一种生产乳酸的菌株及其应用

1.本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一株生产乳酸的菌株及其应用。


背景技术：

2.乳酸是重要的生物化工产品，可广泛用于食品、制药、纺织、制革、环保和农业中，其产品主要用做酸味剂、调味剂、防腐剂、鞣制剂、植物生长调节剂、生物可降解材料和手性药物等。工业乳酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。
3.化学合成法主要是为乳腈法，以乙醛与氢氰酸经碱性催化作用生成乳腈，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为乳酸，粗乳酸用甲醇酯化得到乳酸甲酯，精馏提纯后再用浓硫酸或浓盐酸水解生成乳酸。合成法获得产品是dl-乳酸，但人体仅能吸收l-乳酸。因此，化学合成法的生产成本和产物构型限制了其大规模的工业化生产。
4.发酵法采用天然原料，主要以淀粉、葡萄糖、糖蜜等为原料，生产成本低。发酵法生产乳酸对环境污染小、提纯方便。随着人们对食品安全越来越关注，对乳酸及其衍生物的开发力度在逐年加大，在食品行业乳酸将替代无机酸和对人体有害的防腐剂，在饲料添加剂中也正逐步代替无机酸。因此，低成本、高收率、高品质和轻污染的发酵法生产乳酸便具有了较大的市场和较强的竞争力。
5.发酵法的关键是菌种的选择。用于发酵生产乳酸的菌株主要有细菌和根霉，其中大多数乳酸菌发酵除生成乳酸外，还生成乙醇、co2和乙酸等副产物，米根霉在发酵过程中会形成巨大的菌丝团造成生产速率低、生产不稳定的问题。目前利用乳酸菌生产乳酸的发酵培养基中玉米浆干粉添加量为30-55 g/l，一定程度上导致了培养基成本偏高，因此开发可利用低廉成本培养基且同时具备高产量、少副产物的微生物菌株是目前所关注的热点。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明提供了一种高效生产乳酸的菌株，所要解决的技术问题是在优化培养基提高乳酸产量的同时，提高糖酸转化率、降低培养基成本、减少发酵液副产物。
7.本发明还要解决的技术问题是提供上述菌株的应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明公开了一种菌株，其分类命名为副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉
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武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20211178，保藏日期为2021年9月15日。
9.本发明所述菌株副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2的筛选方法为：称取适量泡菜汤汁，用生理盐水稀释，吸取100 ml于mrs培养平板上， 28~37 ℃下培养3~4天。生长出的菌落划线纯化5代，从而筛选出能够生产乳酸的菌株副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2。
10.菌株lys2的菌落形态如图1所示，菌落直径2~3 mm，菌落呈乳白色微凸圆形，表面光滑、边缘整齐。
11.所述菌株lys2在发酵生产乳酸中的应用。
12.将菌株lys2以接种量1~10% v/v接种到种子培养基中，28~37 ℃，80~200 r
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震荡培养12~72 h，然后以接种量1~10% v/v接种到发酵培养基中28~37 ℃，80~200r
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震荡培养48~96h。
13.本发明中，培养基氮源可以分别为蛋白胨、玉米浆干粉、酵母粉、牛肉膏粉等有机氮源或者无机氮源硫酸铵中的一种或几种混合；优选以玉米浆干粉和酵母粉为氮源所获得的乳酸产量更高，进一步从原料价格上来讲，使用玉米浆干粉作为氮源所需要的成本比酵母粉低。
14.所述氮源浓度为2.5 ~10 g/l。
15.优选地，随着氮源浓度的增加，乳酸产量呈现上升的趋势，在2.5~7.5 g/l之间，乳酸产量上升显著，而在7.5~10 g/l之间，乳酸产量上升不明显，因此更优选地，采用7.5 g/l玉米浆干粉作为培养基的氮源。
16.所述发酵培养基中caco3在5~15 g/l之间，乳酸产量处于显著上升的趋势，在15~25 g/l之间，乳酸产量虽然还在上升但变化范围不大，优选浓度为10~20 g/l，更优选地浓度为15g/l。
17.所述的种子培养基各组分的含量为：10~15 g/l葡萄糖，5~10 g/l酵母粉，5~10 g/l玉米浆干粉，5~10 g/l nah2po4·
2h2o，10~20 g/l k2hpo4·
3h2o，5~15 g/l cahco3。
18.种子培养基各组分的含量优选为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
19.所述发酵培养基各组分的含量为：50~70 g/l葡萄糖，5~10 g/l酵母粉，5~10 g/l玉米浆干粉，5~20 g/l caco3，5~10 g/l nah2po4·
2h2o，10~20 g/l k2hpo4·
3h2o，5~15 g/l cahco3。
20.发酵培养基各组分的含量优选为：60 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，15 g/l caco3，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
21.其中，所述培养为振荡培养，优选为80~200 r
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，进一步优选为120 r
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震荡培养。
22.其中，所述培养过程中保持ph为5.0~6.0。
23.其中，所述培养的温度优选为37℃，周期为96 h。
24.所述发酵培养液可以采用分批补料方式，根据菌株的生长周期，补料添加葡萄糖。在本发明一个实施例中，根据菌株的生长周期，每48 h添加30 g/l葡萄糖，最终消耗144 g/l的葡萄糖，获得了120 g/l的乳酸，其耗糖速率为1 g/（l
· h），产乳酸速率为0.833 g/（l
·
h）。
25.有益效果：本发明以自制泡菜为分离材料，通过一系列的筛选分离纯化得到一株高产乳酸的菌株lactobacillus paracasei lys2。菌株lys2在1~2天迅速生长并利用葡萄糖生产乳酸，且副产物乙酸等的产量几乎为0，大大提高生产效率，便于提纯，降低成本。在5 l发酵罐中发酵6天，共产生120 g/l的乳酸，耗糖速率为1.000 g/（l
·
h），产乳酸速率为0.833 g/（l
·
h）。发酵液乳酸浓度高、残糖量少、副产物少，具备生产竞争力。
附图说明
26.图1为菌株lys2的菌落形态特征；图2为不同氮源种类下乳酸的产量；图3为不同氮源浓度下乳酸的产量；图4为不同碳酸钙浓度下乳酸的产量；图5为最优条件下乳酸菌生长状况（60 g/l葡萄糖）；图6发酵液液相色谱图；图7为分批补料发酵。
具体实施方式
27.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
28.实施例1生产乳酸的副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）的分离筛选及鉴定：称取适量自制泡菜汤汁，用0.9%（w/v）的生理盐水对其进行梯度稀释，将样品稀释，分别吸取各稀释度的稀释液0.1 ml，涂布于mrs培养基平板上，每个稀释度重复3 次，37 ℃下恒温培养24~48 h。观察并记录菌落特征，挑取具有乳酸菌典型特征并伴有溶解圈的菌落，进行反复划线纯化，直至出现单个纯菌落，从而筛选出能够高产乳酸的菌株。对该菌株进行16s rdna测定，经过ncbi数据库比对，在分子水平上将菌株lys2鉴定至lactobacillus paracasei，其16s rdna核苷酸序列如seq id no.1所示。
29.菌株lys2的菌落形态如图1所示，菌落直径2~3 mm，菌落呈乳白色微凸圆形，表面光滑、边缘整齐。
30.实施例2副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2在不同氮源下的乳酸产量：将副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2以接种量5% v/v接种到50 ml的种子培养基中，37 ℃，120 r
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震荡培养12 h，然后以接种量5% v/v分别接种到50 ml发酵培养基中37 ℃，120 r
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震荡培养96 h后取样测乳酸产量。
31.上述种子培养基配方为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
32.发酵培养基配方为：60 g/l葡萄糖，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3，10 g/l氮源，氮源分别为蛋白胨、玉米浆干粉、酵母粉、牛肉膏粉4种有机氮源以及无机氮源硫酸铵。
33.糖浓度以及乳酸浓度的测定：取1 ml 发酵液，12000 rpm 条件下离心1 min，上清液用流动相进行20~100 倍数的稀释，再过膜（0.22 μm）两次。通过高效液相色谱法对发酵液中糖浓度、乳酸浓度及其副产物进行检测，检测条件为：以0.25 mmol/l 的h2so4溶液作为流动相，流速为0.5 ml/min，示差检测器的检测波长为215 nm。色谱分析柱为离子排斥色谱柱；检测器为示差折光检测器。
34.结果如图2所示，在这4中有机氮源中，玉米浆干粉和酵母粉为氮源所获得的乳酸产量较高，分别为55.34 g/l和57.26 g/l，约为无机盐培养基的2.5倍。而这2种有机氮源乳
酸产量相差不大，但从价格上来讲，使用玉米浆干粉作为氮源所需要的成本比酵母粉低，因此后续采用玉米浆干粉作为培养基的氮源。
35.实施例3使用玉米浆干粉作为氮源，副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2不同氮源浓度下的乳酸产量：将副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2以接种量5% v/v接种到50 ml的种子培养基中，37 ℃，120 r
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震荡培养12 h，然后以接种量5% v/v分别接种到50 ml发酵培养基中37 ℃，120 r
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震荡培养96 h。取样测乳酸产量。
36.上述种子培养基配方为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
37.发酵培养基配方为：60 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3，玉米浆干粉浓度分别为2.5 g/l、5 g/l、7.5 g/l、10 g/l。
38.结果如图3所示。随着氮源浓度的增加，乳酸产量呈现上升的趋势，在2.5~7.5 g/l之间，乳酸产量上升显著，而在7.5~10 g/l之间，乳酸产量上升不明显，因此采用7.5 g/l玉米浆干粉作为培养基的氮源。
39.实施例4使用7.5 g/l玉米浆干粉作为氮源，副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2在不同caco3下的乳酸产量：将副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2以接种量5% v/v接种到50 ml的种子培养基中，37 ℃，120 r
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震荡培养12 h，然后以接种量5% v/v分别接种到50 ml发酵培养基中37 ℃，120 r
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震荡培养96 h，取样测乳酸产量。
40.上述种子培养基配方为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
41.发酵培养基配方为：60 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，15 g/l caco3，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3， caco3浓度分别为5 g/l、10 g/l、15 g/l、20 g/l、25 g/l。
42.结果如图4所示，在5~15 g/l之间，乳酸产量处于显著上升的趋势，在15~25 g/l之间，乳酸产量虽然还在上升但变化范围不大，因此采用添加15g/l 的caco3调节培养基的ph。
43.实施例5副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2在最优条件下的生长情况：将副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2以接种量5% v/v接种到50 ml的种子培养基中，37 ℃，120 r
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震荡培养12 h，然后以接种量5% v/v分别接种到50 ml发酵培养基中37 ℃，120 r
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震荡培养96 h，取样测乳酸产量。
44.上述种子培养基配方为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4
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2h2o，15.5 g/l k2hpo4
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3h2o，10 g/l cahco3。
45.发酵培养基配方为60 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，15 g/l caco3，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
46.结果如图5、图6所示，乳酸菌的生长周期为96 h，葡萄糖基本被消耗完，总共获得了58 g/l的乳酸，得率为0.98 g乳酸/g葡萄糖，乙酸等副产物产量几乎为0。
47.实施例6副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2采用分批补料方法的生长情况：将副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2以接种量5% v/v接种到50 ml的种子培养基中，37 ℃，120 r
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震荡培养12 h，然后以接种量5% v/v接种到5 l发酵罐中培养。
48.上述种子培养基配方为：10 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，9.6 g/l nah2po4
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2h2o，15.5 g/l k2hpo4
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3h2o，10 g/l cahco3。
49.发酵培养基配方为60 g/l葡萄糖，5 g/l酵母粉，7.5 g/l玉米浆干粉，15 g/l caco3，9.6 g/l nah2po4·
2h2o，15.5 g/l k2hpo4·
3h2o，10 g/l cahco3。
50.根据该菌株的生长周期，每48 h添加30 g/l葡萄糖。结果如图7所示，该菌株在第144 h停止生长，并最终消耗144 g/l的葡萄糖，获得了120 g/l的乳酸，其耗糖速率为1.00 g/（l
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h），产乳酸速率为0.833 g/（l
·
h）。
51.以上实施例的只是用于分析理解本发明的制备方法及应用范围，但本发明不限于以上实例。如果本领域的普通技术人员受其启示，对本发明直接进行改变、替代、修饰等，均应属于本专利的保护范围。