使神经细胞分化的方法及相关组合物和使用方法与流程

使神经细胞分化的方法及相关组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月13日提交的，标题为“使神经细胞分化的方法及相关组合物和使用方法(method of differentiating neural cells and related compositions and methods of use)”的美国临时申请62/960,669的优先权，该临时申请的内容通过引用整体并入用于所有目的。
技术领域
3.本公开涉及使多能干细胞，包括诱导多能干细胞，谱系特异性分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元的方法。还提供了分化细胞的组合物及其治疗用途，诸如用于治疗神经退行性病状和疾病，包括帕金森病(parkinson’s disease)的治疗用途。


背景技术：

4.考虑到使多能干细胞分化成谱系特异性细胞群的各种方法和所得的细胞组合物可用于患有导致定向细胞群功能损失的疾病的患者的细胞替代疗法。然而，在一些情况下，此类方法在产生具有一致生理特征的细胞的能力方面受到限制，并且由此类方法产生的细胞可能在体内移植和使其它细胞受神经支配的能力方面受到限制。需要改进的方法及其细胞组合物，包括提供用于使细胞分化，诸如以产生生理一致的细胞的改进方法。


技术实现要素：

5.本文提供了一种使神经细胞分化的方法，该方法包括：(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；以及(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述球体的细胞。在一些实施方案中，第二次温育开始于约第7天。
6.在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂直至第7天当天或之前的一天。在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂直到第6天。在一些实施方案中，所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述tgf-β/激活nodal抑制剂。
7.在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂直至第7天当天或之前的一天。在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂直到第6天。在一些实施方案中，所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂。
8.在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述bmp信号传导抑制剂直至第11天当天或
之前的一天。在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述bmp信号传导抑制剂直到第10天。在一些实施方案中，所述细胞从第0天开始至第10天，包括每一天，暴露于所述bmp信号传导抑制剂。
9.在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述gsk3β信号传导抑制剂直至第13天当天或之前的一天。在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述gsk3β信号传导抑制剂直到第12天。在一些实施方案中，细胞从第0天开始至第12天，包括每一天，暴露于所述gsk3β信号传导抑制剂。
10.在一些实施方案中，在提供的任何方法中在使细胞神经分化的条件下培养细胞包括将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)(统称为“bagct”)；和(vi)notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于bagct和notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于bagct和notch信号传导抑制剂，直到收获神经分化细胞。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于bagct和notch信号传导抑制剂，直到刚好或约第18天。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于bagct和notch信号传导抑制剂，直到刚好或约第25天。
11.本文提供了一种使神经细胞分化的方法，该方法包括：(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育当天开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂到第6天，包括每一天；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；以及(b)从第7天开始，进行第二次温育以使所述球体的细胞神经分化，包括在涂覆有选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合的底物的培养器皿中培养所述细胞，其中从第7天开始，将细胞暴露于(i)bmp信号传导抑制剂和(ii)gsk3β信号传导抑制剂；并且从第11天开始，将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)(统称为“bagct”)；和(vi)notch信号传导抑制剂。
12.在所提供的任何方法中的一些方法中，该方法还包括收获神经分化细胞。在一些实施方案中，所述收获在约第16天或之后进行。在一些实施方案中，所述收获在约第16天至约第30天之间进行。在一些实施方案中，所述收获在约第16天至约第27天之间进行。在一些实施方案中，所述收获在第18天至第25天之间进行。在一些实施方案中，所述收获在第18天或约在第18天进行。在一些实施方案中，所述收获在第25天或约在第25天进行。
13.在一些实施方案中，神经分化细胞是定向多巴胺能神经元祖细胞。在一些实施方案中，多巴胺能神经元祖细胞在移植到受试者后能够使宿主组织受神经支配。
14.在一些实施方案中，在进行所述第二次温育之前，将所述球体解离以产生细胞悬浮液，并且将所述细胞悬浮液的细胞在所述底物涂覆的培养器皿中培养。在一些实施方案中，所述解离在所述球体细胞表达pax6和otx2中的至少一者时进行。在一些实施方案中，所述解离在所述球体细胞表达otx2时进行。在一些实施方案中，所述解离在所述球体细胞表达pax6时进行。在一些实施方案中，所述解离在所述球体细胞表达pax6和otx2时进行。
15.在一些实施方案中，所述解离在约第7天进行。
16.在一些实施方案中，所述培养器皿选自由以下项组成的组：板、培养皿、烧瓶和生物反应器。在一些实施方案中，所述培养器皿是板。在一些实施方案中，所述板是6孔板、12孔板、24孔板或96孔板。在一些实施方案中，所述板是微孔板。在一些实施方案中，所述微孔板是6孔板。在一些实施方案中，所述微孔板是24孔板。在一些实施方案中，所述培养器皿是aggrewell
tm
板。
17.在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括
约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。
18.在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔或约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。
19.在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔或约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。
20.在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约1,000个细胞至约5,000个细胞，诸如2,000个细胞至约3,000个细胞的球体。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约1,000个细胞至约5,000个细胞的球体。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约2,000个细胞至约3,000个细胞的球体。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约2,000个细胞的球体。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约3,000个细胞的球体。
21.在一些实施方案中，处理所述培养器皿以减少或消除细胞粘附。在一些实施方案中，处理所述培养器皿以减少细胞粘附。在一些实施方案中，处理所述培养器皿以消除细胞粘附。在一些实施方案中，处理所述培养器皿包括将所述培养器皿与普朗尼克酸一起温育。在一些实施方案中，在所述第一次温育之前，将所述非贴壁培养器皿暴露于表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂是普朗尼克酸。
22.在一些实施方案中，所述非贴壁培养器皿具有低或超低附着表面。在一些实施方案中，所述非贴壁培养器皿具有低附着表面。在一些实施方案中，所述非贴壁培养器皿具有超低附着表面。在一些实施方案中，该底物是基底膜蛋白。在一些实施方案中，该底物选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合中的一种或多种。在一些实施方案中，该底物是重组蛋白。在一些实施方案中，该底物是重组层粘连蛋白。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿在用于培养所述细胞之前，暴露于聚-l-鸟氨酸。
23.在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂是sb431542。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的sb431542。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的sb431542。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的sb431542。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的sb431542。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10μm的sb431542。
24.在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是shh蛋白或嘌吗啡胺(purmorphamine)。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是shh蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是嘌吗啡胺。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂包括选自shh蛋白和嘌吗啡胺的两种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是选自shh蛋白和嘌吗啡胺的两种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至500ng/ml、约20ng/ml至约400ng/ml、约50ng/ml至约200ng/ml或约75ng/ml至约150ng/ml的shh。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至500ng/ml的shh。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约20ng/ml至400ng/ml的shh。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约50ng/ml至200ng/ml的shh。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约75ng/ml至150ng/ml的shh。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约100ng/ml的shh。
25.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的嘌吗啡胺。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的嘌吗啡胺。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的嘌吗啡胺。在一些实施
方案中，所述细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的嘌吗啡胺。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10μm的嘌吗啡胺。
26.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约100ng/ml的shh和浓度为约10μm的嘌吗啡胺。
27.在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10nm至500nm、约20nm至约400nm、约50nm至约200nm或约75nm至约150nm的ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10nm至500nm的ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约20nm至400nm的ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约50nm至200nm的ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约75nm至150nm的ldn193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约100nm的ldn193189。
28.在一些实施方案中，所述gsk3β信号传导抑制剂是chir99021。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1μm至约5μm、约0.5μm至约4μm或约1μm至约3μm的chir99021。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1μm至约5μm的chir99021。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.5μm至约4μm的chir99021。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约3μm的chir99021。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约2μm的chir99021。
29.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5ng/ml至约80ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至约60ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约15ng/ml至约30ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约20ng/ml的gdnf。
30.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5ng/ml至约80ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至约60ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约15ng/ml至约30ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约20ng/ml的bdnf。
31.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1mm至5mm、约0.2mm至约4mm、约0.3mm至约3mm或约0.4mm至约2mm的dbcamp。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1mm至5mm的dbcamp。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.2mm至4mm的dbcamp。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.3mm至3mm的dbcamp。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.4mm至2mm的dbcamp。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.5mm的dbcamp。
32.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约1mm或约0.2mm至约0.5mm的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1mm至约2mm的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.2mm至约0.5mm的抗坏血酸。在一些实施方
案中，所述细胞暴露于浓度为约0.2mm的抗坏血酸。
33.在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1ng/ml至约5ng/ml、约0.3ng/ml至约3ng/ml或约0.5ng/ml至约2ng/ml的tgfβ3。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1ng/ml至约5ng/ml的tgfβ3。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.3ng/ml至约3ng/ml的tgfβ3。在一些实施方案中，，所述细胞暴露于浓度为约0.5ng/ml至约2ng/ml的tgfβ3。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml的tgfβ3。
34.在一些实施方案中，所述notch信号传导抑制剂是dapt。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的dapt。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的dapt。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的dapt。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的dapt。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10μm的dapt。
35.在所提供的任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一次温育和/或所述第二次温育中的所述培养在具有血清或血清替代物的培养基中进行。在所提供的任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一次温育中的所述培养在具有血清或血清替代物的培养基中进行。在所提供的任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二次温育中的所述培养在具有血清或血清替代物的培养基中进行。在一些实施方案中，所述第一次温育和所述第二次温育中的所述培养在具有血清或血清替代物的培养基中进行。在一些实施方案中，所述细胞从约第0天至约第10天在具有血清或血清替代物的培养基中培养。在一些实施方案中，所述血清或血清替代物占培养基的约5％(v/v)。在一些实施方案中，所述血清或血清替代物占培养基的约2％(v/v)。在一些实施方案中，所述培养基从约第0天至约第1天包含约5％的血清或血清替代物(v/v)，并且从约第2天至约第10天包含约2％的血清替代物(v/v)。在一些实施方案中，所述培养基含有血清替代物。在一些实施方案中，所述血清替代物不含胎牛血清(fbs)。在一些实施方案中，所述血清替代物是knockout
tm
血清替代物。
36.在一些实施方案中，所述细胞在培养持续期间在不存在血清的情况下培养。
37.在一些实施方案中，所述细胞在第一次温育和第二次温育的一天或多天期间暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，在该方法的过程中，rock信号传导抑制剂每周至少添加一次。在一些实施方案中，所述细胞在第0天、第7天、第16天和/或第20天暴露于rock信号传导抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞在第0天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞在第7天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞在第16天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞在第20天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞在第0天、第7天、第16天和第20天暴露于rho相关激酶蛋白(rock)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，rock抑制剂是y-27632。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10μm的rock抑制剂。
38.在一些实施方案中，在第一次温育和/或第二次温育的培养期间，每天或每隔一天
或每三天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，每隔一天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，每三天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育期间每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育期间每隔一天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育期间每三天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第二次温育期间每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第二次温育期间每隔一天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第二次温育期间每三天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育和第二次温育期间每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育和第二次温育期间每隔一天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，在第一次温育和第二次温育期间每三天更换培养基的至少约50％。
39.在一些实施方案中，该方法包括在第二次温育之前解离球体。在一些实施方案中，该球体通过酶促解离而解离。在一些实施方案中，该方法包括在第二次温育之前解离球体并且该球体通过酶促解离而解离。在一些实施方案中，该球体通过酶促解离而解离，该酶促解离包括使用选自由以下项组成的组的酶：accutase、分散酶、胶原酶以及它们的组合。在一些实施方案中，该球体通过酶促解离而解离，该酶促解离包括使用accutase。在一些实施方案中，该球体用accutase解离。
40.在一些实施方案中，在球体解离后，在底物涂覆的培养器皿上培养解离的球体的细胞，诸如通过将细胞转移到底物涂覆的培养器皿。在一些实施方案中，在球体解离后，在底物涂覆的培养器皿上培养解离的球体的细胞，诸如通过将细胞转移到底物涂覆的培养器皿，浓度为约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，在球体解离后，在底物涂覆的培养器皿上培养解离的球体的细胞。在一些实施方案中，在球体解离后，在底物涂覆的培养器皿上培养解离的球体的细胞，诸如通过将细胞转移到底物涂覆的培养器皿，浓度为约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，将解离的球体的细胞转移到底物涂覆的器皿发生在约第7天。
41.在一些实施方案中，在将球体细胞转移到底物涂覆的培养器皿之前，来自第一次温育的球体细胞未解离。在一些实施方案中，第二次温育包括培养来自第一次温育的球体细胞，而未先解离细胞以形成细胞悬浮液。
42.在所提供的任何实施方案中的一些实施方案中，该方法还包括用低温保护剂配制
收获的细胞。在一些实施方案中，低温保护剂选自甘油、丙二醇、二甲亚砜(dmso)或它们的组合。在一些实施方案中，低温保护剂包括dmso。在一些实施方案中，低温保护剂是dmso。在一些实施方案中，用约10％dmso配制收获的细胞。
43.在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞、诱导多能干细胞(ipsc)或它们的组合。在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是诱导多能干细胞(ipsc)。在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞。在一些实施方案中，es细胞是小鼠或人胚胎干细胞。在一些实施方案中，es细胞是小鼠胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是诱导多能干细胞。在一些实施方案中，ipsc是小鼠或人诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是小鼠诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。
44.在一些实施方案中，所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是自体的。在一些实施方案中，待治疗的受试者患有帕金森病。在一些实施方案中，待治疗的受试者疑似患有帕金森病。在一些实施方案中，待治疗的受试者患有帕金森综合征(parkinsonism)。在一些实施方案中，待治疗的受试者疑似患有帕金森综合征。
45.在一些实施方案中，所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是同种异体的。在一些实施方案中，所述神经分化细胞是低免疫原性的。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子的基因。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以向aavs1安全港基因座中提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子的基因并且向aavs1安全港基因座中提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。
46.本文还提供了通过所提供的任何方法产生的治疗组合物。
47.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和/或corin。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物的细胞表达en1和corin，并且该组合物中总细胞少于10％表达th。
48.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物含有源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该组合物中的细胞表达en1和corin，并且该组合物中总细胞少于10％表达th。
49.在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
50.在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞大于10％、大于15％或大于20％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞大于10％表达th。在一些实施方案中，该治
疗组合物中总细胞大于15％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞大于20％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的约10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的约15％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的约20％表达th。
51.在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约25％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约30％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约35％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约40％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约45％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约50％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约55％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约60％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约65％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约70％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约75％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约80％表达en1。
52.在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约25％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约30％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约35％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约40％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约45％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约50％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约55％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约60％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约65％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约70％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约75％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约80％表达corin。
53.在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约15％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约25％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约30％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约35％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约40％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约45％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约50％表达en1和
corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约55％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约60％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约65％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约70％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约75％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约80％表达en1和corin。
54.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1，并且该治疗组合物中总细胞少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1，并且该治疗组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1，并且该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1，并且该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1，并且该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
55.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin，并且该治疗组合物中总细胞少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin，并且该治疗组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin，并且该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin，并且该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达corin，并且该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
56.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin，并且该治疗组合物中总细胞少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin，并且该治疗组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin，并且该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin，并且该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达en1和corin，并且该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
57.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该组合物的细胞表达en1并且该组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
58.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该组合物的细胞表达corin并且该组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于1％表达th。
59.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该组合物的细胞表达en1和corin并且该组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于5％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于3％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少
于1％表达th。
60.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物含有源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该治疗组合物表现出小于约2.5
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。
61.本文还提供了一种治疗组合物，该治疗组合物含有源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中该治疗组合物表现出以下中的一项或多项：(a)大于约2
×
10-5
的每百万计数(cpm)neurog1与cpm gapdh的比率；(b)大于约5
×
10-4
的cpm edn3与cpm gapdh的比率；(c)大于约4
×
10-3
的cpm hes1与cpm gapdh的比率；(d)大于约8
×
10-3
的cpm psrc1与cpm gapdh的比率；(e)大于约2
×
10-3
的cpm nek6与cpm gapdh的比率；(f)大于约1
×
10-2
的cpm iqgap3与cpm gapdh的比率；(g)大于约8
×
10-4
的cpm usp44与cpm gapdh的比率；(h)大于约3
×
10-3
的cpm cep55与cpm gapdh的比率；(i)大于约2
×
10-2
的cpm kif20a与cpm gapdh的比率；(j)大于约2
×
10-2
的cpm aurka与cpm gapdh的比率；(k)小于约1
×
10-3
的cpm calca与cpm gapdh的比率；(l)小于约1
×
10-3
的cpm glra2与cpm gapdh的比率；(m)小于约1
×
10-1
的cpm mapt与cpm gapdh的比率；(n)小于约5
×
10-2
的cpm camk2b与cpm gapdh的比率；(o)小于约1
×
10-2
的cpm syt13与cpm gapdh的比率；(p)小于约1
×
10-3
的cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率；(q)小于约5
×
10-3
的cpm ret与cpm gapdh的比率；(r)小于约1
×
10-2
的cpm kcnd3与cpm gapdh的比率；(s)小于约5
×
10-2
的cpm nsg2与cpm gapdh的比率；和(t)小于约2
×
10-2
的cpm snap25与cpm gapdh的比率。
62.在一些实施方案中，每百万计数(cpm)neurog1与cpm gapdh的比率大于约2
×
10-5
。在一些实施方案中，cpm edn3与cpm gapdh的比率大于约5
×
10-4
。在一些实施方案中，cpm hes1与cpm gapdh的比率大于约4
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm psrc1与cpm gapdh的比率大于约8
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm nek6与cpm gapdh的比率大于约2
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm iqgap3与cpm gapdh的比率大于约1
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm usp44与cpm gapdh的比率大于约8
×
10-4
。在一些实施方案中，cpm cep55与cpm gapdh的比率大于约3
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm kif20a与cpm gapdh的比率大于约2
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm aurka与cpm gapdh的比率大于约2
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm calca与cpm gapdh的比率大于约1
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm glra2与cpm gapdh的比率小于约1
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm mapt与cpm gapdh的比率小于约1
×
10-1
。在一些实施方案中，cpm camk2b与cpm gapdh的比率大于约5
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm syt13与cpm gapdh的比率小于约1
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率小于约1
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm ret与cpm gapdh的比率小于约5
×
10-3
。在一些实施方案中，cpm kcnd3与cpm gapdh的比率小于约1
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm nsg2与cpm gapdh的比率小于约5
×
10-2
。在一些实施方案中，cpm snap25与cpm gapdh的比率小于约2
×
10-2
。
63.在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约2项至20项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约2项至15项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约2项至10项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约2项至5项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约5项至20项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约5项至15项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约5项至10项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约
10项至20项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约5项至15项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的约15项至20项。
64.在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少2项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少3项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少4项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少5项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少6项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少7项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少8项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少9项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少10项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少11项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少12项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少13项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少14项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少15项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少16项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少17项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少18项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少19项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的至少20项。
65.在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的2项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的3项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的4项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的5项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的6项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的7项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的8项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的9项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的10项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的11项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的12项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的13项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的14项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的15项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的16项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的17项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的18项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的19项。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)-(t)中的20项。
66.在一些实施方案中，该治疗组合物中的细胞表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出大于约1
×
10-4
的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出大于约2
×
10-2
的corin与gapdh的比率。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出大于约1
×
10-4
的cpm en1与cpm gapdh的比率和大于约2
×
10-2
的cpm corin与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm en1与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-3
至1
×
10-2
之间。在一些实施方案中，cpm corin与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-2
至5
×
10-1
之间。
67.在一些实施方案中，该组合物中的细胞表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th。在一些实施方案中，该治疗组合物表现出小于约3
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm th与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至2.5
×
10-2
之间。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约2％至约10％、约2％至约8％、约2％至约6％、约2％至约4％、约4％至约10％、约4％至约8％、约4％至约6％、约6％至约10％、约6％至约8％或约8％至10％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约2％至约10％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约2％至约8％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约2％至约6％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约2％至约4％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约4％至约10％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约4％至约8％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约4％至约6％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约6％至约10％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约6％至约8％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的约8％至约10％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞对于th表达为阳性的百分比为或约为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，或介于前述任何值之间的任何值。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的1％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的2％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的3％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的4％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的5％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的6％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的7％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的8％表达th。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的9％表达th。
68.在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约15％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1。
69.在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约15％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1。在一些实施方案中，该组
合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1。
70.在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约15％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达corin。
71.在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约15％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达corin。
72.在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约15％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表
达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1和corin。
73.在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约15％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1和corin。
74.在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于3％、2％、1％或0.5％是血清素能细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于1％是血清素能细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于0.5％是血清素能细胞。
75.在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于1％、0.5％、0.25％或0.05％是多能干细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于0.5％是多能干细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞少于0.05％是多能干细胞。
76.在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约70％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约75％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约80％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约85％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约90％是活的。在一些实施方案中，该治疗组合物中总细胞的至少约95％是活的。
77.在一些实施方案中，定向细胞能够在体内移植和使其它细胞受神经支配。
78.在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少500万总细胞、至少1000万总细胞、至少1500万总细胞、至少2000万总细胞、至少3000万总细胞、至少4000万总细胞、至少5000万总细胞、至少1亿总细胞、至少1.5亿总细胞或至少2亿总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少500万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少1000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少1500万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少2000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少3000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括至少4000万总细胞。
79.在一些实施方案中，该治疗组合物包括约500万总细胞、约1000万总细胞、约1500万总细胞、约2000万总细胞、约3000万总细胞、约4000万总细胞、约5000万总细胞、约1亿总细胞、约1.5亿总细胞或约2亿总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约500万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约1000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约1500万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约2000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约3000万总细胞。在一些实施方案中，该治疗组合物包括约4000万总细胞。
80.在一些实施方案中，该治疗组合物为约0.5ml至5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约0.5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约0.75ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约1.0ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约1.25ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约1.5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约1.75ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约2.0ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约2.5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约3.0ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约3.5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约4.0ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约4.5ml。在一些实施方案中，该治疗组合物为约5.0ml。
81.在一些实施方案中，该治疗组合物包含低温保护剂。在一些实施方案中，低温保护剂是甘油、丙二醇、二甲亚砜(dmso)或它们的组合。在一些实施方案中，低温保护剂是dmso。在一些实施方案中，该治疗组合物包含约10％dmso。
82.在一些实施方案中，该组合物用于治疗受试者的神经退行性疾病或病状。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括在黑质(sn)中的多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括在sn致密部(snc)中的多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森病。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森综合征。
83.本文还提供了一种治疗方法，该治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的任何治疗组合物。
84.在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.25
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约0.75
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约0.5
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、
约0.5
×
106个细胞至约0.75
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约10
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约10
×
106个细胞至约15
×
106个细胞或约15
×
106个细胞至约20
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.25
×
106个细胞至约20
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.5
×
106个细胞至约15
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约1
×
106个细胞至约10
×
106个细胞。
85.在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约5
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约10
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约15
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约20
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约25
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约30
×
106个细胞。
86.在一些实施方案中，以约50,000个细胞/微升至约150,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案中，以约50,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案中，以约75,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案中，以约100,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案中，以约125,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案中，以约150,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。
87.在一些实施方案中，受试者患有神经退行性疾病或病状。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，受试者已经损失至少50％的多巴胺能神经元。在一些实施方案中，受试者已经损失黑质(sn)中至少50％的多巴胺能神经元。在一些实施方案中，受试者已经损失sn致密部(snc)中至少50％的多巴胺能神经元。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森综合征。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森病。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是特发性帕金森病。
88.在一些实施方案中，该施用包括通过立体定向注射递送组合物的细胞。在一些实施方案中，该施用包括通过导管递送组合物的细胞。在一些实施方案中，将细胞递送至受试者的纹状体。在一些实施方案中，受试者施用约3
×
106个细胞/半球至15
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约3
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约4
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约5
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约6
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约7
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约8
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约9
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约10
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约11
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约12
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约13
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约14
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106个细胞/半球。在一些实施方案中，受试者施用约15
×
106个细胞/半球。
89.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞对于受试者是自体的。
90.在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞是低免疫原性的。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子的基因。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以向aavs1安全港基因座中提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子的基因并且向aavs1安全港基因座中提供编码pd-l1、hla-g和cd47的基因。
91.本文还提供了本文提供的任何组合物用于治疗帕金森综合征的用途。本文还提供了本文提供的任何组合物用于治疗帕金森病的用途。
92.本文还提供了如本文所述的用于配制用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者药物的组合物。
93.本文还提供了用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者的如本文所述的任何药物组合物。
94.在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，该受试者已损失任选地在黑质(sn)，任选地在sn致密部(snc)中的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的多巴胺能神经元。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森综合征。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状是帕金森病，任选地是特发性帕金森病。
95.在一些实施方案中，该组合物的细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，该组合物的细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞是低免疫原性的。在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。
附图说明
96.图1.示出了用于使多能干细胞分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞或da神经元的示例性非贴壁方案。
97.图2.示出了第25天源自具有大约500、1,000、2,000、3,000、10,000或15,000个细胞的球体的分化细胞的foxa2、th和dapi表达。
98.图3.示出了第10天在有血清替代物或无血清的情况下生长的分化细胞的foxa2、th和dapi表达。
99.图4.示出了用于使多能干细胞分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞或da神经元的示例性贴壁方案。
100.图5.示出了第25天源自示例性贴壁方法或示例性非贴壁方法的分化细胞的foxa2、th和dapi表达。
101.图6.示出了通过示例性非贴壁方法分化的细胞在第18天和第25天的酪氨酸羟化酶(th)基因表达。
102.图7.示出了培养至第75天的细胞的多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)产量(ng/百万测定细胞)。
103.图8a.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的foxa2和th基因表达。
104.图8b.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的en1和corin基因表达。
105.图8c.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的pax6和sox2基因表达。
106.i.定义
107.除非另有定义，否则本文使用的所有专门术语、符号和其它技术和科学术语或术语学旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了方便参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的那些具有实质性差异。
108.如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。例如，“一”或“一个(种)”意指“至少一个”或“一个或多个”。应当理解，本文所述的方面和变型包括“由方面和变型组成”和/或“基本上由方面和变型组成”。
109.在本公开全篇，所要求保护的主题的各个方面以范围的格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁而不应当解释为对所要求保护的主题的范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，介于该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在该规定范围内的任何其它规定值或中间值都涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题中。不论范围的宽度如何，这都适用。
110.如本文所用的术语“约”是指容易知道的各个值的通常误差范围。本文提及“约”值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约x”的描述包括对“x”的描述。
111.如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记物而言为“阳性”的陈述是指特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或在细胞中可检测到存在。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流式细胞术，例如通过用与该标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体所检测的那样存在表面表达，其中该染色可通过流式细胞术检测到，其水平基本上高于在其它相同条件下用同种型匹配的对照进行同样程序所检测到的染色，和/或其水平基本上类似于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或其水平基本上高于已知对于该标记物而言为阴性的细胞的水平。当提及细胞中的标记物，诸如转录产物或翻译产物时，该术语是指例如存在可检测的转录产物或翻译产物，其中检测到产物的水平基本上高于在其它相
同条件下用对照进行同样程序所检测到的水平，和/或其水平基本上类似于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或其水平基本上高于已知对于该标记物而言为阴性的细胞的水平。
112.如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记物而言为“阴性”的陈述是指不存在特定标记物(通常是表面标记物)在细胞上或在细胞中实质性的可检测到存在。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流式细胞术，例如通过用与该标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体所检测的那样不存在表面表达，其中未通过流式细胞术，以基本上高于在其它相同条件下用同种型匹配的对照进行同样程序所检测到的水平，和/或以基本上低于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或以与已知对于该标记物而言为阴性的细胞的水平相比基本上类似的水平检测到染色。当提及细胞中的标记物，诸如转录产物或翻译产物时，该术语是指例如不存在可检测的转录产物或翻译产物，其中未以基本上高于在其它相同条件下用对照进行同样程序所检测到的水平，和/或以基本上低于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或以与已知对于该标记物而言为阴性的细胞相比基本上相似的水平检测到产物。
113.如本文提及基因时使用的术语“表达”或“表达的”是指该基因的转录产物和/或翻译产物。dna分子在细胞中的表达水平可以基于细胞内存在的相应mrna的量或由细胞产生的该dna编码的蛋白质的量来测定(sambrook等人，1989，molecular cloning:a laboratory manual,18.1-18.88)。
114.如本文所用，术语“干细胞”是指以通过细胞有丝分裂进行自我更新的能力和分化成组织或器官的潜能为特征的细胞。在哺乳动物干细胞中，可以区分胚胎干细胞和体干细胞。胚胎干细胞存在于胚泡中并且产生胚胎组织，而体干细胞存在于成体组织中，用于组织再生和修复的目的。
115.如本文所用，术语“成体干细胞”是指胚胎发育后在个体中发现的未分化细胞。成体干细胞通过细胞分裂倍增，以补充死亡细胞和再生受损组织。成体干细胞能够分裂并产生和它自身一样的另一细胞或者产生分化程度更高的细胞。尽管成体干细胞与多能性标记物诸如rex1、nanog、oct4或sox2的表达相关，但它们不具有多能干细胞分化为所有三个胚层的细胞类型的能力。
116.如本文所用，术语“诱导多能干细胞”、“ips”和“ipsc”是指从非多能细胞人为获得(例如，通过人工操纵)的多能干细胞。“非多能细胞”可以是自我更新和分化潜能低于多能干细胞的细胞。较低潜能的细胞可以是但不限于成体干细胞、组织特异性祖细胞、原代细胞或次生细胞。
117.如本文所用，术语“多能”或“多能性”是指能够产生子代的细胞，该子代能够在适当条件下分化成共同表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞可以有助于产前、产后或成体生物体的组织。
118.如本文所用，术语“多能干细胞特征”是指将多能干细胞与其它细胞区分开来的细胞特征。分子标记物的某些组合的表达或不表达是多能干细胞特征的示例。更具体地，人多能干细胞可以表达来自以下非限制性列表的标记物中的至少一些，任选地全部：ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、tra-2-49/6e、alp、sox2、e-钙粘蛋白、utf-1、oct4、lin28、rex1和nanog。与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞的特征。
119.如本文所用，术语“重编程”是指使非多能细胞去分化为表现出多能干细胞特征的细胞的过程。
120.如本文所用，术语“贴壁培养器皿”是指这样的培养器皿，细胞可经由细胞外基质分子等附着于培养器皿上，并且将细胞从该培养器皿分开需要使用酶(例如，胰蛋白酶、分散酶等)。“贴壁培养器皿”与这样的培养器皿大不相同，细胞附着减少并且从该培养器皿中取出细胞不需要使用酶。
121.如本文所用，术语“非贴壁培养器皿”是指细胞附着减少或受限(诸如持续一段时间)的培养器皿。非贴壁培养器皿可含有低附着或超低附着表面，诸如可通过用防止细胞附着的物质处理表面来实现，该物质诸如水凝胶(例如中性带电荷的水凝胶和/或亲水性水凝胶)和/或表面活性剂(例如普朗尼克酸)。非贴壁培养器皿可含有圆形孔或凹面孔，和/或微孔(例如aggrewells
tm
)。在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是aggrewell
tm
板。对于非贴壁培养器皿，可能不需要使用酶从培养器皿中取出细胞。
122.如本文所用，术语“细胞培养物”可以指存在于生物体外部的体外细胞群。细胞培养物可以由从细胞库或动物中分离的原代细胞建立，或者由源自这些来源中的一种来源的次生细胞建立并且永生化以获得长期体外培养物。
123.如本文所用，术语“培养(culture)”、“培养(culturing)”、“生长(grow)”、“生长(growing)”、“维持(maintain)”、“维持(maintaining)”、“扩增(expand)”、“扩增(expanding)”等在提及细胞培养物本身或培养过程时，可以互换使用，意指在体外(例如，离体)维持在适于存活的条件下的细胞。允许培养的细胞存活，并且培养可以引起细胞生长、分化或分裂。
124.如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水溶液、非水溶液或它们的任何组合。
125.术语“药物组合物”是指适于药物用途，诸如哺乳动物受试者(例如人)中的药物用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。该载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0126]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0127]
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，该说明含有关于此类治疗产品使用的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
[0128]
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或其它动物，并且通常是人。
具体实施方式
[0129]
本公开涉及多能干细胞(psc)，诸如胚胎干(es)细胞或诱导多能干细胞(ipsc)的谱系特异性分化的方法。具体描述了指导psc或ipsc谱系特异性分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞(ddpc)和/或多巴胺(da)神经元的方法。使用本文提供的方法制备的分化细胞被进一步考虑用于各种用途，包括但不限于用作逆转患者多巴胺神经元缺乏的疾病或损伤的治疗剂。
[0130]
本文提供了使多能干细胞(psc)诸如胚胎干(es)细胞或诱导多能干细胞(ipsc)谱系特异性分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元
357。基于来自早期外植体研究的发育见解，使用定向分化策略生成中脑da神经元。lee等人，nat.biotechnol.(2000)18v675-679；ye等人，cell(1998)93:755-66。然而，这些努力并未产生含有高百分比中脑da神经元或能够在体内恢复神经元功能的细胞的细胞群。另外，所得到的群体还含有除了中脑da神经元之外的细胞类型的混合物。
[0136]
将人psc(hpsc)用于细胞疗法的现有策略尚未完全令人满意。源自人psc的da神经元通常表现出了较差的体内性能，不能补偿神经元功能的内源性损失。tabar等人nature med.(2008)14:379-81；；lindvall和kokaia,j.clin.invest(2010)120:29-40。
[0137]
最近，首先使人es细胞分化成中脑底中间体，然后进一步分化成da神经元的临床前研究在动物模型中表现出体内存活并且导致运动缺陷的恢复。krik等人，nature(2011)480:547
–
51；kirkeby等人，cell rep.(2012)1:703-14。尽管有这些进步，胚胎干细胞的使用仍然受到伦理问题，以及此类细胞可能在患者体内形成肿瘤的可能性的困扰。最后，在同种异体干细胞移植的情况下，es细胞来源的移植物可能在患者中引起免疫反应。
[0138]
使用诱导多能干细胞(ipsc)，而不是es来源的细胞，具有避免伦理问题的优势。此外，从待治疗患者(即该患者接受自体细胞移植)得到ipsc避免了使用胚胎干细胞固有的免疫排斥风险。由于先前的研究揭示，移植的细胞材料的不良标准化导致高度可变性，因此需要产生大量标准化细胞，诸如用于自体干细胞移植的新方法。lindvall和kokaia,j.clin.invest(2010)120:29-40。
[0139]
目前正在进行一项研究，其中人ipsc分化成da神经元前体并移植到人的纹状体中。然而，这些细胞存活、植入和使体内其它细胞受神经支配的能力尚未报道。takahashi,brain res.(2017)230:213
–
26(2017)；cyranoski,d.,nature news(2018)。
[0140]
因此，现有策略尚未被证明能成功地产生用于植入程序以恢复体内神经元功能的分化细胞群。本文提供了使psc分化成定向多巴胺能神经元祖细胞(ddpc)和/或da神经元细胞的方法。具体而言，所提供的方法基于以下发现：在sb、ldn、shh、pur和chir的存在下，启动作为非贴壁细胞的psc培养，以生成球体，接着在底物涂覆的板上进一步温育球体的细胞，产生具有优异特性的分化细胞。所提供方法的其它方面包括在细胞成为定向多巴胺能(多巴胺神经元)前体细胞时收获细胞，所述前体细胞是能够分化成多巴胺能神经元但不能分化成非多巴胺能神经元的细胞。在所提供的方法的一些实施方案中，此类细胞是根据所提供的方法分化并且在第18天或约第18天收获的细胞。
[0141]
在一些情况下，本文所述的方法包括以非贴壁培养(即悬浮培养)方式将psc培养成球体约7天，然后解离球体并且如果解离的细胞处于板，例如底物涂覆的板上，则继续培养(即作为贴壁培养的形式)直至收获。所提供的以非贴壁培养方式使细胞分化的方法与替代方法相比具有优势，所述替代方法诸如整个分化过程通过细胞贴壁培养进行的方法。
[0142]
在一些情况下，与不涉及细胞非贴壁培养的分化方法相比，所提供的方法的非贴壁培养是有利的，因为在非贴壁培养期间，一种或多种底物和/或一种或多种试剂的可变性对细胞分化的影响被降低或消除。具体地，贴壁培养可涉及将板用一种或多种底物或试剂涂覆，并且此类涂覆可能是不均匀的，从而导致一种或多种底物和/或试剂向贴壁细胞的可变性提供，尤其是在整个分化过程通过细胞贴壁培养进行的方法中。底物和/或试剂向贴壁细胞的此类可变性提供可增加收获的通过该分化方法产生的细胞的可变性。相比之下，底物和/或试剂在非贴壁培养中可能是不必要的，或者在整个非贴壁培养中是均匀分散的。在
后一种情况下，培养的细胞(例如球体)在所有侧面都被培养基包围，使得细胞同等地暴露于培养基中的任何底物和/或试剂。因此，在所提供的实施方案的方面中，通过包括非贴壁培养的分化方法产生的细胞可表现出降低的可变性。
[0143]
与不包括非贴壁培养的方法相比，本文所述的非贴壁培养方法也是有利的，因为非贴壁培养允许细胞间的相互作用增加。具体而言，贴壁(例如单层)培养中的细胞仅在其侧表面接触其它细胞。相比之下，非贴壁(例如悬浮)培养中的细胞能够在整个表面接触其它细胞。通过更忠实地再现生理环境，非贴壁培养中此类增加的细胞间接触可能是有利的。例如，本文所述的非贴壁培养方法所允许的细胞间接触的增加可上调细胞间蛋白质网络，如在体内所观察到的。
[0144]
在一些方面，与替代方法，诸如整个分化过程通过细胞贴壁培养进行的方法相比，本文所述的涉及所提供的非贴壁培养方法的方法提供了培养大量细胞的简易性和效率。例如，在贴壁(例如单层)培养中，培养的细胞数目在二维尺度(即培养表面的长度和宽度)上随着培养表面的表面积而增加。相比之下，在非贴壁(例如悬浮)培养中，培养的细胞数目在三维尺度上随着培养器皿的体积或其中所含培养基的体积而增加。因此，在一些情况下，非贴壁培养更经济和有效，因为与贴壁培养相比，使用更少的资源(例如培养器皿和试剂)，可以生成更多的细胞，或者两者都有。这样，所提供的非贴壁培养方法能够在制造和生产过程中使规模化成为可能。
[0145]
此外，特定益处与包括仅约7天的非贴壁培养的细胞分化方法相关。本文所述的约7天的非贴壁培养产生球体。如果允许非贴壁培养进行超过7天，则球体的递增尺寸可能会限制质量转移，并且跨球体直径产生试剂(例如形态发生素)梯度。跨球体直径的大量试剂(例如形态发生素)梯度是不希望的，因为球体的不同细胞将暴露于不同浓度的试剂(例如形态发生素)，从而导致可变的细胞反应和分化。因此，本文所述的包括仅约7天或最多7天的非贴壁培养的方法是有利的，因为球体细胞所暴露的试剂(诸如形态发生素)的浓度变化被最小化。
[0146]
在一些方面，将本文所述的方法的非贴壁培养组成部分限于约7天也有助于确保培养细胞的一致分化。这是因为psc在非贴壁(例如悬浮)培养中的长期(例如大于7天)分化可允许psc建立允许在多能状态下自我更新的微环境。因此，本文所述的方法通过减少或消除psc在培养物中持续存在的机会，确保了培养细胞的一致和有效分化。
[0147]
在所提供的方法的方面中，通过本文所述的方法产生的细胞是有利的，这是由于其表现出a9特异性标记物的表达，证明了它们作为a9多巴胺神经元的命运以及对于体内其它细胞的移植、植入和神经支配的适合性。
[0148]
具体而言，通过本文所述的方法产生的细胞，包括在分化第18天收获的细胞，表达en1和corin，即在胎儿发育期间由a9祖细胞表达的基因。本文所述的示例性分化方法第25天收获的细胞与第18天收获的细胞相比，也展示出有丝分裂相关基因的下调，表明随着培养时间的增加，对特定细胞类型命运的定型增加。另外，与第18天相比，通过本文所述的方法产生的细胞在第25天展示出神经突生长相关基因的表达上调。神经突生长相关基因参与新神经元投射和突触发生的发展。因此这一发现表明，随着培养时间的增加，通过本文所述的示例性方法分化的细胞变得更加定型为神经元命运。总之，这些特征表明第18天收获的细胞是定型多巴胺能神经元祖细胞。因此，通过本文所述的方法产生的细胞，包括在第18天
收获的分化细胞，与通过其它方法分化的和/或在分化方案的不同天数(即，稍后天数)收获的细胞相比可能是有利的，这是因为它们定型为da神经元命运，但比稍后天数分化程度低。
[0149]
本文的发现还证明，在第18天收获的细胞似乎会表达da神经元前体的许多标记物，但是它们的遗传表达表明它们可能比在第25天收获的细胞更少定型为da神经元命运。在一些实施方案中，第18天收获的细胞因此可以表示收获用于后续体内移植的细胞的理想时间点。具体而言，与通过其它方法分化的和/或在分化方案的不同天数(即，稍后天数)收获的细胞相比，可以提高植入、神经支配或提高功效的能力中的一种或多种能力。
[0150]
在一些实施方案中，在本文所述的方法的第18天或约第18天收获的细胞或本文所述的含有所述细胞的治疗组合物，与在该分化方法的稍后时间(例如，第25天)收获的细胞相比，可表现出植入其它细胞和/或使其它细胞受神经支配的能力提高。在一些实施方案中，在第18天收获的细胞由于其分化状态和神经元定型，也可以在体内表现出改善的功效。例如，与在第25天收获的细胞相比，在第18天收获的细胞可以表现出改善的植入和/或神经支配、改善的功效或两者。
[0151]
在一些实施方案中，通过所提供的分化方法收获的细胞表现出治疗神经退行性疾病的治疗效果。在一些实施方案中，可以在神经退行性疾病的动物模型中确定分化细胞治疗神经退行性疾病的能力。在一些实施方案中，该神经退行性疾病是帕金森病。在一些实施方案中，使用帕金森病的动物模型来筛选通过所提供的方法收获的分化细胞。任何已知和可用的帕金森病动物模型都可以用于筛选。在一些实施方案中，动物模型是损伤模型，其中动物接受6-羟基多巴胺(6-ohda)向黑质的单侧立体定向注射。在一些实施方案中，动物模型是损伤模型，其中动物接受6-ohda向内侧前脑束的单侧立体定向注射。在一些实施方案中，将含有通过所提供的方法产生的分化细胞(例如收获的细胞，诸如第18天的细胞)的治疗组合物植入动物模型的黑质中。在一些实施方案中，进行行为测定以筛选植入对动物模型的治疗效果。在一些实施方案中，行为测定包括监测安非他明诱导的转圈行为。在一些实施方案中，如果确定分化细胞在该模型中减少、降低或逆转帕金森综合征模型的脑损伤，则此类细胞表现出治疗神经退行性疾病的治疗效果。
[0152]
此外，与先前报道的方法不同，通过本文所述方法产生的分化细胞展示出生理一致性。重要的是，这种生理一致性在从不同受试者分化的细胞中得以维持。因此这种方法减少了受试者内和受试者之间的可变性，并允许体内细胞行为更好的可预测性。这些益处与成功的治疗策略相关，特别是在自体干细胞移植的情况下，其中对于每个患者而言细胞是单独生成的。不同受试者之间的此类再现性益处也可以使制造和生产过程中的规模化成为可能。
[0153]
本技术中提及的所有出版物，包括专利文件、科学论文和数据库，都通过引用整体并入用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物通过引用单独并入一样。如果本文提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中提出的定义相反或在其它方面不一致，则本文提出的定义优先于通过引用并入本文的定义。
[0154]
本文使用的章节标题仅用作组织的目的，不应解释为限制所描述的主题。
[0155]
ii.使细胞分化的方法
[0156]
本文提供了使神经细胞分化的方法，所述方法包括：(1)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在第一次温育开始时
(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；以及(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述球体的细胞。
[0157]
所提供的使神经细胞分化的方法，诸如通过使ipsc经受诱导其分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元的细胞培养方法。
[0158]
如本文所述，ipsc是从患有帕金森病的人类患者的成纤维细胞生成的。在第一次温育中，ipsc然后分化成中脑底板前体，并在非贴壁培养中从第0天开始通过暴露于小分子，诸如ldn、sb、pur、shh、chir以及它们的组合，作为球体生长。然后将所得球体转移到贴壁培养物中作为第二次温育的一部分，任选地在球体解离之后，然后暴露于另外的小分子(例如，ldn、chir、bdnf、gdnf、抗坏血酸、dbcamp、tgfβ3、dapt以及它们的组合)以诱导进一步分化为可植入的定向da神经元祖细胞或da神经元。
[0159]
a.样品和细胞的制备
[0160]
在所提供的方法的实施方案中，多能干细胞分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。可在该方法中使用多能干细胞的各种来源，包括胚胎干(es)细胞和诱导多能干细胞(ipsc)。
[0161]
在一些方面，多能性是指能够产生子代的细胞，该子代能够在适当条件下分化成共同表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞可以有助于产前、产后或成体生物体的组织。标准的本领域接受的测试，诸如在8-12周龄scid小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于建立细胞群体的多能性。然而，各种多能干细胞特征的鉴定也可用于鉴定多能细胞。在一些方面，多能干细胞可以通过特定特征与其它细胞区分开来，包括通过表达或不表达某些分子标记物的组合。更具体地，人多能干细胞可以表达来自以下非限制性列表的标记物中的至少一些，任选地全部：ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、tra-2-49/6e、alp、sox2、e-钙粘蛋白、utf-1、oct4、lin28、rex1和nanog。在一些方面，多能干细胞特征是与多能干细胞相关的细胞形态。
[0162]
在一些实施方案中，多能干细胞是从非多能细胞人工获得的诱导多能干细胞(ipsc)。在某些方面，非多能细胞是自我更新和分化潜能低于多能干细胞的细胞。ipsc可以通过称为重编程的过程生成，其中通过将非多能细胞工程改造成表达诸如oct4、sox2和klf4等基因，使非多能细胞有效地“去分化”成胚胎干细胞样状态。takahashi和yamanaka cell(2006)126:663-76。
[0163]
生成ipsc的方法是已知的。例如，2006年(takahashi和yamanaka)报告了小鼠ipsc，且2007年末(takahashi等人和yu等人)报告了人ipsc。小鼠ipsc展示出多能干细胞的重要特征，包括干细胞标记物的表达、含有来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的形成，以及当在发育的极早期阶段注射到小鼠胚胎中时促成许多不同组织的能力。人ipsc也表达干细胞标记物并且能够产生所有三个胚层的细胞特征。
[0164]
在一些实施方案中，psc(例如ipsc)对于待治疗的受试者是自体的，即psc源自施用分化细胞的同一受试者。在一些实施方案中，源自患有帕金森病(pd)的患者的非多能细胞(例如，成纤维细胞)在分化成神经细胞和/或神经元细胞之前经重编程成为ipsc。在一些实施方案中，通过用克隆到质粒中中的基因(oct4、sox2、nanog、lin28和klf4)转化成纤维
细胞，可将成纤维细胞重编程为ipsc(例如，参见，yu等人，science doi:10.1126/science.1172482)。在一些实施方案中，源自患有pd的患者的非多能成纤维细胞在分化成定向da神经元祖细胞和/或da神经元之前重编程成为ipsc，诸如通过使用非整合仙台病毒对细胞进行重编程(例如，使用cts
tm
cytotune
tm-ips 2.1仙台重编程试剂盒)。在一些实施方案中，然后在自体干细胞移植中将所得的分化细胞施用给从中获得它们的患者。在一些实施方案中，psc(例如，ipsc)对于待治疗的受试者是同种异体的，即psc源自与将要施用分化细胞的受试者不同的个体。在一些实施方案中，源自另一个体(例如未患神经退行性病症诸如帕金森病的个体)的非多能细胞(例如，成纤维细胞)在分化成定向da神经元祖细胞和/或da神经元之前，经重编程成为ipsc。在一些实施方案中，通过使用非整合仙台病毒对细胞进行重编程(例如，使用cts
tm
cytotune
tm-ips 2.1仙台重编程试剂盒)，至少部分实现了重编程。在一些实施方案中，然后将所得的分化细胞施用给不是从中获得分化细胞的同一个体的个体(例如同种异体细胞疗法或同种异体细胞移植)。
[0165]
在提供的任何实施方案中，本文所述的psc(例如同种异体细胞)可以进行遗传工程改造为低免疫原性的。降低免疫原性的方法是已知的，并且包括消除多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子表达并将免疫调节因子pd-l1、hla-g和cd47引入分化细胞中的aavs1安全港基因座中。han等人，pnas(2019)116(21):10441-46。因此，在一些实施方案中，本文所述的psc经工程改造以使高度多态的hla-a/-b/-c基因缺失并将免疫调节因子，诸如pd-l1、hla-g和/或cd47引入aavs1安全港基因座中。
[0166]
在一些实施方案中，在不存在饲养细胞的情况下培养psc(例如，ipsc)，直到它们达到80-90％融合，此时将它们收获并进一步培养进行分化(第0天)。在本文所述的方法的一个方面，一旦ipsc达到80-90％融合，就将它们在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤并进行酶促解离，诸如用accutase
tm
进行酶促解离，直到细胞容易从培养器皿的表面移去。然后将解离的ipsc重悬于培养基中，用于下游分化成定向da神经元祖细胞和/或da神经元。
[0167]
在一些实施方案中，psc重悬于基础诱导培养基中。在一些实施方案中，基础诱导培养基配制成含有1:1比率的neurobasal
tm
培养基和dmem/f12培养基，补充有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)、glutamax
tm
、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胰岛素。在一些实施方案中，基础诱导培养基进一步补充有血清替代物、rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂和各种小分子，用于分化。在一些实施方案中，将psc重悬浮在与将在其中培养它们的相同的培养基中，用于第一次温育的至少一部分。
[0168]
b.非贴壁培养
[0169]
所提供的方法包括通过与某些分子(例如小分子)一起温育来培养psc(例如ipsc)以诱导它们分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。具体而言，所提供的实施方案包括在某些分子(例如小分子)的存在下，在非贴壁条件下第一次温育psc以产生球体，在一些方面中所述分子可以提高产生用于植入的生理相关细胞的一致性。在一些实施方案中，所述方法包括进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；
[0170]
在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是具有低或超低附着表面，诸如以抑制或减少细胞附着的培养器皿。在一些实施方案中，在非贴壁培养器皿中培养细胞不会防止培养物中的所有细胞附着于培养器皿的表面。
[0171]
在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是具有超低附着表面的培养器皿。在一些方面，超低附着表面可在一段时间内抑制细胞附着。在一些实施方案中，超低附着表面可在获得与贴壁表面上相同细胞类型的融合生长所必需的时间段内抑制细胞附着。在一些实施方案中，超低附着表面用防止细胞附着的物质，诸如水凝胶层(例如，中性带电荷的水凝胶层和/或亲水性水凝胶层)涂覆或处理。在一些实施方案中，非贴壁培养器皿在第一次温育之前，用表面活性剂涂覆或处理。在一些实施方案中，所述表面活性剂是普朗尼克酸。
[0172]
在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是板、培养皿、烧瓶或生物反应器。在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是板，诸如多孔板。在一些实施方案中，非贴壁培养器皿是6孔板或24孔板。在一些实施方案中，多孔板的孔还包括微孔。在所提供的一些任何实施方案中，非贴壁培养器皿，诸如多孔板，具有圆形或凹面孔和/或微孔。在所提供的任何实施方案中，非贴壁培养器皿，诸如多孔板，没有拐角或接缝。
[0173]
在一些实施方案中，非贴壁培养器皿允许细胞聚集体的三维形成。在一些实施方案中，ipsc在非贴壁培养器皿，诸如多孔板中培养，以产生细胞聚集体(例如，球体)。在一些实施方案中，在该方法的约第7天ipsc在非贴壁培养器皿，诸如多孔板中培养，以产生细胞聚集体(例如，球体)。在一些实施方案中，在该方法的约第7天或之前细胞聚集体(例如，球体)表达pax6和otx2中的至少一种。
[0174]
在一些实施方案中，第一次温育包括在产生细胞球体的条件下在非贴壁培养器皿中培养多能干细胞。
[0175]
在一些实施方案中，该方法第0天平板接种的psc的数目为约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，在底物涂覆的培养器皿上平板接种的细胞数目为约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。
[0176]
在一些实施方案中，在该方法第0天平板接种的psc的数目为约1
×
105个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、
约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔或约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。
[0177]
在一些实施方案中，在该方法第0天在6孔板中平板接种的psc的数目为约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔或约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。
[0178]
在一些实施方案中，在该方法第0天在24孔板中平板接种的psc的数目为约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔或约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。
[0179]
在一些天中，在该方法第0天平板接种的psc的数目是足以产生含有约1,000至约5,000个细胞，或约2,000至约3,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些天中，在该方法第0天平板接种的psc的数目是足以产生含有约1,000至约5,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些天中，在该方法第0天平板接种的psc的数目是足以产生含有约2,000至约3,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些天中，在该方法第0天平板接种的psc的数目是足以产生含有约2,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些天中，在该方法第0天平板接种的psc的数目是足以产生含有约3,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些实施方案中，含有所需数目的球体通过该方法在约第7天或之前产生。
[0180]
在本文提供的方法的一些实施方案中，第一次温育包括在产生细胞球体的条件下在非贴壁培养器皿中培养多能干细胞。在一些实施方案中，第一次温育是从约第0天到约第6天。在一些实施方案中，第一次温育包括在培养基(“介质”)中培养多能干细胞。在一些实施方案中，第一次温育包括从约第0天到约第6天在培养基中培养多能干细胞。在一些实施方案中，第一次温育包括在培养基中培养多能干细胞，以诱导psc分化为中脑底板祖细胞。
[0181]
在一些实施方案中，培养基还补充有血清替代物，该血清替代物含有最少的非人类来源的组分(例如，knockout
tm
血清替代物)。在一些实施方案中，在第一次温育的至少一
部分中，在培养基中提供5％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第0天和第1天，在培养基中提供5％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第一次温育的至少一部分中，在培养基中提供2％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，从第2天到第6天，在培养基中提供2％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第0天和第1天，在培养基中提供5％(v/v)的血清替代物并且从第2天到第6天，提供2％(v/v)的血清替代物。
[0182]
在一些实施方案中，培养基还补充有小分子，诸如以上所述的任何小分子。在一些实施方案中，小分子选自由以下项组成的组：rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂、tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂、至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂、糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂以及它们的组合。
[0183]
在一些实施方案中，在细胞传代时的一天或多天，培养基补充rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，在细胞传代的每一天，培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第0天培养基补充rock抑制剂。
[0184]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的rock抑制剂。
[0185]
在一些实施方案中，rock抑制剂选自由以下项组成的组：法舒地尔(fasudil)、利帕舒地尔(ripasudil)、奈他地尔(netarsudil)、rki-1447、y-27632、gsk429286a、y-30141以及它们的组合。在一些实施方案中，rock抑制剂是小分子。在一些实施方案中，rock抑制剂选择性抑制p160rock。在一些实施方案中，rock抑制剂是y-27632，具有下式：
[0186][0187]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第0天暴露于浓度为约10μm的y-27632。
[0188]
在一些实施方案中，培养基补充有tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基补充有tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂，直至约第7天(例如第6天或第7天)。在一些实施方案中，从约第0天到第6天，包括每一天，培养基补充tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。
[0189]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂。
[0190]
在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂能够降低或阻断转化生长因子β(tgfβ)/激活素nodal
信号传导。在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂抑制alk4、alk5、alk7或它们的组合。在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂抑制alk4、alk5和alk7。在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂不抑制alk2、alk3、alk6或它们的组合。在一些实施方案中，抑制剂不抑制alk2、alk3或alk6。在一些实施方案中，tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂是sb431542(例如，cas 301836-41-9，分子式为c22h18n4o3且名称为4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺)，具有下式：
[0191][0192]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的sb431542。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的sb431542，直至约第7天。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于浓度为约10μm的sb431542。
[0193]
在一些实施方案中，培养基补充有至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂。shh是指作为哺乳动物信号途径家族中至少三种蛋白质之一的蛋白质，称为刺猬因子，另一种是沙漠刺猬因子(dhh)，而第三种是印度刺猬因子(ihh)。shh通过与跨膜分子patched(ptc)和smoothened(smo)相互作用，与至少两种跨膜蛋白相互作用。在一些实施方案中，培养基补充至少一种shh信号传导激活剂，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，从约第0天到第6天，包括每一天，培养基补充至少一种shh信号传导激活剂。
[0194]
在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是shh蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是重组shh蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是重组小鼠shh蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是重组人shh蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是能够与shh受体结合以激活shh的全长鼠类音猬因子蛋白的重组n端片段。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是c25ii shh蛋白。
[0195]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10ng/ml至约500ng/ml、约20ng/ml至400μg/ml、约30ng/ml至约300ng/ml、约40ng/ml至约200ng/ml或约50ng/ml至约100ng/ml(包括每个端值在内)的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约50ng/ml至约100ng/ml(包括每个端值在内)的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约100ng/ml的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于约100ng/ml的shh蛋白。在一些实施方案中，细胞暴露于约100ng/ml的重组shh蛋白。在一些实施方案中，细胞暴露于约100ng/ml的重组小鼠shh蛋白。在一些实施方案中，细胞暴露于约100ng/ml的c25ii shh蛋白。
[0196]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10ng/ml的重组shh蛋白。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10ng/ml的重组shh蛋白，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于浓度为约10ng/ml的重组shh蛋白。
[0197]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm
至约20μm的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的所述至少一种shh信号传导激活剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的所述至少一种shh信号传导激活剂。
[0198]
在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是刺猬因子受体平smoothened的激活剂。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是小分子。在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是嘌吗啡胺(例如cas 483367-10-8)，具有下式：
[0199][0200]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的嘌吗啡胺。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的嘌吗啡胺，直至第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于浓度为约10μm的嘌吗啡胺。
[0201]
在一些实施方案中，所述至少一种shh信号传导激活剂是shh蛋白和嘌吗啡胺。在一些实施方案中，细胞暴露于一定浓度的shh蛋白和嘌吗啡胺直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于shh蛋白和嘌吗啡胺。在一些实施方案中，细胞暴露于一定浓度的100ng/ml shh蛋白和10μm嘌吗啡胺，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于100ng/ml shh蛋白和10μm嘌吗啡胺。
[0202]
在一些实施方案中，培养基补充有bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基补充有bmp信号传导抑制剂，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，从约第0天到第6天，包括每一天，培养基补充bmp信号传导抑制剂。
[0203]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.01μm至约5μm、约0.05μm至约1μm或约0.1μm至约0.5μm(包括每个端值在内)的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.01μm至约5μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.05μ
□
至约1μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约0.5μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm的bmp信号传导抑制剂。
[0204]
在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂选自ldn193189或k02288。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂能够抑制“小母体对抗果蝇皮肤生长因子(small mothers against decapentaplegic)”smad信号传导。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制alk1、alk2、alk3、alk6或它们的组合。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制alk1、alk2、alk3和alk6。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制bmp2、bmp4、bmp6、bmp7和激活素细胞因子信号，并随后抑制smad1、smad5和smad8的smad磷酸化。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是
ldn193189。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是ldn193189(例如，iupac名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为c25h22n6)，具有下式：
[0205][0206]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189。
[0207]
在一些实施方案中，培养基补充有gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基补充有gsk3β信号传导抑制剂，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施方案中，从约第0天到第6天，包括每一天，培养基补充gsk3β信号传导抑制剂。
[0208]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约10μm、约0.5μm至约8μm或约1μm至约4μm或约2μm至约3μm(包括每个端值在内)的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约10μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.5μ
□
至约8μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约4μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2μm至约3μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2μm的gsk3β信号传导抑制剂。
[0209]
在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂选自由以下项组成的组：锂离子、丙戊酸、碘代杀结核菌素、萘普生(naproxen)、法莫替丁(famotidine)、姜黄素(curcumin)、奥氮平(olanzapine)、chir99012以及它们的组合。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂抑制糖原合酶激酶3β酶。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂抑制gsk3α。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂调节tgf-β和mapk信号传导。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是无翼/整合(wnt)信号传导激动剂。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂针对人gsk3β的ic50＝6.7nm。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是chir99021(例如，“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚酮”或iupac名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈)，具有下式：
[0210][0211]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2.0μm的chir99021。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2.0μm的chir99021，直至约第7天(例如，第6天或第7天)。在一些实施
方案中，细胞从约第0天到约第6天，包括每一天，暴露于浓度为约2.0μm的chir99021。
[0212]
在一些实施方案中，从约第2天到约第6天，每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，从约第2天到约第6天，每天、每隔一天或每三天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，从约第2天到约第6天，每天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，在第1天更换培养基的至少约75％。在一些实施方案中，在第1天更换培养基的约100％。在一些实施方案中，与第0天培养基中小分子的浓度相比，替代培养基含有约两倍浓缩的小分子。
[0213]
在一些实施方案中，第一次温育包括在“基础诱导培养基”中培养多能干细胞在一些实施方案中，第一次温育包括从约第0天到约第6天在基础诱导培养基中培养多能干细胞。在一些实施方案中，第一次温育包括在基础诱导培养基中培养多能干细胞，以诱导psc分化为中脑底板祖细胞。
[0214]
在一些实施方案中，基础诱导培养基配制成含有1:1比率的neurobasal
tm
培养基和dmem/f12培养基，补充有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)、glutamax
tm
、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胰岛素。在一些实施方案中，基础诱导培养基还补充有上述任何小分子。
[0215]
c.球体的转移或解离
[0216]
在一些实施方案中，在底物上进行细胞的第二次温育(贴壁培养)之前，转移或解离在非贴壁培养器皿中培养多能干细胞的第一次温育后产生的细胞聚集体(例如球体)。
[0217]
在一些实施方案中，进行第一次温育以产生表达pax6和otx2中的至少一者的细胞聚集体(例如球体)。在一些实施方案中，第一次温育产生表达pax6和otx2的细胞聚集体(例如球体)。在一些实施方案中，在本文提供的方法的约第7天或之前，第一次温育产生细胞聚集体(例如球体)。在一些实施方案中，在本文提供的方法的约第7天或之前，第一次温育产生表达pax6和otx2中的至少一者的细胞聚集体(例如球体)。在一些实施方案中，在本文提供的方法的约第7天或之前，第一次温育产生表达pax6和otx2的细胞聚集体(例如球体)。
[0218]
在一些实施方案中，在底物上第二次温育细胞之前，解离第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)。在一些实施方案中，解离第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)以产生细胞悬浮液。在一些实施方案中，通过解离产生的细胞悬浮液是单细胞悬浮液。在一些实施方案中，当球体细胞表达pax6和otx2中的至少一者时进行解离。在一些实施方案中，当球体细胞表达pax6和otx2时进行解离。在一些实施方案中，解离在约第7天进行。在一些实施方案中，细胞聚集体(例如球体)通过酶促解离而解离。在一些实施方案中，该酶选自由以下项组成的组：accutase、分散酶、胶原酶以及它们的组合。在一些实施方案中，该酶包括accutase。在一些实施方案中，该酶是accutase。在一些实施方案中，该酶是分散酶。在一些实施方案中，该酶是胶原酶。
[0219]
在一些实施方案中，将细胞聚集体或由其产生的细胞悬液转移到底物涂覆的培养器皿中进行第二次温育。在一些实施方案中，将细胞聚集体或由其产生的细胞悬液在细胞聚集体(例如球体)解离后转移到底物涂覆的培养器皿中。在一些实施方案中，在解离之后立即进行转移。在一些实施方案中，转移在约第7天进行。
[0220]
在一些实施方案中，细胞聚集体(例如，球体)在第二次温育之前不解离。在一些实施方案中，将细胞聚集体(例如球体)整体转移到底物涂覆的培养器皿中进行第二次温育。在一些实施方案中，当球体细胞表达pax6和otx2中的至少一者时进行转移。在一些实施方案中，当球体细胞表达pax6和otx2时进行转移。在一些实施方案中，转移在约第7天进行。
[0221]
在一些实施方案中，转移到贴壁培养器皿。在一些实施方案中，该培养器皿是板、培养皿、烧瓶或生物反应器。在一些实施方案中，该培养器皿经底物涂覆。在一些实施方案中，该底物是基底膜蛋白。在一些实施方案中，该底物选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合。在一些实施方案中，该底物是层粘连蛋白。在一些实施方案中，该底物是重组的。在一些实施方案中，该底物是重组层粘连蛋白。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿在用于培养细胞之前，暴露于聚-l-鸟氨酸。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是6孔板或24孔板。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是6孔板。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是24孔板。
[0222]
d.贴壁培养
[0223]
在一些实施方案中，所述方法包括对转移至底物涂覆的培养器皿中的球体细胞进行第二次温育。在一些实施方案中，在底物涂覆的培养器皿中在贴壁条件下培养球体的细胞会诱导它们分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。
[0224]
在一些实施方案中，第二次温育包括在涂覆有包括层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合的底物的培养器皿中培养球体的细胞，其中从第7天开始，将细胞暴露于(i)bmp信号传导抑制剂和(ii)gsk3β信号传导抑制剂；并且从第11天开始，将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)；和(vi)notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，该方法还包括收获分化细胞。
[0225]
在一些实施方案中，底物涂覆的培养器皿是具有细胞可以附着的表面的培养器皿。在一些实施方案中，底物涂覆的培养器皿是具有大量细胞附着的表面的培养器皿。在一些实施方案中，该底物是基底膜蛋白。在一些实施方案中，该底物是层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖或它们的组合。在一些实施方案中，该底物是层粘连蛋白。在一些实施方案中，该底物是胶原。在一些实施方案中，该底物是巢蛋白。在一些实施方案中，该底物是硫酸肝素蛋白聚糖。在一些实施方案中，该底物是重组蛋白。在一些实施方案中，该底物是重组层粘连蛋白。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿暴露于聚-l-鸟氨酸。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿在用于细胞培养之前，暴露于聚-l-鸟氨酸。
[0226]
在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是板、培养皿、烧瓶或生物反应器。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是板，诸如多孔板。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是板。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是6孔板或24孔板。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是培养皿。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是烧瓶。在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿是生物反应器。
[0227]
在一些实施方案中，该底物涂覆的培养器皿允许单层细胞培养。在一些实施方案中，将源自第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)的细胞在底物涂覆的板上以单层培养的形式进行培养。在一些实施方案中，培养源自第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)的细胞，以产生对于lmx1a、foxa2、en1、corin以及它们的组合中的一种或多种而言为阳性的单层细胞培养物。在一些实施方案中，培养源自第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)的细胞，以产生单层细胞培养物，其中至少一些细胞对于en1和corin而言为阳性。在一些实施方案中，培养源自第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)的细胞，以产生单层细
胞培养物，其中至少一些细胞是th 。在一些实施方案中，至少一些细胞在约第25天之前或在约第25天时是th 。在一些实施方案中，培养源自第一次温育产生的细胞聚集体(例如球体)的细胞，以产生单层细胞培养物，其中至少一些细胞是th foxa2 。在一些实施方案中，至少一些细胞在约第25天之前或在约第25天时是th foxa2 。
[0228]
在本文提供的方法中，第二次温育包括在底物涂覆的培养器皿中在诱导细胞神经分化的条件下，培养球体的细胞。在一些实施方案中，在约第7天，将球体的细胞平板接种在底物涂覆的培养器皿上。
[0229]
在一些实施方案中，在底物涂覆的培养器皿上平板接种的细胞数目为约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。在一些实施方案中，在底物涂覆的培养器皿上平板接种的细胞数目为约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。
[0230]
在一些实施方案中，第二次温育从约第7天开始，直到收获细胞。在一些实施方案中，在约第16天或之后收获细胞。在一些实施方案中，在约第16天至约第30天之间收获细胞。在一些实施方案中，在约第18天至约第25天之间收获细胞。在一些实施方案中，在约第18天收获细胞。在一些实施方案中，在约第25天收获细胞。在一些实施方案中，第二次温育是从约第7天直到约第18天。在一些实施方案中，第二次温育是从约第7天直到约第25天。
[0231]
在一些实施方案中，第二次温育包括在培养基(“介质”)中培养源自细胞聚集体(例如球体)的细胞。
[0232]
在一些实施方案中，第二次温育包括从约第7天开始在培养基中培养细胞，直到收获或收集。在一些实施方案中，在培养基中培养细胞以产生定向多巴胺(da)神经元祖细胞或多巴胺(da)神经元。
[0233]
在一些实施方案中，培养基还补充有血清替代物，该血清替代物含有最少的非人类来源的组分(例如，knockout
tm
血清替代物)。在一些实施方案中，从约第7天到约第10天，培养基补充血清替代物。在一些实施方案中，培养基补充约2％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，从约第7天到约第10天，培养基补充约2％(v/v)的血清替代物。
[0234]
在一些实施方案中，培养基还补充有小分子。在一些实施方案中，小分子选自由以下项组成的组：rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂、糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂以及它们的组合。
[0235]
在一些实施方案中，在细胞传代时的一天或多天，培养基补充rho相关蛋白激酶
(rock)抑制剂。在一些实施方案中，在细胞传代的每一天，培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第7天、第16天、第20天或它们的组合时培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第7天培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第16天培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第20天培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第7天和第16天培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第16天和第20天培养基补充rock抑制剂。在一些实施方案中，在第7天、第16天和第20天培养基补充rock抑制剂。
[0236]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的rock抑制剂。
[0237]
在一些实施方案中，rock抑制剂是法舒地尔、利帕舒地尔、奈他地尔、rki-1447、y-27632、gsk429286a、y-30141或它们的组合。在一些实施方案中，rock抑制剂是小分子。在一些实施方案中，rock抑制剂选择性抑制p160rock。在一些实施方案中，rock抑制剂是y-27632，具有下式：
[0238][0239]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第7天、第16天、第20天或它们的组合时暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第7天暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第16天暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第20天暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第7天和第16天暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第16天和第20天暴露于浓度为约10μm的y-27632。在一些实施方案中，细胞在第7天、第16天和第20天暴露于浓度为约10μm的y-27632。
[0240]
在一些实施方案中，培养基补充有bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第7天开始补充有bmp信号传导抑制剂，直至约第11天(例如，第10天或第11天)。在一些实施方案中，从约第7天到第10天，包括每一天，培养基补充bmp信号传导抑制剂。
[0241]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.01μm至约5μm、约0.05μm至约1μm或约0.1μm至约0.5μm(包括每个端值在内)的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.01μm至约5μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.05μm至约1μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约0.5μm的bmp信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm的bmp信号传导抑制剂。
[0242]
在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是ldn193189或k02288。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂能够抑制“小母体对抗果蝇皮肤生长因子”smad信号传导。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制alk1、alk2、alk3、alk6或它们的组合。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制alk1、alk2、alk3和alk6。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂抑制bmp2、bmp4、bmp6、
bmp7和激活素细胞因子信号，并随后抑制smad1、smad5和smad8的smad磷酸化。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是ldn193189。在一些实施方案中，该bmp信号传导抑制剂是ldn193189(例如，iupac名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为c25h22n6)，具有下式：
[0243][0244]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189。在一些实施方案中，细胞从约第7天开始暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189，直至约第11天(例如，第10天或第11天)。在一些实施方案中，细胞从约第7天到约第10天，包括每一天，暴露于浓度为约0.1μm的ldn193189。
[0245]
在一些实施方案中，培养基补充有gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第7天开始补充有gsk3β信号传导抑制剂，直至约第13天(例如，第12天或第13天)。在一些实施方案中，从约第7天到第12天，包括每一天，培养基补充gsk3β信号传导抑制剂。
[0246]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约10μm、约0.5μm至约8μm或约1μm至约4μm或约2μ
□
至约3μm(包括每个端值在内)的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1μm至约10μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.5μ
□
至约8μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约4μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2μm至约3μm的gsk3β信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2μm的gsk3β信号传导抑制剂。
[0247]
在一些实施方案中，gsk3β信号传导抑制剂选自锂离子、丙戊酸、碘代杀结核菌素、萘普生、法莫替丁、姜黄素、奥氮平、chir99012或它们的组合。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂抑制糖原合酶激酶3β酶。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂抑制gsk3α。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂调节tgf-β和mapk信号传导。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是无翼/整合(wnt)信号传导激动剂。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂针对人gsk3β的ic50＝6.7nm。在一些实施方案中，该gsk3β信号传导抑制剂是chir99021(例如，“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚酮”或iupac名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1h-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈)，具有下式：
[0248]
[0249]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约2.0μm的chir99021。在一些实施方案中，细胞从约第7天开始暴露于浓度为约2.0μm的chir99021，直至约第13天(例如，第12天或第13天)。在一些实施方案中，细胞从约第7天到约第12天，包括每一天，暴露于浓度为约2.0μm的chir99021。
[0250]
在一些实施方案中，培养基补充有脑源性神经营养因子(bdnf)。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充bdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充bdnf，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充bdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充bdnf。
[0251]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1ng/ml至100ng/ml、约5ng/ml至约50ng/ml、约10ng/ml至约30ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10ng/ml至约30ng/ml的bdnf。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约20ng/ml的bdnf。
[0252]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充20ng/ml bdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充20ng/ml bdnf，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约20ng/ml bdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约20ng/ml bdnf。
[0253]
在一些实施方案中，培养基补充有胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充gdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充gdnf，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充gdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充gdnf。
[0254]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约50ng/ml、约10ng/ml至约30ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10ng/ml至约30ng/ml的gdnf。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约20ng/ml的gdnf。
[0255]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充20ng/ml gdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充20ng/ml gdnf，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约20ng/ml gdnf。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约20ng/ml gdnf。
[0256]
在一些实施方案中，培养基补充有抗坏血酸。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充抗坏血酸。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充抗坏血酸，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充抗坏血酸。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充抗坏血酸。
[0257]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约1mm、约0.2mm至约0.5mm(包括每个端值在内)的抗坏血酸。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm(包括每个端值在内)的抗坏血酸。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1mm至约1mm(包括每个端值在内)的抗坏血酸。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.2mm的抗坏血酸。
[0258]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充约0.2mm抗坏血酸。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充0.2mm抗坏血酸，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约0.2mm抗坏血酸。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约0.2mm抗坏血酸。
[0259]
在一些实施方案中，培养基补充有二丁酰环amp(dbcamp)。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充dbcamp。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充dbcamp，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充dbcamp。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充dbcamp。
[0260]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约3mm、约0.2mm至约1mm(包括每个端值在内)的dbcamp。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1mm至约3mm(包括每个端值在内)的dbcamp。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.2mm至约1mm(包括每个端值在内)的dbcamp。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.5mm的dbcamp。
[0261]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充约0.5mm dbcamp。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充0.5mm dbcamp，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约0.5mm dbcamp。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约0.5mm dbcamp。
[0262]
在一些实施方案中，培养基补充有转化生长因子β3(tgfβ3)。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充tgfβ3。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充tgfβ3，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充tgfβ3。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充tgfβ3。
[0263]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1ng/ml至10ng/ml、约0.5ng/ml至约5ng/ml或约1.0ng/ml至约2.0ng/ml的tgfβ3。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1.0ng/ml至约2.0ng/ml(包括每个端值在内)的tgfβ3。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1ng/ml的tgfβ3。
[0264]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充约1ng/ml tgfβ3。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充1ng/ml tgfβ3，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约1ng/ml tgfβ3。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约1ng/ml tgfβ3。
[0265]
在一些实施方案中，培养基补充有notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充notch信号传导抑制剂，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充notch信号传导抑制剂。
[0266]
在一些实施方案中，notch信号传导抑制剂选自cowanin、pf-03084014、l685458、ly3039478、dapt或它们的组合。在一些实施方案中，notch信号传导抑制剂抑制γ分泌酶。在一些实施方案中，notch信号传导抑制剂是小分子。在一些实施方案中，notch信号传导抑制剂是dapt，具有下式：
[0267]
[0268]
在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm的dapt。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm的dapt。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5μm至约15μm的dapt。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约8μm至约12μm的dapt。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约10μm的dapt。
[0269]
在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充约10μm dapt。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充10μm dapt，直到收获或收集。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第18天补充约10μm dapt。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充约10μm dapt。
[0270]
在一些实施方案中，从约第11天开始，培养基补充约20ng/ml bdnf、约20ng/ml gdnf、约0.2mm抗坏血酸、约0.5mm dbcamp、约1ng/ml tgfβ3和约10μm dapt。在一些实施方案中，从约第11天开始直到收获或收集，培养基补充约20ng/ml bdnf、约20ng/ml gdnf、约0.2mm抗坏血酸、约0.5mm dbcamp、约1ng/ml tgfβ3和约10μm dapt。在一些实施方案中，从约第11天到第18天，培养基补充约20ng/ml bdnf、约20ng/ml gdnf、约0.2mm抗坏血酸、约0.5mm dbcamp、约1ng/ml tgfβ3和约10μm dapt。在一些实施方案中，从约第11天到第25天，培养基补充约20ng/ml bdnf、约20ng/ml gdnf、约0.2mm抗坏血酸、约0.5mm dbcamp、约1ng/ml tgfβ3和约10μm dapt。
[0271]
在一些实施方案中，从约第7天到约第10天，在培养基中提供血清替代物。在一些实施方案中，在第7天到第10天，在培养基中提供2％(v/v)的血清替代物。
[0272]
在一些实施方案中，从约第7天到约第16天，每天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，从约第7天到约第16天，每天、每隔一天或每三天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，从约第7天到约第16天，每天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，从约第17天开始，每天、每隔一天或每三天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，从约第17天开始，每隔一天更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，从约第17天开始，每天、每隔一天或每三天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，从约第17天开始，每隔一天更换培养基的约50％。在一些实施方案中，与第0天培养基中小分子的浓度相比，替代培养基含有约两倍浓缩的小分子。
[0273]
在一些实施方案中，第二次温育包括在“基础诱导培养基”中培养源自细胞聚集体(例如球体)的细胞。在一些实施方案中，第二次温育包括在“成熟培养基”中培养源自细胞聚集体(例如球体)的细胞。在一些实施方案中，第二次温育包括在基础诱导培养基中，然后在成熟培养基中培养源自细胞聚集体(例如球体)的细胞。
[0274]
在一些实施方案中，第二次温育包括从约第7天到约第10天在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，第二次温育包括从约第11天开始在成熟培养基中培养细胞。在一些实施方案中，第二次温育包括从约第7天到约第10天在基础诱导培养基中培养细胞，然后从约第11天开始在成熟培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在成熟培养基中培养细胞以产生定向多巴胺(da)神经元祖细胞或多巴胺(da)神经元。
[0275]
在一些实施方案中，基础诱导培养基配制成含有1:1比率的neurobasal
tm
培养基和dmem/f12培养基，补充有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)、glutamax
tm
、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胰岛素。在一些实施方案中，基础诱导培养基还补充有第ii部分中描述的任何分子。
[0276]
在一些实施方案中，成熟培养基配制成含有补充有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)和glutamax
tm
的neurobasal
tm
培养基。在一些实施方案中，成熟培养基还补充有第ii部分中描述的任何分子。
[0277]
在一些实施方案中，从约第7天到约第11天(例如，第10天或第11天)在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，从约第7天到第10天，包括每一天，在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，从约第11天开始，在成熟培养基中培养细胞。在一些实施方案中，从约第7天到约第10天在基础诱导培养基中培养细胞，然后从约第11天开始在成熟培养基中培养细胞。在一些实施方案中，从约第11天开始在成熟培养基中培养细胞，直到收获或收集细胞。在一些实施方案中，在第16天至第27天之间收获细胞。在一些实施方案中，在第18天至第25天之间收获细胞。在一些实施方案中，在第18天收获细胞。在一些实施方案中，在第25天收获细胞。
[0278]
e.收获、收集和配制分化细胞
[0279]
在所提供的方法的实施方案中，可以收获或收集通过本文提供的方法产生的中性分化细胞，诸如用于配制和使用细胞。在一些实施方案中，所提供的用于产生分化细胞，诸如在神经退行性疾病治疗中用作细胞疗法的方法，可包括配制细胞，诸如配制由本文所述的所提供的方法产生的分化细胞。在一些实施方案中，包含分化细胞(例如定向da神经元祖细胞或da神经元)的细胞剂量作为组合物或配制物，诸如药物组合物或配制物提供。此类组合物可根据所提供的方法使用，诸如用于预防或治疗神经退行性病症，包括帕金森病。
[0280]
在一些情况下，在一个或多个步骤中处理细胞，以制造、生成或产生细胞疗法和/或分化细胞可以包括细胞配制物，诸如由所述方法产生的分化细胞的配制物。在一些情况下，可以按用于剂量施用，诸如用于单个单位剂量施用或多剂量施用的量配制细胞。
[0281]
在某些实施方案中，配制分化细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在产生一种或多种组合物后，配制分化细胞的一种或多种组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种组合物先前已经低温保存和储存，并在施用前解冻。
[0282]
在某些实施方案中，分化细胞包括定向da神经元祖细胞。在一些实施方案中，分化细胞的配制组合物是富含定向da神经元祖细胞的组合物。在某些实施方案中，分化细胞包括da神经元。在一些实施方案中，分化细胞的配制组合物是富含da神经元的组合物。
[0283]
在某些实施方案中，细胞培养最短或最长的持续时间或时间量。在某些实施方案中，细胞培养最短的持续时间或时间量。在某些实施方案中，细胞培养最长的持续时间或时间量。在一些实施方案中，细胞分化至少16天。在一些实施方案中，细胞分化16天至30天。在一些实施方案中，细胞分化16天至27天。在一些实施方案中，细胞分化18天至25天。在一些实施方案中，细胞分化约18天。在一些实施方案中，细胞分化约25天。
[0284]
在某些实施方案中，细胞培养最短或最长的持续时间或时间量。在某些实施方案中，细胞培养最短的持续时间或时间量。在某些实施方案中，细胞培养最长的持续时间或时间量。在一些实施方案中，在培养至少16天后收获细胞。在一些实施方案中，在培养16天至30天之间收获细胞。在一些实施方案中，在培养16天至27天之间收获细胞。在一些实施方案中，在培养18天至25天之间收获细胞。在一些实施方案中，在培养约18天后收获细胞。在一些实施方案中，在培养约25天后收获细胞。
[0285]
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，在一些方面，该缓冲
液可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述加工包括将介质更换为药学上可接受的或期望施用于受试者的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，加工步骤可以包括洗涤分化细胞以更换药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式的示例，包括药学上可接受的载体或赋形剂，可以是下面连同可接受用于将细胞和组合物施用于受试者的形式描述的任何药物形式。在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防神经退行性病状或疾病(例如帕金森病)的量，诸如治疗有效量或预防有效量的细胞。
[0286]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0287]
在一些方面，载体的选择部分由特定细胞和/或施用方法决定。因此，存在多种合适的配制物。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体例如由remington’s pharmaceutical sciences第16版，osol,a.ed.(1980)进行描述。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(peg)。
[0288]
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面，使用两种或多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性的方法在例如remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；第21版(2005年5月1日)中有更详细地描述。
[0289]
所述配制物可以包括水溶液。该配制物或组合物还可以含有一种以上可用于用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病状的活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些活性成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量呈组合存在。因此，在一些实施方案中，该药物组合物还包含其它药物活性剂或药物，诸如卡比多巴-左旋多巴(例如，左旋多巴)、多巴胺激动剂(例如，普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)和阿扑吗啡(apomorphine))、mao b抑制剂(例如，司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)和沙芬酰胺(safinamide))、儿茶酚o-甲基转移酶(comt)抑制剂(例如，恩他卡朋(entacapone)和托卡朋(tolcapone))、抗胆碱能药(例如，苯托品(benztropine)和苯海索(trihexylphenidyl))、金刚烷胺(amantadine)等。
[0290]
在一些实施方案中组合物以无菌液体制剂，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散
体或粘性组合物的形式提供，在一些方面所述液体制剂可以缓冲至选定的ph。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。无菌注射溶液可通过将细胞掺入溶剂中，诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合来制备。根据施用途径和所需的制剂，组合物可以含有辅助物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂和/或着色剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
[0291]
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。预防微生物作用可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保。可通过使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。
[0292]
在一些实施方案中，配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％dmso溶液，诸如5％至20％dmso溶液或5％至10％dmso溶液的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液是或含有例如含20％dmso和8％人血清白蛋白(hsa)的pbs，或其它合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存溶液是或含有例如至少或约7.5％dmso。在一些实施方案中，加工步骤可以包括洗涤分化细胞以更换低温保存溶液中的细胞。在一些实施方案中，将细胞在终浓度为或约为12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的dmso，或1％至15％、6％至12％、5％至10％或6％至8％的dmso的介质和/或溶液中冷冻，例如低温保存或低温保护。在特定实施方案中，将细胞在最终浓度为或约为5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％hsa或0.1％至-5％、0.25％至4％、0.5％至2％或1％至2％hsa的介质和/或溶液中冷冻，例如低温保存或低温保护。
[0293]
在特定实施方案中，分化细胞的组合物经配制、低温保存，然后储存一段时间。在某些实施方案中，将配制的低温保存的细胞储存到释放细胞用于施用。在特定实施方案中，配制的低温保存的细胞储存1天至6个月、1个月至3个月、1天至14天、1天至7天、3天至6天、6个月至12个月或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温保存并储存约或少于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，储存后将细胞解冻并施用于受试者。
[0294]
在一些实施方案中，使用一个或多个加工步骤进行配制，包括洗涤、稀释或浓缩细胞。在一些实施方案中，所述加工可包括将细胞稀释或浓缩到所需浓度或数目，诸如在给定剂量或其部分中包括施用的细胞数目的单位剂量形式的组合物。在一些实施方案中，加工步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方案中，加工步骤可以包括增大体积，从而根据需要降低细胞浓度。在一些实施方案中，所述加工包括向分化细胞中添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积为约1μl至5000μl，诸如至少或约至少或约或刚好5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、1000μl、2000μl、3000μl、4000μl或5000μl。
[0295]
容器通常可以容纳有待施用的细胞，例如其一个或多个单位剂量。该单位剂量可以是待施用于受试者的细胞的量或数目，或者是待施用的细胞数目的两倍(或更多)。它可以是将要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
[0296]
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用于受试者以治疗神经退行性疾病或病状。
[0297]
f.示例性过程
[0298]
如前所述通过本文所提供的方法，多能干细胞可以分化成谱系特异性细胞群，包括定向da祖细胞和da神经元。然后这些细胞可用于细胞替代疗法。如前所述通过这里的方法，在一些实施方案中，多能干细胞分化成中脑底板祖细胞，并且所得球体细胞进一步分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。在一些实施方案中，多能干细胞分化成定向da神经元祖细胞。在一些实施方案中，多能干细胞分化成da神经元。在一些实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞是诱导多能干细胞。
[0299]
在一些实施方案中，胚胎干细胞分化成中脑底板祖细胞，然后分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。在一些实施方案中，胚胎干细胞分化成定向da神经元祖细胞。在一些实施方案中，胚胎干细胞分化成da神经元。
[0300]
在一些实施方案中，诱导多能干细胞分化成中脑底板祖细胞，然后分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元。在一些实施方案中，诱导多能干细胞分化成定向da神经元祖细胞。在一些实施方案中，诱导多能干细胞分化成da神经元。
[0301]
在一些实施方案中，所述方法包括(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；以及(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在诱导细胞神经分化的条件下培养所述球体的细胞。
[0302]
在一些实施方案中，在诱导细胞神经分化的条件下培养细胞包括将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)；和(vi)notch信号传导抑制剂。
[0303]
在一些实施方案中，所述方法包括(a)进行第一次温育，包括在具有多孔的板中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；和(v)血清替代物；(b)解离球体的细胞以产生细胞悬浮液；(c)将细胞悬浮液的细胞转移到层粘连蛋白涂覆的培养器皿中；(d)进行第二次温育，包括在层粘连蛋白涂覆的培养器皿中在诱导细胞神经分化的条件下培养球体的细胞；并且(e)收获神经分化细胞。在一些实施方案中，第二次温育包括在血清替代物的存在下培养细胞。在一些实施方案中，在诱导细胞神经分化的条件下培养细胞包括将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)；和(vi)notch信号传导抑制剂。
[0304]
在一些实施方案中，细胞从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)暴露于tgf-β/激活nodal抑制剂(例如，sb431542或“sb”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到第6天，包括每一天，暴露于tgf-β/激活nodal抑制剂(例如，sb431542或“sb”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)，暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂(例如，
shh蛋白和嘌吗啡胺，统称为“shh/pur”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到第6天，包括每一天，暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂(例如，shh蛋白和嘌吗啡胺，统称为“shh/pur”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到约第11天(例如，第10天或第11天)暴露于bmp信号传导抑制剂(例如，ldn193189或“ldn”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到第10天，包括每一天，暴露于bmp信号传导抑制剂(例如，ldn193189或“ldn”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到约第13天(例如，第12天或第13天)暴露于gsk3β信号传导抑制剂(例如，chir99021或“chir”)。在一些实施方案中，细胞从第0天到第12天暴露于gsk3β信号传导抑制剂(例如，chir99021或“chir”)。
[0305]
在一些实施方案中，细胞(i)从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)暴露于tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)暴露于至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)从第0天到约第11天(例如，第10天或第11天)暴露于骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)从第0天到约第13天(例如，第12天或第13天)暴露于糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞(i)从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)暴露于sb；(ii)从第0天到约第7天(例如，第6天或第8天)暴露于shh/pur；(iii)从第0天到约第11天(例如第10天或第11天)暴露于ldn；和(iv)从第0天到约第13天(例如第12天或第13天)暴露于chir。在一些实施方案中，细胞(i)从第0天到第6天，包括每一天，暴露于tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)从第0天到第6天，包括每一天，暴露于至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)从第0天到第10天，包括每一天，暴露于骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)从第0天到第12天，包括每一天，暴露于糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞(i)从第0天到第6天，包括每一天，暴露于sb；(ii)从第0天到第6天，包括每一天，暴露于shh/pur；(iii)从第0天到第10天，包括每一天，暴露于ldn；和(iv)从第0天到第12天，包括每一天，暴露于chir。
[0306]
在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于脑源性神经营养因子(bdnf)。在一些实施方案中，细胞暴露于抗坏血酸。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于二丁酰环amp(dbcamp)。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于转化生长因子β-3(tgfβ3)。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于notch信号传导抑制剂(例如，dapt)。在一些实施方案中，从第11天开始，将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)；和(vi)notch信号传导抑制剂(例如，dapt)(统称为“bagct/dapt”)。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于bagct/dapt，直到收获或收集。在一些实施方案中，细胞从第11天到第18天暴露于bagct/dapt。在一些实施方案中，细胞从第11天到第25天暴露于bagct/dapt。
[0307]
在一些实施方案中，细胞在第0天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，细胞在第7天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，细胞在第16天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，细胞在第20天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，细胞在第0天、第7天、第16天和第20天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)抑制剂。在一些实施方案中，在细胞传代的当天，将细胞暴
露于rock抑制剂。在一些实施方案中，细胞在第0天、第7天、第16天、第20天或它们的组合时进行传代。在一些实施方案中，细胞在第0天、第7天、第16天和第20天进行传代。
[0308]
在一些实施方案中，将细胞在包含dmem/f-12和neurobasal培养基(例如，1:1比率)的基础诱导培养基中培养，该基础诱导培养基补充有n2、b27、非必需氨基酸(neaa)、glutamax、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胰岛素。在一些实施方案中，从约第0天到约第10天，在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，基础诱导培养基用于使多能干细胞分化成中脑底板祖细胞。
[0309]
在一些实施方案中，在成熟培养基中培养细胞，该成熟培养基包含neurobasal培养基，补充有n2、b27、非必需氨基酸(neaa)和glutamax。在一些实施方案中，从约第11天开始在基础诱导培养基中培养细胞，直到收获或收集。在一些实施方案中，从约第11天到第18天，在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，成熟培养基用于使中脑底板祖细胞分化成定向多巴胺(da)神经元祖细胞。在一些实施方案中，从约第11天到第25天，在基础诱导培养基中培养细胞。在一些实施方案中，成熟培养基用于使中脑底板祖细胞分化成多巴胺(da)神经元。
[0310]
在一些实施方案中，培养基补充有如上所述的小分子，包括sb、shh/pur、ldn、chir、bagct/dapt和rocki。在一些实施方案中，每天或每隔一天更换培养基。在一些实施方案中，每天更换培养基。在一些实施方案中，每隔一天更换培养基。在一些实施方案中，从约第0天到约第17天(例如，第16天或第18天)每天更换培养基。在一些实施方案中，从约第18天，每隔一天更换培养基，直到收获或收集。在一些实施方案中，从约第0天到约第17天(例如，第16天或第18天)每天更换培养基，然后从约第18天，每隔一天更换培养基，直到收获或收集。
[0311]
在一些实施方案中，从约第0天到约第10天(例如第9天或第11天)，在培养基中提供血清替代物。在一些实施方案中，在第0天和第1天，在培养基中提供5％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第2天到第10天，在培养基中提供2％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第0天和第1天，在培养基中提供5％(v/v)的血清替代物并且从第2天到第10天，在培养基中提供2％(v/v)的血清替代物。在一些实施方案中，在第10天后，培养基中不提供血清替代物。
[0312]
在一些实施方案中，更换培养基的至少约50％或至少约75％。在一些实施方案中，更换培养基的至少约50％。在一些实施方案中，更换培养基的至少约75％。在一些实施方案中，更换培养基的约100％。
[0313]
在一些实施方案中，更换培养基的约50％或约75％。在一些实施方案中，更换培养基的约50％。在一些实施方案中，更换培养基的约75％。在一些实施方案中，更换培养基的约100％。
[0314]
在一些实施方案中，培养基补充有选自sb、shh/pur、ldn、chir、bagct/dapt、rocki或它们的组合的小分子。在一些实施方案中，当更换培养基的约50％时，每种小分子的浓度与其在第0天的浓度相比加倍。
[0315]
在一些实施方案中，在约第16天至约第30天之间收获细胞。在一些实施方案中，在约第16天至约第27天之间收获细胞。在一些实施方案中，在约第18天至约第25天之间收获细胞。在一些实施方案中，在约第18天收获细胞。在一些实施方案中，在约第25天收获细胞。
在一些实施方案中，用低温保存剂，例如dmso配制收获的细胞。在一些实施方案中，收获的通过该方法产生的细胞在使用前低温保存。在一些实施方案中，此类低温保存的细胞在使用或施用于受试者，例如患有神经退行性疾病或病状(诸如帕金森病)的人类患者之前解冻。
[0316]
在一些实施方案中，包含通过本文提供的方法生成的细胞的组合物用于治疗神经退行性疾病或病状，诸如帕金森病。在一些实施方案中，将通过本文所述的任何方法生成的细胞的组合物施用于患有帕金森病的受试者。在一些实施方案中，通过立体定向注射，例如用导管，施用通过本文所述的任何方法生成的细胞的组合物。在一些实施方案中，将通过本文所述的任何方法生成的细胞的组合物施用于帕金森病患者的纹状体。
[0317]
iii.组合物和配制物
[0318]
本文提供了含有分化细胞的治疗组合物，所述分化细胞是定向多巴胺(da)神经元祖细胞。本文还提供了含有通过所提供的任何方法，诸如第ii部分中描述的任何方法产生的分化细胞的治疗组合物。在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法产生的分化细胞是定向多巴胺(da)神经元祖细胞。
[0319]
在一些实施方案中，所提供的治疗组合物中的分化细胞，包括通过本文所述的任何方法产生的细胞，能够产生多巴胺(da)。在一些实施方案中，所提供的治疗组合物中的分化细胞，包括通过本文所述的任何方法产生的细胞，不产生或基本上不产生去甲肾上腺素(ne)。因此，在一些实施方案中，本文提供的治疗组合物中的分化细胞，包括通过本文所述的任何方法产生的细胞，能够产生da，但不产生或基本上不产生ne。
[0320]
在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1。
[0321]
在一些实施方案中，该治疗组合物表现出大于约1
×
10-4
的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm en1与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-3
至1
×
10-2
之间。
[0322]
在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达
corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达corin。
[0323]
在一些实施方案中，该治疗组合物表现出大于约1
×
10-4
的每百万计数(cpm)corin与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm corin与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-2
至5
×
10-1
之间。
[0324]
在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1和corin。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1和corin。
[0325]
在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)大于约1
×
10-4
的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率；和(b)大于约2
×
10-2
的cpm corin与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm en1与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-3
至1
×
10-2
之间；并且cpm corin与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-2
至5
×
10-1
之间。
[0326]
在一些实施方案中，少于10％的定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达th。在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达低水平的th。在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞不表达th。在一些实施方案中，定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达th的水平低于在其它天收获或收集的细胞。在一些实施方案中，一些定向多巴胺(da)神经元祖细胞表达en1和corin且少于10％的细胞表达th。
[0327]
在一些实施方案中，少于8％的细胞表达th。在一些实施方案中，少于5％的细胞表达th。在一些实施方案中，组合物中总细胞的约2％至10％、约2％至8％、约2％至6％、约2％至4％、约4％至10％、约4％至8％、约4％至6％、约6％至10％、约6％至8％或约8％至10％表
达th。
[0328]
在一些实施方案中该治疗组合物表现出小于约3
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。在一些实施方案中，cpm th与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至2.5
×
10-2
之间。
[0329]
在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1。
[0330]
在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达corin。
[0331]
在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约20％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约25％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中
总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约30％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约35％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约40％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约55％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约60％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约65％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约70％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约75％表达en1和corin。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达th，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达en1和corin。
[0332]
在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法产生的分化细胞是多巴胺(da)神经元(例如，中脑命运da神经元)。在一些实施方案中，在收获时，中脑命运多巴胺(da)神经元是foxa2 /th 。在一些实施方案中，中脑命运多巴胺(da)神经元在约第18天之前或在约第18天时为foxa2 /th 。在一些实施方案中，中脑命运多巴胺(da)神经元在约第25天之前或在约第25天时为foxa2 /th 。
[0333]
在一些实施方案中，本文所述的治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺祖细胞(ddpc)。在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法产生的治疗组合物表现出以下中的一项或多项：(a)大于约2
×
10-5
的每百万计数(cpm)neurog1与cpm gapdh的比率；(b)大于约5
×
10-4
的edn3与cpm gapdh的比率；(c)大于约4
×
10-3
的hes1与cpm gapdh的比率；(d)大于约8
×
10-3
的psrc1与cpm gapdh的比率；(e)大于约2
×
10-3
的nek6与cpm gapdh的比率；(f)大于约1
×
10-2
的iqgap3与cpm gapdh的比率；(g)大于约8
×
10-4
的usp44与cpm gapdh的比率；(h)大于约3
×
10-3
的cep55与cpm gapdh的比率；(i)大于约2
×
10-2
的kif20a与cpm gapdh的比率；(j)大于约2
×
10-2
的aurka与cpm gapdh的比率；(k)小于约1
×
10-3
的calca与cpm gapdh的比率；(l)小于约1
×
10-3
的glra2与cpm gapdh的比率；(m)小于约1
×
10-1
的mapt与cpm gapdh的比率；(n)小于约5
×
10-2
的camk2b与cpm gapdh的比率；(o)小于约1
×
10-2
的syt13与cpm gapdh的比率；(p)小于约1
×
10-3
的lhfpl4与cpm gapdh的比率；(q)小于约5
×
10-3
的ret与cpm gapdh的比率；(r)小于约1
×
10-2
的kcnd3与cpm gapdh的比率；(s)小于约5
×
10-2
的nsg2与cpm gapdh的比率；和(t)小于约2
×
10-2
的snap25与cpm gapdh的比率。
[0334]
在一些实施方案中，(a)cpm neurog1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-5
至约5
×
10-3
之间；(b)cpm edn3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(c)cpm hes1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(d)cpm psrc1与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-2
至约5
×
10-2
之间；(e)cpm nek6与cpm gapdh的比率介于约2
×
10-2
至约5
×
10-1
之间；(f)iqgap3与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-2
至约1
×
10-1
之间；(g)cpm usp44与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(h)cpm cep55与cpm gapdh的比率介于约4
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(i)cpm kif20a与cpm gapdh的比率介于约2.5
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；(j)cpm aurka与cpm gapdh的比率介于约2.6
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；(k)cpm calca与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-5
至约1
×
10-3
之间；(l)cpm glra2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-6
至约1
×
10-3
之间；(m)cpm mapt与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约1
×
10-1
之间；(n)cpm camk2b与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(o)cpm syt13与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；(p)cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约1
×
10-3
之间；(q)cpm ret与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约4
×
10-3
之间；(r)cpm kcnd3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；(s)cpm nsg2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约2.4
×
10-2
之间；和/或(t)cpm snap25与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间。
[0335]
用于测量或评估基因表达或基因产物(包括转录和/或翻译产物)的方法包括在第i部分中描述的那些方法。此外，在一些实施方案中，测量或评估基因表达或基因产物是或包括评估、测量、测定和/或量化样品中基因产物(转录和/或翻译)的水平、量或浓度。
[0336]
在一些实施方案中，基因表达是或包括将基因信息用于基因产物合成的过程。因此，在一些实施方案中，基因产物是用基因编码的信息组装、生成和/或合成的任何生物分子，并且可以包括多核苷酸和/或多肽。在特定实施方案中，评估、测量和/或测定基因表达是或包括测定或测量基因产物的水平、量或浓度。在某些实施方案中，基因产物的水平、量或浓度可以转化(例如，标准化)或直接分析(例如，原始的)。
[0337]
在一些实施方案中，基因产物是或包括由基因编码和/或表达的蛋白质，即多肽。在特定实施方案中，基因产物编码局限和/或暴露于细胞表面的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是可溶性蛋白。在某些实施方案中，蛋白质由细胞分泌。在特定实施方案中，基因表达是由基因编码的蛋白质的量、水平和/或浓度。在某些实施方案中，通过本领域已知的任何合适的方法测量一种或多种蛋白质基因产物。用于评估、测量、测定和/或量化一种或多种蛋白质基因产物的水平、量或浓度的合适方法包括但不限于用免疫测定法、基于核酸或基于蛋白质的适体技术、hplc(高精度液相色谱法)、肽测序(诸如edman降解测序或质谱法(例如ms/ms)，任选地与hplc联用)，以及前述任何微阵列改编(包括核酸、抗体或蛋白质-蛋白质(即非抗体)阵列)进行检测。在一些实施方案中，免疫测定法是或包括基于免疫反应，例如通过检测抗体或抗原结合抗体片段与基因产物的结合检测蛋白质的方法或测定法。免疫测定法包括但不限于定量免疫细胞化学法或免疫组织化学法、elisa(包括直接、间接、夹心、竞争性、多重和便携式elisa(参见，例如，美国专利号7,510,687)、蛋白质印迹(包括一维、二维或高维印迹或其它色谱手段，任选包括肽测序)、酶免疫测定法(eia)、ria(放射免疫测定法)和spr(表面等离子共振)。
[0338]
在某些实施方案中，基因产物是由基因编码的多核苷酸，例如mrna或蛋白质。在一些实施方案中，基因产物是由基因表达和/或编码的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸是rna。在一些实施方案中，基因产物是信使rna(mrna)、转移rna(trna)、核糖体rna、小核rna、小核仁rna、反义rna、长的非编码rna、微小rna、piwi相互作用rna、小干扰rna和/或短发夹rna。在特定实施方案中，基因产物是mrna。
[0339]
在特定实施方案中，评估、测量、测定和/或量化rna基因产物的量或水平包括从rna基因产物生成、聚合和/或衍生cdna多核苷酸和/或cdna寡核苷酸的步骤。在某些实施方
案中，通过直接评估、测量、测定和/或量化源自rna基因产物的cdna多核苷酸和/或cdna寡核苷酸来评估、测量、测定和/或量化rna基因产物。
[0340]
在特定实施方案中，样品中多核苷酸的量或水平可以通过本领域已知的任何合适的方法进行评估、测量、测定和/或量化。例如，在一些实施方案中，多核苷酸基因产物的量或水平可以通过聚合酶链式反应(pcr)来评估、测量、测定和/或量化，包括逆转录酶(rt)pcr、微滴式数字pcr、实时和定量pcr(qpcr)方法(包括，例如，分子信标、lightup
tm
、scorpion
tm
、参见，例如美国专利号5,538,848；5,925,517；6,174,670；6,329,144；6,326,145和6,635,427)；northern印迹法；例如逆转录产物和衍生物的southern印迹法；基于阵列的方法，包括印迹阵列、微阵列或原位合成阵列；和测序，例如边合成边测序、焦磷酸测序、双脱氧测序或边连接边测序，或本领域已知的任何其它方法，诸如在shendure等人，nat.rev.genet.5:335-44(2004)或nowrousian,euk.cell 9(9):1300-1310(2010)中所讨论的，包括诸如454、abi 和测序等特定平台。在特定实施方案中，通过定量pcr(qpcr)方法，诸如qrt-pcr测量核酸基因产物的水平。在一些实施方案中，qrt-pcr使用每个基因的三个核酸集合，其中三个核酸包括引物对以及结合在引物结合的靶核酸区域之间的探针——商业上称为测定法。
[0341]
在特定实施方案中，同时测量或评估两个或更多个基因的表达。在某些实施方案中，多重pcr，例如多重rt-pcr评估或多重定量pcr(qpcr)，用于测量、测定和/或量化两种或更多种基因产物的水平、量或浓度。在一些实施方案中，微阵列(例如和式阵列)用于评估、测量、测定和/或量化两种或多种基因产物的水平、量或浓度。在一些实施方案中，微阵列用于评估、测量、测定和/或量化源自rna基因产物的cdna多核苷酸的水平、量或浓度。在一些实施方案中，一种或多种基因产物(例如，多核苷酸基因产物)的表达通过对基因产物进行测序和/或通过对源自该基因产物的cdna多核苷酸进行测序来测定。在一些实施方案中，测序通过非sanger测序方法和/或下一代测序(ngs)技术进行。下一代测序技术的示例包括但不限于大规模平行签名测序(mpss)、polony测序、焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、solid测序、离子半导体测序、dna纳米球测序、helioscope单分子测序、单分子实时(smrt)测序、单分子实时(rnap)测序和纳米孔dna测序。
[0342]
在一些实施方案中，ngs技术是rna测序(rna-seq)。在特定实施方案中，所述一种或多种多核苷酸基因产物的表达通过rna-seq进行测量、测定和/或量化。rna-seq，也称为全转录组鸟枪法测序，确定样品中rna的存在和数量。rna测序方法已适合于最常见的dna测序平台[hiseq系统(illumina)、454基因组测序仪flx系统(roche)、applied biosystems solid(life technologies)、iontorrent(life technologies)。这些平台需要rna最初逆转录成cdna。相反，单分子测序仪heliscope(helicos biosciences)能够使用rna作为测序的模板。pacbio rs平台上直接rna测序的原理验证也已得到证明(pacific bioscience)。在一些实施方案中，所述一种或多种rna基因产物通过rna-seq评估、测量、测定和/或量化。在一些实施方案中，rna-seq是基于标签的rna-seq。在基于标签的方法中，每个转录本由唯一的标签表示。最初，基于标签的方法是作为基于序列的方法开发的，用于测量转录本丰度
和鉴定差异性表达的基因，假设标签的数量(计数)直接对应于mrna分子的丰度。通过对限定区域进行测序获得样品降低的复杂性，对于使基于sanger的方法可负担得起是至关重要的。当ngs技术变得可用时，可以生成的大量读段促进差异性基因表达的分析。在基于标签的方法中，不会遇到诸如对于鸟枪法所观察到的基因表达水平量化的转录本长度偏差。根据定义，所有基于标签的方法都是链特异性的。在特定实施方案中，通过基于标签的rna-seq评估、测量、测定和/或量化所述一种或多种rna基因产物。
[0343]
在一些实施方案中，rna-seq是鸟枪法rna-seq。对于鸟枪法rna-seq已经描述了许多方案，但是它们具有许多共同的步骤：片段化(其可以发生在rna水平或cdna水平)、rna转化为cdna(通过寡dt或随机引物进行)、第二链合成、在3’末端和5’末端连接衔接子序列(在rna或dna水平)以及最终扩增。在一些实施方案中，如果在片段化之前选择聚(a) rna，则rna-seq可以仅集中在多聚腺苷酸化rna分子上(主要是mrna，但也有一些lncrna、snorna、假基因和组蛋白)，或者如果没有进行选择，也可以包括非多聚腺苷酸化rna。在后一种情况下，核糖体rna(超过总rna库的80％)需要在片段化之前耗尽。因此，很明显，捕获转录组mrna部分的差异导致检测到的转录本类型部分重叠。而且，不同的方案可影响测序读段的丰度和分布。这使得难以比较用不同文库制备方案进行的实验结果。
[0344]
在一些实施方案中，从每个样品中获得rna，将其片段化并用于生成互补dna(cdna)样品，诸如用于测序的cdna文库。可以对读段进行加工并与人类基因组进行比对，并且估计每个基因/同种型的预期映射数目并用于测定读段计数。在一些实施方案中，按照基因/同种型的长度和文库中读段的数目将读段计数归一化，以得到例如按照基因/同种型的长度和文库中读段的数目归一化的fpkm，以根据基因长度和总映射读段得到每百万映射读段中外显子每千个碱基的片段数(fpkm)。在一些方面，样品间归一化是通过归一化来实现的，诸如第75分位数归一化，其中每个样品按来自所有样品的第75分位数的中值来缩放，例如，以得到分位数归一化的fpkm(fpkq)值。fpkq值可以是对数变换的(log2)。
[0345]
在一些实施方案中，从每个样品中获得rna，将其片段化并用于生成互补dna(cdna)样品，诸如用于测序的cdna文库。可以对读段进行加工并与人类基因组进行比对，并且估计每个基因/同种型的预期映射数目并用于测定读段计数。在一些实施方案中，读段计数按照基因/同种型的长度和文库中的读段数目来归一化。在一些实施方案中，读段计数以每百万计数(cpm)的形式提供。
[0346]
在一些实施方案中，通过比较靶基因的cpm与管家基因的cpm来测量相对基因表达。在一些实施方案中，管家基因是gapdh。在一些实施方案中，靶基因的相对基因表达测定为靶基因的cpm与管家基因(例如gapdh)的cpm的比率。
[0347]
在一些实施方案中，在提供的任何组合物中有含有药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，包含通过本文公开的任何方法产生的细胞的细胞剂量以组合物或配制物，诸如药物组合物或配制物的形式提供。此类组合物可以根据所提供的方法、制品和/或所提供的组合物使用，诸如用于预防或治疗疾病、病状和病症，诸如神经退行性病症。
[0348]
术语“药物配制物”是指这样的制剂，其形式使得其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对将施用该配制物的受试者有不可接受的毒性的另外的组分。
[0349]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0350]
在一些方面，载体的选择部分由特定细胞或药剂和/或施用方法决定。因此，存在多种合适的配制物。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体例如由remington’s pharmaceutical sciences第16版，osol,a.ed.(1980)进行描述。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖类诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(peg)。
[0351]
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其它酸和盐。在一些方面，使用两种或多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性的方法在例如remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；第21版(2005年5月1日)中有更详细地描述。
[0352]
该配制物或组合物还可以含有一种以上可用于正在用所述细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病状的活性成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量呈组合存在。因此，在一些实施方案中，该药物组合物还包含其它药物活性剂或药物，诸如卡比多巴-左旋多巴(例如，左旋多巴)、多巴胺激动剂(例如，普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀和阿扑吗啡)、mao b抑制剂(例如，司来吉兰、雷沙吉兰和沙芬酰胺)、儿茶酚o-甲基转移酶(comt)抑制剂(例如，恩他卡朋和托卡朋)、抗胆碱能药(例如，苯托品和苯海索)、金刚烷胺等。在一些实施方案中，所述药剂或细胞以盐的形式，例如药学上可接受的盐的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括那些源自无机酸和有机酸的盐，无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，有机酸诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸。
[0353]
该配制物或组合物还可以与可用于正在用所述细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病状的另一种治疗形式组合施用，其中各自的活性不会相互产生不利影响。因此，在一些实施方案中，该药物组合物与深部脑刺激(dbs)组合施用。
[0354]
在一些实施方案中，该药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病状的量，诸如治疗有效量或预防有效量的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过对治疗受试者的定期评估来监测治疗或预防功效。对于几天或更长时间的重复施用，根据情况，重复治疗直至出现对疾病症状的所需抑制。然而，其它剂量方案也可能有用并且可以确定。所需剂量可通过单次推注施用组合物，通过多次推注施用组合物，或通过连续输注施用组合物来递送。
[0355]
所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过立体定向注射(例如，使
用导管)。在一些实施方案中，给定剂量通过单次推注施用细胞或药剂来施用。在一些实施方案中，例如在几个月或几年的时间内通过多次推注施用细胞或药剂来施用。在一些实施方案中，所述药剂或细胞可以通过立体定向注射到脑部中，诸如纹状体中来施用。
[0356]
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗疾病的类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用所述药剂或细胞是用于预防还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对所述药剂或细胞的反应以及主治医生的判断。在一些实施方案中，一次性或通过一系列治疗向受试者适当地施用所述组合物。
[0357]
可以使用标准施用技术、配制物和/或装置施用所述细胞或药剂。提供了用于储存和施用组合物的配制物和装置，诸如注射器和小瓶。关于细胞，施用可以是自体的。例如，非多能细胞(例如，成纤维细胞)可以从受试者获得，并且在重编程和分化后施用于同一受试者。当施用治疗组合物(例如，含有遗传重编程和/或分化细胞或治疗或改善疾病或病症(诸如神经退行性病症)的症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。配制物包括那些用于立体定向施用，诸如施用到脑部(例如纹状体)中的配制物。
[0358]
在一些实施方案中组合物以无菌液体制剂，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物的形式提供，在一些方面所述液体制剂可以缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍更便于施用，尤其是通过注射施用。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触期。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。
[0359]
无菌注射溶液可通过将药剂或细胞掺入溶剂中，诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合来制备。
[0360]
用于体内施用的配制物通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如，通过无菌滤膜过滤。
[0361]
iv.治疗方法
[0362]
本文提供了使用所提供的任何组合物治疗有此需要的受试者的疾病或病状的方法。在特定实施方案中，该组合物通过本文提供的方法产生。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如，包括向患有疾病、病状或病症的受试者施用治疗性细胞或含有治疗性细胞的组合物。在一些实施方案中，该疾病或病状是神经退行性疾病或病状。在一些实施方案中，以有效量施用所述细胞或其药物组合物以实现疾病或病症的治疗。用途包括所述细胞或其药物组合物在此类方法和治疗中的用途，以及在制备药物以便实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病状或病症。
[0363]
本公开涉及多能干细胞(psc)，包括胚胎干(es)细胞和诱导多能干细胞(ipsc)的谱系特异性分化以在神经退行性疾病中使用的方法。具体地，本文提供的方法、组合物及其用途考虑了多能干细胞的分化，以施用于表现出多巴胺(da)神经元损失(包括帕金森病)的受试者。
[0364]
帕金森病(pd)是第二最常见的神经退行性疾病，估计影响全世界400-500万患者。预计到2030年，这一数字将增加一倍以上。pd是仅次于阿尔茨海默病的第二最常见的神经
退行性病症，在美国影响大约100万患者，每年诊断出60,000名新患者。目前还没有治愈pd的方法，pd的病理学特征是黑质中中脑da神经元的选择性损失。因此pd的基本特征是中脑多巴胺(da)神经元的进行性、严重且不可逆的损失，最终导致运动功能障碍。
[0365]
在一些实施方案中，受试者患有神经退行性疾病。在一些实施方案中，神经退行性疾病包括脑部中多巴胺神经元的损失。在一些实施方案中，受试者已经损失黑质(sn)中的多巴胺神经元。在一些实施方案中，受试者已经损失黑质致密部(snc)中的多巴胺神经元。在一些实施方案中，受试者表现出强直、运动徐缓、姿势反射损伤、静止性震颤或它们的组合。在一些实施方案中，受试者表现出异常的[18f]-l-dopa pet扫描。在一些实施方案中，受试者表现出帕金森病相关模式(pdrp)的[18f]-dg-pet证据。
[0366]
在一些实施方案中，该神经退行性疾病是帕金森综合征。在一些实施方案中，该神经退行性疾病是帕金森病。在一些实施方案中，该神经退行性疾病是特发性帕金森病。在一些实施方案中，该神经退行性疾病是帕金森病的家族形式。在一些实施方案中，受试者患有轻度帕金森病。在一些实施方案中，受试者具有小于或等于32的运动障碍协会-统一帕金森病评定量表(mds-updrs)运动评分。在一些实施方案中，受试者患有中度或晚期帕金森病。在一些实施方案中，受试者患有轻度帕金森病。在一些实施方案中，受试者具有在33至60之间的mds-updrs运动评分。
[0367]
在一些实施方案中，根据所提供的方法和/或所提供的制品或组合物，向受试者施用一定剂量的细胞。在一些实施方案中，剂量的大小或定时根据受试者的特定疾病或病状来确定。在一些情况下，鉴于所提供的描述，特定疾病的剂量大小或定时可以凭经验确定。
[0368]
在一些实施方案中，将该剂量的细胞施用于受试者的纹状体。在一些实施方案中，将该剂量的细胞施用于受试者纹状体的一个半球。在一些实施方案中，将该剂量的细胞施用于受试者的两个半球。
[0369]
在一些实施方案中，向受试者施用的细胞剂量为约5
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞剂量为约10
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞剂量为约15
×
106个细胞。在一些实施方案中，施用于受试者的细胞剂量为约20
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞剂量为约25
×
106个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用的细胞剂量为约30
×
106个细胞。
[0370]
在一些实施方案中，该细胞剂量包括每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约500万个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约1000万个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约1500万个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约500万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约1000万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约1000万个细胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约1000万个细胞、每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或约1000万个细胞、每半球刚好或约500万个细胞至每半球刚好或约1000万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约500万个细
胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约500万个细胞、每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或约500万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约100万个细胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约100万个细胞或每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约500,00万个细胞。
[0371]
在一些实施方案中，该细胞剂量为每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或约3000万个细胞。在一些实施方案中，该细胞剂量为每半球刚好或约500万个细胞至每半球刚好或约2000万个细胞。在一些实施方案中，该细胞剂量为每半球刚好或约1000万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞。
[0372]
在一些实施方案中，该细胞剂量为约3
×
106个细胞/半球至15
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约3
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约4
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约5
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约6
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约7
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约8
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约9
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约10
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约11
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约12
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约13
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约14
×
106个细胞/半球。在一些实施方案中，该细胞剂量为约15
×
106个细胞/半球。
[0373]
在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.25
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约15
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约10
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约5
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约1
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约0.75
×
106总细胞、约0.25
×
106总细胞至约0.5
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约15
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约10
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约5
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约1
×
106总细胞、约0.5
×
106总细胞至约0.75
×
106总细胞、约0.75
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约0.75
×
106总细胞至约15
×
106总细胞、约0.75
×
106总细胞至约10
×
106总细胞、约0.75
×
106总细胞至约5
×
106总细胞、约0.75
×
106总细胞至约1
×
106总细胞、约1
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约1
×
106总细胞至约15
×
106总细胞、约1
×
106总细胞至约10
×
106总细胞、约1
×
106总细胞至约5
×
106总细胞、约5
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约5
×
106总细胞至约15
×
106总细胞、约5
×
106总细胞至约10
×
106总细胞、约10
×
106总细胞至约20
×
106总细胞、约10
×
106总细胞至约15
×
106总细胞或约15
×
106总细胞至约20
×
106总细胞。
[0374]
在某些实施方案中，以每半球约500万个细胞至每半球约2000万个细胞的范围或这些范围之间的任何值向受试者施用细胞或细胞亚型的单个群体。剂量可以根据疾病或病症和/或患者和/或其它治疗所特有的属性而变化。
[0375]
在一些实施方案中，患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值以内。在一些实施方案中，该细胞剂量包括施用每半球刚好或约500万个细胞至每半球约2000万个细胞，包括每个端值在内。
[0376]
在一些实施方案中，细胞(例如分化细胞)剂量以单剂量形式施用给受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长时间段内仅施用一次。
[0377]
在干细胞移植的情况下，给定“剂量”的施用涵盖给定量或数目的细胞以单一组合物的形式施用和/或单一不间断施用，例如以单一注射或连续输注的形式，并且还涵盖给定量或数目的细胞以分剂量或以多种组合物的形式施用，以多种单独的组合物或输注物在特定的时间段(诸如一天)内提供。因此，在一些情况下，该剂量是在单个时间点给予或开始的指定数目的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情况下，该剂量在单个时期内多次注射或输注施用，诸如在一天的时期内通过多次输注施用。
[0378]
因此，在一些方面，该剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，该剂量的细胞以共同含有该剂量的细胞的多种组合物施用。
[0379]
在一些实施方案中，该剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液，诸如第一种和第二种，任选地更多种组合物或溶液来施用，每种组合物或溶液含有该剂量的一些细胞。在一些方面，各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多种组合物单独或独立地施用，任选在一定时间段内施用。
[0380]
在一些实施方案中，该组合物或剂量的施用，例如多种细胞组合物的施用，包括细胞组合物的单独施用。在一些方面，单独施用同时进行，或者以任何顺序依次进行。
[0381]
在一些实施方案中，受试者接受多个剂量的细胞，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，在第一剂量之后施用多个连续剂量，以便在施用连续剂量之后施用一个或多个附加剂量。在一些方面，以附加剂量向受试者施用的细胞数目与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，该一个或多个附加剂量大于先前剂量。
[0382]
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一种或多种标准确定，诸如受试者对先前治疗的反应，例如疾病分期和/或受试者发展不良结果(例如运动障碍)的可能性或发生率。
[0383]
在一些实施方案中，该细胞剂量通常大到足以有效改善疾病症状。
[0384]
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，在一些方面，所需剂量包括细胞或细胞类型的所需剂量或数目和/或细胞类型的所需比率。在一些实施方案中，该细胞剂量基于单个群体或单个细胞类型(例如，th 或th-)中所需的细胞总数(或每千克体重的数目)。在一些实施方案中，该剂量基于此类特征的组合，诸如所需的总细胞数、所需比率和单个群体中所需的总细胞数。
[0385]
因此，在一些实施方案中，该剂量基于所需的总细胞固定剂量和所需比率，和/或基于所述单个亚型或亚群中的一个或多个(例如每个)亚型或亚群的所需固定剂量。
[0386]
在特定实施方案中，细胞的数目和/或浓度是指th阴性细胞的数目。在其它实施方案中，细胞的数目和/或浓度是指施用的所有细胞的数目或浓度。
[0387]
在一些实施方案中，细胞以所需剂量施用，在一些方面，所需剂量包括细胞或细胞类型的所需剂量或数目和/或细胞类型的所需比率。因此，在一些实施方案中，该细胞剂量基于细胞的总数和单个群体或亚型的所需比率。在一些实施方案中，该细胞剂量基于单个群体或单个细胞类型中细胞的所需总数(或每千克体重的数目)。在一些实施方案中，该剂量基于此类特征的组合，诸如所需的总细胞数、所需比率和单个群体中所需的总细胞数。
[0388]
因此，在一些实施方案中，该剂量基于所需的总细胞固定剂量和所需比率，和/或基于所述单个亚型或亚群中的一个或多个(例如每个)亚型或亚群的所需固定剂量。
[0389]
在特定实施方案中，细胞的数目和/或浓度是指th阴性细胞的数目。在其它实施方案中，细胞的数目和/或浓度是指施用的所有细胞的数目或浓度。
[0390]
在一些方面，剂量的大小基于一种或多种标准确定，诸如受试者对先前治疗的反应，例如疾病类型和/或分期和/或受试者发展毒性结果(例如运动障碍)的可能性或发生率。
[0391]
v.制品和试剂盒
[0392]
还提供了可用于进行所提供的方法的制品、系统、设备和试剂盒。还提供了制品，所述制品包括：(i)用于多能干细胞分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元的一种或多种试剂；和(ii)使用所述一种或多种试剂进行本文所述的任何方法的说明书。
[0393]
在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括能够抑制tgf-β/激活nodal信号传导的小分子。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括sb431542。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括能够激活shh信号传导的小分子。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于激活shh信号传导的试剂是或包括shh。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于激活shh信号传导的试剂是或包括嘌吗啡胺。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于激活shh信号传导的试剂是或包括shh和嘌吗啡胺。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括能够抑制bmp信号传导的小分子。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于抑制bmp信号传导的试剂是ldn193189。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括能够抑制gsk3β信号传导的小分子。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，该试剂是或包括chir99021。在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括bdnf、gdnf、dbcamp、抗坏血酸、tgfβ3和dapt中的一种或多种。在一个实施方案中，该试剂盒中的试剂可以是溶液的形式，可以是冷冻的，或者可以是冻干的。
[0394]
还提供了制品，所述制品包括(i)本文所述的任何组合物；和(ii)向受试者施用该组合物的说明书。
[0395]
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料和在所述一个或多个容器和/或包装上或随附所述一个或多个容器和/或包装的标签或包装插页，通常包括使用说明书，例如用于多能细胞分化，例如ipsc分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(da)神经元祖细胞和/或多巴胺(da)神经元的试剂的说明书，以及进行本文提供的任何方法的说明书。在一些方面，所提供的制品含有例如在制造过程的一个或多个步骤用于使细胞分化和/或成熟的试剂，诸如在第ii部分和第iii部分的任何步骤中描述的任何试剂。
[0396]
还提供了含有分化细胞，诸如使用本文提供的方法生成的那些分化细胞的制品和试剂盒，以及任选地使用说明书，例如施用说明书。在一些实施方案中，说明书提供指导或指定方法用于在接受细胞疗法之前评估受试者是否可能或疑似可能在施用表达重组受体的分化细胞以治疗疾病或病症后产生反应和/或反应的程度或水平。在一些方面，制品可以含有一定剂量的分化细胞或分化细胞的组合物。
[0397]
本文提供的制品含有包装材料。用于包装所提供的材料的包装材料是本领域技术
人员所熟知。参见，例如，美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，这些专利中的每个专利整体并入本文。包装材料的示例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、一次性实验室用品，例如移液管吸头和/或塑料板，或瓶。制品或试剂盒可包括一种装置，以利于分配材料或利于以高通量或大规模方式使用，例如利于在机器人装备中使用。通常，该包装与其中所含的组合物不反应。
[0398]
在一些实施方案中，试剂和/或细胞组合物单独包装。在一些实施方案中，每个容器可以具有单个隔室。在一些实施方案中，制品或试剂盒的其它组分单独包装，或者一起包装在单个隔室中。
[0399]
vi.示例性实施方案
[0400]
在所提供的实施方案中有：
[0401]
1.一种使神经细胞分化的方法，所述方法包括：
[0402]
(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；以及
[0403]
(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述球体的细胞。
[0404]
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述第二次温育开始于约第7天。
[0405]
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述细胞暴露于所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂直至第7天当天或之前的一天。
[0406]
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述tgf-β/激活nodal抑制剂。
[0407]
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂直至第7天当天或之前的一天。
[0408]
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂。
[0409]
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述bmp信号传导抑制剂直至第11天当天或之前的一天。
[0410]
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第10天，包括每一天，暴露于所述bmp信号传导抑制剂。
[0411]
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述gsk3β信号传导抑制剂直至第13天当天或之前的一天。
[0412]
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第12天，包括每一天，暴露于所述gsk3b信号传导抑制剂。
[0413]
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述细胞包括将所述细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)(统称为“bagct”)；和(vi)notch信号传导抑制剂。
[0414]
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞从第11天开始暴露于
bagct和所述notch信号传导抑制剂。
[0415]
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞从第11天开始暴露于bagct和所述notch信号传导抑制剂，直到收获所述神经分化细胞，任选地直到第18天，任选地直到第25天。
[0416]
14.一种使神经细胞分化的方法，所述方法包括:
[0417]
(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育当天开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂到第6天，包括每一天；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；以及
[0418]
(b)从第7天开始，进行第二次温育以使所述球体的细胞神经分化，包括在涂覆有选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合的底物的培养器皿中培养所述细胞，其中从第7天开始，将细胞暴露于(i)bmp信号传导抑制剂和(ii)gsk3β信号传导抑制剂；并且从第11天开始，将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)(统称为“bagct”)；和(vi)notch信号传导抑制剂。
[0419]
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，所述方法还包括收获所述神经分化细胞。
[0420]
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述收获在约第16天或之后进行。
[0421]
17.根据实施方案15或实施方案16所述的方法，其中所述收获在约第16天至约第30天之间进行。
[0422]
18.根据实施方案15-17中任一项所述的方法，其中所述收获在第18天至第25天之间进行。
[0423]
19.根据实施方案15-18中任一项所述的方法，其中所述收获在第18天或约在第18天进行。
[0424]
20.根据实施方案15-18中任一项所述的方法，其中所述收获在第25天或约在第25天进行。
[0425]
21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述神经分化细胞是定向多巴胺能神经元祖细胞。
[0426]
22.根据实施方案21所述的方法，其中所述多巴胺能神经元祖细胞在移植到受试者后能够使宿主组织受神经支配。
[0427]
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中，在进行所述第二次温育之前，将所述球体解离以产生细胞悬浮液，并且将所述细胞悬浮液的细胞在所述底物涂覆的培养器皿中培养。
[0428]
24.根据实施方案23所述的方法，其中所述解离在所述球体细胞表达pax6和otx2中的至少一者时进行。
[0429]
25.根据实施方案23或实施方案24所述的方法，其中所述解离在约第7天进行。
[0430]
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述培养器皿选自由以下项组成的组：板、培养皿、烧瓶和生物反应器。
[0431]
27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述培养器皿是板。
[0432]
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述板是6孔板、12孔板、24孔板或96孔板。
[0433]
29.根据实施方案27或实施方案28所述的方法，其中所述板是微孔板。
[0434]
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述微孔板是6孔板。
[0435]
31.根据实施方案29所述的方法，其中所述微孔板是24孔板。
[0436]
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述培养器皿是aggrewell
tm
板。
[0437]
33.根据实施方案29-32中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。
[0438]
34.根据实施方案29-33中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养在6孔板中进行并且包含约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔或约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。
[0439]
35.根据实施方案29-34中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养在24孔板中进行并且包含约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔或约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。
[0440]
36.根据实施方案29-35中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约1,000个细胞至约5,000个细胞或约2,000个细胞至约3,000个细胞的球体。
[0441]
37.根据实施方案29-36中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约2,000个细胞的球体。
[0442]
38.根据实施方案29-36中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养
包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约3,000个细胞的球体。
[0443]
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中处理所述培养器皿以减少或消除细胞粘附。
[0444]
40.根据39所述的方法，其中所述处理所述培养器皿包括将所述培养器皿与普朗尼克酸一起温育。
[0445]
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中，在所述第一次温育之前，将所述非贴壁培养器皿暴露于表面活性剂。
[0446]
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述表面活性剂是普朗尼克酸。
[0447]
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述非贴壁培养器皿包括低或超低附着表面。
[0448]
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，所述非贴壁培养器皿包括超低附着表面。
[0449]
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述底物是基底膜蛋白。
[0450]
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中所述底物选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合中的一种或多种。
[0451]
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其中所述底物是重组蛋白。
[0452]
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中所述底物是重组层粘连蛋白。
[0453]
49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中，所述底物涂覆的培养器皿在用于培养所述细胞之前，暴露于聚-l-鸟氨酸。
[0454]
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂为sb431542。
[0455]
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的sb431542。
[0456]
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述至少一种shh信号传导激活剂为shh或嘌吗啡胺。
[0457]
53.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述至少一种shh信号传导激活剂包含选自shh蛋白和嘌吗啡胺的两种shh信号传导激活剂。
[0458]
54.根据实施方案52或实施方案53所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至500ng/ml、约20ng/ml至约400ng/ml、约50ng/ml至约200ng/ml或约75ng/ml至约150ng/ml，任选地约100ng/ml的shh。
[0459]
55.根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的嘌吗啡胺。
[0460]
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中所述bmp信号传导抑制剂为ldn193189。
[0461]
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约10nm至500nm、约20nm至约400nm、约50nm至约200nm或约75nm至约150nm，任选地约100nm的ldn193189。
[0462]
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，其中所述gsk3β信号传导抑制剂为chir99021。
[0463]
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1μm至约5μm、约
0.5μm至约4μm或约1μm至约3μm，任选地约2μm的chir99021。
[0464]
60.根据实施方案11-59中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml，任选地约20ng/ml的gdnf。
[0465]
61.根据实施方案11-60中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml，任选地约20ng/ml的bdnf。
[0466]
62.根据实施方案11-61所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1mm至5mm、约0.2mm至约4mm、约0.3mm至约3mm或约0.4mm至约2mm，任选地约0.5mm的dbcamp。
[0467]
63.根据实施方案11-62中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约1mm或约0.2mm至约0.5mm，任选地约0.2mm的抗坏血酸。
[0468]
64.根据实施方案11-63中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1ng/ml至约5ng/ml、约0.3ng/ml至约3ng/ml或约0.5ng/ml至约2ng/ml，任选地约1ng/ml的tgfβ3。
[0469]
65.根据实施方案11-64中任一项所述的方法，其中所述notch信号传导抑制剂为dapt。
[0470]
66.根据实施方案11-65中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的dapt。
[0471]
67.根据实施方案1-66中任一项所述的方法，其中所述第一次温育和/或所述第二次温育中的所述培养在包含血清或血清替代物的培养基中进行。
[0472]
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述第一次温育和所述第二次温育中的所述培养在包含血清或血清替代物的培养基中进行。
[0473]
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述细胞从约第0天至约第10天在包含血清或血清替代物的培养基中培养。
[0474]
70.根据实施方案67-69中任一项所述的方法，其中所述血清或血清替代物占所述培养基的约5％(v/v)。
[0475]
71.根据实施方案67-70中任一项所述的方法，其中所述血清或血清替代物占所述培养基的约2％(v/v)。
[0476]
72.根据实施方案67-71中任一项所述的方法，其中所述培养基从约第0天至约第1天包含约5％的血清或血清替代物(v/v)，从从约第2天至约第10天包含约2％的血清替代物(v/v)。
[0477]
73.根据实施方案67-72中任一项所述的方法，其中所述培养基包含血清替代物。
[0478]
74.根据实施方案67-73中任一项所述的方法，其中所述血清替代物不含胎牛血清(fbs)。
[0479]
75.根据实施方案67-74中任一项所述的方法，其中所述血清替代物是knockout
tm
血清替代物。
[0480]
76.根据实施方案1-66中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述培养持续期间在不存在血清的情况下培养。
[0481]
77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述细胞在第0天、第7天、第16
天和/或第20天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。
[0482]
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中所述细胞在第0天、第7天、第16天和第20天暴露于rho相关激酶蛋白(rock)信号传导抑制剂。
[0483]
79.根据实施方案77或实施方案78所述的方法，其中所述rock抑制剂是y-27632。
[0484]
80.根据实施方案77-79中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的所述rock抑制剂。
[0485]
81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中每天或每隔一天或每三天更换所述培养基的至少约50％。
[0486]
82.根据实施方案23-81中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离。
[0487]
83.根据实施方案23-82中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离，所述酶促解离包括使用选自由以下项组成的组的酶：accutase、分散酶、胶原酶以及它们的组合。
[0488]
84.根据实施方案23-83中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离，所述酶促解离包括使用accutase。
[0489]
85.根据实施方案1-84中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述底物涂覆的培养器皿中转移约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。
[0490]
86.根据实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述底物涂覆的培养器皿中转移约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。
[0491]
87.根据实施方案85或实施方案86所述的方法，其中所述转移发生在约第7天。
[0492]
88.根据实施方案15-87中任一项所述的方法，所述方法还包括用低温保护剂配制所收获的细胞。
[0493]
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述低温保护剂选自由以下项组成的组：甘油、丙二醇和二甲亚砜(dmso)。
[0494]
90.根据实施方案88或实施方案89所述的方法，所述方法还包括低温保存所收获的细胞，并且任选地在使用前解冻所述细胞。
[0495]
91.根据实施方案1-90中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞、诱导多能干细胞(ipsc)或它们的组合。
[0496]
92.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞，任选地是小鼠或人胚胎干细胞。
[0497]
93.根据实施方案1-92中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人胚胎干细胞。
[0498]
94.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞，任选地是小鼠或人诱导多能干细胞。
[0499]
95.根据实施方案1-91和94中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。
[0500]
96.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是自体的。
[0501]
97.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是同种异体的。
[0502]
98.根据实施方案1-97中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是低免疫原性的。
[0503]
99.根据实施方案98所述的方法，其中所述多能干细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。
[0504]
100.一种通过根据实施方案1-99中任一项所述的方法产生的治疗组合物。
[0505]
101.根据实施方案100所述的治疗组合物，其中所述组合物的细胞表达en1和corin，并且所述组合物中总细胞少于10％表达th。102.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述组合物中的细胞表达en1和corin，并且所述组合物中所述总细胞少于10％表达th。
[0506]
103.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述治疗组合物表现出小于约2.5
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。
[0507]
104.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述治疗组合物表现出以下中的一项或多项：
[0508]
(a)大于约2
×
10-5的每百万计数(cpm)neurog1与cpm gapdh的比率；
[0509]
(b)大于约5
×
10-4的cpm edn3与cpm gapdh的比率；
[0510]
(c)大于约4
×
10-3的cpm hes1与cpm gapdh的比率；
[0511]
(d)大于约8
×
10-3的cpm psrc1与cpm gapdh的比率；
[0512]
(e)大于约2
×
10-3的cpm nek6与cpm gapdh的比率；
[0513]
(f)大于约1
×
10-2的cpm iqgap3与cpm gapdh的比率；
[0514]
(g)大于约8
×
10-4的cpm usp44与cpm gapdh的比率；
[0515]
(h)大于约3
×
10-3的cpm cep55与cpm gapdh的比率；
[0516]
(i)大于约2
×
10-2的cpm kif20a与cpm gapdh的比率；
[0517]
(i)大于约2
×
10-2的cpm aurka与cpm gapdh的比率；
[0518]
(k)小于约1
×
10-3的cpm calca与cpm gapdh的比率；
[0519]
(l)小于约1
×
10-3的cpm glra2与cpm gapdh的比率；
[0520]
(m)小于约1
×
10-1的cpm mapt与cpm gapdh的比率；
[0521]
(n)小于约5
×
10-2的cpm camk2b与cpm gapdh的比率；
[0522]
(o)小于约1
×
10-2的cpm syt13与cpm gapdh的比率；
[0523]
(p)小于约1
×
10-3的cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率；
[0524]
(q)小于约5
×
10-3的cpm ret与cpm gapdh的比率；
[0525]
(r)小于约1
×
10-2的cpm kcnd3与cpm gapdh的比率；
[0526]
(s)小于约5
×
10-2的cpm nsg2与cpm gapdh的比率；以及
[0527]
(t)小于约2x 10-2的cpm snap25与cpm gapdh的比率。
[0528]
105.根据实施方案104所述的治疗组合物，其中：
[0529]
(a)cpm neurog1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-5
至约5
×
10-3
之间；
[0530]
(b)cpm edn3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
[0531]
(c)cpm hes1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
[0532]
(d)cpm psrc1与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-2
至约5
×
10-2
之间；
[0533]
(e)cpm nek6与cpm gapdh的比率介于约2
×
10-2
至约5
×
10-1
之间；
[0534]
(f)cpm iqgap3与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-2
至约1
×
10-1
之间；
[0535]
(g)cpm usp44与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
[0536]
(h)cpm cep55与cpm gapdh的比率介于约4
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
[0537]
(i)cpm kif20a与cpm gapdh的比率介于约2.5
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；
[0538]
(j)cpm aurka与cpm gapdh的比率介于约2.6
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；
[0539]
(k)cpm calca与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-5
至约1
×
10-3
之间；
[0540]
(l)cpm glra2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-6
至约1
×
10-3
之间；
[0541]
(m)cpm mapt与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约1
×
10-1
之间；
[0542]
(n)cpm camk2b与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
[0543]
(o)cpm syt13与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；
[0544]
(p)cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约1
×
10-3
之间；
[0545]
(q)cpm ret与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约4
×
10-3
之间；
[0546]
(r)cpm kcnd3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；
[0547]
(s)cpm nsg2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约2.4
×
10-2
之间；和/或
[0548]
(t)cpm snap25与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间。
[0549]
106.根据实施方案104或实施方案105所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出(a)-(t)中的2项至20项。
[0550]
107.根据实施方案100和103-106中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物中的细胞表达en1和corin。
[0551]
108.根据实施方案100-107中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出：
[0552]
(a)大于约1
×
10-4
的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率；和/或
[0553]
(b)大于约2
×
10-2
的cpm corin与cpm gapdh的比率。
[0554]
109.根据实施方案100-108中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物的所述细胞表现出：
[0555]
介于约1.5
×
10-3至1
×
10-2之间的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率；和/或
[0556]
介于约5
×
10-2至5
×
10-1之间的cpm corin与cpm gapdh的比率。
[0557]
110.根据实施方案100和104-109中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中的细胞表达th。
[0558]
111.根据实施方案100和103-110中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞少于10％表达th。
[0559]
112.根据实施方案100-111中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出小于约3
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。
[0560]
113.根据实施方案100-112中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞的约2％至约10％、约2％至约8％、约2％至约6％、约2％至约4％、约4％至约10％、约4％至约8％、约4％至约6％、约6％至约10％、约6％至约8％或约8％至10％表达th。
[0561]
114.根据实施方案100-113中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞少于5％表达th。
[0562]
115.根据实施方案100-114中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞的约1％至约5％或约2％至约4％表达th。
[0563]
116.根据实施方案100-115中任一项所述的治疗组合物，其中所述定向细胞能够在体内移植并且使其它细胞受神经支配。
[0564]
117.根据实施方案100-116中任一项所述的治疗组合物，其中所述定向细胞能够产生多巴胺，任选地其中所述定向细胞不产生或不大量产生去甲肾上腺素。
[0565]
118.根据实施方案100-117中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少500万总细胞、至少1000万总细胞、至少1500万总细胞、至少2000万总细胞、至少3000万总细胞、至少4000万总细胞、至少5000万总细胞、至少1亿总细胞、至少1.5亿总细胞或至少2亿总细胞。
[0566]
119.根据实施方案100-118中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含刚好或约500万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约2500万总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1000万总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约2500万总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约1亿总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约1亿总细胞至刚好或约1.5亿总细胞或刚好或约1.5亿总细胞至刚好或约2亿总细胞。
[0567]
120.根据实施方案100-119中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少1千万总细胞。
[0568]
121.根据实施方案100-120中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少2千万总细胞。
[0569]
122.根据实施方案100-121中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少3千万总细胞。
[0570]
123.根据实施方案100-122中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少4千万总细胞。
[0571]
124.根据实施方案100-123中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物中所述总细胞的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％是活的。
[0572]
125.根据实施方案100-124中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含低温保护剂。
[0573]
126.根据实施方案125所述的治疗组合物，其中所述低温保护剂选自由以下项组成的组：甘油、丙二醇和二甲亚砜(dmso)。
[0574]
127.根据实施方案100-126中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物用于治疗受试者的神经退行性疾病或病状。
[0575]
128.根据实施方案100-127中任一项所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状包括任选地在sn中，任选地在snc中的多巴胺能神经元的损失。
[0576]
129.根据实施方案128所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病。
[0577]
130.根据实施方案128所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。
[0578]
131.一种治疗方法，所述治疗方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案100-130中任一项所述的治疗组合物。
[0579]
132.根据实施方案131所述的方法，其中向所述受试者施用的细胞的数目为约0.25
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约0.75
×
106个细胞、约0.25
×
106个细胞至约0.5
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、约0.5
×
106个细胞至约0.75
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约0.75
×
106个细胞至约1
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约1
×
106个细胞至约5
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约15
×
106个细胞、约5
×
106个细胞至约10
×
106个细胞、约10
×
106个细胞至约20
×
106个细胞、约10
×
106个细胞至约15
×
106个细胞或约15
×
106个细胞至约20
×
106个细胞。
[0580]
133.根据实施方案131或实施方案132所述的方法，其中所述受试者患有神经退行性疾病或病状。
[0581]
134.根据实施方案131-133中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病
状包括多巴胺能神经元的损失。
[0582]
135.根据实施方案131-134中任一项所述的方法，其中所述受试者已损失任选地在所述黑质(sn)，任选地在所述sn致密部(snc)中的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的多巴胺能神经元。136.根据131-135中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。
[0583]
137.根据实施方案131-135中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病，任选地为特发性帕金森病。
[0584]
138.根据实施方案131-137中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过立体定向注射递送组合物的细胞。
[0585]
139.根据实施方案131-138中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过导管递送组合物的细胞。
[0586]
140.根据实施方案138或实施方案139所述的方法，其中将所述细胞递送到所述受试者的纹状体。
[0587]
141.根据实施方案131-140中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞对于所述受试者是自体的。
[0588]
142.根据实施方案131-141中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞对于所述受试者是同种异体的。
[0589]
143.根据实施方案131-142中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞是低免疫原性的。
[0590]
144.根据实施方案143所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。
[0591]
145.根据实施方案100-130中任一项所述的组合物用于配制用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者的药物的用途。
[0592]
146.根据实施方案100-115中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者。
[0593]
147.根据实施方案145所述的用途或根据实施方案146所述使用的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。
[0594]
148.根据实施方案145-147中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述受试者已损失任选地在所述黑质(sn)，任选地在所述sn致密部(snc)中的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的多巴胺能神经元。
[0595]
149.根据实施方案145-148中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。
[0596]
150.根据实施方案145-148中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病，任选地为特发性帕金森病。
[0597]
151.根据实施方案145-150中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述组合物的所述细胞对于所述受试者是自体的。
[0598]
152.根据实施方案145-150中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述组合物的所述细胞对于所述受试者是同种异体的。
[0599]
153.根据实施方案145-152中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述治疗组合物的所述细胞是低免疫原性的。
[0600]
154.根据实施方案153所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述治疗组合物的所述细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。
[0601]
vii.实施例
[0602]
将以下实施例包括在内仅仅是为了说明的目的，并非旨限制本发明的范围。
[0603]
实施例1：ipsc的神经元分化
[0604]
由从患有帕金森病的人类供体获得的成纤维细胞产生诱导多能干细胞(ipsc)，并且经受多巴胺能(da)神经元分化方案。评估各种中脑标记物的表达。
[0605]
通过在geltrex
tm
涂覆的6孔板中以200,000个细胞/cm2平板接种来维持来自人类供体的ipsc。在没有饲养细胞的情况下，在基于mtesr
tm
1的培养基中培养细胞，直到它们达到大约90％融合(第0天)。然后用无菌pbs洗涤ipsc并通过用accutase
tm
进行酶促解离从6孔板分离。然后将收集的ipsc用于后续分化方案。
[0606]
a.分化方案
[0607]
将收集的ipsc重悬于“基础诱导培养基”中(参见下文)，并使用6孔或24孔aggrewell
tm
板在非贴壁条件下接种。在达到以下浓度的条件下接种细胞：500个细胞/球体；1,000个细胞/球体、2,000个细胞/球体；3,000个细胞/球体；10,000个细胞/球体；或15,000个细胞/球体。细胞接种后，将6孔或24孔板立即分别以200
×
g或100
×
g离心3分钟。从第0天开始，培养基中补充如下所述的各种小分子。细胞培养7天，如以下详述的那样更换培养基，以形成球体。第7天，通过用accutase
tm
进行酶促解离将所得的球体解离成单细胞，并将细胞以单层的形式以600,000个细胞/cm2的浓度平板接种在底物涂覆的6孔板(geltrex
tm
)上进行剩余的培养，并进一步补充营养物和如下所述的小分子。
[0608]
图1和表e1中示出了示例性非贴壁分化方案的示意图，该示意图描绘了在分化方法期间的不同天数添加的小分子化合物。从第0天到第10天，将细胞在基础诱导培养基中培养，该基础诱导培养基配制成含有1:1比率的neurobasal
tm
培养基和dmem/f12培养基(且具有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)、glutamax
tm
、l-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和胰岛素)，并且补充适当的小分子化合物。从第11天到第25天，将细胞在“成熟培养基”(含有n-2和b27补充物、非必需氨基酸(neaa)和glutamax
tm
的neurobasal
tm
培养基)中培养，并且补充适当的小分子化合物。基础诱导培养基还包括血清替代物。
[0609]
[0610][0611][0612]
s：血清替代物；ldn：ldn193189；sb：sb431542；shh：重组小鼠音猬因子(rmshh)；pur：嘌吗啡胺；chir：chi99021；rocki：y-27632；bdnf：重组人脑源性神经营养因子
(rhbdnf)；gdnf：重组人胶质细胞源性神经营养因子(rhgdnf)；tgfβ3：重组人转化生长因子β3(rhtgfβ3)；dbcamp：二丁酰环amp；抗坏血酸：抗坏血酸；*标明培养基补充有rock抑制剂(y-27632)
[0613]
具体地，在第0天，将基础诱导培养基配制成含有：5％血清替代物、0.1μm ldn、10μm sb、0.1μg/ml shh、2μm pur、2μm的gsk3βδ抑制剂chir99021和10μm的rock抑制剂y-27632。在第1天完全更换培养基，以提供与第0天相同浓度的小分子化合物，除了没有添加rock抑制剂外。从第2天到第6天，每天提供与第1天相同浓度的小分子化合物，但是交换50％的培养基；在第2天至第6天，基础诱导培养基中小分子的浓度加倍，以确保向细胞培养物中添加相同总浓度的化合物。同样，第2天至第6天的培养基用2％血清替代物配制。
[0614]
在第7天将细胞转移到底物涂覆的板上时，将基础诱导培养基配制成含有：2％血清替代物、0.1μm ldn、10μm sb、2μm chir99021和10μm y-27632。从第8天到第10天每天用基础诱导培养基更换培养基，该基础诱导培养基配制成含有2％血清替代物、0.1μm ldn和2μm chir99021。
[0615]
从第11天开始，将培养基换成成熟培养基，该成熟培养配制成含有：20ng/ml bdnf、0.2mm抗坏血酸、20ng/ml gdnf、0.5mm dbcamp和1ng/ml tgfβ3(统称为“bagct”)、10μm dapt和2μm chir99021。在第12天，将培养基更换为含有与第11天相同浓度的小分子化合物的相同培养基配制物。从第13天直到收获，每天(第13天至第17天)或每隔一天(第17天之后)用成熟培养基更换培养基，该成熟培养基配制成含有与第11天和第12天相同浓度的bagct和dapt(统称为“bagct/dapt”)。
[0616]
在第16天和第20天，通过用分散酶和胶原酶进行酶促解离来使细胞传代。将细胞作为小块重悬并重新平板接种。在传代第16天和第20天，将细胞重新平板接种在进一步补充了rock抑制剂的成熟培养基中。
[0617]
b.分化状态
[0618]
在第25天，通过免疫组织化学分析分化细胞中的中脑da神经元标记物，包括foxa2和酪氨酸羟化酶(th)，或者通过酶促解离收获分化细胞并冷冻供下游使用或分析。通过dapi染色鉴定细胞核。如图2中所示，产生2,000个或3,000个细胞/球体的初始接种密度产生离散的foxa2 th 神经元(参见示例性的foxa2 th 神经元，在图2的右上图中圈出)。在较低和较高的接种密度下，观察到细胞分化程度较低。
[0619]
为了比较存在血清替代物和不存在任何血清的情况下进行的分化，使细胞从第0天至第10天在相同条件下生长，但不存在血清替代物的情况下生长。在没有血清或没有血清替代物的情况下生长的细胞表现出降低的活力和较低的th 频率，如通过染色所确定的(图3；在“无血清”组中显示较少的th 细胞)。
[0620]
在另一实验中，如前一部分所述处理细胞，但是从第7天到第12天添加chir抑制剂的条件通过添加成纤维细胞生长因子8(fgf8)和不同浓度的chir得以修改。培养基配制物和小分子补充物的所有其它方面保持如表e1所示。具体地，从第7天到第12天，添加2μm、4μm或6μm的chir，有或没有100ng/ml成纤维细胞生长因子8(fgf8)。在分化方案的第26天，评估th 神经元的数目。与不含fgf8和仅含2μm chir的条件相比，添加fgf8和增加chir浓度并未产生更多的th 神经元(数据未示出)。
[0621]
这些结果与观察结果一致，即ipsc的初始接种密度以及血清替代物的存在会影响
通过所述方法产生的细胞的神经元分化状态。结果还支持2μm chir足以支持适当的分化，因为添加fgf8和/或将chir的浓度从2μm增加到4μm或6μm并未进一步改变th 细胞的数目。
[0622]
实施例2：神经元分化标记物的表达
[0623]
比较由上述示例性非贴壁方法生成的细胞与通过不同方法生成的细胞之间的神经元分化标记物的表达水平，其中最初在第0天将细胞平板接种在geltrex
tm
涂覆的6孔板中，并在分化方案持续期间保持平板接种(“贴壁方法”)。贴壁方法与非贴壁方法的不同之处还在于小分子按不同的时间表添加(图4)。对于所有实验条件而言，细胞都源自同一人类供体。
[0624]
在分化的第25天收获来自贴壁方法和非贴壁方法的细胞，并评估foxa2 th 神经元的存在。通过用dapi染色鉴定细胞核。如图5中所示，通过两种方法产生的细胞培养物看起来是同等的，两种培养物都表现出离散的foxa2 th 神经元。
[0625]
实施例3：酪氨酸羟化酶(th)表达
[0626]
比较通过以上在实施例1中描述的非贴壁方法生成的细胞之间的酪氨酸羟化酶的表达。在第18天或第25天收集细胞(n＝3)。通过基线化方法对数据进行归一化，其中将来自特定时间点的样品的归一化计数的平均值或中值从来自该时间点的每个样品的归一化计数中减去。样品分析显示，与第18天相比，第25天细胞中的th基因表达增加(图6)。这些发现与以下观察结果一致，即通过示例性非贴壁方法产生的细胞在该方法的早期时间点分化程度低(例如，第18天与第25天相比)。
[0627]
实施例4：对不同时间点分化细胞中的多巴胺产生的评估
[0628]
由从六个不同的人类供体获得的成纤维细胞产生诱导多能干细胞(ipsc)系，并经受实施例2中描述的贴壁多巴胺能(da)神经元分化方法。将分化细胞培养至第75天，然后在汉克氏缓冲盐水溶液(hbss)中用56mm kcl刺激，以通过高效液相色谱法(hplc)测量多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)的产生。如图7中所示，来自六个供体细胞系中的每个供体细胞系的分化细胞都表现出da产生，范围为每百万个测定细胞3ng至11ng。没有检测到去甲肾上腺素(ne)产生，或者检测到低水平的去甲肾上腺素(ne)产生(《每百万个测定细胞1ng)。由于da是ne产生中的中间体，但是没有观察到ne产生或观察到低ne产生，该发现与该分化方案能够产生能够产生多巴胺能神经元的细胞的观察结果一致。
[0629]
实施例5：分化细胞中基因表达的分析
[0630]
通过实施例1中描述的非贴壁分化方案使细胞分化，并在分化的不同天数收集细胞，用于通过rnaseq分析基因表达。
[0631]
如图图8a所示，观察到分化细胞会表达中脑da神经元基因foxa2和th。具体而言，与第18天相比，在第25天th基因表达出现增加，这与实施例3中观察到的结果一致。从约第4天或第7天开始，还观察到分化细胞表达en1和corin，即在胎儿发育期间由a9祖细胞表达的基因(图8b)。在分化细胞上也观察到早期神经祖细胞标记物pax6和sox2的低表达(图8c)。值得注意的是，sox2的表达倾向于随着分化时间的推移而降低，特别是到第18天和进一步到第25天。具体而言，这些发现与在25天的过程中细胞变得分化程度越来越高(即，定型为多巴胺能神经元命运)的观察结果一致。第18天和第25天细胞之间的差异与第18天细胞分化程度较低但表现出定型为多巴胺能神经元的定向多巴胺能前体细胞的特征，使得它们不能分化成非多巴胺能细胞一致。
[0632]
为了评估分化至第18天或第25天的细胞中的基因表达，通过rnaseq分析在非贴壁分化方法的第18天收获的细胞与第25天收获的细胞之间的差异性基因表达。使用《0.05的错误发现率(fdr)和》0的对数
2-倍数变化来鉴定和生成与第18天相比在第25天上调(“上调”列表)和下调(“下调”列表)的显著差异性表达基因的列表。
[0633]
将差异性表达基因的上调列表与公开可用的神经突生长相关基因列表(可在amigo.geneontology.org/amigo/term/go:0043005获得)进行比较。“上调”列表中总共132个基因被鉴定为在第18天至第25天之间差异性表达的神经突生长相关基因，尤其是与第18天相比在第25天上调的基因。当鉴定的差异性表达的神经突生长相关基因按显著性排序时，发现前十(10)个显著基因依次为：calca、glra2、mapt、camk2b、syt13、lhfpl4、ret、kcnd3、nsg2和snap25。
[0634]
类似地，将差异性表达基因的下调列表与公开可用的有丝分裂相关基因列表(可在amigo.geneontology.org/amigo/term/go:0000278获得)进行比较。“下调”列表中总共108个基因被鉴定为在第18天至第25天之间差异性表达的有丝分裂相关基因，尤其是与第18天相比在第25天下调的基因。当鉴定的差异性表达的有丝分裂相关基因按显著性排序时，发现前十(10)个显著基因依次为：neurog1、edn3、hes1、psrc1、nek6、iqgap3、usp44、cep55、kif20a和aurka。
[0635]
通过相对于gapdh表达测量来自第18天和第25天的每一天的六个不同分化样品中所述基因中的每个基因的基因表达，确定差异性上调和下调列表中的基因的相对表达。具体而言，靶基因和gapdh的每百万计数(cpm)估计值归一化为rnaseq文库大小。计数值表示基因水平的分析。对于第18天和第25天中的每一天，样品中每个基因的最小表达、最大表达和平均相对表达以靶基因的cpm与gapdh的cpm比率的形式生成。对靶基因en1、corin和th重复相同分析。对于前10个上调和下调的差异性表达基因(按显著性排序)，以及对于en1、corin和th，这些值示于下面的表e2中。
[0636]
第18天至第25天之间最显著的差异性表达基因中的一者或多者可以作为遗传表达标记，通过该标记可以鉴定第18天的细胞。
[0637]
[0638][0639]
给定的值是靶基因的每百万计数(cpm)/gapdh的cpm，并且是相对表达的量度。
[0640]
总之，这些发现表明，随着示例性分化方案天数的增加，细胞变得越来越多地定型为定向神经元命运。具体而言，有丝分裂相关基因从第18天至第25天减少，表明从多能、自我更新状态向更加定向的细胞类型转变，而神经突生长相关基因从第18天至第25天增加，表明向定向神经元表型转变。
[0641]
本发明的范围并不旨在限于公开的特定实施方案，这些实施方案例如是为了举例说明本发明的各个方面而提供的。对所述组合物和方法的各种修改从本文的描述和教导看将变得显而易见。此类变化可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施，并且旨在落入本公开的范围内。