PHB1基因敲除非人动物的构建方法及其应用与流程

phb1基因敲除非人动物的构建方法及其应用
技术领域
1.本技术涉及基因敲除非人动物的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种phb1基因脑敲除非人动物的构建方法及其在毒理学和生物医药领域的应用。


背景技术：

2.脉络丛（choroid plexus, cp）是由室管膜向脑室内陷后分化而形成的，在脑室内呈网状排列，根据其解剖定位不同，可以分为侧脑室脉络丛，第三脑室脉络丛及第四脑室脉络丛三种。脉络丛不仅是脑脊液(cerebrospinal fluid, csf)的重要来源，而且可以通过其活性上皮所构成的血-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, bcb)将一些血源性物质有选择地向csf内转运，以维持csf环境的稳态，同时也阻止了一些存在于外周循环中的有害因子对脑组织可能造成的损伤。
3.在外源物质的毒性作用和药理作用中，脉络丛具有双重特性，既有神经保护作用（阻隔毒物进入脑组织和脑脊液）；又是一些神经毒物的靶组织（作为毒物蓄积的部位；或外源物质毒性作用可直接导致bcb结构和功能损伤）。从神经保护的角度来看，脉络丛具有大量的微绒毛和特定功能的蛋白受体/转运体，能够有选择地主动吸收或排出一些特定的物质，可作为一些有毒重金属（如铅、汞、镉等化合物）和其它外源化合物（如药物等）的贮存场所，在脉络丛组织内屏护并浓缩这些有毒重金属和有毒物质，阻止它们进入脑脊液，保持脑脊液成分的稳定，进而对中枢神经系统起到保护作用。
4.脉络丛在脑的发育、成熟、老化过程、内分泌调控以及一些神经退行性疾病的发病机理中也发挥着很重要的作用。另外，对于脉络丛在脑组织炎症、老化以及继发性神经毒性机制方面的研究均有所报道。但是，国内在这些方面的研究却很有限，主要集中于脉络丛的囊肿与肿瘤等方面，对于与脉络丛相关的毒理药理研究方面未引起足够的重视，有必要进一步加强。通过系统研究bcb在内、外源性化合物作用下的反应机制、在神经性损伤及损伤后修复过程中所发挥的作用及其调控机理等，有可能发现一些神经性毒物\神经损伤的早期诊断标志物与cns(中枢神经系统)特异性药物的转运蛋白等，推动cns疾病诊治水平的发展。
5.抑制素蛋白（prohibitin，phb1）由275个氨基酸组成，是一种结构上高度保守，广泛分布于真核生物线粒体内功能多样的蛋白。它主要参与维持线粒体结构和功能，保护细胞抵御老化，调节细胞内铁动态平衡，以及作为分子伴侣蛋白参与线粒体蛋白的稳定和线粒体结构的维持。此外，phb1在细胞核和胞浆中的分布也使它参与到细胞周期、凋亡和转录调节等活动中，并作为细胞表面受体参与到细胞内信号转导。phb1的表达变化直接影响着氧化应激的增加和线粒体功能障碍、结构的异常，这与某些疾病如癌症、炎性疾病、胰岛素抵抗2型糖尿病等的诱发以及慢性病的药物治疗有密切的关系。
6.phb1在线粒体中的作用是目前研究最深入也是最明确的，phb1和phb2相互结合形成异物二聚体，每12-16个异物二聚体进一步聚合形成同心圆型地基样结构，并通过它们共有的氨基端亲脂性结构域锚定于线粒体内膜上，发挥分子伴侣蛋白作用，维持线粒体的和
功能，并作为线粒体内铁储存蛋白维持体内铁动态平衡以及参与抗凋亡作用。
7.近年来，人们通过免疫组织化学法和免疫共沉淀等技术发现phb1在乳腺癌细胞系和前列腺细胞系与e2f转录因子家族成员、rb蛋白家族成员、p53肿瘤抑制蛋白等其他肿瘤生长抑制蛋白共定位于细胞核，并且通过与它们各自的交互作用发挥细胞增殖抑制和促凋亡作用。这也是phb1渐渐被人们做为抗肿瘤药物研究的靶蛋白而受到重视的原因。
8.krishnaraj和thomas于2005年通过sirna技术建立phb1基因沉默细胞系，发现phb1蛋白的另一种作用，即在浆膜上作为raf-1的分子伴侣蛋白参与到的ras活化以及ras与raf-1的结合，并稳固锚定到浆膜上，发生一系列磷酸化过程，如酪氨酸341与丝氨酸338（tyrosine 341、serine 338）、去磷酸化（serine 259）、二聚合反应等使raf-1进一步活化，通过磷酸化下游的mek蛋白激酶、erk激酶（the serine/ threonine specific extra cellular signal-regulated kinase，erk）和mapk激酶（mitogen-activated protein kinases，mapk）来发挥调节细胞增殖、分化、细胞死亡、有丝分裂、迁移、炎症等过程的作用。
9.除了对细胞周期的调控作用，phb1还具有多种功能，其不同定位以及在多种疾病中存在差异表达的现象提示，phb1可能参与疾病的发生与发展过程。目前phb1被认为是评价肝损伤、鼻咽癌等疾病病程进展及患病风险预测的潜在生物标志物指标，被作为肿瘤、肥胖、糖尿病等疾病治疗的新的药物靶标蛋白。
10.前期研究已经证实：锰（6mg/kg
·
bw）对大鼠脉络丛组织具有病理损伤作用，并可引起脉络丛组织中phb1蛋白表达上调；体外研究中，锰作用下，脉络丛上皮细胞系z310发生细胞周期阻滞并且phb1蛋白表达上调，结合phb1的分子调控机制，推断其在锰致z310细胞周期阻滞中发挥着重要的调控作用，但其确切的调控机制尚不清楚。
11.基于以上研究结果与问题，以及条件性基因敲除的cre/loxp重组系统，应用crispr/cas9系统, 将loxp基因定点插入到大鼠phb1基因的5’端和3’端的内含子中，之后将体外构建好的这段基因序列转入受精卵中，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列，并植入到假孕大鼠的子宫使其重新发育成一个完整的胚胎，最终成为一只在目标基因两侧内含子中带有loxp位点的转基因大鼠，用adgra3-creert2基因敲入大鼠与其杂交后，即可在子代中筛选出phb1基因脑脉络丛组织条件性敲除大鼠。phb1基因条件性敲除非人动物的构建，将有助于我们从整体动物水平上验证与挖掘phb1在锰致脉络丛组织上皮细胞凋亡与周期阻滞效应中确切的分子调控机制，以及phb1所调控的锰致脉络丛上皮细胞周期阻滞的后果如何，是否会影响到脉络丛的分泌功能，是否不利于多巴胺神经元特异性神经营养因子gdf-15 的合成和分泌，以及是否最终影响多巴胺神经元的损伤修复等等，因此，本领域急需开发phb1基因敲除非人动物模型。
12.非专利文献“liver
‐
specific deletion of prohibitin 1 results in spontaneous liver injury, fibrosis, and hepatocellular carcinoma in mice
”ꢀ
hepatology, 2010, 52(6):2096-2108公开了一种肝phb1基因敲除小鼠，该基因敲除小鼠仅通过cre/loxp重组系统构建。
13.因此，现有技术仅公开了用于肝脏研究的肝phb1基因敲除小鼠，但是并没有公开脉络丛phb1基因敲除非人动物，并且还没有公开利用cre/loxp重组系统和crispr/cas9系统组合构建的phb1基因敲除非人动物。


技术实现要素：

14.本发明的第一方面，涉及一种phb1基因敲除非人动物的构建方法，所述的方法包括敲除phb1基因，使得非人动物的脉络丛组织中phb1蛋白不表达或表达的phb1蛋白不具有功能。优选的，敲除phb1基因的编码序列、基因组dna序列、敲除控制phb1蛋白表达的序列或者敲除phb1蛋白的功能区域。
15.优选的，所述的脉络丛组织包括但不限于上皮组织和结缔组织，包括但不限于上皮细胞、室管膜细胞和巨噬细胞等等。
16.其中，敲除的phb1基因的编码序列包含phb1基因的4号至5号外显子的编码序列。
17.本发明使用基因编辑技术进行phb1基因敲除非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶、rnai技术、cre/loxp技术、flp/frt技术或其他分子生物学技术或其组合。进一步优选的，所述基因编辑技术利用crispr/cas9技术和/或cre/loxp技术的组合。
18.优选的，在非人动物phb1基因座插入同向的特异性重组位点识别序列，获得条件性phb1基因敲除flox非人动物，向条件性phb1基因敲除flox非人动物导入重组酶或重组酶表达序列，删除条件性phb1基因敲除flox非人动物phb1基因，获得phb1基因敲除非人动物。
19.进一步优选的，所述插入的位点为3号内含子和5号内含子。
20.进一步优选的，所述的phb1基因敲除4号外显子至5号外显子。
21.进一步优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列包括但不限于loxp或frt。
22.进一步优选的，所述的重组酶包括但不限于cre或flp。
23.更进一步优选的，在非人动物phb1基因的3号内含子和5号内含子各插入一个loxp或frt序列，获得条件性phb1基因敲除flox非人动物，将条件性phb1基因敲除flox非人动物与脉络丛组织中表达cre或flp重组酶的非人动物交配，利用cre-loxp或flp-frt基因重组系统，获得phb1基因敲除非人动物。
24.优选的，所述的脉络丛组织中表达cre或flp重组酶的非人动物为将编码cre的核苷酸序列敲入编码脉络从组织中表达的蛋白的基因中获得。
25.进一步优选的，所述的编码cre的核苷酸序列可以为编码cre-er的核苷酸序列以及从蛋白角度或从基因角度优化的序列，包括但不限于编码cre-ert、cre-ert2或者icre-ert2的核苷酸序列。
26.进一步优选的，所述的编码脉络从组织中表达的蛋白的基因为adgra3基因。敲入位置优选为启动子之后，使得敲入的编码cre的核苷酸序列受到adgra3基因的调控元件控制。
27.优选的，所述的构建方法包括使用sgrna和/或打靶载体将loxp或frt序列插入phb1基因座。
28.优选的，所述的sgrna3
´
末端包含pam序列，进一步优选的，所述的pam序列可以为agg、tgg或ggg。
29.进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.1-7任一项所示，所述的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8-14任一项所示。
30.更进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.5所示，所述
的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8所示。
31.优选的，所述sgrna的底链寡核苷酸与seq id no.15-28任一项具有80%以上的同源性或者包含seq id no.15-28任一项所示的核苷酸序列。
32.进一步优选的，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体dna序列，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包括同向的特异性重组位点识别序列、phb1基因核苷酸序列、同向的特异性重组位点识别序列。
33.更进一步优选的，所述的phb1基因核苷酸序列包含phb1基因的4号至5号外显子。
34.更进一步优选的，所述的5’臂如seq id no.51所示。
35.更进一步优选的，所述的3’臂如seq id no.52所示。
36.更进一步优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列为loxp或frt。本发明所述的非人动物选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
37.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
38.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将打靶载体、靶向phb1基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，子代与表达cre或flp重组酶的非人动物杂交，鉴定筛选获得phb1基因敲除非人动物。
39.优选的，所述的构建方法包括如下步骤：1）将序列如seq id no.1-14所示的任一或多项sgrna靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；2）合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna，将上述片段依次通过酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；3）分别合成步骤1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2）所述的pt7-sgrna载体的双链；4）将步骤3）中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。
40.5）设计打靶载体，构建并获得包含loxp/frt重组系统的打靶载体，打靶载体包含phb1基因同源序列，2个loxp/frt序列、3’臂和5’臂；6）将sgrna载体的体外转录产物和cas9 mrna以及打靶载体进行混合，获得混合液，将混合液注射至非人动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母体非人动物的输卵管中发育，得到f0代非人动物；7）将f0代非人动物利用pcr技术进行检验，验证打靶载体导入情况，获得导入打靶载体阳性非人动物；8）将步骤7）筛选的阳性非人动物通过与表达cre或flp重组酶的非人动物杂交，建立稳定的phb1基因敲除非人动物。
41.本发明的第二方面，涉及一种采用上述构建方法获得的phb1基因敲除非人动物或其后代。
42.本发明的第三方面，涉及一种条件性phb1基因敲除flox非人动物的构建方法，在
非人动物phb1基因座插入同向的特异性重组位点识别序列。
43.优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列包括但不限于loxp或frt。
44.优选的，所述的插入位点为phb1基因的3号内含子和5号内含子。
45.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物phb1基因的3号内含子和5号内含子各插入一个loxp或frt序列，获得条件性phb1基因敲除flox非人动物。
46.优选的，所述的phb1基因敲除4号至5号外显子。
47.优选的，所述的构建方法包括使用sgrna和/或打靶载体将loxp或frt序列插入phb1基因座。
48.优选的，所述的sgrna3
´
末端包含pam序列，进一步优选的，所述的pam序列可以为agg、tgg或ggg。
49.进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.1-7任一项所示，所述的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8-14任一项所示。
50.更进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.5所示，所述的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8所示。
51.优选的，所述sgrna的底链寡核苷酸与seq id no.15-28任一项具有80%以上的同源性或者包含seq id no.15-28任一项所示的核苷酸序列。
52.进一步优选的，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体dna序列，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包括同向的特异性重组位点识别序列、phb1基因核苷酸序列、同向的特异性重组位点识别序列。
53.更进一步优选的，所述的phb1基因核苷酸序列包含phb1基因的4号至5号外显子。
54.更进一步优选的，所述的5’臂如seq id no.51所示。
55.更进一步优选的，所述的3’臂如seq id no.52所示。
56.更进一步优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列为loxp或frt。
57.本发明所述的非人动物选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
58.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
59.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括以下步骤：构建产生sgrna的载体并获得sgrna体外转录产物、构建包含外源核苷酸序列的打靶载体、将sgrna体外转录产物和cas9 mrna以及打靶载体导入非人动物细胞，并进一步植入假孕母鼠的子宫，获得非人动物或其子代。其中，所述的非人动物细胞可以为非人动物的受精卵细胞、es细胞、体细胞。
60.优选的，所述的构建方法包括如下步骤：1）将序列如seq id no.1-14所示的任一或多项sgrna靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；2）合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna，将上述片段依次通过酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；3）分别合成步骤1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚
核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2）所述的pt7-sgrna载体的双链；4）将步骤3）中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。
61.5）设计打靶载体，构建并获得包含loxp/frt重组系统的打靶载体，打靶载体包含phb1基因同源序列，2个loxp/frt序列、3’臂和5’臂；6）将sgrna载体的体外转录产物和cas9 mrna以及打靶载体进行混合，获得混合液，将混合液注射至非人动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母体非人动物的输卵管中发育，得到f0代非人动物；7）将f0代非人动物利用pcr技术进行检验，验证打靶载体导入情况，获得导入打靶载体阳性非人动物，即为条件性phb1基因敲除flox非人动物。
62.本发明的第三方法，涉及一种采用上述的构建方法获得的条件性phb1基因敲除flox非人动物。
63.本发明的第四方面，涉及一种上述的条件性phb1基因敲除flox非人动物用于敲除非人动物的phb1基因。
64.本发明的第五方面，涉及一种靶向phb1基因的sgrna，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.1-7任一项所示，所述的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8-14任一项所示。
65.更进一步优选的，所述的sgrna靶向的5’端靶位点序列如seq id no.5所示，所述的sgrna靶向的3’端靶位点序列如seq id no.8所示。
66.优选的，所述sgrna的底链寡核苷酸序列与seq id no.15-28任一项具有80%以上的同源性或者包含seq id no.15-28任一项所示的核苷酸序列。
67.本发明的第六方面，涉及一种包含上述sgrna的载体。优选的，所述的载体包括t7启动子及sgrnascaffold的片段dna。
68.优选的，所述的载体为病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。
69.本发明的第七方面，涉及一种打靶载体，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体dna序列，所述的供体dna序列从5
’‑3’
包括同向的特异性重组位点识别序列、phb1基因核苷酸序列、同向的特异性重组位点识别序列。
70.优选的，所述的phb1基因核苷酸序列包含phb1基因的4号至5号外显子。
71.优选的，所述的5’臂如seq id no.51所示。
72.优选的，所述的3’臂如seq id no.52所示。
73.优选的，所述的同向的特异性重组位点识别序列为loxp或frt。
74.优选的，所述的打靶载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因可以为白喉毒素a亚基的编码基因（dta）、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（hsv-tk）、sacb、rpsl（stra）、tetar、phes、thya、cacy、gata-i或ccdb等。
75.在本发明的一个具体实施方式中，所述的打靶载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因可以为新霉素磷酸转移酶编码序列neo、潮霉素b磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶
（hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。
76.本发明的第八方面，涉及一种sgrna的载体的制备方法，包括如下步骤：1）将序列如seq id no.1-14所示的任一项sgrna靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；2）合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna，将上述片段依次通过酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；3）分别合成步骤1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2）所述的pt7-sgrna载体的双链；4）将步骤3）中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。
77.本发明的第九方面，涉及一种编码上述的sgrna的dna分子。
78.本发明的第十方面，涉及一种包含上述打靶载体，上述靶向phb1基因的sgrna，上述的包含上述sgrna的载体或者上述dna分子的细胞。
79.本发明的第十一方面，涉及一种包含上述打靶载体，上述靶向phb1基因的sgrna，上述的包含上述sgrna的载体，上述dna分子，或者上述的细胞在phb1基因敲除中的应用。
80.本发明的第十二方面，涉及一种动物的疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的非人动物或其后代、上述的构建方法获得的非人动物或其后代。优选的，所述的疾病包括肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症。例如荷瘤动物模型。
81.本发明的第十三方面，提供了一种动物的疾病模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述非人动物的步骤；优选的，所述的疾病包括肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症，进一步优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
82.本发明的第十四方面，提供了上述的sgrna、上述的包含上述sgrna的载体、上述的dna分子、上述的打靶载体、上述的非人动物或其后代或上述构建方法获得的非人动物或其后代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症。
83.本发明的第十五方面，提供了上述的sgrna、上述的包含上述sgrna的载体、上述的dna分子、上述的打靶载体、上述的非人动物或其后代、上述构建方法获得的非人动物或其后代或上述的疾病模型在重金属或其他有毒物质对大脑脉络丛的毒理作用研究以及制备治疗肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。
84.本发明的第十六方面，涉及一种细胞、组织或器官，其来源于上述的非人动物或其后代，或者疾病模型。
85.本发明的第十七方面，涉及了一种上述的非人动物或其后代、上述的构建方法获得的非人动物或其后代、上述的细胞、组织或器官在制备治疗或预防肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症的药物中的应用。
86.本发明的第十八方面，涉及一种上述的非人动物或其后代、上述的构建方法获得的非人动物或其后代、上述的细胞、组织或器官在phb1基因或蛋白中相关研究中的应用，所述的应用包括：a）涉及细胞周期调控的产品开发中的应用；b）作为毒理学、药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；
c）涉及细胞周期调控过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学、毒理学研究、用于开发诊断策略或用于开发治疗策略中的应用；d）在体内研究phb1信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，e）研究phb1基因或蛋白功能，研究针对phb1靶位点的药物、药效，研究肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、抗肿瘤或炎症药物方面的用途。
87.本发明所述的“脉络丛相关疾病”包括但不限于脉络膜囊肿、脉络膜增大、脉络膜乳头状瘤、脑膜瘤、脑室炎、神经丛炎、sturge-weber综合征或神经纤维瘤病。
88.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
89.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。
90.本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
91.本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。
92.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度。
93.本发明所述的cre-er是指将人雌激素受体（estrogen receptor，简称er）的配体结合区（lbd）与cre重组酶相融合后，形成的定位于胞浆中的融合蛋白（cre-er），只有在激素诱导后，融合的cre蛋白才会发生构象变化从锚定蛋白hsp90上解离下来，进入细胞核，识别loxp位点并发生切割。
c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
100.本发明所述的术语wildtype allele (wt)：即野生型大鼠；本发明所述的术语targeted allele (fl)：即由f0代鼠和野生型大鼠交配获得的f1代阳性杂合子大鼠。
101.本发明所述的术语deleted allele (δ)：即由fl大鼠和组织特异性cre或cre-deleter大鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的大鼠。
102.本发明的技术效果在于应用crispr/cas9与cre/loxp两大基因重组系统进行基因条件性敲除重组，以脉络丛组织这个新的视点为研究靶标：脉络丛组织在脑的发育、成熟、老化过程、内分泌调控以及一些神经退行性疾病的发病机理中发挥着很重要的作用。在外源物质的毒性作用和药理作用中，脉络丛具有双重特性，既有神经保护作用（阻隔毒物进入脑组织和脑脊液）；又是一些神经毒物的靶组织（作为毒物蓄积的部位；或外源物质毒性作用可直接导致bcb结构和功能损伤）。并且基于一定的研究基础，直接对功能性蛋白phb1的基因进行修饰，可更好地探讨phb1在毒性发生过程中所发挥的作用机制，同时目前尚未有脑脉络丛phb1基因条件性敲除非人动物模型的建立。
103.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
104.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
105.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：图1：phb1基因条件性敲除大鼠的技术路线图；图2：f1代鼠尾dna的southern blot检测结果；图3：sgrna1-sgrna14活性检测结果，其中，con为阴性对照，pc为阳性对照；图4：打靶策略示意图；图5：southern blot筛选策略的示意图；图6：酶切及测序验证结果，其中1使用限制性内切酶为kpni，目标片段长度为4116bp 2973bp，2使用限制性内切酶为ecori，目标片段长度为5519bp 1138bp 432bp；3使用限制性内切酶为xhoi，目标片段长度为4085bp 3004bp，ck为对照组；图7：f0代大鼠基因型检测结果，其中m为marker，wt为野生型对照，h2o为水对照，a为（ege-zk-033）-l-gt-f/cko-3'-do-r引物检测结果，b为cko-5'-do-f/（ege-zk-033）-r-gt-r引物检测结果；图8：f1代大鼠基因型检测结果，其中m为marker，wt为野生型对照， 为阳性对照，h2o为水对照，a为（ege-zk-033）-l-gt-f/cko-3'-do-r引物检测结果，b为cko-5'-do-f/（ege-zk-033）-r-gt-r引物检测结果；图9：获得组织特异性phb1基因敲除大鼠方案，wt即野生型大鼠，fl即由f0代鼠和
野生型大鼠交配获得的f1代阳性杂合子大鼠，δ即由fl大鼠和组织特异性cre或cre-deleter大鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的大鼠；图10：条件性phb1基因敲除第一步方案基因型图谱（一）；图11：条件性phb1基因敲除第一步方案基因型图谱（二）；图12：条件性phb1基因敲除第二步方案基因型图谱；图13：获得phb1全基因敲除大鼠方案，wt即野生型大鼠，fl即由f0代鼠和野生型大鼠交配获得的f1代阳性杂合子大鼠，δ即由fl大鼠和组织特异性cre或cre-deleter大鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的大鼠；图14：phb1全基因敲除第一步方案基因型图谱；图15：phb1全基因敲除第二步方案基因型图谱；图16：pcs-3g载体示意图；图17：rna电泳图，电泳条件为65℃，5min。
具体实施方式
106.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
107.实施例1条件性phb1基因敲除flox大鼠为了敲除phb1基因，主要通过cre/loxp重组系统敲除大鼠phb1基因，利用crispr/cas9系统将loxp插入大鼠phb1基因座，获得条件性phb1基因敲除flox大鼠，向条件性phb1基因敲除flox大鼠导入重组酶或重组酶表达序列，删除条件性phb1基因敲除flox动物phb1基因，使脉络丛组织中phb1蛋白不表达或表达的phb1蛋白不具有功能，从而获得phb1基因敲除大鼠，具体构建方法如图1所示。
108.首先引入crispr/cas系统进行基因编辑，该系统中靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率，但不同品系，基因序列可能有差异。为了保证所设计crispr/sgrna的效率，首先需要对大鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以保证sgrna识别序列与构建品系大鼠dna序列完全一致。pcr引物如表1所示。
109.高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提，设计并合成识别sgrna靶位点序列（sgrna1-sgrna14），其中，各sgrna靶向的靶位点序列如表2所示，各sgrna的底链寡核苷酸序列如表3所示。按照已设计sgrna序列合成oligos，通过gibson无缝连接的方式连入pcs-3g质粒如图16，连接产物转化后送样测序验证正确。
110.表1：pcr引物名称及具体序列
表2 sgrna序列列表表3：sgrna的底链寡核苷酸序列
利用百奥赛图自主开发的检测试剂盒（uca
tm
）对sgrna/cas9进行活性检测，活性检测结果如图3所示，从中综合选择sgrna5和sgrna8进行后续实验。
111.接下来，crispr/cas9体外转录，具体步骤如下：1）制备获得sgrna正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，其中，sgrna5和sgrna8的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列分别如seq id no.33-36所示，见表4；2）合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna，将上述片段依次通过酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得带t7启动子质粒载体（pt7-sgrna）；3）分别合成步骤1）中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2）所述的pt7-sgrna载体的双链（seq id no：15-28）；4）将步骤3）中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体并进行体外转录，得到用于显微注射的rna，结果如图17所示。
112.表4：sgrna5和sgrna8正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列
下一步，选择sgrna5和sgrna8的sgrna/cas9靶位点序列信息设计并构建phb1基因条件性敲除打靶载体，设计如图4所示的打靶策略，打靶载体上含有大鼠phb1基因同源序列，2个loxp序列、3’臂和5’臂，依次为5’臂（seq id no.51）、loxp、phb1基因同源序列（e4、5）、loxp、3’臂（seq id no.52）。其中，5’端和3’端loxp位点分别插入在intron3和intron5中；5’端和3’端的同源臂分别为1423bp 和1437bp。
113.打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的打靶载体通过酶切鉴定和测序进行验证，结果如图6所示，1-3均为阳性克隆。将验证正确的打靶载体用于后续实验。
114.将sgrna载体的体外转录产物和cas9 mrna以及打靶载体进行混合，获得混合液，将混合液注射至大鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，利用pcr技术进行检测确认打靶载体导入情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，其中pcr整合检测引物如表5所示：表5：loxp序列插入检测引物将筛选出的正确的阳性克隆细胞移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到f0代大鼠，即flox大鼠。对f0代大鼠基因型进行检测，所使用的pcr引物如表6所示，结果如图7所示，通过pcr扩增及产物测序，表明ek33-30、ek33-36、ek33-39、ek33-46、ek33-52 和ek33-54为f0代阳性鼠。将f0代阳性大鼠与野生型大鼠交配得到f1代，并对f1代鼠进行pcr鉴定及测序检测，其中pcr检测引物如表6所示。如图8所示通过pcr及测序，表明1ek33-21、1ek33-28、1ek33-38和1ek33-41为f1代阳性条件性敲除大鼠。
115.表6：f0及f1代大鼠检测pcr引物名称及具体序列pcr反应条件(touchdown)：对f1代pcr鉴定为阳性的大鼠进行southern blot检测，确认是否存在随机插入。
116.southern blot筛选策略的示意图如图5所示。
117.具体设计如下：分别在5’端和3’端loxp位点外侧引入southern blot酶切位点，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；若未正确重组，将只会出现野生型条带。
118.表7 具体探针及目的片段的长度表8探针合成引物
具体探针及目的片段的长度见表7和8，检测结果如图2所示，1ek33-21、1ek33-28、1ek33-38和1ek33-41为 f1代阳性大鼠，并且均没有随机插入。
119.实施例2 条件性phb1基因敲除大鼠为获得脉络丛组织中表达cre重组酶的大鼠，具体的，利用crispr/cas9系统将受他莫昔芬调控的编码icre-ert2的核苷酸序列敲入大鼠adgra3基因启动子下游，大鼠体内的cre重组酶的表达受adgra3基因调控元件调控，使得该大鼠在脉络丛组织中特异性表达cre重组酶。
120.将实施例1中获得的flox杂合子大鼠与脉络丛组织中表达cre重组酶的大鼠杂交，实现目的基因组织特异性的敲除，具体方案如图9所示。wt即野生型大鼠，fl即由f0代鼠和野生型大鼠交配获得的f1代阳性杂合子大鼠，δ即由fl大鼠和组织特异性cre或cre-deleter大鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的大鼠。
121.第一步：与组织特异性cre大鼠（ts-cre）交配，获得fl杂合子大鼠，如图10或11所示；其中基因型检测策略如表9所示：表9 条件性敲除大鼠第一步基因型检测策略此步只能获得杂合子大鼠（fl/ , cre/ ），纯合子大鼠（实验用大鼠）需要进行进一步地交配获得；基因型为 / , cre/ 、fl/ , / 、 / , / 的大鼠，均可用做对照。
122.第二步：获得fl纯合子大鼠，将上一步获得的杂合子大鼠（fl/ , cre/ ），相互交配，得到纯合子大鼠（fl/fl, cre/ ），如图12所示，其中基因型检测策略如表10所示：
表10 条件性敲除大鼠第二步基因型检测策略基因型为fl/fl, cre/ 的大鼠属于实验组（即条件性敲除大鼠），其它基因型的大鼠为对照组，优选对照组是 / ，cre/ 大鼠。
123.本实施例中所使用的引物如表5所示。
124.实施例3phb1全基因敲除大鼠（全身敲除phb1的大鼠）为获得全基因敲除大鼠，将fl杂合子大鼠与cre-deleter大鼠交配，交配方案见图13。wt即野生型大鼠，fl即由f0代鼠和野生型大鼠交配获得的f1代阳性杂合子大鼠，δ即由fl大鼠和组织特异性cre或cre-deleter大鼠交配，获得的组织特异性或全身敲除目的基因的大鼠。
125.第一步：与cre-deleter大鼠交配，获得全基因敲除杂合子大鼠；得到的f1代杂合子大鼠，与cre-deleter大鼠交配，以去除exon4-5。所用的cre-deleter大鼠可以是纯合子，也可以是杂合子，如图14所示。其中基因型检测策略如表11所示：表11全基因敲除大鼠第一步基因型检测策略此步只能获得杂合子大鼠（δ/ , cre/ ），实验用纯合子大鼠需要进一步地交配获得；基因型为 / , cre/ 的大鼠可以用做对照。
126.第二步：获得全基因敲除纯合子大鼠，将杂合子大鼠（δ/ , cre/ ）进一步地交配，如图15所示。其中基因型检测策略如表12所示：表12 全基因敲除大鼠第二步基因型检测策略
基因型为δ/δ的大鼠属于实验组（即全基因敲除大鼠），基因型为δ/ 和 / 的大鼠为对照组。
127.本实施例中所使用的引物如表5所示。
128.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
129.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
130.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。