一种基于微流控芯片建立二型糖尿病体外模型的方法及其应用

1.本发明属于微流控芯片技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片建立二型糖尿病体外模型的方法及其应用。


背景技术：

2.糖尿病严重危害人类健康和生活质量，已引起世界范围内关注，也是生命科学领域的研究热点。二型糖尿病(diabetes mellitus type 2,t2dm)患者主要表现为胰岛素分泌相对不足，胰岛素抵抗是其重要的病理生理基础。然而，由于糖尿病以多器官参与为主要特征及其复杂的病理特点，与其相关的研究技术手段尚不充分。传统体外模型仅针对一种器官类型，无法兼顾糖尿病复杂的病理特点。因此，建立一种反映糖尿病病理特征并适合快速开展降糖药物评价的糖尿病研究新体系，深入研究糖尿病的基本规律、病理生理过程，对于糖尿病的治疗和药物研发等具有重要意义。
3.在体内，糖尿病是一个复杂的病理过程，涉及多种组织器官间的复杂交互作用。如生理条件下，体内糖调节稳态受肌肉和胰腺等组成的反馈环的调控，其中胰岛β细胞经糖刺激后可释放胰岛素，并促进肌肉等胰岛素敏感组织对葡萄糖的摄取，从而调控糖水平的稳态。当在病理条件下，肌肉等组织发生胰岛素抵抗，引起糖调节失衡，糖水平升高，这个过程与t2dm发生发展密切相关。现阶段，针对t2dm的研究手段主要依赖于细胞模型和动物模型。目前常用的二型糖尿病细胞模型的建立方法包括棕榈酸、葡萄糖、胰岛素等诱导法，均具有一定的缺陷。棕榈酸具有明显的细胞毒性，并且水溶性较差，加大了建立模型时操作上的困难；而葡萄糖是细胞生存的必须营养物质，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低，并且影响对糖水平的检测；胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性。最主要的，这些模型都是以单层细胞静态培养为主，只针对一种类型细胞，模型过于简单，不能反映体内组织器官的复杂微环境特点，更难以反映人体组织器官间交互作用以及糖调节的动态调控过程。动物实验在现代医学与生物学中占据了极为重要的位置，但是高成本以及动物伦理等也成了难以回避的问题，并且其难以对生物过程进行定量分析、机制探讨。因此，迫切需要建立一种接近组织/器官水平，并能反映体内组织器官间互作和糖调节动态过程的新模型、新方法，以突破传统现有生物医学研究模型的明显不足，这也是糖尿病研究领域亟待解决的关键问题。
4.微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台，为在体外模拟人体组织器官特点以及组织器官间互作等提供了可能，也为在生理和病理条件下研究糖调节动态调控等提供了一种全新的平台。在生命科学和新药研发等领域显示出重大应用前景。但是目前本领域尚未有与利用微流控芯片技术体外构建具有多器官参与、糖动态调节为特点的二型糖尿病模型有关的报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片建立二型糖尿病体外模型的方法，采用本发明提供的微流控芯片构建的二型糖尿病体外模型具有机制相对明确、稳定性好、成本低、周期短等优点，能够用于糖尿病疾病研究和降糖药物的评价、筛选等。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片，所述微流控芯片具有胰岛功能区和肌肉功能区，所述胰岛功能区和肌肉功能区通过联通通道连接；所述微流控芯片使用胶原蛋白进行表面修饰；所述胰岛功能区用于接种具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞，所述肌肉功能区用于接种具有糖摄取能力的肌肉细胞。
8.优选的，所述胰岛功能区和肌肉功能区的底面积比例为1:1-10:1。
9.优选的，所述联通通道高度比胰岛功能区和肌肉功能区低20-100μm。
10.优选的，所述胰岛细胞和肌肉细胞的数量比为1:1-10:1。
11.本发明还提供了一种建立二型糖尿病体外模型的方法，包括如下步骤：将具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞和具有糖摄取能力的肌肉细胞分别接种至上述微流控芯片中，共培养，使用葡萄糖胺诱导肌肉细胞发生胰岛素抵抗，检测二型糖尿病模型的病理表征。
12.优选的，所述葡萄糖胺的浓度为2-20mm，葡萄糖胺的作用时间为12-48h。
13.优选的，所述病理表征包括检测培养基葡萄糖水平评估模型是否成功，或检测肌肉细胞基因表达水平评估模型是否成功。
14.优选的，所述检测培养基葡萄糖水平评估模型是否成功具体为：加入高糖培养基，模型组培养12-24h葡萄糖水平高于11.1mm，或葡萄糖水平较对照组高3mm以上，则表明二型糖尿病模型构建成功。
15.优选的，所述检测肌肉细胞基因表达水平评估模型是否成功包括：检测模型组肌肉细胞的二型糖尿病相关基因，较对照组表达降低25％以上，则表明二型糖尿病模型构建成功。
16.本发明还提供了一种上述微流控芯片或上述方法在筛选和/或评价降糖药物中的应用。
17.本发明的有益效果：
18.本发明首次提供了一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片，具有多分区灵活设计特点，实现功能细胞的3d共培养。
19.通过在本发明提供的微流控芯片上施加葡萄糖胺诱导肌肉细胞发生胰岛素抵抗，模拟二型糖尿病胰岛素分泌相对不足的病理特征，使得培养体系中维持较高的糖水平，从而得到二型糖尿病体外模型。经由本发明方法构建所得的模型，胰岛细胞可分泌胰岛素，肌肉细胞具胰岛素响应性的糖摄取能力。当肌肉细胞经诱导发生胰岛素抵抗时糖摄取能力发生改变，体系维持较高的糖水平，在此基础上可评估糖尿病治疗药物通过改善胰岛素抵抗、增强胰岛素敏感性等途径实现的降糖作用。采用本发明方法建立的二型糖尿病体外模型同时具备胰岛素分泌与糖摄取这两个糖代谢的关键特征，可以反映体内糖调节的互作特点。且模型糖水平控制范围与接近于人的生理状况，更加有助于评估候选药物的降糖作用。另外，本发明模型建立方法简单可控，成本低廉，周期短。
20.采用本发明方法建立的体外二型糖尿病模型具有机制相对明确、稳定性好、成本
低、周期短等优点，可用于糖尿病疾病研究和降糖药物评价筛选，且可实现通量的筛选，具有很好地稳定性和可靠性，能够相对更加准确的评估降糖药物的作用，为降糖药物的筛选提供了新的思路，具有很好地市场前景。
附图说明
21.图1为本发明微流控芯片示意图；
22.图2为糖尿病模型表征，其中a为肌肉细胞的2-nbdg摄取示意图，a中从左至右分别为肌肉细胞组、胰岛肌肉细胞共培养组、胰岛肌肉细胞共培养加诱导剂组，b为2-nbdg摄取的定量结果，c为葡萄糖水平的定量结果；
23.图3为糖尿病模型表征降糖药物评价，其中a为模型组的葡萄糖水平变化；b为模型组肌肉细胞胰岛素抵抗相关基因表达变化；
24.图4为降糖药物评价，其中a为降糖药物对葡萄糖水平的影响，b为降糖药物对肌肉细胞的胰岛素抵抗相关基因表达的影响。
具体实施方式
25.本发明提供了一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片，所述微流控芯片具有胰岛功能区和肌肉功能区，所述胰岛功能区和肌肉功能区通过联通通道连接；所述微流控芯片使用胶原蛋白进行表面修饰；所述胰岛功能区用于接种具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞，所述肌肉功能区用于接种具有糖摄取能力的肌肉细胞。
26.本发明对于微流控芯片中胰岛功能区和肌肉功能区的具体位置没有特殊限定，两个功能区有一定间隔即可。本发明对于修饰微流控芯片的胶原蛋白、具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞和具有糖摄取能力的肌肉细胞的具体来源没有特殊限定。在本发明中，所述胰岛功能区和肌肉功能区的底面积比优选为1:1-10:1，更优选为3:1-7:1；所述联通通道高度比胰岛功能区和肌肉功能区优选的低20-100μm，更优选的低40-70μm。在本发明中，胰岛功能区中胰岛细胞和肌肉功能区中肌肉细胞的数量比优选为1:1-10:1，更优选为3:1-7:1。本发明所述用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片示意图如图1所示。
27.本发明还提供了一种建立二型糖尿病体外模型的方法，包括如下步骤：将具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞和具有糖摄取能力的肌肉细胞分别接种至上述微流控芯片中，共培养，使用葡萄糖胺诱导肌肉细胞发生胰岛素抵抗，检测二型糖尿病模型的病理表征。
28.在本发明中，优选的是将胰岛细胞和肌肉细胞分别制成细胞悬液，然后分别接种至微流控芯片中，本发明对于胰岛细胞悬液和肌肉细胞悬液的培养液以及各细胞悬液的浓度没有特殊限定。在本发明中，所述培养优选的为37℃培养，每隔24h换液一次。共培养结束后，使用葡萄糖胺诱导肌肉细胞发生胰岛素抵抗，所述葡萄糖胺的浓度优选为2-20mm，更优选为5-15mm，葡萄糖胺的作用时间优选为12-48h，更优选为15-40h。
29.在本发明中，使用葡萄糖胺诱导肌肉细胞发生胰岛素抵抗后，检测二型糖尿病模型的病理表征，以判断二型糖尿病模型是否构建成功。所述病理表征优选的包括检测培养基葡萄糖水平评估模型是否成功，或检测肌肉细胞基因表达水平评估模型是否成功。
30.本发明对于培养基葡萄糖水平以及肌肉细胞基因表达水平的具体检测方法没有特殊限定。在本发明中，依据检测培养基葡萄糖水平评估模型是否成功，优选的为：加入高
糖培养基，模型组培养12-24h葡萄糖水平高于11.1mm，或葡萄糖水平较对照组高3mm以上，则表明二型糖尿病模型构建成功。依据检测肌肉细胞基因表达水平评估模型是否成功，优选的为：检测模型组肌肉细胞的二型糖尿病相关基因，较对照组表达降低25％以上，则表明二型糖尿病模型构建成功。在本发明中，所述二型糖尿病相关基因优选的包括insr、ins-1、glut-4。
31.本发明还提供了一种上述微流控芯片或上述方法在筛选和/或评价降糖药物中的应用。
32.采用本发明微流控芯片进行降糖药物评价或筛选时，优选的包括如下步骤：确定体外二型糖尿病模型构建成功后，施加不同浓度药物，作用24-48h；收集培养基，进行葡萄糖水平的检测，评估药物的降糖效应；或者对肌肉细胞进行免疫荧光染色观察，评估药物对肌肉细胞胰岛素抵抗相关蛋白的影响；或者收集肌肉细胞进行rt-pcr分析，评估药物对细胞胰岛素抵抗相关基因的影响。
33.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1
37.一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片(示意图如图1所示)，具有胰岛功能区(用于接种具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞)和肌肉功能区(用于接种具有糖摄取能力的肌肉细胞)，胰岛功能区和肌肉功能区通过联通通道连接，芯片使用胶原蛋白进行表面修饰。胰岛功能区和肌肉功能区的底面积比为2:1，联通通道高度比胰岛功能区和肌肉功能区低30μm。在本发明中，胰岛功能区中胰岛细胞和肌肉功能区中肌肉细胞的数量比为2:1。
38.实施例2
39.一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片，具有胰岛功能区(用于接种具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞)和肌肉功能区(用于接种具有糖摄取能力的肌肉细胞)，胰岛功能区和肌肉功能区通过联通通道连接，芯片使用胶原蛋白进行表面修饰。胰岛功能区和肌肉功能区的底面积比为8:1，联通通道高度比胰岛功能区和肌肉功能区低80μm。在本发明中，胰岛功能区中胰岛细胞和肌肉功能区中肌肉细胞的数量比为8:1。
40.实施例3
41.一种用于建立二型糖尿病体外模型的微流控芯片，具有胰岛功能区(用于接种具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞)和肌肉功能区(用于接种具有糖摄取能力的肌肉细胞)，胰岛功能区和肌肉功能区通过联通通道连接，芯片使用胶原蛋白进行表面修饰。胰岛功能区和肌肉功能区的底面积比为5:1，联通通道高度比胰岛功能区和肌肉功能区低50μm。在本发明中，胰岛功能区中胰岛细胞和肌肉功能区中肌肉细胞的数量比为5:1。
42.实施例4
43.分别将具有胰岛素分泌功能的胰岛和具有糖摄取能力的肌肉细胞调整至106cells/ml的细胞悬液，加入实施例1中对应功能区，细胞贴附于芯片基面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养，每隔24h换液一次。将16mm葡萄糖胺加入肌肉功能区作用时间为24h，构建模型(模型组，记为胰岛肌肉细胞共培养加诱导剂组)。成功造模后，加入含
5mm 2-nbdg的pbs替换培养基，以单独的肌肉细胞组、单独的胰岛细胞组、胰岛肌肉细胞共培养组为对照，30min后，使用荧光显微镜拍照，结果如图2a所示，使用软件细胞荧光亮度进行定量，结果如图2b所示。加入20mm葡萄糖的培养基。24h后收集培养基，使用葡萄糖检测试剂盒进行葡萄糖水平的检测，结果如图2c所示。16mm葡萄糖胺处理24h后，糖水平可维持在11.1mm的水平。可见，造模成功后，模型组的葡萄糖摄取能力明显减弱，培养基的葡萄糖水平维持在较高的水平，反映了糖尿病较低糖摄取能力和血糖升高的病理特征。
44.实施例5
45.分别将具有胰岛素分泌功能的胰岛和具有糖摄取能力的肌肉细胞调整至107cells/ml的细胞悬液，加入实施例2中对应功能区，细胞贴附于芯片基面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养，每隔24h换液一次。肌肉功能区未加入葡萄糖胺进行造模，为control组作基准。将16mm葡萄糖胺加入肌肉功能区作用时间为24h，构建模型(模型组，gcm 16mm组)。成功造模后，加入20mm葡萄糖的培养基。24h后收集培养基，使用葡萄糖检测试剂盒进行葡萄糖水平的检测，结果如图3a所示。可见，造模成功后，模型组的葡萄糖摄取能力明显减弱，培养基的葡萄糖水平维持在较高的水平，反映了糖尿病较低糖摄取能力和血糖升高的病理特征。
46.收集肌肉细胞进行mrna的提取与纯化，向细胞中加入rnaiso plus溶液，使细胞充分裂解；加入氯仿，涡旋混匀15s，在室温下放置3min；冷冻离心机转速12000rpm，4℃离心15min，离心后液体分为三层，吸取上层水相移入一新ep管中，加入异丙醇混匀，室温放置10min；冷冻离心机转速12000rpm，4℃离心10min，小心弃上清，缓慢沿管壁加入depc水配制的75％乙醇进行洗涤；冷冻离心机转速12000rpm，4℃离心5min，小心弃上清，保留小块沉淀，在超净台干燥5min；将干燥后的mrna溶解于depc水中，置于-80℃冰箱中保存备用。
47.反转录cdna。取出反转录试剂盒(takara)中的各种试剂和稀释备用的mrna溶液，依次加入pcr管中，置于pcr仪中进行反转录反应，反应结束后将反转录得到的cdna置于-80℃冰箱中保存备用。
48.荧光定量rt-pcr检测。取出sybr荧光定量pcr反应试剂盒(takara)中的各种试剂和cdna溶液，分装至pcr反应板中，置于pcr仪中，进行rt-pcr反应，pikoreal软件记录各孔的吸光度(ct)值。计算基因的相对表达量开展数据分析。分析glut-4、insr、irs-1胰岛素抵抗相关基因表达变化。结果如图3b所示，可见模型组的胰岛素抵抗相关基因表达发生明显变化。结果表明本发明构建的模型能够反映二型糖尿病的机理特点。
49.实施例6
50.降糖药物评价应用
51.在实施例4构建所得的体外二型糖尿病模型中，分别加入不同浓度(0.1μm、1μm、10μm、100μm、1mm)二甲双胍处理，处理24h后收集培养基，检测葡萄糖水平。肌肉功能区未加入葡萄糖胺进行造模为control组作基准，以未加入二甲双胍的体外二型糖尿病模型为model组，结果如图4a所示，可见经不同浓度二甲双胍处理后，模型组升高的糖水平明显降低。
52.收集肌肉细胞进行细胞rna提取、rna反转录、定量pcr检测及数据分析，具体实验过程同实施例5。分析glut-4、insr、irs-1胰岛素抵抗相关基因表达变化。结果如图4b所示，可见经二甲双胍处理处理后，模型组降低的胰岛素抵抗相关基因表达明显升高。证实了该模型具有很好的降糖药物评价的潜力，尤其针对二型糖尿病的降糖药物，具有评价结果准
确的优势。
53.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。