性以及耐冷性的影响效果。
35.2、具体实验
36.2.1材料与方法
37.2.1.1供试菌株
38.韩国假单胞菌pseudomonas koreensis gs(ncbi登记号：prjna517377)，分离自为黑龙江省铁力市桃山镇桃山天德人参有限公司人参基地，小兴安岭南麓(46
°
57
′
n，128
°
16
′
e)，棕壤土，由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源实验室保藏。同时，该菌株已于2021年9月22日向中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)提交保藏，保藏编号是no.23459。
39.2.1.2供试番茄品种
40.番茄种子(金棚一号)，购自西安金鹏种苗有限公司。
41.2.1.3供试培养基
42.牛肉膏—蛋白胨液体培养基(nb)用于韩国假单胞菌的液体发酵培养；
43.牛肉膏—蛋白胨琼脂培养基(na)用于韩国假单胞菌培养与保存。
44.无土栽培育苗基质由优质草炭、基质原料、珍珠岩、蛭石等组成，有机质含量大于35％，水分大于20％，ph值为中性，无土栽培育苗基质购自莘县鲁源育苗基质有限公司。
45.2.1.4干旱胁迫试验
46.a)皿内发芽及促生耐旱试验
47.采用室内培养皿生物测定法。p.koreensis gs于28℃条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基中震荡(180rpm)培养72h后，将培养物在4℃下10，000rpm离心15min，并通过无菌微滤膜(0.22μm孔径)过滤，收集p.koreensis gs无菌发酵滤液，p.koreensis gs无菌发酵滤液用无菌水稀释成100倍稀释液，备用。番茄种子600粒，用75％酒精消毒30s，再用无菌水洗涤至少5次以上，将消毒的番茄种子均匀置于铺有灭菌双层滤纸的培养皿中(每皿20粒种子)。
48.将消毒的番茄种子分为两组，一组用无菌水浸种，另一组采用稀释100倍的p.koreensis gs无菌发酵滤液浸种(本发明以100倍稀释为例进行详细说明，具体的稀释筛选详见表1)，处理之后将培养皿放置在25℃的恒温光照培养箱，黑暗萌发。从第2d开始隔1d定时向每个培养皿更换新的10ml对应处理的溶液，每天定时观察并记录每个培养皿的种子发芽个数。以种子露出胚芽作为萌发开始的标志，以第1粒种子露出白色胚芽的天数作为此处理下种子萌发的开始时间，以连续3d没有种子露出胚芽作为该处理试验结束时间。
49.如表1可见，首先，与正常生长条件下相比，干旱胁迫条件下番茄幼苗的生长受到显著抑制。其次，非干旱及干旱胁迫条件下，不同稀释倍数的p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理下番茄幼苗的地上鲜重干重、根长和株高较对照相比均有增加。非胁迫条件下，不同稀释倍数的p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理下地上鲜重、干重、根长和株高增率分别为0.55％～14.78％、7.76％～17.24％、28.72％～45.61％、0.086％～6.02％；干旱胁迫条件下，其增率分别为17.78％～25.40％、27.50％～45.83％、12.00％～36.27％、0.97％～4.87％。在干旱条件下，在最大稀释倍数为1000倍处理下番茄幼苗的地上鲜重、干重及根长均有显著提高，其增率分别为25.40％、27.50％和12％。由以上结果可知，p.koreensis gs发酵滤液在100～1000倍稀释梯度下，对番茄植株的生长均有明显的促生作用，可有效提高了番茄植株的耐旱性，且在干旱胁迫条件下，p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄幼苗干重的提高效果更强。以表1为基础，本发明选用100倍稀释进行详细说明。
50.表1干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄幼苗生物学指标的影响
[0051][0052][0053]
注：同列不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0054]
番茄幼苗生长10d后，分别用无菌水和稀释100倍的无细胞发酵滤液配置浓度为12％的聚乙二醇溶液(亲水性大分子，吸水性强，会造成植物吸水困难，模拟干旱胁迫)进行干旱胁迫处理，由此设置四种处理，分别为：只加无菌水的对照组(ck)、只加p.koreensis gs无菌发酵滤液处理(pk)、无菌水 聚乙二醇(dk)、p.koreensis gs无菌发酵滤液 聚乙二醇(dpk)，加7ml处理液，每皿中20粒番茄种子，每一皿为一个重复，每个处理设置5个重复，每组处理100粒番茄种子。干旱胁迫处理后的0h和96h，收获番茄幼苗，用于植物生物学性状和生理生化指标的测定。
[0055]
b)皿内促生及耐冷性试验
[0056]
番茄种子萌发设计：p.koreensis gs于28℃条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基中180rpm震荡培养72h后，将培养物在4℃下10000rpm离心15min，并通过无菌微滤膜(0.22μm孔径)过滤，收集p.koreensis gs无细胞发酵液，滤液用无菌水稀释成50倍和100倍稀释液。
[0057]
取番茄种子适量，用75％酒精消毒30s，再用无菌水洗涤至少5次以上，将消毒的番茄种子均匀置于铺有灭菌双层滤纸的培养皿中(每皿30粒种子)，共30个培养皿。将培养皿分为三组，每组10个，分别用无菌水、稀释50倍和100倍的无细胞发酵液浸种，所需处理液以浸湿滤纸及种子为主并记录初始质量，处理之后将培养皿放置在25℃的恒温光照培养箱中，黑暗萌发。从第2d开始每天定时向每个培养皿补加对应处理的溶液，保证与初始质量相同，每天定时观察并记录每个培养皿的种子发芽个数。以种子露出胚芽2mm作为种子发芽的标志，以连续3d没有种子发芽作为发芽的结束。番茄发芽结束后，分别用无菌水、稀释50倍和100倍的无细胞发酵液进行冷害胁迫和适温处理。共设置六个处理，每个处理5次重复，具体处理方式如表2所示。
[0058]
表2不同温度胁迫处理条件
[0059]
[0060][0061]
将冷害胁迫处理的培养皿置于光照恒温培养箱中培养，昼/夜时间安排14h/10h，温度17℃/10℃，空气相对湿度65％，光照强度为8000lx；将适温处理的培养皿置于另一光照恒温培养箱中培养，昼/夜时间安排14h/10h，温度26℃/20℃，空气相对湿度65％，光照强度为8000lx，每个处理每天添加15ml对应处理液。处理后的第10d，测量番茄幼苗主株高，处理后的第14d，收获番茄幼苗，用于植株生理生化指标的测定。
[0062]
2.1.5盆栽试验
[0063]
栽培基质为无土栽培基质，将栽培基质121℃湿热灭菌2h，并置于营养钵中。将约800粒番茄种子用75％酒精消毒30s，再用无菌水洗涤5次，将消毒后的种子等分为两份，一份用稀释倍数为100倍的p.koreensis gs无菌发酵滤液浸泡，一份用等体积无菌水浸泡。浸种72h待种子露白后，分别将两种处理的番茄种子播种于营养钵中(每盆3粒)，建苗后每盆留2株。实验设计为随机完整区组设计，具有3个区组，每个区组包含80个盆栽。将每个区组的盆栽随机等分为对照组(ck)和处理组(pk)，每组40盆，共240盆。
[0064]
培养钵按照随机完整区组设计置于光照恒温培养箱中培养，昼/夜培养条件为光照时间12h/12h，温度25℃，相对湿度65％，光照1000μmol
·
m-2
s-1
。实验组和对照组在第1～25d每天浇灌20ml 1/2hoagland营养液，实验组每3d补加一次由稀释100倍的p.koreensis gs无菌发酵滤液配置的营养液。所有处理在第6d间苗，于第25d将处理组分为正常水分组和干旱胁迫组，正常水分组继续浇1/2hoagland营养液，不浇灌作干旱处理，干旱胁迫至出现番茄幼苗出现萎蔫。由此设置四种处理，分别为只加营养液的对照组(ck)，加p.koreensis gs无菌发酵滤液的处理(pk)，加营养液 干旱胁迫处理(dk)，p.koreensis gs无菌发酵滤液 干旱胁迫处理(dpk)，每组分20盆(每盆2株)，共480株。
[0065]
2.2生物学指标的测定
[0066]
2.2.1皿内试验
[0067]
番茄幼苗收获后，立即测定株高、根长(主根长)、生物学鲜重，用吸水纸吸干材料表面水分，之后将材料于鼓风烘箱中105℃下杀青10min，再于75℃连续烘干至恒重，分别称取干重。
[0068]
2.2.2盆栽试验
[0069]
盆栽番茄25d，从实验组和对照组各采20株番茄植株，测量其地上株高、根长、鲜重、茎粗等生物学指标测定以分析菌株的促生效果。盆栽番茄30d，各处理在中午11:00用叶绿素仪分别快速测定番茄叶片spad值；测植株的株高、根长、鲜重、干重以及根鲜重、干重；从四个处理中分别混合采取3个样本，每个生物学样本由随机3株番茄植株的特定叶片(自生长点向下第5片叶子)组成以供酶活测定；从各处理中分别混合采取6个样本，每个生物学样本由随机3株番茄植株的特定叶片(自生长点向下第4片叶子)组成以供测定脯氨酸和丙二醛。叶片样品采样后直接放入冰盒，带回实验室放入-80℃冰箱保存待用。
[0070]
2.2.3酶活测定
[0071]
粗酶液制备：将样品加入液氮迅速研磨，并加入预冷的0.1m的磷酸钠缓冲液(ph 7.0)迅速混匀，研磨液于4℃下10，000
×
g离心10min，取上清液作为粗酶液，4℃冰箱放置备用。
[0072]
过氧化物酶(pod)：测定的反应体系包括0.2ml粗酶液(空白对照加0.2ml预失活粗酶液)，1.0ml 0.1％的愈创木酚，0.18％的过氧化氢1ml，蒸馏水7.6ml；吸光度在470nm处每分钟变化0.01作为1个酶活性单位u，酶活性表示为u/min。
[0073]
过氧化氢酶(cat)：测定反应体系包含0.1ml粗酶液(空白对照加0.1ml预失活粗酶液)，tris-hcl 1.0ml(ph 7.0)，蒸馏水1.7ml，25℃预热3min后，逐管加入0.2ml 200mmol/l过氧化氢，吸光度在240nm处每分钟变化0.01作为1个酶活性单位u，酶活性表示为u/min。
[0074]
2.2.4脯氨酸含量的测定
[0075]
脯氨酸含量的测定：取0.5g鲜样，加10ml 3％磺基水杨酸，沸水浴中浸提15min，离心取上清液，用于脯氨酸含量的测定。6ml反应体系为：2ml浸提液，2ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，100℃反应30min后，放入冰水中终止反应。反应混合物用5ml甲苯萃取，取上清液测520nm下的吸光度，并通过标准曲线计算脯氨酸含量。
[0076]
2.2.5丙二醛(mda)含量的测定
[0077]
丙二醛的含量可反映膜脂质过氧化水平，丙二醛含量的测定采用2-硫代巴比酸(tba)法。用5％的三氯乙酸(tca)研磨浸提番茄叶片中的丙二醛，在试管中加入2ml提取液和2ml硫代巴比酸，混匀，沸水浴12min，迅速冷却终止反应，如有沉淀，在4500rpm下离心10min。以硫代巴比酸溶液为空白，测定上清液在532nm、600nm和450nm处的吸光度。计算公式如下：
[0078]
mda(μmol
·
g-1
fw)＝[6.452
×
(a652－a600)－0.559
×
a450]
×
vt/vs/fw
[0079]
其中，vt为提取液总体积(ml)；vs为测定用提取液体积(ml)；fw为样品鲜重(g)。
[0080]
2.3数据分析
[0081]
采用excel 2007和spss 21.0软件对数据进行统计分析。采用单因素(one-way anova)和lsd法进行方差分析和多重比较(α＝0.05)。利用excel 2007软件作图。图表中数据为平均值
±
标准差。
[0082]
2.4皿内发芽及促生耐旱试验结果
[0083]
2.4.1p.koreensis gs发酵滤液对皿内番茄幼苗生长的影响
[0084]
2.4.1.1p.koreensis gs发酵滤液对番茄皿内发芽率的影响
[0085]
由图1可以看出，用p.koreensis gs无细胞发酵滤液(简称发酵滤液，下同)浸种的番茄萌发率高于对照组。pk组的发芽率在1d比ck组显著提高了26.88％，在2d显著提高了31.25％，在3d显著提高了25.0％。dpk组发芽率较dk组也显著提高，表明p.koreensis gs发酵滤液在干旱胁迫条件下可以提高番茄种子的萌发速率。
[0086]
2.4.1.2p.koreensis gs发酵滤液对皿内番茄生物学特性的影响
[0087]
表3干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液对番茄幼苗生物学指标的影响
[0088][0089]
注：同列不同大写字母表示组间差异显著(p《0.01)，同列不同小写字母表示组间差异显著(p《0.05)。
[0090]
下同
[0091]
如表3所示，非胁迫处理下p.koreensis gs发酵滤液对番茄植株生长有促进作用，p.koreensis gs发酵滤液显著提高了番茄的株高、根长、鲜重和干重，其分别显著提高了2.72％、14.80％、10.60％和26.47％。在干旱胁迫下p.koreensis gs发酵滤液对番茄植株也有显著的促生作用，dpk组的番茄植株较dk组株高显著提高了1.06％，根长显著提高了14.86％，鲜重显著提高了18.18％，干重显著增加了3.33％。结果表明，在干旱条件下p.koreensis gs发酵滤液可促进番茄幼苗的生长。
[0092]
2.4.1.3p.koreensis gs发酵滤液处理对皿内番茄防御酶活的影响
[0093]
由图3所示，pk组的番茄幼苗中pod、cat酶活性较ck组显著提高了11.85％，97.07％(图3a和图3b)。dpk组的pod酶活性较dk组无显著变化(图3a)，cat酶活性较dk组显著上升50.16％(图3b)。说明施加p.koreensis gs发酵滤液可提高番茄植株防御酶pod、cat的活性，且在干旱胁迫下，番茄植株cat酶活对p.koreensis gs发酵滤液处理较敏感。
[0094]
2.4.2p.koreensis gs发酵滤液对盆栽番茄植株生物学特性的影响
[0095]
2.4.2.1p.koreensis gs发酵滤液对盆栽番茄植株生长的影响
[0096]
如表4所示，处理第25d时，p.koreensis gs发酵滤液显著提高了番茄植株的株高、根长、茎粗，其分别显著提高了13.35％、27.76％和12.50％，番茄植株鲜重较对照组也显著提高16.05％。结果表明，p.koreensis gs发酵滤液对盆栽番茄植株有促生作用。
[0097]
表4干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄植株生物学指标的影响(25d)
[0098][0099]
表5干旱及非干旱条件下p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理对番茄植株生物学指标的影响(30d)
[0100][0101]
如表5所示，处理第30d时，pk组与ck组相比，番茄的株高、鲜重、干重、根长和spad值分别显著提高了4.75％、4.15％、1.81％、23.25％、9.89％，番茄植株的根干重显著提高了9.83％。干旱胁迫下，p.koreensis gs发酵滤液对番茄的株高、根长、鲜重、干重、和spad值有促进作用。dpk组与dk组相比，株高、根长、鲜重、干重、和spad值分别显著提高了1.56％、9.82％、11.05％、3.77％、13.60％，番茄的根干重显著提高了1.69％。p.koreensis gs发酵滤液对番茄植株有显著促生作用，有效提高了番茄植株的耐旱性。
[0102]
2.4.2.2p.koreensis gs发酵滤液对盆栽番茄防御酶活的影响
[0103]
由图4以及图5所示，p.koreensis gs发酵滤液处理的番茄植株cat酶活性较ck组显著提高27.30％(图5b)，pod酶活性无显著变化(图5a)。dpk组番茄植株pod、cat酶活性分别较dk组显著提高了64.51％、358.25％(图5a和b)。结果表明干旱胁迫下p.koreensis gs发酵滤液处理对于番茄植株内pod、cat酶活性有激活作用。
[0104]
2.4.2.3p.koreensis gs发酵滤液对盆栽番茄脯氨酸和丙二醛含量的影响
[0105]
由图6所示，p.koreensis gs发酵滤液处理对非干旱条件下番茄植株脯氨酸和mda含量无显著影响，dpk组脯氨酸含量较dk组显著提高2.59％(图6a)，mda含量较dk组显著下降38.30％(图6b)。番茄在非胁迫条件下，植株内脯氨酸和mda含量无明显变化；而在干旱胁迫下，番茄植株内mda含量变化较为显著且对p.koreensis gs发酵滤液处理较为敏感。
[0106]
干旱胁迫从多方面对植物生长发育造成损害：活性氧(ros)过量积累、细胞膜和细胞核结构受损、叶片和根系生长受到抑制、光合速率降低等。植物叶片和根系受损，根系活力下降，还会抑制植物对水分和矿物质元素的吸收。干旱胁迫下，p.koreensis gs发酵滤液处理后的番茄株高、鲜重、根长、sapd等指标显著提高，说明p.koreensis gs发酵滤液可以提高番茄植株的耐旱性。植物遭受干旱胁迫时，生物膜系统是敏感和最初部位，高浓度的ros对植物细胞膜系统等具有毒害作用。植物细胞中有一套完整的ros清除系统，可在逆境时调节提高抗氧化酶类或抗氧化物质的活性，使细胞内的ros水平维持在一定范围内，进而缓解胁迫造成的氧化应激。植物中的渗透调节系统会促进植物积累大量的溶质(糖醇类化合物、氨基酸、次生代谢物、有机酸等)，以适应逆境。干旱胁迫下，p.koreensis gs发酵滤液处理下的番茄叶片中pod、cat酶活性显著提高，脯氨酸含量显著上升，mda含量显著下降，表明，p.koreensis gs发酵滤液参与了番茄的渗透调节，降低了叶片中ros的积累，缓和了番茄叶片细胞膜脂质过氧化程度(mda)，从而减轻ros对细胞膜的破坏。
[0107]
本发明所提供的技术方案，p.koreensis gs发酵滤液处理对干旱胁迫下的番茄有显著促生和耐旱调节作用，表明p.koreensis gs发酵滤液对于提高农作物的干旱耐受性有
重要的应用价值。
[0108]
2.5皿内发芽及促生耐冷性试验结果
[0109]
2.5.1番茄幼苗株高
[0110]
如图7以及图8所示，皿内试验处理10d后，用直尺测量番茄苗子的株高(子叶到植物生长点之间的距离)。结果显示，p.koreensis gs对番茄幼苗生长有促进作用，能够显著提高番茄幼苗的株高。稀释50倍和100倍的无细胞发酵滤液对比无菌水处理，在低温下番茄幼苗株高增加了20.72％和13.81％，适温处理下番茄幼苗株高增加了10.70％和26.49％。
[0111]
2.5.2叶绿素含量测定
[0112]
方法：叶绿素含量的测定选用96％乙醇提取法。0.2g鲜样，加适量96％乙醇和石英砂研磨至植物组织发白，单层滤纸过滤到25ml棕色容量瓶，用96％乙醇反复冲洗滤纸至其发白，定容。测定665nm、449nm和470nm波长下吸光值(调零杯为96％乙醇)，参照植物生理学(张继澍编)课本对叶绿素含量进行计算，每个处理重复3次。
[0113]
结果及分析：
[0114]
如表6所示(表6中a＝δlck％；b＝δsck％)，在低温及适温处理下，番茄叶片总叶绿素含量随着稀释倍数的增加呈增加趋势，低温处理对比适温处理各类叶绿素含量均显著增加。以总叶绿素含量来说，稀释50倍的无细胞发酵滤液在低温处理比适温处理增加了32.87％，稀释100倍的无细胞发酵滤液在低温处理比适温处理增加了28.78％，且差异显著。
[0115]
表6冷害及适温条件p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理下番茄叶片叶绿素含量
[0116][0117]
2.5.3番茄幼苗抗氧化酶活性的测定
[0118]
方法：粗酶液制备：称取0.5g鲜样，加入5ml预冷的0.1mol/l的磷酸钠缓冲液(ph 7.0)迅速混匀，研磨液于4℃下10000
×
g离心10min，取上清液作为粗酶液，4℃冰箱放置。超氧化物歧化酶(sod)活性测定采用氮蓝四唑还原法，过氧化物酶(pod)活性测定采用愈创木酚法，每个处理重复3次。
[0119]
结果及分析：
[0120]
如表7所示(表7中a＝δlck％；b＝δsck％)，低温及适温处理下，经p.koreensis gs无细胞发酵液不同稀释倍数处理的番茄幼苗sod、pod酶活性较无菌水呈明显增高趋势。其中低温处理下，sod酶活分别增加了26.55％、35.62％，pod酶活分别增加了18.82％、9.09％。在同等处理液处理下，低温处理比适温处理的酶活显著提高，sod活性分别增加了43.95％、48.20％、37.07％；pod活性分别增加了12.48％、24.37％、17.84％。
[0121]
表7冷害及适温条件p.koreensis gs无细胞发酵滤液处理下番茄幼苗抗氧化酶活
性
[0122][0123][0124]
耐冷性总结：
[0125]
(1)p.koreensis gs无细胞发酵液可以促进番茄幼苗株高的增长，在冷害条件下也有明显的促生作用。
[0126]
(2)p.koreensis gs无细胞发酵滤液能够显著提高番茄幼苗叶片中各类叶绿素的含量。在冷害胁迫下，并没有被降解，能够提高番茄幼苗的光合作用。
[0127]
(3)p.koreensis gs无细胞发酵滤液能够提高番茄幼苗防御酶sod、pod的活性，增强番茄幼苗耐冷性。