用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法和系统与流程

用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法和系统
1.相关申请的交叉引用
2.根据《美国法典》第35章第119节(e)项规定，本专利申请案主张于2019年1月31日提交的编号为62/968,516的美国临时专利申请案以及于2019年7月17日提交的编号为63/053,108的美国临时专利申请案提交日期的优先权；这些专利申请案中的内容以引用方式并入本文中。


背景技术：

3.流式细胞术是一种用于表征且通常用于分选生物材料的技术，例如，血样中的细胞或另一种生物或化学样品中的目的颗粒。流式细胞仪通常包括用于接收流体样品(例如，血样)的样品容器，以及含鞘液的鞘液容器。流式细胞仪将流体样品中的颗粒(包括细胞)以细胞流的形式传输至流动池，同时也将鞘液引导至流动池中。为了表征流体介质的组分，用光辐照流体介质。流体介质中材料的变化(例如，形态或存在荧光标记物)可能引起所观测到的光发生变化，这些变化可用于表征和分离。例如，流体悬浮液中的颗粒(例如分子、与分析物结合的微珠或个别细胞)通过检测区域，在所述区域内，所述颗粒暴露于通常来自一个或更多个激光器的激发光中，并且测定所述颗粒的光散射和荧光特性。颗粒或其组分通常用荧光染料标记以便进行检测。各种不同的颗粒或组分可以通过用光谱特性不同的荧光染料标记来同时加以检测。在一些实施方案中，所述分析仪包括多个检测器，一个适用于待测定的每个散射参数，一个或更多个适用于待检测的每种不同染料。例如，一些实施例包括光谱结构，其中针对每种染料使用一个以上的传感器或检测器。所获得的数据包含针对所述光散射检测器和所述荧光发射中的每一项测得的所述信号。
4.流式细胞仪可以进一步包含用于记录所测得的数据并分析所述数据的装置。例如，可以使用与所述检测电子器件连接的计算机来进行数据存储和分析。例如，所述数据可以列表形式存储，其中每一行对应于一颗颗粒的数据，而所述列对应于每项被测特征。使用标准文件格式(例如，“fcs”文件格式)存储来自颗粒分析仪的数据有助于采用单独的程序和/或机器分析数据。采用当前分析方法时，所述数据通常以一维直方图或二维(2d)图的形式展示，以便于可视化，但也可采用其他方法来使多维数据可视化。
5.例如，使用流式细胞仪测定的参数通常包括所述颗粒在激发波长下以狭角主要沿前向散射的光(被称为前向散射(fsc))；所述颗粒沿与所述激发激光器正交的方向散射的所述激发光(被称为侧向散射(ssc))；以及由一个或更多个检测器(用于在一定光谱波长范围内测量信号)中的荧光分子发射出的光，或者由主要在所述特定检测器或检测器阵列中检测到的荧光染料发射出的光。不同的细胞类型可以通过用荧光染料标记的抗体或其他荧光探针标记各种细胞蛋白或其他组分而得到/产生的光散射特性和荧光发射加以识别。
6.流式细胞仪和扫描式细胞仪均可从诸如bd biosciences(加利福尼亚州圣何塞)等处购得。流式细胞术的相关描述请见以下出版物，例如，landy等人(编)，临床流式细胞术，纽约科学院年鉴，第677卷(1993年)；bauer等人(编)，临床流式细胞术：原理与应用，williams&wilkins(1993年)；ormerod(编)，流式细胞术：实用方法，牛津大学出版社
(1994)；jaroszeski等人(编)，流式细胞术方案，methods in molecular biology，第91期，humana press(1997年)；以及shapiro，实用流式细胞术，第4版，wiley-liss(2003年)；所述出版物中的所有内容以引用方式并入本文。荧光成像显微镜检查的相关描述请见以下出版物，例如，pawley(编)，生物共聚焦显微镜检查手册，第2版，plenum press(1989年)，其以引用方式并入本文。
7.从一个或更多个检测器中接收流式细胞仪数据后，通常会进行数据分析过程，以便用户理解。在一些情况下，流式细胞仪数据分析涉及确定与流式细胞仪中接受辐照的分析物(例如，细胞、颗粒)相关的表型。对于所有细胞计数法用样品中的大多数样品，在进行任何更深入的分析之前，有必要识别细胞类型子集(即，表型)。在典型的工作流程中，必须手动调整预先计划的门控层次结构(概括了普遍接受的细胞类型定义)，以适应各样品的所述数据(以考虑生物效应、批次效应和任何其他特性)。调整方法可以是“无监督”方法，也可以是“监督”方法。采用无监督方法时，首先将流式细胞仪数据聚类成群体，然后利用一些有关特定分析物与某些参数(例如，荧光)相关联的先验知识，尝试将细胞类型标签(即，表型)分配给各群体聚类。另一方面，采用监督方法时，通常先确立门控层次结构，即，一组规则：根据其相对于一个或更多个参数的状态来管理单个细胞的分类方式(即，表型分析)。随后，将流式细胞仪数据“拟合”到所述门控层次结构，使得各个数据点均落在所述层次结构中的某个位置。例如，dafi算法能够根据事件质心将事件聚类拟合到现有门控树，以便沿着所述数据的自然边界而非固定门边界来划分细胞类型。dafi算法的相关描述请见，例如，lee等人(2018)。dafi：一种直接递归数据过滤和聚类方法，用于改进和解释通过多色流式细胞术数据实现的对细胞群体的数据聚类识别。细胞计数法，第a部分，93(6)，597-610；其内容以引用方式并入本文。另一方面，flowdensity能够找到所述数据中的密度波谷，用作预先定义的层次结构的门边界。flowdensity算法的相关描述请见以下出版物，例如，malek等人(2015)，flowdensity：通过基于密度的自动细胞群体识别来再现流式细胞术数据的手动门控，生物信息学，31(4)，606-607；其内容以引用方式并入本文。但是，dafi算法只能考虑较小的样品间变化，而flowdensity算法需要根据每个检测试剂盒的具体情况手动进行自动表型分析专家调优。
8.ek'balam算法是一种流式细胞仪数据调整方法，它相对于dafi和flowdensity算法有所改进，因为ek'balam算法易于调优，且能够处理较大的样品间变化。但是，涉及两个或更多个参数(例如，荧光信号)测量的流式细胞术数据分析协议(例如ek'balam算法)因溢出而变得复杂，所述溢出是一种现象，其中指示特定荧光色素的颗粒调制光由一个或更多个未被配置成测量所述参数的检测器接收。因此，光可能会“溢出”并被非目标检测器检测到。溢出可通过解混来纠正，其中新的全荧光色素强度值通过求解方程组计算得出，所述方程组通过观察到的溢出水平将所述荧光色素强度值与所得测得的检测器值相关联。在检测器数量等于解混的荧光色素的数量时，解混通常称为“补偿”。尽管解混纠正了各荧光色素对各其他荧光色素的强度贡献，但它无法纠正噪声贡献，即，溢出致使荧光流式细胞仪数据出现的误差。这种噪声称为“溢出扩散”。在一些情况下，溢出扩散噪声具有建设性，它使得信号强度高于其他情况下观察到的信号强度，而在其他情况下，所述噪声具有破坏性，使得强度较低。例如，图1展示了群体101是如何因来自检测器(其用于测量荧光色素b)上的荧光色素a的噪声而扩散的。由于群体扩散，依据数据分析协议对荧光流式细胞仪数据进行的分
类(即，表型分析)可能会变得不准确。例如，图2a和图2b展示了溢出扩散对ek'balam算法正确区分不同流式细胞仪数据群体聚类的能力的影响。如图2b所示，对群体101进行了错误分区，且所述群体的一部分因此被分配了错误的表型(即，a
b
而非a

b-)。因此，需要一种应对流式细胞仪数据分析中的溢出扩散的解决方案。


技术实现要素：

9.本发明的方面包括用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法。在一些实施例中，所述方法包括用监督算法处理所述流式细胞仪数据，所述监督算法被配置成将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。在实施例中，基于各数据点相对于层次结构的状态，对荧光流式细胞仪数据进行聚类。在此类实施例中，基于所述荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光色素呈阳性或阴性，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。在一些实施例中，基于所述荧光流式细胞仪数据与阈值的关系，确定荧光流式细胞仪数据对特定荧光色素呈阳性还是阴性。对数据进行聚类后，本方法的实施例包括确定溢出扩散程度。在一些实施例中，确定溢出扩散包括计算溢出扩散系数，即，量化由第一检测器从第一荧光色素中收集到的光的强度受同时由同一检测器从第二荧光色素中收集到的光的影响程度。在实施例中，针对荧光检测器与荧光色素组成的各个可能的组合，计算溢出扩散系数，以便确定在给定检测器处收集到的特定荧光色素所发射的光的量。在一些实施例中，在溢出扩散矩阵中组合溢出扩散系数。在某些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据群体，以考虑在所述溢出扩散矩阵中确定的溢出扩散幅度。实施本发明的方法可以进一步包括对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。在实施例中，对所述群体进行分区涉及计算马修斯相关系数，以及以针对各相关阈值优化马修斯相关系数的方式，确立在不同群体(即，表现出不同荧光参数的群体)间进行划分的分区。在实施例中，随后对已分区的荧光流式细胞仪数据群体进行分类，使得所述不同群体与相应的亚型(即，表型)相关联。
10.本发明的方面还包括用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的系统。在一些实施例中，系统包括被配置成产生荧光流式细胞仪数据的颗粒分析仪。系统还可以包括处理器，所述处理器具有与其可操作地耦合的存储器，其中所述存储器包括存储于其上的指令，所述指令由所述处理器执行时，会使所述处理器利用监督算法处理所述流式细胞仪数据，所述监督算法被配置成将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。在实施例中，基于各数据点相对于层次结构的状态，对荧光流式细胞仪数据进行聚类。在此类实施例中，基于所述荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光色素呈阳性或阴性，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。在一些实施例中，基于所述荧光流式细胞仪数据与阈值的关系，确定荧光流式细胞仪数据对特定荧光色素呈阳性还是阴性。对数据进行聚类后，所述处理器被配置成确定溢出扩散程度。在一些实施例中，确定溢出扩散包括计算溢出扩散系数，即，量化由第一检测器从第一荧光色素中收集到的光的强度受同时由同一检测器从第二荧光色素中收集到的光的影响程度。在实施例中，针对荧光检测器与荧光色素组成的各个可能的组合，计算溢出扩散系数，以便确定在给定检测器处收集到的特定荧光色素所发射的光的量。在一些实施例中，所述处理器被配置成在溢出扩散矩阵中组合溢出扩散系数。在某些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据群体，以考虑在所述溢出扩散矩阵中确定的溢出扩散幅度。所述处理器可以进一步被配置成对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。在实
施例中，对所述群体进行分区涉及计算马修斯相关系数，以及以针对各相关阈值优化马修斯相关系数的方式，确立在不同群体(即，表现出不同荧光参数的群体)间进行划分的分区。在实施例中，随后对已分区的荧光流式细胞仪数据群体进行分类，使得所述不同群体与相应的亚型(即，表型)相关联。
11.本发明的方面进一步包括计算机控制系统，其中所述系统进一步包括一台或更多台计算机，用于实现完全自动化或部分自动化。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，所述存储介质中存储有计算机程序，其中所述计算机程序包括在加载到所述计算机上时，用以执行以下操作的指令：根据一个或更多个不同参数(即，荧光色素)，将荧光流式细胞仪数据聚类成群体；确定各检测器-参数对之间的溢出扩散(即，通过计算溢出扩散系数确定)；创建溢出扩散矩阵，展示其相应检测器对特定荧光色素的检测如何受到其他荧光色素溢出的影响；调整所述荧光流式细胞仪数据，通过减小由所述溢出扩散矩阵确定的所述溢出扩散幅度来补偿溢出扩散；相对于阈值(用以区分对给定参数呈阳性的群体与对给定参数呈阴性的群体)计算马修斯相关系数，从而评价分离不同荧光流式细胞仪数据群体的不同分区的质量；以及对经调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型分析)。
附图说明
12.结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。附图中包括以下图示：
13.图1描绘了荧光流式细胞仪数据的溢出扩散。
14.图2a 描绘了溢出扩散如何抑制算法正确区分不同荧光流式细胞仪数据群体聚类的能力。
15.图2b描绘了溢出扩散如何抑制算法对荧光流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型)的能力。
16.图3描绘了用于对t细胞进行表型分析的层次结构，其中表型分析通过确定细胞相对于cd4或cd8的存在呈阳性还是阴性来完成。
17.图4描绘了相对于阈值对荧光流式细胞仪数据进行聚类的情况。
18.图5描绘了溢出扩散矩阵。
19.图6描绘了基于溢出扩散调整流式细胞仪数据群体的过程。
20.图7a描绘了已基于溢出扩散加以调整的流式细胞仪数据。
21.图7b描绘了对已基于溢出扩散加以调整的流式细胞仪数据进行分类(即，表型分析)的情况。
22.图8描绘了根据某些实施例的流式细胞仪。
23.图9描绘了根据某些实施例的处理器的一个示例的功能框图。
24.图10描绘了根据某些实施例的计算系统的框图。
具体实施方式
25.本发明提供了用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法。在一些情况下，方法包括用监督算法处理所述流式细胞仪数据，所述监督算法被配置成根据数据点与相关阈值
的关系，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成不同群体。在实施例中，方法包括计算溢出扩散系数并在溢出扩散矩阵中将其组合，从而确定溢出扩散程度。在一些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据群体，以减小由所述溢出扩散矩阵确定的所述溢出扩散幅度。在实施例中，在相对于所述阈值评价潜在分区之后，对经溢出扩散调整的群体进行分区。在实施例中，按照层次结构对已分区的荧光流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型分析)。本发明还提供了用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的系统和计算机可读介质。
26.在更加详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
27.在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。
28.本文中提出的某些范围在数值前带有术语“大约”。本文中使用术语“大约”的目的是为其后的精确数字以及与该术语之后数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定某一数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字在其出现的上下文中可以是基本上等同于所具体列举数字的数字。
29.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了具有代表性的示例性方法和材料。
30.在本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用方式并入本文中，犹如每一单独出版物或专利被具体地和单独地表明通过引用方式并入，且通过引用并入本文的目的是公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。
31.需要注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。
32.在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本文所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何陈述的方法。
33.尽管为了语法的流畅性已经或将要描述该系统和方法，并进行功能上的说明，但应明确理解，除非《美国法典》第35章有明确规定，否则任何情况下都不得将权利要求解释为必须受“方式”或“步骤”的限制，而应按照等效物的司法原则与权利要求中所述定义的含义和等效物的完整范围相符，当明确按照《美国法典》第35章第112节的规定编写权利要求
时，权利要求应与《美国法典》第35章第112节中的法定等效物完全相符。
34.用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法
35.如上所述，本发明的方面包括用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法。“荧光流式细胞仪数据”意指有关流动池中样品(例如，细胞、颗粒)参数的信息，这些信息由颗粒分析仪中任意数量的荧光检测器收集。在实施例中，荧光流式细胞仪数据包括来自多种不同荧光色素的信号，例如，2至20种不同的荧光色素，并且包括3至5种不同的荧光色素。在一些实施例中，多种不同的荧光色素包括2种或更多种不同的荧光色素，包括3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多、11种或更多、12种或更多、13种或更多、14种或更多、15种或更多以及20种或更多种不同的荧光色素。荧光流式细胞仪数据可以通过任何适宜的方案获取，包括下文描述的方案。
36.在一些实施例中，方法包括基于样品中分析物(例如，细胞、颗粒)的确定参数(例如，荧光)产生一个或更多个群体聚类。本文中使用的分析物“群体”或“子群体”(例如，细胞或其他颗粒)通常是指相对于一个或更多个被测荧光参数具有特性(例如，光学、阻抗或时间特性)的一组分析物，其使得被测参数数据在数据空间中形成聚类。因此，群体被识别为数据中的聚类。相反，虽然通常也观测到了对应于噪声或本底的聚类，但每个数据聚类通常被解释为对应于特定类型的细胞或分析物群体。可以在所述维度的子集(例如，相对于被测荧光参数(即，荧光色素)的子集)中定义聚类，其对应于仅在被测参数或特征(提取自所述样品测量值)的子集中有所不同的群体。
37.本发明的方面包括对荧光流式细胞仪数据的监督聚类。此步骤可以采用任何适宜的监督表型分析算法。在一些实施例中，所述监督表型分析算法是ek'balam算法。ek'balam算法的相关描述请见以下出版物：amir等人(2019)，使用标准化分析管道开发综合抗体染色数据库，免疫学前沿，10，1315；其内容以引用方式并入本文。因此，在某些实施例中，基于各数据点相对于层次结构的状态，对荧光流式细胞仪数据进行聚类。如本文所述的层次结构定义了将荧光流式细胞仪数据划分为特定群体所依据的标准。在一些实施例中，所述层次结构确立了对相同参数呈阳性或阴性的数据点被归为一组的方式。例如，图3展示了用于对t细胞进行聚类的层次结构，其中聚类通过确定细胞相对于cd4或cd8的存在呈阳性还是阴性来完成。cd4阳性但cd8阴性的细胞属于“cd4 t细胞”，而对两种标志物均呈阳性的细胞属于“双阳性t细胞”，依此类推。
38.在一些实施例中，对荧光流式细胞仪数据进行聚类包括将所述荧光流式细胞仪数据与阈值进行比较。“阈值”意指能够区分阳性/阴性荧光流式细胞仪数据(相对于特定荧光色素而言)的值。换言之，可以将高于阈值的荧光流式细胞仪数据描述为对特定荧光色素呈阳性，而将低于阈值的荧光流式细胞仪数据描述为对相同荧光色素呈阴性。例如，图4描绘了如何根据区分阳性和阴性数据的阈值对流式细胞仪数据进行聚类。阈值401能够区分cd8阳性的流式细胞仪数据与cd8阴性的流式细胞仪数据。类似地，阈值402能够区分cd4阳性的流式细胞仪数据与cd4阴性的流式细胞仪数据。可以采用任何适宜的方法进行聚类。在一些实施例中，通过flowsom算法进行聚类。flowsom的相关描述请见以下出版物：van gassen等人(2015)，flowsom：使用自组织映射图使流式细胞术数据可视化并加以解释，细胞计数法，第a部分，87(7)，636-645；其内容以引用方式并入本文。在其他实施例中，通过选自以下各项的算法进行聚类：som-相关描述请见以下出版物：kohonen，“自组织映射图”，ieee会报
(1990)，78：1464-1480；k-means-相关描述请见以下出版物：hartigan和wong，“算法as 136：k-means聚类算法”，英国皇家统计学会会刊，c系列(应用统计学)(1979)，28：第100-108页；高斯混合模型-相关描述请见以下出版物：sanderson和curtin，“多线程高斯混合模型、k-means和期望最大化的开源c 实现”，2017年第11届信号处理和通信系统国际会议(icspcs)(https://doi.org/10.1109/icspcs.2017.8270510)；flowgrid-相关描述请见以下出版物：ye和ho，“使用flowgrid对单细胞流式细胞仪数据进行超快速聚类”，bmc系统生物学，13，35(2019)，https://doi.org/10.1186/s12918-019-0690-2；或x-shift-相关描述请见以下出版物：samusik等人，“表型空间与单细胞数据的自动映射”，自然：方法(2016)，13：493-496。
39.对流式细胞仪数据进行聚类后，本发明的实施例包括确定所述荧光流式细胞仪数据群体的溢出扩散程度。如介绍部分所述，并且如图1和图2a-2b所示，收集点(即，被一个或更多个荧光检测器接收的点)的荧光流式细胞仪数据受溢出扩散影响。溢出是一种现象，其中指示特定荧光色素的颗粒调制光由一个或更多个未被配置成测量所述参数的检测器接收。因此，光可能会“溢出”并被非目标检测器检测到。因此，溢出扩散是由溢出引起的荧光流式细胞仪数据中存在的噪声。因此，在一些实施例中，由于一个或更多个检测器无意中检测到了某些波长的光，未经调整的流式细胞仪数据存在差错。在某些实施例中，确定溢出扩散程度包括量化由第一检测器从第一荧光色素中收集到的荧光流式细胞仪数据受同时由同一检测器从第二荧光色素中收集到的光的影响程度。在一些情况下，受溢出扩散影响的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度高于其他情况下观察到的信号强度(即，溢出扩散噪声具有建设性)。在其他情况下，受溢出扩散影响的荧光流式细胞仪数据受到信号强度的影响，所述信号强度低于其他情况下观察到的信号强度(即，溢出扩散噪声具有破坏性)。在某些实施例中，确定溢出扩散程度包括计算溢出扩散系数。溢出扩散系数的详细描述请见以下出版物：nguyen等人(2013)，量化溢出扩散以比较仪器性能且有助于多色检测试剂盒设计，细胞计数法，第a部分，83(3)：306-315，该出版物中的内容以引用方式并入本文。在一些实施例中，根据公式1计算溢出扩散系数：
[0040][0041]
如公式1所示，ss是所述溢出扩散系数，δσf是增量标准差，表示从荧光色素中收集的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间的发射扩散；δd是荧光检测器接收到的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间荧光强度的差异。因此，所述溢出扩散系数测定通过给定荧光检测器采集的荧光流式细胞仪数据受与特定荧光色素相关联的光的存在的影响程度。换言之，所述溢出扩散系数通过给定检测器收集到的相关荧光色素所发射的光来估计荧光流式细胞仪数据出现的误差(即，噪声)。在实施例中，对于给定荧光色素-检测器对，溢出扩散系数越高，溢出扩散越多。
[0042]
在一些实施例中，确定溢出扩散程度还包括针对各个可能的荧光检测器-荧光色素组合，计算溢出扩散系数，以便确定在各检测器处收集到的荧光流式细胞仪数据如何受到与各荧光色素相关联的光的存在的影响。在实施例中，在溢出扩散矩阵中组合计算得出的各荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。在某些实施例中，所述溢出扩散矩阵展示了
其相应检测器对特定荧光色素的检测如何受到其他荧光色素溢出的影响。例如，图5展示了提供23种不同荧光色素的溢出扩散系数的溢出扩散矩阵的一个实施例。所述矩阵中的每一列都对应于被配置成检测所述23种不同荧光色素中的其中一种的检测器，并且所述矩阵中的每一行都对应于检测到的流式细胞仪数据的参数。列与行相交的单元格填充有计算得出的所述荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数，所述系数指示所探讨的荧光色素对相关检测器出现检测误差的影响程度。荧光色素对溢出扩散的总影响程度可以通过对其行中的所有值进行求和来估计，而溢出扩散对检测器的总影响程度可以通过对其列中的所有值进行求和来计算。在一些实施例中，对溢出扩散系数进行求和，以计算总扩散效应(即，溢出扩散对特定荧光流式细胞仪数据子集的累积效应)。
[0043]
在一些实施例中，通过autospread算法计算溢出扩散矩阵。autospread算法由becton dickinson创建，相关描述请见第63/020,758号美国临时专利申请案，该申请案以引用方式并入本文；autospread算法被配置成在无需区分相对于给定荧光色素呈阳性和阴性的流式细胞仪数据群体的情况下创建溢出扩散矩阵(例如，如上所述)。autospread通过在同一流式细胞术检测试剂盒中纳入第二荧光色素，表征来自第一荧光色素的被检信号的扩散情况。autospread针对荧光检测器与荧光色素之间的每次交互生成一个系数，并将所述系数排列在类似于上述溢出扩散矩阵的矩阵中。在实施例中，计算溢出扩散系数包括假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零，且对应的标准差为未知量。在一些实施例中，根据公式2计算所述溢出扩散系数：
[0044][0045]
如公式2所示，ss是溢出扩散系数，σ2是所述阳性荧光流式细胞仪数据群体的标准差，是所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计值，d是荧光检测器收集到的光的强度。在一些实施例中，在假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零时，为了获得对所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计通过一系列线性回归法计算溢出扩散系数。首先根据所述荧光检测器检测到的强度值，将荧光流式细胞仪数据按分位数分类。默认情况下，分位数数量为256，但下调至8，以确保各分位数具有足够数量的数据点，以便可靠地估计标准差。接下来，相对于针对各分位数检测到的光的强度中值的平方根，对所述荧光色素所发射的光的相应稳健标准差进行回归分析。假设针对所述阴性群体检测到的光的强度为零时，普通最小二乘法拟合的y轴截距被视为是所述阴性流式细胞仪数据群体的标准差的估计值。使用所述荧光色素所发射的光的相应标准差的估计值来获得新的零调整标准差。相对于所述荧光检测器检测到的各分位数的荧光中值的平方根，对所述荧光色素的所述零调整标准差进行回归分析。普通最小二乘法拟合的斜率(利用公式2计算得出)被视为是溢出扩散系数。
[0046]
本发明的方面进一步包括调整荧光流式细胞仪数据，以考虑溢出扩散。“调整”意指改变数据，以便更准确地量化流动池中接受辐照的样品(例如，细胞、颗粒)中存在的荧光色素。在一些实施例中，调整荧光流式细胞仪数据，以基本上消除由溢出扩散导致的所有建设性误差。在实施例中，调整荧光流式细胞仪数据包括生成不同的经溢出扩散调整的群体。在某些实施例中，生成不同的经溢出扩散调整的群体包括减小所述流式细胞仪数据相关群
体的所述溢出扩散幅度，即，抵消受溢出扩散影响的信号的建设性作用。在某些实施例中，所述溢出扩散幅度由所述溢出扩散矩阵确定。在一些实施例中，调整流式细胞仪数据包括减小流式细胞仪数据相关部分的总扩散效应。例如，图6展示了流式细胞仪数据的调整情况，以便考虑溢出扩散。箭头601表示所述群体聚类的中值下移的方式。换言之，减小所述群体聚类内所述数据点的溢出扩散幅度，从而改变所述聚类相对于其他群体聚类的位置。图7a描绘了已通过上述过程加以调整的流式细胞仪数据。在一些实施例中，根据所有已知的噪声源(包括溢出扩散)计算各细胞相应值高于阈值的可能性，从而调整荧光流式细胞仪数据。
[0047]
在针对溢出扩散调整荧光流式细胞仪数据群体后(例如，如上所述)，本发明的方面进一步包括对所述经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。“分区”意指在基于相对于多种不同荧光色素呈阳性或阴性而被确定为有所不同的流式细胞仪数据群体间进行划分。换言之，创建分区，以正式区分待以不同方式进行分类(例如，代表不同的表型)的荧光流式细胞仪数据群体。
[0048]
在实施例中，划分不同的经溢出扩散调整的流式细胞仪数据群体包括计算马修斯相关系数(mcc)。该系数是对二元分类质量的度量，且量化了利用给定阈值区分阳性和阴性流式细胞仪数据组的准确程度。马修斯相关系数的相关描述请见以下出版物：matthews,b.w.(1975)，t4噬菌体溶菌酶的预测和观测二级结构的比较，生物化学与生物物理学报(bba)-蛋白质结构，405(2)，442-451；该出版物中的内容以引用方式并入本文。在实施例中，相对于各阈值评价了不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间的潜在分区。在此类实施例中，针对各阈值计算马修斯相关系数，从而评估阈值与分区之间的一致性水平。因此，本发明的实施例涉及对群体进行分区，以便相对于所述相关阈值优化所述马修斯相关系数，所述阈值能够区分相对于特定荧光色素呈阳性和阴性的流式细胞仪数据群体。换言之，对荧光流式细胞仪数据进行分区包括最大限度地提高区分不同群体(即，表现出不同荧光参数组合的群体)的能力，这取决于其与相关阈值的关系(例如，由马修斯相关系数量化)。在实施例中，此过程迭代，以确定用以区分对各流式细胞仪数据的相关参数呈阳性和阴性的群体的最佳分区。在实施例中，根据公式3计算马修斯相关系数：
[0049][0050]
如公式3所示，mcc是马修斯相关系数，tp代表真阳性事件，tn代表真阴性事件，fp代表假阳性事件，fn代表假阴性事件。根据本发明，真阳性事件是指荧光流式细胞仪数据根据阈值和分区被评估为对特定荧光色素呈阳性；真阴性事件是指荧光流式细胞仪数据根据阈值和分区被评估为对特定荧光色素呈阴性；假阳性事件是指荧光流式细胞仪数据根据分区被评估为对特定荧光色素呈阳性，而根据阈值则被评估为对特定荧光色素呈阴性；假阴性事件是指流式细胞仪数据根据分区被评估为对特定荧光色素呈阴性，而根据阈值则被评估为对特定荧光色素呈阳性。
[0051]
在本发明的一些实施例中，荧光流式细胞仪数据不含对特定荧光色素呈阳性的信号。换言之，未检测到从所述荧光色素中发射出的荧光。在此类实施例中，对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据进行分区可以包含计算各分区的平衡准确度，作为用
于确定最佳分区的替代指标。平衡准确度是确定阳性事件的准确度和确定阴性事件的准确度的平均值，根据公式4计算：
[0052][0053]
如公式4所示，ba是平衡准确度，tp代表真阳性事件，tn代表真阴性事件，fp代表假阳性事件，fn代表假阴性事件。
[0054]
本发明的实施例还包括对所述已分区的荧光流式细胞仪数据群体进行分类，即，确定由各不同的经溢出扩散调整的流式细胞仪数据群体指定的细胞或颗粒的亚型。在实施例中，基于所述层次结构(如上所述)确定分类。因此，基于其展现出的荧光参数组合，向已分区的荧光流式细胞仪数据群体(例如，如上所述)分配分类(即，表型分析)。例如，图7b描绘了图7a中所示的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据如何分区，以便向不同的群体聚类正确分配其各自的表型。如图2b所示，且如介绍部分所述，群体聚类101的一部分被分配了错误的表型，且无任何数据调整。但是，针对溢出扩散(例如，如图6所示)调整所述群体(箭头601)后，向整个群体701分配正确的表型(即a

b-)，而非仅向部分群体701分配正确的表型。
[0055]
如上所述，可以使用任何适宜的方案获取本发明的方法中采用的荧光数据。在一些实施例中，用光源辐照具有颗粒的样品，并检测来自所述样品的光，以至少部分基于所检测到的光的所述测量值来生成相关颗粒群体。在一些情况下，所述样品是生物样品。依据常规含义，术语“生物样品”是指整个生物体、植物、真菌或动物组织的子集、细胞或组成部分，在某些情况下，可能见于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液中。因此，“生物样品”既指天然生物体或其组织的子集，也指利用所述生物体或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于：血浆；血清；脊髓液；淋巴液；皮肤、呼吸道、胃肠道、心血管和泌尿生殖道切片；眼泪；唾液；乳汁；血细胞；肿瘤；器官等。生物样品可以是任何类型的生物组织，包括健康组织和病理组织(例如，癌组织、恶性组织、坏死组织等)。在某些实施例中，所述生物样品是液体样品，例如，血液或其衍生物(例如，血浆、眼泪、尿液、精液等)，其中，在某些情况下，样品是血液样品，包括全血样品，例如，血液通过静脉穿刺或手指针刺获取的血液(其中，血液在分析之前可能会也可能不会与任何试剂(例如防腐剂、抗凝剂等)混合)。
[0056]
在某些实施例中，所述样品来源为“哺乳动物”，此术语被广泛地用于描述属于哺乳动物类的生物体，包括食肉动物(例如狗和猫)、啮齿类动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长类动物(例如人、黑猩猩和猴子)。在某些情况下，受试者是人类。方法可适用于从任何发育阶段(即新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的男性和女性受试者中获取的样品，在其中某些实施例中，所述人类受试者是少年、青少年或成人。尽管本发明适用于取自人类受试者的样品，但应当理解，所述方法也可对取自其他动物受试者(即在“非人类受试者”中)的血液实施，这些受试者包括但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、家畜和马。
[0057]
在实施标的方法时，用来自光源的光辐照具有颗粒的样品(例如，在流式细胞仪的流体介质中)。在一些实施例中，光源是宽带光源，其发射出具有宽范围波长的光，例如，跨度为50nm或以上、100nm或以上、150nm或以上、200nm或以上、250nm或以上、300nm或以上、
350nm或以上、400nm或以上，包括500nm或以上的跨度。例如，一种合适的宽带光源发射出波长范围为200nm至1500nm的光。合适的宽带光源的另一示例包括发射出波长范围为400nm至1000nm的光的光源。在方法包括用宽带光源进行辐照的情况下，目的宽带光源方案可能包括但不限于：卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定的光纤耦合宽带光源、具有连续光谱的宽带led、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱led白色光源、多颗led集成光源及其他宽带光源或上述任意组合。
[0058]
在其他实施例中，方法包括用发射出特定波长或窄范围波长的光的窄带光源进行辐照，例如，用发射出窄范围波长的光的光源进行辐照，例如，范围跨度为50nm或更少、40nm或更少、30nm或更少、25nm或更少、20nm或更少、15nm或更少、10nm或更少、5nm或更少、2nm或更少，包括发射出一种特定波长的光(即单色光)的光源。在方法包括用窄带光源进行辐照的情况下，目的窄带光源方案可能包括但不限于：窄波长led、激光二极管或与一片或更多片光学带通滤光片、衍射光栅、单色仪耦合的宽带光源或其任意组合。
[0059]
本发明的方面包括用荧光检测器收集荧光。在一些情况下，荧光检测器可以被配置成检测来自荧光分子的荧光发射，例如，与所述流动池中的所述颗粒相关的标记的特异性结合成员(例如与目的标志物特异性结合的标记的抗体)。在某些实施例中，方法包括用一个或更多个荧光检测器检测来自所述样品的荧光，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、15个或更多，并且包括25个或更多个荧光检测器。在实施例中，所述荧光检测器中的每一个均被配置成产生荧光数据信号。各荧光检测器可以在波长范围200nm
–
1200nm中的一种或更多种波长下独立检测来自所述样品的荧光。在一些情况下，方法包括在一定波长范围内检测来自所述样品的荧光，例如，200nm至1200nm、300nm至1100、400nm至1000nm、500nm至900nm，包括600nm至800nm。在其他情况下，方法包括用各荧光检测器在一种或更多种特定波长下检测荧光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任何组合中的一种或更多种波长下检测所述荧光，具体取决于标的光检测系统中不同荧光检测器的数量。在某些实施例中，方法包括检测与所述样品中存在的某些荧光色素的荧光峰波长相对应的光的波长。在实施例中，通过一个或更多个荧光检测器(例如，一条或更多条检测通道)，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多并且包括8个或更多个荧光检测器(例如，8条或更多条检测通道)接收荧光流式细胞仪数据。
[0060]
用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的系统
[0061]
本发明的方面还包括用于对荧光流式细胞仪数据进行分类的系统。在实施例中，对荧光流式细胞仪数据进行聚类，针对溢出扩散对其进行调整并分区，从而以不同方式对不同的群体进行分类。在一些实施例中，系统包括被配置成产生荧光流式细胞仪数据的颗粒分析仪，以及被配置成分析所述荧光流式细胞仪数据的处理器。
[0062]
在一些实施例中，标的颗粒分析仪具有流动池以及被配置成辐照所述流动池中的颗粒的激光器。在实施例中，所述激光器可以是任何适宜的激光器，例如连续波激光器。例如，所述激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见光二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施例中，所述激光器可以是氦氖(hene)激光器。在一些情况下，所述激光器是气体激光器，例如，氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、
co2激光器、co激光器、氟化氩(arf)准分子激光器、氟化氪(krf)准分子激光器、氯化氙(xecl)准分子激光器或氟化氙(xef)准分子激光器或其组合。在其他情况下，标的流式细胞仪包括染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或若丹明激光器。在其他情况下，目的激光器包括金属蒸气激光器，例如，氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况下，标的流式激光器包括固态激光器，例如，红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、thulim yag激光器、yag镱激光器、三氧化二镱激光器或掺铈激光器及其组合。
[0063]
本发明的方面还包括被配置成检测前向散射光的前向散射检测器。标的流式细胞仪中前向散射检测器的数量可以根据需要而变化。例如，标的颗粒分析仪可以包括1个前向散射检测器或多个前向散射检测器，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多，并且包括5个或更多。在某些实施例中，流式细胞仪包括1个前向散射检测器。在其他实施例中，流式细胞仪包括2个前向散射检测器。
[0064]
用于检测所收集到的光的任何适宜的检测器都可以用于本文所述的前向散射检测器中。目的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如，有源像素传感器(aps)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(ccd)、增强型电荷耦合装置(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(pmt)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施例中，采用电荷耦合装置(ccd)、半导体电荷耦合装置(ccd)、有源像素传感器(aps)、互补金属氧化物半导体(cmos)、图像传感器或n型金属氧化物半导体(nmos)图像传感器测量所述收集到的光。在某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如各区域的有效检测表面积范围为0.01cm2至10cm2(例如0.05cm2至9cm2、0.1cm2至8cm2、0.5cm2至7cm
2，
并且包括1cm2至5cm2)的光电倍增管。
[0065]
在标的颗粒分析仪包括多个前向散射检测器的情况下，各检测器可以是相同的，或者所述检测器集合可以是不同类型的检测器的组合。例如，在标的颗粒分析仪包括两个前向散射检测器的情况下，在一些实施例中，所述第一前向散射检测器是ccd型设备，而所述第二前向散射检测器(或成像传感器)是cmos型设备。在其他实施例中，所述第一和第二前向散射检测器均为ccd型设备。在其他实施例中，所述第一和第二前向散射检测器均为cmos型设备。在其他实施例中，所述第一前向散射检测器是ccd型设备，而所述第二前向散射检测器是光电倍增管(pmt)。在其他实施例中，所述第一前向散射检测器是cmos型设备，而所述第二前向散射检测器是光电倍增管。在其他实施例中，所述第一和第二前向散射检测器均为光电倍增管。
[0066]
在实施例中，所述前向散射检测器被配置成连续地或以离散时间间隔测量光。在某些情况下，目的检测器被配置成连续地测量收集的光。在其他情况下，目的检测器被配置成以离散时间间隔进行测量，例如，测量光的时间间隔为0.001毫秒、0.01毫秒、0.1毫秒、1毫秒、10毫秒、100毫秒，包括1000毫秒或一些其他时间间隔。
[0067]
本发明的实施例还包括位于所述流动池与所述前向散射检测器之间的光色散/分光模块。目的光色散设备包括但不限于有色玻璃、带通滤光片、干涉滤光片、二向色镜、衍射
光栅、单色仪及其组合以及其他波长分离设备。在一些实施例中，带通滤光片位于所述流动池与所述前向散射检测器之间。在其他实施例中，超过一片带通滤光片位于所述流动池与所述前向散射检测器之间，例如2片或更多、3片或更多、4片或更多，并且包括5片或更多。在实施例中，所述带通滤光片的最小带宽范围为2nm至100nm，例如，3nm至95nm、5nm至95nm、10nm至90nm、12nm至85nm、15nm至80nm，包括最小带宽范围为20nm至50nm的带通滤光片。波长并将其他波长的光反射至所述前向散射检测器。
[0068]
本发明的某些实施例包括侧向散射检测器，其被配置成检测光的侧向散射波长(例如，从所述颗粒的所述表面和内部结构折射和反射的光)。在其他实施例中，流式细胞仪包括多个侧向散射检测器，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多，并且包括5个或更多。
[0069]
用于检测所收集到的光的任何适宜的检测器都可以用于本文所述的侧向散射检测器中。目的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如，有源像素传感器(aps)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(ccd)、增强型电荷耦合装置(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(pmt)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施例中，采用电荷耦合装置(ccd)、半导体电荷耦合装置(ccd)、有源像素传感器(aps)、互补金属氧化物半导体(cmos)、图像传感器或n型金属氧化物半导体(nmos)图像传感器测量所述收集到的光。在某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如各区域的有效检测表面积范围为0.01cm2至10cm2(例如0.05cm2至9cm2、0.1cm2至8cm2、0.5cm2至7cm2，并且包括1cm2至5cm2)的光电倍增管。
[0070]
在标的颗粒分析仪包括多个侧向散射检测器的情况下，各侧向散射检测器可以是相同的，或者所述侧向散射检测器集合可以是不同类型的检测器的组合。例如，在标的颗粒分析仪包括两个侧向散射检测器的情况下，在一些实施例中，所述第一侧向散射检测器是ccd型设备，而所述第二侧向散射检测器(或成像传感器)是cmos型设备。在其他实施例中，所述第一和第二侧向散射检测器均为ccd型设备。在其他实施例中，所述第一和第二侧向散射检测器均为cmos型设备。在其他实施例中，所述第一侧向散射检测器是ccd型设备，而所述第二侧向散射检测器是光电倍增管(pmt)。在其他实施例中，所述第一侧向散射检测器是cmos型设备，而所述第二侧向散射检测器是光电倍增管。在其他实施例中，所述第一和第二侧向散射检测器均为光电倍增管。
[0071]
本发明的实施例还包括位于所述流动池与所述侧向散射检测器之间的光色散/分光模块。目的光色散设备包括但不限于有色玻璃、带通滤光片、干涉滤光片、二向色镜、衍射光栅、单色仪及其组合以及其他波长分离设备。
[0072]
在实施例中，标的颗粒分析仪还包括被配置成检测一种或更多种荧光波长的光的荧光检测器。在其他实施例中，颗粒分析仪包括多个荧光检测器，例如2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、10个或更多、15个或更多，并且包括20个或更多。
[0073]
用于检测所收集到的光的任何适宜的检测器都可以用于本文所述的荧光检测器中。目的检测器可以包括但不限于光学传感器或检测器，例如，有源像素传感器(aps)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合装置(ccd)、增强型电荷耦合装置(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热测定器、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管(pmt)、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合以及其他检测器。在某些实施
accuri
tm
流式细胞仪、bd accuri
tm c6 plus流式细胞仪、bd biosciences facscelesta
tm
流式细胞仪、bd biosciences facslyric
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsverse
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsymphony
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortessa
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortessa
tm x-20流式细胞仪、bd biosciences facspresto
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsvia
tm
流式细胞仪和bd biosciences facscalibur
tm
细胞分选仪、bd biosciences facscount
tm
细胞分选仪、bd biosciences facslyric
tm
细胞分选仪、bd biosciences via
tm
细胞分选仪、bd biosciences influx
tm
细胞分选仪、bd biosciences jazz
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细胞分选仪、bd biosciences aria
tm
细胞分选仪、bd biosciences facsaria
tm ii细胞分选仪、bd biosciences facsaria
tm iii细胞分选仪、bd biosciences facsaria
tm fusion细胞分选仪和bd biosciences facsmelody
tm
细胞分选仪、bd biosciences facsymphony
tm s6细胞分选仪等。
[0079]
在一些实施例中，标的系统是流式细胞术系统，例如，以下编号的美国专利中所述的系统：10,663,476；10,620,111；10,613,017；10,605,713；10,585,031；10,578,542；10,578,469；10,481,074；10,302,545；10,145,793；10,113,967；10,006,852；9,952,076；9,933,341；9,726,527；9,453,789；9,200,334；9,097,640；9,095,494；9,092,034；8,975,595；8,753,573；8,233,146；8,140,300；7,544,326；7,201,875；7,129,505；6,821,740；6,813,017；6,809,804；6,372,506；5,700,692；5,643,796；5,627,040；5,620,842；5,602,039；4,987,086和4,498,766；这些文件中的内容以引用方式全文并入本文。
[0080]
在某些情况下，本发明的流式细胞仪系统被配置成利用射频标记发射(fire)通过荧光成像对流体介质中的颗粒进行成像，例如，以下出版物中所述的系统：diebold等人，自然光子学，第7(10)卷；806-810(2013)；第9,423,353、9,784,661、9,983,132、10,006,852、10,078,045、10,036,699、10,222,316、10,288,546、10,324,019、10,408,758、10,451,538、10,620,111号美国专利；以及第2017/0133857、2017/0328826、2017/0350803、2018/0275042、2019/0376895和2019/0376894号美国专利公开出版物，这些出版物中的内容以引用方式并入本文。
[0081]
在某些实施例中，标的系统另外包括处理器，所述处理器具有与其可操作地耦合的存储器，其中所述存储器包括存储于其上的指令，所述指令由所述处理器执行时，会使所述处理器执行以下操作：对荧光流式细胞仪数据进行聚类，确定溢出扩散程度；针对溢出扩散调整所述荧光流式细胞仪数据；以及对所述经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据进行分区。
[0082]
在一些实施例中，所述处理器被配置成基于所述样品中分析物(例如，细胞、颗粒)的确定参数产生一个或更多个群体聚类。在实施例中，荧光流式细胞仪数据包括来自多种不同荧光色素的信号，例如，2至20种不同的荧光色素，并且包括3至5种不同的荧光色素。在一些实施例中，多种不同的荧光色素包括2种或更多种不同的荧光色素，包括3种或更多、4种或更多、5种或更多、6种或更多、7种或更多、8种或更多、9种或更多、10种或更多、11种或更多、12种或更多、13种或更多、14种或更多、15种或更多，并且包括20种或更多种不同的荧光色素。因此，群体被识别为数据中的聚类。相反，虽然通常也观测到了对应于噪声或本底的聚类，但每个数据聚类通常被解释为对应于特定类型的细胞或分析物群体。可以在所述维度的子集(例如，相对于被测荧光参数(即，荧光色素)的子集)中定义聚类，其对应于仅在
被测参数或特征(提取自所述样品测量值)的子集中有所不同的群体。
[0083]
在实施例中，所述处理器含有用于对荧光流式细胞仪数据进行监督聚类的指令。因此，在某些实施例中，基于各数据点相对于层次结构的状态，对荧光流式细胞仪数据进行聚类。在一些实施例中，所述层次结构确立了对相同荧光色素呈阳性或阴性的数据点被归为一组的方式。在一些实施例中，对荧光流式细胞仪数据进行聚类包括将所述荧光流式细胞仪数据与阈值进行比较。换言之，可以将高于阈值的荧光流式细胞仪数据描述为对特定荧光色素呈阳性，而将低于阈值的荧光流式细胞仪数据描述为对相同荧光色素呈阴性。
[0084]
对流式细胞仪数据进行聚类后，所述处理器被配置成确定所述荧光流式细胞仪数据群体的溢出扩散程度。在一些实施例中，由于一个或更多个检测器无意中检测到了某些波长的光，未经调整的流式细胞仪数据含有噪声(即，溢出扩散)。在某些实施例中，确定溢出扩散程度包括量化由第一检测器从第一荧光色素中收集到的光的强度受同时由同一检测器从第二荧光色素中收集到的光的影响程度。在某些实施例中，确定溢出扩散程度包括计算溢出扩散系数。在一些实施例中，根据公式1计算所述溢出扩散系数：
[0085][0086]
如公式1所示，ss是所述溢出扩散系数，δσf是增量标准差，表示从荧光色素中收集的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间的发射扩散；δd是荧光检测器接收到的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间荧光强度的差异。因此，所述溢出扩散系数测定通过给定荧光检测器采集的荧光流式细胞仪数据受与特定荧光色素相关联的光的存在的影响程度。换言之，所述溢出扩散系数通过给定检测器收集到的相关荧光色素所发射的光来估计荧光流式细胞仪数据出现的误差(即，噪声)。在实施例中，对于给定荧光色素-检测器对，溢出扩散系数越高，溢出扩散越多。
[0087]
在一些实施例中，确定溢出扩散程度还包括针对各个可能的荧光检测器-荧光色素组合，计算溢出扩散系数，以便确定在各检测器处收集到的荧光流式细胞仪数据如何受到与各荧光色素相关联的光的存在的影响。在实施例中，在溢出扩散矩阵中组合计算得出的各荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。在某些实施例中，所述溢出扩散矩阵展示了其相应检测器对特定荧光色素的检测如何受到其他荧光色素溢出的影响。列与行相交的单元格填充有计算得出的所述荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数，所述系数指示所探讨的荧光色素对相关检测器出现检测误差的影响程度。荧光色素对溢出扩散的总影响程度可以通过对其行中的所有值进行求和来估计，而溢出扩散对检测器的总影响程度可以通过对其列中的所有值进行求和来计算。在一些实施例中，对溢出扩散系数进行求和，以计算总扩散效应(即，溢出扩散对特定荧光流式细胞仪数据子集的累积效应)。
[0088]
在一些实施例中，通过autospread算法计算溢出扩散矩阵。autospread算法被配置成在无需区分相对于给定荧光色素呈阳性和阴性的流式细胞仪数据群体的情况下创建溢出扩散矩阵(例如，如上所述)。autospread通过在同一流式细胞术检测试剂盒中纳入第二荧光色素，表征来自第一荧光色素的被检信号的扩散情况。autospread针对荧光检测器与荧光色素之间的每次交互生成一个系数，并将所述系数排列在类似于上述溢出扩散矩阵的矩阵中。在实施例中，计算溢出扩散系数包括假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细
胞仪数据群体采集的荧光强度为零，且对应的标准差为未知量。在一些实施例中，根据公式2计算所述溢出扩散系数：
[0089][0090]
如公式2所示，ss是溢出扩散系数，σ2是所述阳性荧光流式细胞仪数据群体的标准差，是所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计值，d是荧光检测器收集到的光的强度。在一些实施例中，在假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零时，为了获得对所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计通过一系列线性回归法计算溢出扩散系数。首先根据所述荧光检测器检测到的强度值，将荧光流式细胞仪数据按分位数分类。默认情况下，分位数数量为256，但下调至8，以确保各分位数具有足够数量的数据点，以便可靠地估计标准差。接下来，相对于针对各分位数检测到的光的强度中值的平方根，对所述荧光色素所发射的光的相应稳健标准差进行回归分析。假设针对所述阴性群体检测到的光的强度为零时，普通最小二乘法拟合的y轴截距被视为是所述阴性流式细胞仪数据群体的标准差的估计值。使用所述荧光色素所发射的光的相应标准差的估计值来获得新的零调整标准差。相对于所述荧光检测器检测到的各分位数的荧光中值的平方根，对所述荧光色素的所述零调整标准差进行回归分析。普通最小二乘法拟合的斜率(利用公式2计算得出)被视为是溢出扩散系数。
[0091]
在一些实施例中，所述处理器被配置成调整荧光流式细胞仪数据，以考虑溢出扩散。在一些实施例中，调整流式细胞仪数据，以消除由溢出扩散导致的所有建设性误差。在实施例中，调整荧光流式细胞仪数据包括生成不同的经溢出扩散调整的群体。在某些实施例中，生成不同的经溢出扩散调整的群体包括减小所述流式细胞仪数据相关群体的所述溢出扩散幅度，即，抵消因建设性溢出扩散错误而增加的信号的影响。在某些实施例中，所述溢出扩散幅度由所述溢出扩散矩阵确定。在一些实施例中，调整流式细胞仪数据包括减小流式细胞仪数据相关部分的总扩散效应。
[0092]
在针对溢出扩散调整荧光流式细胞仪数据群体后(例如，如上所述)，所述处理器可以被配置成对所述经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。创建分区，以正式区分待以不同方式进行分类(例如，代表不同的表型)的荧光流式细胞仪数据群体。在实施例中，划分不同的经溢出扩散调整的流式细胞仪数据群体包括计算马修斯相关系数。在实施例中，相对于各阈值评价了不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间的潜在分区。在此类实施例中，针对各阈值计算马修斯相关系数，从而评估阈值与分区之间的一致性水平。因此，本发明的实施例涉及对群体进行分区，以便相对于所述相关阈值优化所述马修斯相关系数，所述阈值能够区分相对于特定荧光色素呈阳性和阴性的流式细胞仪数据群体。换言之，对荧光流式细胞仪数据进行分区包括最大限度地提高区分不同群体(即，表现出不同荧光参数组合的群体)的能力，这取决于其与相关阈值的关系(例如，由马修斯相关系数量化)。在实施例中，所述处理器使此过程迭代，以确定用以区分对各流式细胞仪数据的相关参数呈阳性和阴性的群体的最佳分区。在实施例中，根据公式3计算马修斯相关系数：
[0093][0094]
如公式3所示，mcc是马修斯相关系数，tp代表真阳性事件，tn代表真阴性事件，fp代表假阳性事件，fn代表假阴性事件。根据本发明，真阳性事件是指荧光流式细胞仪数据根据阈值和分区被评估为对特定荧光色素呈阳性；真阴性事件是指荧光流式细胞仪数据根据阈值和分区被评估为对特定荧光色素呈阴性；假阳性事件是指荧光流式细胞仪数据根据分区被评估为对特定荧光色素呈阳性，而根据阈值则被评估为对特定荧光色素呈阴性；假阴性事件是指流式细胞仪数据根据分区被评估为对特定荧光色素呈阴性，而根据阈值则被评估为对特定荧光色素呈阳性。
[0095]
在本发明的一些实施例中，荧光流式细胞仪数据不含对特定荧光色素呈阳性的信号。换言之，未检测到从所述荧光色素中发射出的荧光。在此类实施例中，对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区可以包含计算各分区的平衡准确度，作为用于确定最佳分区的替代指标。平衡准确度是确定阳性事件的准确度和确定阴性事件的准确度的平均值，根据公式4计算：
[0096][0097]
如公式4所示，ba是平衡准确度，tp代表真阳性事件，tn代表真阴性事件，fp代表假阳性事件，fn代表假阴性事件。
[0098]
本发明的实施例还包括对所述已分区的荧光流式细胞仪数据群体进行分类，即，确定由各不同的经溢出扩散调整的流式细胞仪数据群体指定的细胞或颗粒的亚型。在实施例中，基于所述层次结构(如上所述)确定分类。因此，基于其展现出的荧光参数组合，向已分区的荧光流式细胞仪数据群体(例如，如上所述)分配分类(即，表型分析)。
[0099]
图8展示了根据本发明的说明性实施例的用于流式细胞术的系统800。系统800包括流式细胞仪810、控制器/处理器890和存储器895。流式细胞仪810包括一个或更多个激发激光器815a-815c、聚焦透镜820、流动室825、前向散射检测器830、侧向散射检测器835、荧光收集透镜840、一个或更多个分束器845a-845g、一片或更多片带通滤光片850a-850e、一片或更多片长通(“lp”)滤光片855a-855b以及一个或更多个荧光检测器860a-860f。
[0100]
激发激光器815a-c发射激光束形式的光。在图8所示的示例系统中，从激发激光器815a-815c中发射出的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。先引导所述激光束通过一个或更多个分束器845a和845b。分束器845a透射波长为488nm的光，并反射波长为633nm的光。分束器845b透射uv光(波长范围为10至400nm的光)，并反射波长为488nm和633nm的光。
[0101]
然后，将所述激光束引导至聚焦透镜820，所述聚焦透镜使所述光束聚焦至流动室825内样品颗粒所在的流体介质的一部分上。所述流动室是流体系统的一部分，其将颗粒(在流中通常一次一个)引导至聚焦激光束以进行询问。所述流动室可包含台式细胞仪中的流动池或空气中流式细胞仪中的喷嘴头。
[0102]
来自所述激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收与所述样品中的所述颗粒
相互作用，并根据所述颗粒的特性(例如其尺寸、内部结构以及存在附着于或天然存在于所述颗粒之上或之中的一种或更多种荧光分子)在各种不同的波长下再发射。可以通过分束器845a-845g、带通滤光片850a-850e、长通滤光片855a-855b和荧光收集透镜840中的一项或更多项将所述荧光发射以及所述衍射光、折射光、反射光和散射光引导至前向散射检测器830、侧向散射检测器835以及一个或更多个荧光检测器860a-860f中的一项或更多项。
[0103]
荧光收集透镜840收集通过颗粒-激光束相互作用发射的光，并将所述光引导至一个或更多个分束器和滤光片。带通滤光片(例如带通滤光片850a-850e)允许窄范围的波长通过所述滤光片。例如，带通滤光片850a是510/20滤光片。第一个数字代表光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，在所述光谱带中心的每一侧，510/20滤光片均使波长增大10nm，或使波长从500nm增至520nm。短通滤光片透射波长等于或小于指定波长的光。长通滤光片(例如长通滤光片855a-855b)透射波长等于或长于指定光波长的光。例如，长通滤光片855a(670nm长通滤光片)透射波长等于或长于670nm的光。通常选择滤光片来优化检测器对特定荧光染料的特异性。可以配置所述滤光片，使得透射至所述检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
[0104]
分束器将不同波长的光向不同方向引导。分束器可以通过滤光片特性来表征，例如短通和长通。例如，分束器805g是620sp分束器，这意味着分束器845g透射波长为620nm或更短的光，并且向不同方向反射波长长于620nm的光。在一实施例中，分束器845a-845g可以包含光学反射镜，例如二向色镜。
[0105]
前向散射检测器830的位置远离通过所述流动池的直射光束，并且被配置成检测衍射光、主要为前向的穿过或围绕颗粒行进的激发光。所述前向散射检测器检测到的光的强度取决于所述颗粒的整体尺寸。所述前向散射检测器可以包括光电二极管。侧向散射检测器835被配置成检测来自所述颗粒表面和内部结构的折射光和反射光，且数量倾向于随着颗粒结构复杂性的增加而增加。一个或更多个荧光检测器860a-860f可以检测来自与所述颗粒相关的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器835和荧光检测器可包括光电倍增管。在前向散射检测器830、侧向散射检测器835和荧光检测器处检测到的信号可以被所述检测器转换成电子信号(电压)。所述数据可以提供有关所述样品的信息。
[0106]
在运行中，细胞仪运行由控制器/处理器890控制，来自所述检测器的测量数据可存储在存储器895中并由控制器/处理器890处理。尽管未明确示出，但控制器/处理器890与所述检测器耦合，以从中接收所述输出信号，并且还可以与流式细胞仪800的电气和机电组件耦合，以控制所述激光器、流体流动参数等。还可以在系统中提供输入/输出(i/o)功能件897。存储器895、控制器/处理器890和i/o 897完全可以作为流式细胞仪810的组成部分提供。在此类实施例中，显示器还可以构成i/o功能件897的一部分，用于向细胞仪800的用户呈现实验数据。或者，存储器895和控制器/处理器890和i/o功能件中的一些或全部可以是一个或更多个外部设备(例如通用计算机)的一部分。在一些实施例中，存储器895和控制器/处理器890中的一些或全部可以与细胞仪810进行无线或有线通信。控制器/处理器890连同存储器895和i/o 897均可被配置成执行各种与流式细胞仪实验的准备和分析相关的功能。
[0107]
图8所示的系统包括六个不同的检测器，这些检测器能够在六个不同波长带中检测荧光(在本文中可以称为给定检测器的“滤光窗口”)，如流动池825与各检测器之间的光
束路径中的滤光片和/或分离器的配置所定义。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子会在其自己的特征波长带内发射光。可以选择用于实验的所述特定荧光标记及其相关荧光发射带，以便大体上与所述检测器的滤光窗口一致。但是，在提供更多检测器并使用更多标记的情况下，无法实现滤光窗口与荧光发射光谱的完美对应。事实上，虽然特定荧光分子的发射光谱的峰值可能位于一个特定检测器的滤光窗口内，但所述标记的一些发射光谱还会与一个或更多个其他检测器的滤光窗口重叠。这可以称为溢出。i/o 897可以被配置成接收有关流式细胞仪实验的数据，所述实验具有一组荧光标记和多个细胞群体(具有多种标志物)，每个细胞群体具有多种标志物子集。i/o 897还可被配置成接收生物学数据(涉及将一种或更多种标志物分配给一个或更多个细胞群体)、标志物密度数据、发射光谱数据、有关将标记分配给一种或更多种标志物的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据(例如标记光谱特征和流式细胞仪配置数据)也可以存储在存储器895中。控制器/处理器890可被配置成评价对标志物的一种或更多种标记分配。
[0108]
本领域技术人员认识到，根据本发明的实施例的流式细胞仪并不局限于图8所示的流式细胞仪，可以包括本领域已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以具有任意数量的激光器、分束器、滤光片和检测器，它们具有各种波长和各种不同的配置。
[0109]
图9展示了用于分析和显示数据的处理器900的一个示例的功能框图。处理器900可被配置成实施用于控制生物事件图形显示的各种过程。流式细胞仪902可被配置成通过分析生物样品(例如，如上所述)来获取荧光流式细胞仪数据。所述装置可被配置成将生物事件数据提供给处理器900。可以在流式细胞仪902和处理器900之间纳入数据通信通道。可以经由所述数据通信通道将所述数据提供给处理器900。处理器900可被配置成向显示器906提供包括图表的图形显示(例如，如上所述)。例如，处理器900可进一步被配置成对显示设备906所示的荧光流式细胞仪数据群体设门，其覆盖在所述图表上。在一些实施例中，所述门可以是在单参数直方图或双变量图上绘制的一个或更多个目的图形区域的逻辑组合。在一些实施例中，所述显示器可用于显示分析物参数或饱和检测器数据。
[0110]
处理器900可进一步被配置成以不同于门外荧光流式细胞仪数据中其他事件的方式在门内的显示设备906上显示荧光流式细胞仪数据。例如，处理器900可被配置成使门内含有的荧光流式细胞仪数据的颜色与门外的荧光流式细胞仪数据的颜色不同。通过这种方式，处理器900可以被配置成呈现不同颜色，以表示各独特的数据群体。显示设备906可以显示器、平板计算机、智能电话或被配置成展示图形界面的其他电子设备的形式实现。
[0111]
处理器900可被配置成接收来自第一输入设备的识别所述门的门选择信号。例如，所述第一输入设备可以鼠标910的形式实现。鼠标910可以向处理器900发出门选择信号，以确定待在显示设备906上显示或经由显示设备906操纵的群体(例如，当光标位于此处时，在所需门上或内单击)。在一些实施方案中，第一设备可以键盘908或用于向处理器900提供输入信号的其他装置(例如触摸屏、触控笔、光学检测器或语音识别系统)的形式实现。某些输入设备可能包括多种输入功能。在此等实施方案中，所述输入功能可以各自地被视为是一种输入设备。例如，如图9所示，鼠标910可以包括鼠标右键和鼠标左键，其均可产生触发事件。
[0112]
所述触发事件可以促使处理器900改变显示荧光流式细胞仪数据的方式(在显示设备906上实际显示部分数据)，和/或提供输入以作进一步处理，例如选择目的群体进行分
析。
[0113]
在一些实施例中，处理器900可被配置成检测鼠标910启动门选择的时间。处理器900可进一步被配置成自动修改图可视化，以便促进所述设门过程。所述修改可以基于由处理器900接收的数据的特定分布进行。
[0114]
处理器900可与存储设备904连接。存储设备904可被配置成接收和存储来自处理器900的数据。存储设备904还可被配置成允许处理器900检索数据，例如，荧光流式细胞仪数据。
[0115]
显示设备906可被配置成接收来自处理器900的显示数据。所述显示数据可以包含荧光流式细胞仪数据图和概述所述图部分的门。显示设备906可进一步被配置成根据接收自处理器900的输入以及接收自装置902、存储设备904、键盘908和/或鼠标910的输入来改变所展示的信息。
[0116]
在一些实施方案中，处理器900可以生成用户界面以接收示例事件，以便进行分选。例如，所述用户界面可以包括用于接收示例事件或示例图像的控件。可以在采集样品的事件数据之前或基于所述样品某一部分的初始事件集合来提供示例事件或图像或示例门。
[0117]
计算机控制系统
[0118]
本发明的方面进一步包括计算机控制系统，其中所述系统进一步包括一台或更多台计算机，用于实现完全自动化或部分自动化。在一些实施例中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，所述存储介质中存储有计算机程序，其中所述计算机程序包括在加载到所述计算机上时，用以执行以下操作的指令：根据一个或更多个不同参数(即，荧光色素)，将荧光流式细胞仪数据聚类成群体；确定各检测器-参数对之间的溢出扩散(即，通过计算溢出扩散系数确定)；创建溢出扩散矩阵，展示其相应检测器对特定参数的检测如何受到其他参数溢出的影响；更改所述荧光流式细胞仪数据，通过减小由所述溢出扩散矩阵确定的所述溢出扩散幅度来补偿溢出扩散；相对于阈值(用以区分对给定参数呈阳性的群体与对给定参数呈阴性的群体)计算马修斯相关系数，从而评价分离不同荧光流式细胞仪数据群体的不同分区的质量；以及对经调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型分析)。
[0119]
在实施例中，所述系统被配置成分析软件或分析工具内的数据，所述软件或分析工具用于分析流式细胞仪数据或核酸序列数据，例如(ashland，俄勒冈州)。是由flowjo llc(becton dickinson的子公司)开发的用于分析流式细胞仪数据的软件包。该软件被配置成管理流式细胞仪数据，并在其上生成图形报告(https://www(dot)flowjo(dot)com/learn/flowjo-university/flowjo)。可以采用适当方式在数据分析软件或工具(例如，)内分析初始数据，所述方式例如手动设门、聚类分析或其他计算技术。本发明的系统或其部分可以用于分析数据的软件的软件组件的形式实现，例如在这些实施例中，根据本发明的计算机控制系统可以用作适用于现有软件包(例如)的软件“插件”。
[0120]
在实施例中，所述系统包括输入模块、处理模块和输出模块。标的系统可能包括硬件和软件组件，其中硬件组件可能是一个或更多个平台，例如，服务器，其使得系统的功能元件(即，系统中执行特定任务(例如，管理信息的输入和输出、处理信息等)的元件)可以通过在系统所装备的一个或更多个计算机平台上执行软件应用程序来发挥作用。
[0121]
系统可能包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备可以是键盘、鼠标等。所述处理模块包括可以访问存储器的处理器，所述存储器具有其上存储的用于执行标的方法步骤的指令。所述处理模块可能包括操作系统、图形用户界面(gui)控制器、系统存储器、记忆存储设备、输入—输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元及许多其他设备。所述处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将可用的其他处理器中的一种。如本领域所公知，所述处理器执行操作系统，而操作系统以众所周知的方式与固件和硬件连接，且帮助处理器协调和执行各种计算机程序的功能，所述计算机程序可以用各种编程语言编写，例如，java、perl、c 、其他高级或低级语言及其组合。所述操作系统通常与处理器协作，以协调并执行计算机其他组件的功能。所述操作系统还根据已知技术提供调度、输入—输出控制、文件和数据管理、内存管理、通信控制及相关服务。所述处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施例中，处理器包括模拟电子器件，其使得用户可以基于所述第一和第二光信号手动对准光源与所述流体介质。在一些实施例中，所述处理器包括提供反馈控制(例如，负反馈控制)的模拟电子器件。
[0122]
所述系统存储器可以是各种已知或日后推出的记忆存储设备中的任何一种。示例包括任何通常可用的随机存取存储器(ram)、磁性介质(例如，常驻硬盘或磁带)、光学介质(例如，读写光盘)、闪存设备或其他记忆存储设备。所述记忆存储设备可以是各种已知或日后推出的设备中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。所述类型的记忆存储设备通常从程序存储介质(未示出)中读取内容和/或将内容写入程序存储介质中，所述程序存储介质包括光盘、磁带、可移动硬盘或软盘等。这些程序存储介质中的任何一种，或现在正在使用的或以后可能开发的其他介质，均可以视为一种计算机程序产品。可以理解的是，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也被称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或与记忆存储设备结合使用的程序存储设备中。
[0123]
在一些实施例中，描述了计算机程序产品，其包含存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。所述控制逻辑由计算机处理器执行时，可使处理器执行本文所述的功能。在其他实施例中，一些功能主要利用诸如硬件状态机等在硬件中实施。启用硬件状态机以执行本文所述的功能，这对相关领域的技术人员来说是显而易见的。
[0124]
存储器可以是处理器能在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如，磁、光学或固态存储设备(包括磁盘、光盘或磁带或ram，或任何其他合适的固定或便携式设备)。处理器可能包括通用数字微处理器，其已基于携带必要程序代码的计算机可读介质进行适当编程。编制程序可以通过通信信道远程提供给处理器，也可以利用任何与存储器连接的设备预先保存在计算机程序产品中，例如，存储器或某些其他便携式或固定计算机可读存储介质。例如，磁盘或光盘可以携带编制程序，且可以用磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括用于实施上述方法的编制程序，例如，计算机程序产品、算法。根据本发明的编制程序可以记录在计算机可读介质中，例如，任何可以由计算机直接读取和访问的介质。所述介质包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，例如cd-rom；电存储介质，例如ram和rom；便携式闪存驱动器；所述类别的混合体，例如磁性/光学存储介质。
[0125]
处理器还可以访问通信信道，以与位于远程位置的用户通信。远程位置是指用户
与系统无直接联系，而是将输入信息从外部设备(例如，连接至广域网(“wan”)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信信道，包括移动电话(即，智能手机))转发至输入管理器。
[0126]
在一些实施例中，根据本发明的系统可以被配置成包括通信接口。在一些实施例中，所述通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收机和/或发射机。所述通信接口可被配置成用于有线或无线通信，包括但不限于：射频(rf)通信(例如，射频识别(rfid)、zigbee通信协议、wifi、红外通信、无线通用串行总线(usb)、超宽带(uwb)、通信协议和蜂窝通信，例如码分多址(cdma)或全球移动通信系统(gsm)。
[0127]
在一实施例中，所述通信接口被配置成包括一个或更多个通信端口，例如，物理端口或接口(例如，usb端口、rs-232端口)或任何其他合适的电气连接端口，以实现标的系统与任何外部设备(例如，被配置成实现类似互补数据通信的计算机终端(例如，在医师的办公室或医院环境中))之间的数据通信。
[0128]
在一实施例中，所述通信接口被配置成用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使标的系统能够与其他设备进行通信，例如，计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助手，或用户可以结合使用的任何其他通信设备。
[0129]
在一实施例中，所述通信接口被配置成利用互联网协议(ip)通过移动电话网络、短信服务(sms)提供数据传输连接；向连接至互联网的局域网(lan)内的个人计算机(pc)提供无线连接；或在一个wifi热点提供wifi连接，以连接至互联网。
[0130]
在一实施例中，标的系统被配置成通过通信接口与服务器设备进行无线通信，例如，利用通用标准，例如802.11或rf协议或irda红外协议。所述服务器设备可以是另一种便携式设备，例如，智能手机、个人数字助手(pda)或笔记本电脑；或一种更大型的设备，例如，台式电脑、器械等。在一些实施例中，服务器设备包括显示器(例如，液晶显示器(lcd))和输入设备(例如，按钮、键盘、鼠标或触摸屏)。
[0131]
在一些实施例中，所述通信接口被配置成利用上述一种或更多种通信协议和/或机制，自动或半自动地将存储于标的系统中的数据(例如，存储于可选数据存储单元中)与网络或服务器设备进行通信。
[0132]
输出控制器可能包括用于各种已知显示设备中的任何一种的控制器，以向本地或远程用户(无论是人还是机器)提供信息。如果一种所述显示设备提供视觉信息，则所述信息通常可以在逻辑上和/或物理上组成图像元素阵列。图形用户界面(gui)控制器可能包括各种已知或日后待开发的软件程序中的任何一种程序，以在系统和用户之间提供图形输入和输出接口，以及处理用户输入。计算机的功能元件可能通过系统总线进行相互通信。其中一些通信可能在替代性实施例中利用网络或其他类型的远程通信来实现。所述输出管理器也可能根据已知技术，向位于远程位置的用户提供由处理模块生成的信息，例如，通过因特网、电话或卫星网络。所述输出管理器可能根据各种已知技术来实现数据显示。在某些示例中，数据可能包括sql、html或xml文档、电子邮件或其他文件或其他形式的数据。所述数据可能包括互联网url地址，以便用户可以从远程源中检索其他sql、html、xml或其他文档或数据。标的系统中的一个或更多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或日后待开发的计算机平台，尽管其通常属于某一类计算机(通常称之为服务器)。但是，所述平台也可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知的或日后待开发的电缆或其他通信系统(包括联网或其他方式连接的无线系统)进行连接。它们可以位于同一位置，
也可以在物理上分离。可以在任何计算机平台上采用各种操作系统，具体可能取决于所选择的计算机平台类型和/或品牌。适当的操作系统包括windows nt、windows xp、windows 7、windows 8、ios、sun solaris、linux、os/400、compaq tru64 unix、sgi irix、siemens reliant unix等。
[0133]
图10描绘了根据某些实施例的示例计算设备1000的总体架构。图10所示的计算设备1000的所述总体架构包括计算机硬件和软件组件的布置。但是，提供实现性公开内容时，无需示出所有此类常规元件。如图所示，计算设备1000包括处理单元1010、网络接口1020、计算机可读介质驱动器1030、输入/输出设备接口1040、显示器1050和输入设备1060，所有这些都可以通过通信总线与另一设备进行通信。网络接口1020可与一个或更多个网络或计算系统连接。处理单元1010因此可以经由网络从其他计算系统或服务处接收信息和指令。处理单元1010还可以与存储器1070进行通信，且可以通过输入/输出设备接口1040进一步为可选显示器1050提供输出信息。例如，作为可执行指令存储在分析系统的非暂时性存储器中的分析软件(例如，数据分析软件或程序，例如)可以向用户显示流式细胞术事件数据。输入/输出设备接口1040还可以接受来自可选输入设备1060的输入，例如键盘、鼠标、数位笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏手柄、加速度计、陀螺仪或其他输入设备。
[0134]
存储器1070可以含有计算机程序指令(在一些实施例中被分组为模块或组件)，所述指令由处理单元1010执行以实现一个或更多个实施例。存储器1070通常包括ram、rom和/或其他持久性、辅助性或非暂时性计算机可读介质。存储器1070可以存储操作系统1072，所述操作系统提供计算机程序指令以供处理单元1010在计算设备1000的常规管理和操作中使用。数据可以存储在数据存储设备1090中。存储器1070可以进一步包括用于实现本发明的方面的计算机程序指令和其他信息。
[0135]
计算机可读存储介质
[0136]
本发明的方面进一步包括具有用于实施标的方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。可以在一台或更多台计算机上采用计算机可读存储介质，使得用于实施本文所述的方法的系统实现完全自动化或部分自动化。在一些实施例中，可以将根据本文所述的方法的指令以“编程”的形式编码至计算机可读介质中，其中本文中使用的术语“计算机可读介质”是指任何参与向计算机提供指令和数据以便执行和处理的非暂时性存储介质。合适的非暂时性存储介质的示例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、cd-rom、cd-r、磁带、非易失性存储卡、rom、dvd-rom、蓝光磁盘、固态磁盘和网络附加存储设备(nas)，无论此类设备是计算机的内部设备还是外部设备。在一些情况下，可以在集成电路设备上提供指令。在某些情况下，目的集成电路器件可以包括可重构现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)或复杂可编程逻辑器件(cpld)。含有信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，以便计算机日后可以访问和检索这些信息。可使用能够以任意数量的计算机编程语言中的一种或更多种编写的编程来实施本文所述的计算机实现的方法。例如，此类语言包括java(sun microsystems,inc.，加州圣克拉拉)、visual basic(microsoft corp.，华盛顿州雷德蒙德)和c (at&t corp.，新泽西州贝德明斯特)及许多其他语言。
[0137]
在一些实施例中，目的计算机可读存储介质包括存储于其上的计算机程序，其中所述计算机程序包括在加载到所述计算机上时，用以执行以下操作的指令：根据一个或更
多个不同参数，将荧光流式细胞仪数据聚类成群体；确定各检测器-参数对之间的溢出扩散(即，通过计算溢出扩散系数确定)；创建溢出扩散矩阵，展示其相应检测器对特定参数的检测如何受到其他参数溢出的影响；更改所述荧光流式细胞仪数据，通过减小由所述溢出扩散矩阵确定的所述溢出扩散幅度来补偿溢出扩散；相对于阈值(用以区分对给定参数呈阳性的群体与对给定参数呈阴性的群体)计算马修斯相关系数，从而评价分离不同荧光流式细胞仪数据群体的不同分区的质量；以及对经调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型分析)。
[0138]
在实施例中，所述系统被配置成分析软件或分析工具内的数据，所述软件或分析工具用于分析流式细胞仪数据或核酸序列数据，例如可以采用适当方式在数据分析软件或工具(例如，)内分析初始数据，所述方式例如手动设门、聚类分析或其他计算技术。本发明的系统或其部分可以用于分析数据的软件的软件组件的形式实现，例如在这些实施例中，根据本发明的计算机控制系统可以用作适用于现有软件包(例如)的软件“插件”。
[0139]
所述计算机可读存储介质可以用于更多或更多具有显示器和操作员输入设备的计算机系统中。操作员输入设备可以是键盘、鼠标等。所述处理模块包括可以访问存储器的处理器，所述存储器具有其上存储的用于执行标的方法步骤的指令。所述处理模块可能包括操作系统、图形用户界面(gui)控制器、系统存储器、记忆存储设备、输入—输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元及许多其他设备。所述处理器可以是市售处理器，也可以是已经或将可用的其他处理器中的一种。如本领域所公知，所述处理器执行操作系统，而操作系统以众所周知的方式与固件和硬件连接，且帮助处理器协调和执行各种计算机程序的功能，所述计算机程序可以用各种编程语言编写，例如，java、perl、python、c 、其他高级或低级语言及其组合。所述操作系统还根据已知技术提供调度、输入—输出控制、文件和数据管理、内存管理、通信控制及相关服务。
[0140]
效用
[0141]
标的设备、方法和计算机系统可用于需要在确定生物样品中的分析物(例如，细胞、颗粒)的参数时提高分辨率和准确度的各种应用中。例如，本发明可用于分析受溢出扩散影响的数据。由于流式细胞仪通常涉及通过多个检测器收集多个荧光参数，因此检测到的荧光强度可能会因多个检测器检测到相同的光而错误增加。因此，本发明可在分析含有来自多种荧光色素的信号的流式细胞仪数据期间使用。标的设备、方法和计算机系统也可用于对流式细胞仪数据群体进行分类(即，表型分析)，所述数据群体通常会因溢出扩散的影响而被错误表征。在一些实施例中，标的方法和系统提供全自动方案，使得几乎无需进行数据调整，如有，则进行人工输入。
[0142]
本发明可用于表征许多类型的分析物，尤其是与医疗诊断或患者护理方案相关的分析物，包括但不限于：蛋白(包括游离蛋白和蛋白以及结构表面结合蛋白，例如细胞)、核酸、病毒颗粒等。此外，样品可以来自体外或体内来源，而且样品可以是诊断样品。
[0143]
套件
[0144]
本发明的方面进一步包括套件，其中套件包括存储介质，例如软盘、硬盘、光盘、磁光盘、cd-rom、cd-r、磁带、非易失性存储卡、rom、dvd-rom、蓝光磁盘、固态磁盘和网络附加存储设备(nas)。这些程序存储介质中的任何一种，或现在正在使用的或以后可能开发的其
他介质，均可以包括在标的套件中。在实施例中，所述程序存储介质包括用于执行以下操场的指令：将荧光流式细胞仪数据聚类成群体；确定所述群体的溢出扩散；基于溢出扩散调整流式细胞仪数据；以及确定经调整的流式细胞仪数据之间的分区(例如，如上所述)。在实施例中，标的套件或其部分提供的计算机可读介质中含有的指令可以用于分析数据的软件的软件组件的形式实现，例如在这些实施例中，根据本发明的计算机控制系统可以用作适用于现有软件包(例如)的软件“插件”。
[0145]
除上述组分外，标的套件可以进一步包括(在某些实施例中)诸如用于将插件安装到现有软件包(例如)的指令。这些说明书可能以多种形式存在于标的套件中，其中一种或更多种可能存在于所述套件中。这些说明书可能存在的一种形式是印在合适的介质或基材(例如，其上印有信息的一张纸或几张纸)、套件包装、包装说明书等之上的印刷信息。这些说明书存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、光盘(cd)、便携式闪存驱动器等。这些说明书可能存在的另一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。
[0146]
虽然本文附有权利要求书，但本发明的范围还受以下条款限定：
[0147]
1.一种对荧光流式细胞仪数据进行分类的方法，所述方法包含：
[0148]
用监督算法处理所述流式细胞仪数据，所述监督算法被配置成：
[0149]
将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体；
[0150]
确定所述荧光流式细胞仪数据群体的溢出扩散程度；
[0151]
基于所述确定的溢出扩散调整所述荧光流式细胞仪数据群体，以生成不同的经溢出扩散调整的群体；以及
[0152]
在所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区，以对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类。
[0153]
2.根据条款1所述的方法，其中基于所述荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光色素呈阳性或阴性，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。
[0154]
3.根据条款1或2所述的方法，其中基于所述荧光流式细胞仪数据与阈值的关系，确定所述荧光流式细胞仪数据对特定荧光色素呈阳性还是阴性。
[0155]
4.根据条款1至3中任一项所述的方法，其中确定溢出扩散包含量化通过荧光检测器采集的荧光流式细胞仪数据因收集特定荧光色素所发射的光而增加的程度。
[0156]
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中确定溢出扩散包含计算荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0157]
6.根据条款5所述的方法，其中根据公式1计算所述溢出扩散系数：
[0158][0159]
其中：
[0160]
ss是所述溢出扩散系数；
[0161]
δσf是增量标准差，表示从荧光色素中收集的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间的发射扩散；以及
[0162]
δd是荧光检测器接收到的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间荧光强度的
差异。
[0163]
7.根据条款5所述的方法，其中计算所述溢出扩散系数包含假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零。
[0164]
8.根据条款7所述的方法，其中根据公式2计算所述溢出扩散系数：
[0165][0166]
其中：
[0167]
ss是所述溢出扩散系数；
[0168]
σ2是所述阳性荧光流式细胞仪数据群体的标准差；
[0169]
是所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计值；以及
[0170]
d是荧光检测器收集到的光的强度。
[0171]
9.根据条款8所述的方法，其中通过线性回归法计算
[0172]
10.根据前述条款中任一项所述的方法，其中从多种不同的荧光色素发射的光中收集所述荧光流式细胞仪数据。
[0173]
11.根据条款10所述的方法，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为2至20种不同的荧光色素。
[0174]
12.根据条款10或11所述的方法，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为3至5种不同的荧光色素。
[0175]
13.根据条款10至12中任一项所述的方法，其中计算各荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0176]
14.根据条款10至13中任一项所述的方法，其中在溢出扩散矩阵中组合计算得出的各荧光检测器-荧光色素对的所述溢出扩散系数。
[0177]
15.根据条款14所述的方法，其中所述方法进一步包含基于所述溢出扩散矩阵，计算所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0178]
16.根据条款15所述的方法，其中调整荧光流式细胞仪数据包含减小对应于所述荧光色素的所述荧光流式细胞仪数据群体中所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0179]
17.根据前述条款中任一项所述的方法，其中在不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区包含评价所述不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异。
[0180]
18.根据条款17所述的方法，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算马修斯相关系数。
[0181]
19.根据条款18所述的方法，其中所述荧光流式细胞仪数据不含对至少一种荧光色素呈阳性的数据。
[0182]
20.根据条款19所述的方法，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算平衡准确度。
[0183]
21.根据前述条款中任一项所述的方法，其中按照层次结构对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。
[0184]
22.根据条款21所述的方法，其中所述层次结构详细说明了对特定荧光色素呈阳性或阴性的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体与相应表型之间的关联。
[0185]
23.一种系统，其包含：
[0186]
被配置成获取荧光流式细胞仪数据的颗粒分析仪组件；以及
[0187]
处理器，其包含与其可操作地耦合的存储器，其中所述存储器包含存储于其上的指令，所述指令由所述处理器执行时，会使所述处理器执行以下操作：
[0188]
将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体；
[0189]
确定所述荧光流式细胞仪数据群体的溢出扩散程度；
[0190]
基于所述确定的溢出扩散调整所述荧光流式细胞仪数据群体，以生成不同的经溢出扩散调整的群体；以及
[0191]
在所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区，以对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类。
[0192]
24.根据条款23所述的系统，其中基于所述荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光色素呈阳性或阴性，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。
[0193]
25.根据条款23或24所述的系统，其中基于所述荧光流式细胞仪数据与阈值的关系，确定所述荧光流式细胞仪数据对特定荧光色素呈阳性还是阴性。
[0194]
26.根据条款23至25中任一项所述的系统，其中确定溢出扩散包含量化通过荧光检测器采集的荧光流式细胞仪数据因收集特定荧光色素所发射的光而增加的程度。
[0195]
27.根据条款23至26中任一项所述的系统，其中确定溢出扩散包含计算荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0196]
28.根据条款27所述的系统，其中根据公式1计算所述溢出扩散系数：
[0197][0198]
其中：
[0199]
ss是所述溢出扩散系数；
[0200]
δσf是增量标准差，表示从荧光色素中收集的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间的发射扩散；以及
[0201]
δd是荧光检测器接收到的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间荧光强度的差异。
[0202]
29.根据条款27所述的系统，其中计算所述溢出扩散系数包含假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零。
[0203]
30.根据条款29所述的系统，其中根据公式2计算所述溢出扩散系数：
[0204][0205]
其中：
[0206]
ss是所述溢出扩散系数；
[0207]
σ2是所述阳性荧光流式细胞仪数据群体的标准差；
[0208]
是所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计值；以及
[0209]
d是荧光检测器收集到的光的强度。
[0210]
31.根据条款30所述的系统，其中通过线性回归法计算
[0211]
32.根据条款23至31中任一项所述的系统，其中从多种不同的荧光色素发射的光中收集所述荧光流式细胞仪数据。
[0212]
33.根据条款32所述的系统，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为2至20种不同的荧光色素。
[0213]
34.根据条款32或33所述的系统，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为3至5种不同的荧光色素。
[0214]
35.根据条款32至34中任一项所述的系统，其中计算各荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0215]
36.根据条款32至35中任一项所述的系统，其中在溢出扩散矩阵中组合计算得出的各荧光检测器-荧光色素对的所述溢出扩散系数。
[0216]
37.根据条款36所述的系统，其进一步包含基于所述溢出扩散矩阵，计算所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0217]
38.根据条款37所述的系统，其中调整荧光流式细胞仪数据包含减小对应于所述荧光色素的所述荧光流式细胞仪数据群体中所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0218]
39.根据条款23至38中任一项所述的系统，其中在不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区包含评价所述不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异。
[0219]
40.根据条款39所述的系统，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算马修斯相关系数。
[0220]
41.根据条款40所述的系统，其中所述荧光流式细胞仪数据不含对至少一种荧光色素呈阳性的数据。
[0221]
42.根据条款41所述的系统，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算平衡准确度。
[0222]
43.根据条款23至42中任一项所述的系统，其中按照层次结构对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。
[0223]
44.根据条款43所述的系统，其中所述层次结构详细说明了对特定荧光色素呈阳性或阴性的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体与相应表型之间的关联。
[0224]
45.一种非暂时性计算机可读存储介质，其包含存储于其上的指令，所述指令用于通过方法对流式细胞仪数据进行分类，所述方法包含：
[0225]
用监督算法处理所述流式细胞仪数据，所述监督算法被配置成：
[0226]
将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体；
[0227]
确定所述荧光流式细胞仪数据群体的溢出扩散程度；
[0228]
基于所述确定的溢出扩散调整所述荧光流式细胞仪数据群体，以生成不同的经溢出扩散调整的群体；以及
[0229]
在所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区，以对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分类。
[0230]
46.根据条款45所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中基于所述荧光流式细胞仪数据相对于特定荧光色素呈阳性或阴性，将所述荧光流式细胞仪数据聚类成群体。
[0231]
47.根据条款45或46所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中基于所述荧光流式细胞仪数据与阈值的关系，确定所述荧光流式细胞仪数据对特定荧光色素呈阳性还是阴性。
[0232]
48.根据条款45至47中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中确定溢出扩散包含量化通过荧光检测器采集的荧光流式细胞仪数据因收集特定荧光色素所发射的光而增加的程度。
[0233]
49.根据条款45至48中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中确定溢出扩散包含计算荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0234]
50.根据条款49所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中根据公式1计算所述溢出扩散系数：
[0235][0236]
其中：
[0237]
ss是所述溢出扩散系数；
[0238]
δσf是增量标准差，表示从荧光色素中收集的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数
[0239]
据之间的发射扩散；以及
[0240]
δd是荧光检测器接收到的所述阳性和阴性荧光流式细胞仪数据之间荧光强度的差异。
[0241]
51.根据条款49所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中计算所述溢出扩散系数包含假设所述荧光检测器针对所述阴性流式细胞仪数据群体采集的荧光强度为零。
[0242]
52.根据条款51所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中根据公式2计算所述溢出扩散系数：
[0243][0244]
其中：
[0245]
ss是所述溢出扩散系数；
[0246]
σ2是所述阳性荧光流式细胞仪数据群体的标准差；
[0247]
是所述阴性荧光流式细胞仪数据群体的标准差的估计值；以及
[0248]
d是荧光检测器收集到的光的强度。
[0249]
53.根据条款52所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中采用线性回归法计算
[0250]
54.根据条款45-53中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中从多种不同的荧光色素发射的光中收集所述荧光流式细胞仪数据。
[0251]
55.根据条款54所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为2至20种不同的荧光色素。
[0252]
56.根据条款54或55所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述多种不同的荧光色素的种数范围为3至5种不同的荧光色素。
[0253]
57.根据条款54至56中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中计算各荧光检测器-荧光色素对的溢出扩散系数。
[0254]
58.根据条款54至57中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中在溢出扩散矩阵中组合计算得出的各荧光检测器-荧光色素对的所述溢出扩散系数。
[0255]
59.根据条款58所述的非暂时性计算机可读存储介质，其进一步包含基于所述溢出扩散矩阵，计算所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0256]
60.根据条款59所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中调整荧光流式细胞仪数据包含减小对应于所述荧光色素的所述荧光流式细胞仪数据群体中所述多种不同的荧光色素中每一种的所述溢出扩散幅度。
[0257]
61.根据条款45至60中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中在不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体之间建立分区包含评价所述不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异。
[0258]
62.根据条款61所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算马修斯相关系数。
[0259]
63.根据条款62所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述荧光流式细胞仪数据不含对至少一种荧光色素呈阳性的数据。
[0260]
64.根据条款63所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中评价不同的经溢出扩散调整的群体相对于阈值的差异包含计算平衡准确度。
[0261]
65.根据条款45至64中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中按照层次结构对所述不同的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体进行分区。
[0262]
66.根据条款65所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述层次结构详细说明了对特定荧光色素呈阳性或阴性的经溢出扩散调整的荧光流式细胞仪数据群体与相应表型之间的关联。
[0263]
尽管为了达到清晰理解的目的采用图示和示例的方式详细描述了前述发明，但是鉴于本发明的教学意义，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可对其进行特定的变更和修改。
[0264]
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员能够设计出各种结构，尽管这里没有明确表述或示出，但这些设计反应了本发明的原理，未超出本发明的精神和范围。此外，本文列举的所有示例和条件语言主要为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步拓展本领域所提供的构想，并且应解释为不受这些具体列举的示例和条件的限制。而且，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其在结构和功能上的等同物。此外，所述等同物拟包括目前已知的等同物和日后待开发的等同物，即，开发出的任何功能相同且不考虑其结构的元件。而且，无论在权利要求书中是否明确叙述了本发明的公开内容，都不会向公众披露其中的任何内容。
[0265]
因此，本发明的范围并不限于本文中显示和描述的示例性实施例。相反，本发明的
范围和精神通过所附权利要求书体现。在权利要求书中，只有当权利要求书的限制内容开头明确使用短语“用于
……
的手段”或“用于
……
的步骤”时，《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)明确定义为被援引；如果权利要求书的限制内容中未使用所述短语，则《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)未被援引。