检测并分型致泻大肠埃希氏菌的多重引物及应用

1.本发明涉及食品安全监测技术领域，更具体地说是涉及一种对致泻大肠埃希氏菌进行检测并分型的多重引物及应用。


背景技术：

2.致泻性大肠埃希氏菌(diarrheagenicescherichiacoli，dec)，是一类能引起人体以腹泻为主要感染症状的大肠埃希氏菌的总称。常见的致泻性大肠埃希氏菌主要分为5类，包括包括肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenicescherichiacoli，epec)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasiveescherichiacoli,eiec)、产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(shigatoxin-producingescherichiacoli，stec)或称为肠道出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicescherichiacoli，ehec)、肠道聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregativeescherichiacoli,eaec)。
3.目前，主要以单重pcr技术对dec基因进行扩增，并结合琼脂糖凝胶电泳技术对扩增片段进行鉴定，实现对dec的分型。单重pcr结合电泳技术分型dec，操作繁琐、工作量大；且在pcr扩增结束后，开盖操作容易引起气溶胶，污染实验室。多重pcr技术可减少操作步骤，这就对引物的设计要求比较严格，若引物灵敏度低或特异性差，会造成假阴性或者假阳性结果的出现。荧光定量pcr可分型的目标dna片段数量有限，无法实现单孔分型dec的目的。
4.因此，如何提供一种特异性好、灵敏度高的多重引物并将其应用于分型检测dec中是本领域技术人员亟需解决的问题。
5.

技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种对dec进行检测并分型的多重引物，引物具有高度特异性和较高的灵敏度，9种目的基因的扩增产物tm值不相同，可以实现在单孔中对dec的检测和分型。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种对大肠埃希氏菌进行检测并分型的引物，所述引物序列如seqidno.1～seqidno.18所示；
9.aggr-f:cattaagacgcctaaaggatgc，如seqidno.1所示；
10.aggr-r:gaccaattcggacaactgca，如seqidno.2所示；
11.pic-f:tggtggcaatacgaagtgga，如seqidno.3所示；
12.pic-r:gtcacgcaggtcacccatac，如seqidno.4所示；
13.escv-f:caatgagcacgccaccaa，如seqidno.5所示；
14.escv-r:tgccaggaaagcaaatgagta，如seqidno.6所示；
15.stx1-f:atcaggcaggacactactcaacc，如aeq id no.7所示
16.stx1-r:cagaggggatttcgtacaacac，如seq id no.8所示；
17.stx2-f:ttgaccatcttcgtctgattattg，如seq id no.9所示
18.stx2-r:ggtagaaagtatttgttgccgtatt，如seq id no.10所示；
19.lt-f:acaggaggtttctgcgttagg，如seq id no.11所示；
20.lt-r:agcttggtgatccggtgg，如seq id no.12所示；
21.sth-f:tgtctttttcacctttcgctc，如seq id no.13所示；
22.sth-r:cggtacaagcaggattacaacac，如seq id no.14所示；
23.inve-f:agcatccgagaacttggtattg，如seq id no.15所示；
24.inve-r:gcctgaaaggcacgagtga，如seq id no.16所示；
25.uida-f:gcgaggtacggtaggagttg，如seq id no.17所示；
26.uida-r:tcacagccaaaagccagaca，如seq id no.18所示。
27.作为本发明优选的技术方案，所述引物基于dec的8种不同标志性毒力基因aggr、pic、escv、stx1、stx2、lt、sth、inve和大肠埃希氏菌标志基因uida 设计而成；其中大肠埃希氏菌的标志基因为uida；eaec的特征基因为aggr、 pic；epec的特征基因为escv；stec的特征基因为stx1、stx2；etec的特征基因为lt、sth；eiec的特征基因为inve；同时每种dec均具有大肠埃希氏菌的标志基因uida。一种在单孔中对dec进行检测并分型的多重引物在制备检测并对dec进行分型试剂盒中的应用。
28.一种对dec进行检测并分型的方法，检测并对dec进行分型的过程包括：
29.(1)提取可疑菌落全基因组dna；
30.(2)以提取得到的基因组dna为模板进行9重pcr扩增，其中pcr 体系中含饱和荧光染料；并利用荧光定量pcr仪对扩增产物进行高分辨热熔解曲线分析，监测不同温度时荧光信号获得扩增目标产物的熔解曲线，进而对dec进行分型。
31.作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，9重pcr体系为：加入10μl hrm master mix(含饱和染料和pcr扩增的基本原料)，一定量的9对引物混合液(所有正向引物和反向引物终浓度均为5μm)，1.0μl可疑单菌落全基因组dna(1ng/μl或以上)，最后用去离子水定容至20μl。
32.作为本发明优选的技术方案，步骤(2)pcr扩增反应和hrm曲线分析条件如下：
33.第一阶段：热激，95℃/10min；
34.第二阶段：扩增，95℃/15s，60℃/1min，40个循环；
35.第三阶段：hrm分析，95℃/10s；60℃/1min；以0.5～1％的速率升温至 95℃，过程中用pcr荧光定量仪采集信号；95℃/15s；60℃/15s。
36.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种对 dec进行检测并分型的多重引物，引物基于8种不同的标志性毒力基因和1 种大肠埃希氏菌特征基因保守区域进行设计，根据不同引物扩增出的片段热熔解tm值的差异，建立基于9重pcr结合高分辨热熔解曲线分析技术，在单管中同时对dec进行分型鉴定，时间短，效率高，无需测序或其他后期分析，实现了真正的闭管操作，提高了检测的效率，一定程度上降低了检测成本。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
38.图1附图为9重pcr结合hrm分型鉴定熔解曲线图；
39.图2附图为特异性实验验证结果图；s1金黄色葡萄球菌；s2单核增生李斯特氏菌；s3副溶血性弧菌；s4沙门氏菌；s5铜绿假单胞菌；s6空肠弯曲菌；s7蜡样芽孢杆菌；s8肠球菌；s9阪崎肠杆菌；
40.图3附图为检出限验证结果图；
41.图4附图为致泻性大肠埃希氏菌熔解曲线图；a：etec，b：stec，c： epec d：eiec；e：eaec；
42.图5附图为传统pcr法检测5种致泻大肠埃希氏菌毛细管电泳图。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.实施例1 hrm引物的设计
45.利用primer5.0引物设计工具对目标基因进行引物设计。为了满足hrm检测技术的要求，每对引物tm值的范围在58-60℃之间，且扩增出的片段大小要小于250bp，且不超过400bp。
46.同时，为了验证引物的灵敏度与特异性，用blast(https://www.ncbi.nlm.n ih.gov/tools/primer-blast/)对引物进行了验证，结果发现所设计的引物具有较高的特异性。
47.表1引物参数评价表
[0048][0049]
不同毒力基因对应的引物见表2；
[0050]
表2 dec高分辨热熔解曲线分型鉴定引物
[0051]
[0052][0053]
实施例2 9重pcr结合hrm分型鉴定
[0054]
在单管中加入10μl hrm mastermix(含饱和染料和pcr扩增的基本原料)，一定量的9对引物混合液(所有正向引物和反向引物终浓度均为5μm)， 1.0μl可疑单菌落全基因组dna(1ng/μl或以上)，最后用去离子水定容至20 μl。置于荧光定量pcr仪对扩增产物进行高分辨热熔解曲线分析，监测不同温度时荧光信号获得扩增目标产物的熔解曲线，进而对dec进行分型鉴定。
[0055]
反应条件如下：
[0056]
第一阶段，热激，95℃/10min；
[0057]
第二阶段，扩增，95℃/15s，60℃/1min，40个循环；
[0058]
第三阶段，hrm分析，95℃/10s；60℃/1min(以0.5～1％的速率升温)； 95℃/15s；60℃/15s；
[0059]
分析样本的熔解曲线和峰形，根据扩增产物片段的tm值确定致泻性大肠埃希氏菌的类别。如图1所示；结果表明此方法具有很广的线性范围，适用于不同条件、dec样品的鉴定。
[0060]
实施例3特异性验证
[0061]
利用实施例2中的扩增体系，将其基因组dna分别替换为金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌等常见病原菌进行检测，结果均为阴性，表明该方法针对检测具有良好的特异性，见图2；
[0062]
由图2可知，s1金黄色葡萄球菌；s2单核增生李斯特氏菌；s3副溶血性弧菌；s4沙门氏菌；s5铜绿假单胞菌；s6空肠弯曲菌；s7蜡样芽孢杆菌； s8肠球菌；s9阪崎肠杆菌；特异性
实验验证结果图表明普通大肠埃希氏菌因具有uida基因，故可以检出；其他非大肠埃希氏菌无特征峰出现，方法具有良好的特异性。
[0063]
实施例4检出限验证
[0064]
以10倍系列稀释含有dec的基因组样本为模板进行扩增，扩增方法同实施例2，并分析其标准峰型。结果表明该方法对五种不同dec基因组模板的检测下限均具有很高的灵敏度，如图3所示，且其标准峰型区分明显。
[0065]
实施例5样品中的dec分型鉴定
[0066]
(1)取25mg的牛肉肉糜加入到225ml培养基中，接种一定浓度的五种致泻性大肠埃希氏菌混合液，温度在36℃
±
1℃，时间为8～18h震荡培养。
[0067]
(2)将1ml培养基进行12000rpm离心2-3min，收集菌体沉淀，利用热裂解法进行基因组dna的提取。
[0068]
(3)以提取的细菌基因组dna为模板，进行hrm分析，反应体系为： meltdoctor
tm hrm master mix，25μl；9种primer f/r(5μm)，各1.2μl；genomic dna(20ng/μl)，1.0μl，加去离子水至50μl。置于7500fastsystem仪器中进行9重高分辨热熔解曲线分型鉴定。
[0069]
反应程序为：
[0070]
第一阶段，热激，95℃/10min；
[0071]
第二阶段，扩增，95℃/15s，60℃/1min，40个循环；
[0072]
第三阶段，hrm分析，95℃/10s；60℃/1min(以1％的速率升温)；95℃/15 s；60℃/15s；
[0073]
分析样本的熔解曲线和峰形，确定致泻性大肠埃希氏菌的类别。同步以传统pcr法进行鉴定比对。
[0074]
结果如图4显示，用高分辨率熔解曲线法和传统pcr法检测到的阳性样品及其基因型判定均能一一对应，传统pcr法进行鉴定比对结果如图5。表明高分辨率熔解曲线法能有效的用于不同来源致泻性大肠埃希氏菌的分型鉴定。
[0075]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0076]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。