一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用

1.本发明涉及组织工程修复与再生领域，具体涉及一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。


背景技术：

2.口腔黏膜缺损疾病是临床中的高发疾病，超过25％的年轻人患过口腔溃疡等粘膜疾病，临床上可表现为粘膜及固有层缺损，自觉烧灼感、疼痛，严重影响患者的生活质量。与外部皮肤缺损不同，口腔内的唾液以及饮食长期对粘膜形成刺激；此外，咀嚼、发音、吞咽，甚至面部表情的变化均可引起口腔黏膜的运动，进而加剧疼痛，并影响缺损愈合。潮湿、高度动态的环境使其治疗具有挑战性。传统使用的保护性材料和治疗性药物对其治疗效果欠佳，归咎于上述原因而使材料和药物在伤口处短暂的停留，不能长时间发挥作用。
3.近年来，干细胞在组织缺损修复中的应用越来越广泛。有研究人员利用仿生水凝胶承载二维培养的间充质干细胞，可快速实现伤口的修复与再生，其实质是利用水凝胶的三维网状结构，使间充质干细胞实现三维生长。间充质干细胞的三维培养可明显提高干细胞的增殖能力、抗凋亡、抗炎能力和旁分泌能力。但是采用仿生水凝胶承载的二维培养的间充质干细胞，培养过程复杂，成本高，很难实现大规模生产。
4.鉴于此，本发明提供一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。提供一种成本低，简单方便，可大规模生的三维球形的间充质干细胞以及在组织修复中的应用。
6.本发明解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种间充质干细胞体外三维培养方法，所述干细胞体外三维培养方法为将间充质干细胞接种至成球培养基中进行培养，得到球形间充质干细胞；
7.其中，所述成球培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为dmem/f12培养基；所述添加物包括血清白蛋白和双抗p/s(青链霉素混合液(100x)。
8.本发明的有益效果是：本发明的血清白蛋白促进间充质干细胞形成三维球形结构，其成本较低，简单方便，可大规模生产。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
10.进一步，所述添加物包括质量浓度为1-10％血清白蛋白和1％双抗p/s(青链霉素混合液(100x))。
11.采用上述进一步方案的有益效果是：含有质量浓度为1-10％血清白蛋白和1％双抗p/s的dmem/f12培养基更够更好的的促进间充质干细胞形成的三维球形。
12.进一步，所述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞(adscs)、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞中的任一种；所述血清白蛋白
包括质量浓度为1％牛血清白蛋白(bsa)或1％人血清白蛋白。所述间充质干细胞可以通过商购的方式获得，或通过实验制备获得。
13.进一步，所述干细胞体外三维培养方法具体包括以下步骤：
14.用胰蛋白酶溶液将第p3-p7代的间充质干细胞解离成单个细胞，离心、洗涤，用含有牛血清白蛋白和双抗p/s的dmem/f12培养基重悬，后铺于细胞培养板中于37℃、5％co2的孵箱中培养3～5d，得到球形间充质干细胞。
15.采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述步骤培养使间充质干细胞形成的三维球形。
16.进一步，所述干细胞体外三维培养方法具体包括以下步骤：
17.用0.25wt％胰蛋白酶溶液将第p3-p7代的脂肪间充质干细胞解离成单个细胞，离心，pbs洗涤2次，用质量浓度含有1-10％牛血清白蛋白和1％双抗p/s的dmem/f12培养基重悬，后铺于细胞培养板中于37℃、5％co2的孵箱中培养3～5d，得到球形脂肪间充质干细胞。
18.采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述步骤培养使脂肪间充质干细胞形成的三维球形。
19.本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，包括上述所述一种间充质干细胞体外三维培养方法的制备得到的球形间充质干细胞。所述药物组合物中的活性成分(本发明的球形间充质干细胞)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。
20.进一步，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
21.进一步，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型均可。所述药物组合物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
22.本发明的第三个目的是提供一种药物组合物的应用，所述药物组合物在组织修复和/或再生的药物中的应用。
23.进一步，所述组织修复为黏膜组织修复。除了口腔黏膜修复，还包括其他组织的修复，如皮肤黏膜的修复和再生。
24.发明首次发现了血清白蛋白(牛血清白蛋白或人血清白蛋白)可以促进间充质干细胞在体外形成三维球形，其成本较低，简单方便，可大规模生产。与二维细胞相比，球形间充质干细胞具有促进细胞增殖、使巨噬细胞向m2型发生表型转换，同时能够维持细胞活性。在动物模型中，利用sd大鼠口腔黏膜缺损模型，验证牛血清白蛋白促进人脂肪间充质干细胞形成的三维球形能够促进sd大鼠硬腭黏膜的修复和再生。因此可以应用于制备促进口腔黏膜缺损修复的药物，能够有效、长期的用于治疗口腔黏膜缺损相关疾病。
附图说明
25.图1为本发明第1至4天形成的脂肪干细胞球的形态光镜图；
26.图2为本发明球形脂肪干细胞的流式细胞术的鉴定图；
27.图3为本发明脂肪干细胞的增殖特性的cck-8图；
28.图4为本发明脂肪干细胞球的增殖相关基因表达检测图；*p《0.05，**p《0.01；误差线：平均值
±
标准差值(means
±
sd)，a为表皮生长因子(egf)的表达，b为胰岛素样生长因子(igf1)的表达；
29.图5为本发明脂肪干细胞球的活死(合并)细胞染色图片，a为细胞染色图，b为活细胞的统计图；
30.图6为本发明脂肪干细胞球的巨噬细胞极化后相关基因表达检测图片；*p《0.05，**p《0.01；误差线：平均值
±
标准差值(means
±
sd)，a为il-10的表达，b为tgf-β的表达，c为il-1β的表达，d为tnf-a的表达；
31.图7为本发明脂肪干细胞球的白介素1受体拮抗剂的表达情况图；*p《0.05，**p《0.01；误差线：平均值
±
标准差值(means
±
sd)，a为pcr检测中il-1rn的表达，b为wb检测中il-1rn的表达；
32.图8为本发明探索脂肪干细胞球体的应用的动物模型图；
33.图9为脂肪干细胞球体对口腔黏膜缺损治疗后的体视显微镜图；*p《0.05，**p《0.01；误差线：平均值
±
标准差值(means
±
sd)，a为pcr检测中il-1rn的表达，b为wb检测中il-1rn的表达，a为体视显微镜对照图，b为伤口面积统计对照；
34.图10为脂肪干细胞球体对口腔黏膜缺损治疗后的he和masson染色图；
35.图11为脂肪干细胞球体对口腔黏膜缺损治疗后的免疫组织化学染色图。
具体实施方式
36.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。所述试剂和生物材料，如无特别的说明，均可从商业途径获得。
37.实验材料和试剂
38.(1)材料：皮下脂肪组织与sd大鼠：用于提取adscs的皮下脂肪组织来自临床抽脂患者；球形adscs在体内的应用中的sd大鼠购自维通利华动物实验公司。
39.(2)试剂：bsa购自sigma品牌，dmem/f12培养基等购自gibco品牌。
40.说明：其余未说明的试剂均从各正规经销商处购买。
41.实施例1人脂肪间充质干细胞(adscs)球体的形成
42.本实施例所述的人脂肪间充质干细胞(adscs)球体的形成，包括如下的步骤：
43.1.adscs提取和培养
44.将吸脂后的皮下脂肪组织切成小块，在含有消化酶ii(4mg/ml)和胶原酶i(3mg/ml)的溶液中37℃振动30min。悬浮液通过70μm过滤器，以300g 5min离心收集。新鲜分离的细胞在含有5％胎牛血清(fbs)，5％间充质干细胞生长因子(mscgs)以及1％p/s(p/s是双抗，就是青霉素和链霉素的混合，起到抑制细菌生长的作用)的mscm中培养,37℃、5％co2的孵箱中培养24h。磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次继续培养，通过fc受体对adscs进行鉴定。mscm
用于adscs的扩增和传代。
45.2.球形adscs的形成
46.本实施例用0.25％胰蛋白酶溶液将第p3-p7代的adscs解离成单个细胞，离心。pbs洗涤2次，用含有1％bsa和1％p/s的dmem/f12培养基重悬。初始细胞密度约为5
×
104个/cm2铺于6孔细胞培养板中。于37℃、5％co2的孵箱中培养3-4d，得到球形adscs。结果如图1所示，1％bsa牛血清白蛋白(bsa)刺激后，adscs由单个梭形细胞逐渐聚集形成网状结构，逐渐缩回伪足，进而聚集成为3d球体结构。球体形成后渐渐从皿底脱离并悬浮在培养基中。相邻的球体可以融合形成更大的球体。
47.实施例2球形adscs的鉴定
48.本实施例采用流式细胞术，分别用cd29、cd90、cd105、cd146、cd44和cd45抗体对实施例1得到的球形adscs室温进行孵育1h，通过流式细胞仪对球形adscs表面标志物cd29、cd90、cd105、cd146、cd44和cd45进行检测。结果如图2所示，cd90和cd105阳性率≥90％，且cd45阳性率≤5％，说明球形adscs属于间充质干细胞。
49.实施例3增殖检测
50.1.cck-8检测
51.cck-8(细胞计数试剂)检测：将实施例1得到的adscs随机分成实验分两组，分别为control组(dmem/f12培养基)和bsa组(dmem/f12 1％bsa培养基)。将adscs以5.0
×
103/孔接种于96孔培养板中，每组重复3次。每天在相同的时间点，吸去旧培养基，pbs洗涤2次，更换cck-8工作液。每孔加入100μl cck-8工作液，37℃避光孵育2h，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度。连续测3天吸光度值。结果如图3所示，bsa组细胞增殖比control组更明显。
52.2.pcr检测
53.重复上述cck-8检测的分组和培养方法，2d后通过rt-pcr检测增殖相关基因表皮生长因子(egf)和胰岛素样生长因子(igf1)的表达。具体操作为：6孔细胞培养板每孔加800μl的trizol(是一种新型总rna抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总rna)，冰上裂解5min，置于1.5ml离心管中。加入1/5trizol体积的氯仿，剧烈震荡15s，静置2min。4℃12000g离心15min，取上清，切忌吸出白色中间层。加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10min。4℃12000g离心10min，此时在离心管侧壁可看到点状白色rna沉淀。加入75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5min，洗涤2次。晾干由乳白至半透明，加入15-20μl无酶水，置于冰上，测rna浓度。进行逆转录。计算每管中需加的rna和无酶水，rna 无酶水＝11.5μl。加oligo(dt)
18
primer(oligo(dt)
18
引物)1μl。梯度基因扩增仪，65℃5min，4℃终止。配剩余的液体，每管中5
×
reaction buffer(反应缓冲液)4μl；ribolock rnase inhibitor(核糖核酸酶抑制剂)1μl；10mm dntp mix(dntp混合物)2μl；revertaid reverse transcriptase(逆向逆转录酶)0.5μl。42℃60min，70℃5min，4℃直到终止，逆转成cdna，置于-20℃冰箱中保存。实时定量基因扩增仪7500上机。结果如图4所示，与control组相比，bsa组中增殖相关基因egf、igf1表达更明显。
54.实施例4细胞活性检测
55.本实施例将calcein-am(钙黄绿素)和pi试剂室温复温30min。取pi试剂(原始浓度16mm)5μl加至10ml的pbs中，混匀后得8μm(工作浓度)的pi溶液。取calcein-am溶液(原始浓度4mm)5μl加入到10ml的pi溶液中，涡旋仪混匀。最后的工作液浓度：pi为8μm、calcein-am
为2μm，直接用于细胞染色。激光共聚焦培养皿培养实施例1中制得的adscs和球形adscs。用pbs洗涤细胞2次，完全去除培养基中含有的活性酯酶。加入足量的配好的工作液，室温孵育45min，吸出染色工作液终止孵育。加入少量pbs使细胞保持湿润，荧光显微镜下观察标记细胞。结果如图5所示，在细胞活性方面，control组和bsa组并无明显差异，说明bsa可维持细胞活性。
56.实施例5抗炎特性检测
57.1.巨噬细胞极化
58.将单层adscs根据实施例1的记载的方法培养成球形adscs。单层和球形adscs分别在dmed/f12培养基中培养2d。分别收集培养基，滤器过滤。将收集的培养基分别刺激巨噬细胞2d，提取rna。根据实施例3记载的方法，通过rt-pcr检测炎症因子il-10，tgf-β，il-1β和tnf-a的表达。结果如图6所示，与control组相比，bsa组抗炎介质il-10和tgf-β表达增高；促炎细胞因子il-1β和tnf-a表达降低。
59.2.il-1rn检测
60.重复实施例3分组和细胞培养方法，培养2d后，根据实施例3记载的方法，通过rt-pcr和wb检测白细胞介素1受体拮抗剂(il-1rn)的表达情况。结果如图7所示，il-1rn在bsa组中表达显著增加。
61.实施例6球形adscs在体内的应用
62.1.sd大鼠口腔黏膜缺损模型的建立以及细胞移植
63.1％戊巴比妥按0.5ml/100g麻醉sd大鼠。开口器撑开口角，碘伏棉球硬腭黏膜消毒。用直径3mm的活检穿孔器在硬腭的第三黏膜皱襞稍后方建立黏膜全层环形缺损，压迫止血。所有程序均由本人在无菌条件下进行。每只sd大鼠在缺损的左、右、前、后方分别注射10μl的pbs或adscs(实施例1制得)或球形adscs(实施例1制得)，细胞数量106个/只。分组：pbs组、adscs组和球形adscs组。细胞移植4天后取完整硬腭及黏膜。结果如图8所示，活检穿孔器在sd大鼠硬腭的第三黏膜皱襞稍后方建立黏膜全层环形缺损，直径为3mm。
64.2.体视显微镜记录
65.取材后，多聚甲醛(pfa)固定24h，换pbs，体视显微镜记录。结果如图9所示，球形adscs组sd大鼠的口腔黏膜伤口面积明显小于pbs组和adscs组，差异有统计学意义(p＜0.05)，说明球形adscs显著促进口腔黏膜创面的愈合。
66.3.组织处理
67.组织处理处理的处理的过程为：取材-固定-脱钙-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片。
68.4.he染色
69.he染色的过程：脱蜡、水化(组织切片依次经过二甲苯15min
×
3，无水乙醇3min
×
2，95％乙醇3min
×
2，90％乙醇3min，80％乙醇3min，70％乙醇3min，蒸馏水3min
×
3)。苏木素染色5min，蒸馏水洗3min
×
3。
70.盐酸酒精分化3s，蒸馏水洗3min
×
3。流水冲洗10min。伊红染色1min，蒸馏水洗3min
×
3。脱水、透明和封片(80％乙醇2min，90％乙醇2min，95％乙醇2min，100％无水乙醇2min，二甲苯2min
×
2，中性树脂封片，显微镜观察)。结果如图10所示，与pbs和adscs组相比，球形adscs组sd大鼠硬腭缺损区口腔黏膜恢复得更完整，修复更好，上皮钉突明显，炎症程度有所减轻。
71.5.masson染色
72.常规脱蜡、水化。现用现配weigert铁苏木素染色液(铁苏木素a液：b液＝1:1)，染色15min。酸性乙醇分化液分化15s，水洗1min。masson蓝化液3min，水洗1min。丽春红品红染色液染色10min，用弱酸工作液(蒸馏水：弱酸溶液＝2:1)洗1min。
73.磷钼酸溶液洗30s后，弱酸工作液洗1min。苯胺蓝染色液染色15s后，弱酸工作液洗2min。常规脱水和透明、封片。结果如图10所示，pbs和adscs组sd大鼠硬腭区黏膜不连续，组织结构紊乱；球形adscs组上皮呈现完整连续状态，上皮钉突存在，结缔组织增生明显，排列更为规则、致密，大量的胶原纤维生成。
74.6.免疫组织化学染色
75.常规脱蜡、水化。用蛋白酶k(1
×
)和胰蛋白酶以1:1比例混匀进行抗原修复，37℃孵育20min。pbs冲洗3min
×
3。阻断内源性过氧化物酶：加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温避光孵育15min。pbs冲洗3min
×
3。封闭：5％bsa室温封闭30min。滴加一抗(1:100 5％bsa)，4℃孵育过夜。第二天复温1h，pbs冲洗3min
×
3。滴加反应增强液：适量的反应增强液，37℃孵育20min。pbs冲洗3min
×
3。滴加二抗，37℃孵育20min。pbs冲洗3min
×
3。加入现配的dab显色液，室温30s(抗体不同，时间而异)，蒸馏水立即终止。显微镜下观察。苏木素染色5min；分化、冲洗返蓝。常规脱水和透明、封片。结果如图11所示，与pbs和adscs组相比，抗炎因子il-1rn在球形adscs中表达明显，而il-1β则减少。说明球形adscs在缺损区域可以分泌il-1rn，起到减轻炎症，加速黏膜愈合的作用。
76.综上所述，牛血清白蛋白促进人脂肪间充质干细胞形成的三维球体，具有促进细胞增殖、使巨噬细胞向m2型巨噬细胞发生表型转换，同时能够维持细胞活性，分泌更多的生长因子。此外，还可以分泌更多的il-1rn。在动物模型中，利用sd大鼠口腔黏膜缺损模型，再次验证了牛血清白蛋白促进人脂肪间充质干细胞形成的三维球体能够促进sd大鼠硬腭黏膜的修复和再生。因此，牛血清白蛋白促进人脂肪间充质干细胞形成的三维球体有望成为一种新型的促进黏膜再生的治疗策略。
77.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。