一种适用于碱性磷酸酶化学发光体系的清洗液的制作方法

1.本发明属于化学发光技术领域，具体涉及一种适用于碱性磷酸酶化学发光体系的清洗液。


背景技术：

2.全自动化学发光测定仪结合了高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应，且具有使用操作简便、结果可靠、性能稳定等优点，已成为医院临床检验科使用频率最高的仪器之一。其中碱性磷酸酶化学发光体系为化学发光测定仪常用的体系之一，碱性磷酸酶可以水解各种单磷酸酯并释放无机磷酸盐。在碱性磷酸酶体系中，1,2-二氧杂环丁烷化合物(amppd)作为一种超灵敏的碱性磷酸酶底物，在碱性磷酸酶的催化作用下，amppd的磷酸根基团水解并形成一个不稳定的中间体，该中间体自行分解后四元环断裂释放出大量能量，从而激发化学发光反应。
3.清洗液作为全自动化学发光测定仪的通用试剂，常与各种免疫检测试剂盒配套使用，用于清洗反应杯内和针头上的未参加特异性反应物质，避免检测结果的异常波动，降低非特异性结合所导致的干扰。良好的清洗液应能在不影响抗原-抗体特异性结合和碱性磷酸酶功能的基础上，最大限度的清洗掉杯壁、针头、磁珠和抗体-抗原非特异性弱结合的物质，以提高检测灵敏度、精密度，降低检测变异系数。
4.cn111607465a公开了一种化学发光清洗液及其制备方法和应用，其主要包含tris、钠离子、chaps、triton-100、pc300、bnd、尼泊金丙脂和硅油型消泡剂，且清洗液ph值为7.0-7.5。cn110862881a公开了一种全自动化学发光测定仪专用的清洗液或其稀释液及其制备方法，其主要包含无机盐、磷酸盐缓冲体系、表面活性剂1(吐温-20或吐温80)、表面活性剂2(十二烷基硫酸钠或月硅酸钠)、防腐剂(proclin300和bronidox)，ph值为7.2-8.3。cn113484306a公开了一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法，其主要包含磷酸盐缓冲体系、无机盐、edta钠盐、吐温20、十二烷基硫酸钠、pc300、叠氮化钠、硅油型消泡剂、ph为7.0-7.5。在上述专利申请中，存在以下问题：
①
磷酸盐缓冲体系并不适用于碱性磷酸酶化学发光体系，因为磷酸根会抑制碱性磷酸酶，导致检测信号降低，从而导致部分项目的检测灵敏度不够；
②
edta钠盐会鳌合碱性磷酸酶的激活金属离子mg和zn，导致碱性磷酸酶失活；
③
虽然硅油型消泡剂可以有效抑制泡沫，但其会影响抗原抗体结合，少量携带至试剂中的硅油型消泡剂还会严重影响试剂的稳定性；
④
尼泊金丙酯、叠氮化钠等为易燃或易爆物质，安全性低。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用于碱性磷酸酶化学发光体系的清洗液，提高清洗能力的同时进一步提高检测灵敏度。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
7.一种适用于碱性磷酸酶化学发光体系的清洗液，其ph为9～10，具体包括tris、
nacl、mgcl2、表面活性剂和消泡剂；其中，表面活性剂由非离子型表面活性剂和gemini表面活性剂组成。
8.进一步地，在上述技术方案中，消泡剂为聚醚型消泡剂，且添加量为0.001～0.1wt％。
9.进一步地，在上述技术方案中，清洗还包括添加量为0.1～2wt％的防腐剂；更进一步地，防腐剂为pc-950和/或bnd-10。
10.进一步地，在上述技术方案中，gemini表面活性剂的添加量为0.001～0.1wt％。gemini表面活性剂由二个相同阳离子表面活性剂的头部通过疏水基团连接在一起，由于其独特的双亲水头部结构，使之具备了更加突出的特征性质，如更易吸附在气/液表面，能更有效地降低水溶液表面张力，更易聚集生成胶束。
11.具体的，gemini表面活性剂的阴离子为cl离子或br离子，gemini表面活性剂的阳离子结构则如下所示：
[0012][0013]
其中阳离子结构中n的数值为6-20，m的数值为2-6。
[0014]
进一步地，在上述技术方案中，非离子型表面活性剂包括吐温20和s9(乙二胺烷氧基化物嵌段共聚物，又称tetronic 1307)，吐温20的添加量为0.1～2wt％，s9的添加量为0.1～2wt％。
[0015]
进一步地，在上述技术方案中，nacl的添加量是1～10wt％。
[0016]
进一步地，在上述技术方案中，mgcl2的添加量是1～10wt％。
[0017]
本发明进一步提供了上述清洗液的制备方法，具体为：以纯水为溶剂，按比例添加tris、nacl、mgcl2、非离子型表面活性剂、防腐剂、gemini表面活性剂和聚醚型消泡剂，搅拌混匀后，再用盐酸调节至ph至9～10，最后用0.22μm滤膜过滤溶液即得。
[0018]
由于清洗液使用量较大，为了节省运输成本，本发明配制的清洗剂为浓缩刑，故采用本发明提供的清洗液用于化学发光免疫分析的清洗步骤时，应先用纯水稀释10～20倍。
[0019]
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0020]
1)本发明提供的清洗液的ph为9～10，高ph一方面有利于激活碱性磷酸酶，另一方面还可以最大限度洗脱抗原-抗体的非特异性结合，而且实验证明，本发明的清洗液在此ph条件下导致抗原抗体之间的解离，进而导致有效信号的丢失；另外，在此ph条件下使用pc-950和bnd-10做防腐剂有更好的防腐效果，而pc-300则会因变黄失去防腐性；
[0021]
2)在清洗液中同时采用非离子型表面活性剂和gemini表面活性剂，本发明发现使用极少量gemini表面活性剂可以在不破坏抗原抗体结合的情况下清洗掉非特异性结合的杂蛋白，非离子表面活性剂吐温20和s9可以减少蛋白与杯壁和针头之间的物理吸附，二者
协同作用，可以降低非特异性结合在磁珠或试管上的碱性磷酸酶，进而降低测试时的变异系数；
[0022]
3)本发明中添加了大量的无机盐(即nacl和mgcl2)以提供免疫反应适宜的电解质，降低非目标蛋白与抗体的结合能力；而且gemini表面活性剂与mg离子配合能提前快速激活碱性磷酸酶的催化位点，进而提高检测灵敏度；
[0023]
4)本发明采用聚醚型消泡剂，不仅能有效以防止洗涤过程中产生气泡，而且不会影响检测试剂的稳定性，避免发生跳值现象。
具体实施方式
[0024]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0025]
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0026]
实施例1
[0027]
本实施例提供的清洗液包括：2％tris、10％nacl、5％mgcl2、2％吐温20、1％s9、1％pc-950、1％bnd-10、0.1％gemini表面活性剂(具体为n＝12，m＝4的氯化物)和0.1％聚醚型消泡剂(sigma的消泡剂204)。将上述原料按比例加入纯水中，搅拌至混合均匀后用盐酸调至ph为9.5，并用0.22μm滤膜过滤溶液。
[0028]
本实施例提供的清洗液在使用时推荐用纯水稀释20倍。
[0029]
对比例1
[0030]
此例提供的清洗液中不含有gemini表面活性剂，其他同实施例1一致。
[0031]
对比例2
[0032]
此例提供的清洗液中不含有mgcl2，其它同实施例1一致。
[0033]
对比例3
[0034]
本例提供的清洗液为中国专利cn111607465a的最优配方，具体为：500mm tris缓冲液、0.5％chaps、0.5％tritonx-100、500mm nacl、0.6％proclin-300、0.1％bnd、0.1％尼泊金丙酯、0.1％硅油型消泡剂，且ph为7.3。
[0035]
从外观上看，实施例1、对比例1和对比例2中的清洗液为无色透明液体，对比例3中的清洗液为无色透明有油状漂浮物的液体。
[0036]
进一步通过全自动化学发光测定仪(生之源szy-cl1000仪器)和ca125发光试剂盒(生之源自研试剂)、g17发光试剂盒(生之源自研试剂)检测清洗液实施例1、对比例1、对比例2和对比例3对检测结果的影响，具体包括以下几个方面：
[0037]
(1)空白校准品的检测。
[0038]
分别使用清洗液实施例1、对比例1、对比例2和对比例3，按照仪器操作流程和发光试剂盒说明书，分别重复测定各试剂盒的零浓度校准品20次，结果如下表所示(变异系数＝(标准偏差sd/平均值mean)
×
100％)：
[0039][0040][0041]
从上表可知，实施例1的清洗液比对比例1～3的清洗液的空白值低，而且实施例1的清洗液的变异系数也显著低于对比例1～3清洗液。
[0042]
(2)低值校准品的检测。
[0043]
分别使用清洗液实施例1、对比例1、对比例2和对比例3，重复测试ca125发光试剂盒的10u/ml校准品和g17发光试剂盒的5pmol/l校准品各20次，结果如下表所示：
[0044][0045][0046]
从上表可知，对于同样的校准品，对比例3的清洗液不仅变异系数较高，而且存在跳值问题，实施例1的清洗液变异系数小于5％，且测试信号明显高于对比例清洗液；对比例1和对比例2的变异系数虽然有了较大程度的降低，但测试信号强度明显低于实施例1。
[0047]
(3)混合样本的检测。
[0048]
分别使用清洗液实施例1、对比例1、对比例2和对比例3，用ca125和g17试剂盒分别重复测试混合样本(随机混合的10个不同人的临床血清样本)20次，测试结果如小表所示：
[0049][0050][0051]
从上表可知，测同样的样本，对比例3的清洗液不仅变异系数较高，而且存在跳值问题，实施例1的清洗液变异系数小于5％，且测试信号明显高于对比例清洗液。对比例1和对比例2的变异系数虽然有了较大程度的降低，但测试信号强度和变异系数均明显劣于实施例1。
[0052]
(4)清洗液的稳定性检测。
[0053]
将清洗液实施例1、对比例1、对比例2和对比例3，常温避光放置6个月。从外观上看，清洗液实施例1、对比例1、对比例2的外观无变化，清洗液对比例3的颜色稍有变黄；进一步用ca125和g17试剂盒重复测试混合样本20次，检测结果如下表所示：
[0054][0055][0056]
从上表可知，实施例1的清洗液对比6月前的样本测试变异系数没有明显变化，而对比例清洗液跳值出现的频率有所升高。
[0057]
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
[0058]
综上所述，本发明提供的清洗液在常温避光下稳定性良好，且清洗能力强，相对于现有技术具有更低的空白检测值和测试变异系数，同时本发明的清洗液在清洗时可以预活化碱性磷酸酶，提高了检测信号值，进而提高了试剂盒的检测灵敏度。
[0059]
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。