用于人多能干细胞制造的端到端平台的制作方法

用于人多能干细胞制造的端到端平台


背景技术：

1.干细胞技术已经彻底改变了再生医学，迎来了一个专注于治愈性治疗而不是疾病管理的新时代。在过去十年中，开发和优化符合cgmp的基于细胞的疗法的大规模制造的努力已经显著增加。然而，基于干细胞的疗法的产业化需要创新的解决方案来缩小研究和商业化之间的差距。例如，需要可扩展的细胞生产平台来可靠地递送在开发和商业供应的各个阶段期间所需的细胞量。
2.人多能干细胞(hpsc)是生成治疗性细胞类型的关键来源材料，并且通过体细胞重编程成功生成人诱导多能干细胞(hipsc)在再生医学、疾病建模和药物开发中开辟了新途径。具有自我更新和多能性，来源于正常和异常表型患者的hipsc理论上无限供应了临床相关ipsc衍生细胞，而没有现有限制和免疫排斥。例如，考虑到心脏的再生能力有限甚至没有，新的心肌细胞可通过调节体内胚胎发育中关键的发育线索而从hipsc衍生。
3.然而，ipsc成功分化为特定细胞谱系所必需的包括仔细考虑维持ipsc的微环境和方法。尽管通过使用传统的二维(2d)培养获得了大量的信息，但是该系统不能以成本有效的方式生成许多疗法中所需的细胞数量，并且不能完全概括体内条件。
4.例如，为了替代心肌梗塞期间损失的细胞数量，例如，每患者剂量需要大约1
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109个细胞。假定基于2d的细胞培养平台是不可扩展的，具有最小的扩展能力，在2d系统中实现高细胞密度将涉及昂贵的布置，包括大量的人工努力、实验室空间和人员。这些平台通常也不具有足够的系统来控制或监测参数，例如培养中的hipsc产生的关键代谢物。此外，尽管许多研究表明通过调节现有方法增强成熟，但ipsc衍生的心肌细胞在表型上仍不成熟。
5.许多研究已经展现了使用基于聚集物和微载体(mc)的三维(3d)培养系统在悬浮培养中hpsc扩增的可行性。基于聚集物的3d培养提供了更生理相关的微环境，但已显示不仅需要小分子y27632用于hpsc的存活，而且还需要顺序传代以实现高倍数扩增。基于微载体的培养系统并非没有其自身的优点，基于微载体的培养系统就可扩展性而言有利于提高表面积与体积之比，在扩增期间为粘附和生长提供大的表面积，提供使用限定的细胞外基质的灵活性，并且允许维持均相培养条件。
6.因此，提供符合cgmp的、商业上可行的可扩展方法以生成大量高质量hpsc将是有益的。此外，提供用于hpsc扩增的端到端平台和方法将是有益的，其解决了一个或多个上述问题，和/或提供了使用无异源培养条件的基于微载体的扩增。此外，提供端到端平台和方法将是有益的，其中细胞在封闭的、自动化的和受控的一次性搅拌釜式生物反应器中扩增。另外地或可替代地，提供收获和分离mc以及使用封闭的自动离心系统来浓缩细胞的封闭步骤将是有益的，其中细胞可被进一步冻存。如果冻存细胞也可以用作起始材料(例如冻存的hpsc)，其可以在接种之前解冻到2d培养中或直接解冻到生物反应器中，也将是有益的。如果端到端平台解决了一个或多个上述问题，同时在培养的9至14天内使用该平台也实现了》50的高扩增倍数，则将是额外的益处。此外，如果扩增的hpsc展现了高质量的自我更新和多能性，和/或能够分化成所有三个胚层，则是有利的。另外，提供不需要使用2d种子培养的端到端平台将是有益的。


技术实现要素：

7.一般而言，本公开涉及一种用于制造多能干细胞的方法。所述方法包括将多个微载体置于生物反应器中，用多能干细胞接种所述生物反应器，在所述生物反应器中孵育所述多能干细胞达足以产生约50倍或更大的倍数扩增以产生扩增的多能干细胞的一段时间，浓缩所述扩增的多能干细胞，以及冻存所述扩增的多能干细胞。此外，所述多能干细胞以约0.2
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106个细胞/ml或更少的接种密度接种，并且所述方法是封闭和/或自动化方法。
8.在一方面，多能干细胞在孵育期间不传代。另外地或可替代地，在一方面，用于接种所述生物反应器的所述多能干细胞作为冻存的多能干细胞接种到所述生物反应器中。在另一方面，所述多能干细胞在接种所述生物反应器之前不在2d过程中孵育。
9.此外，在一方面，所述多个微载体具有约125μm或更大的粒度。另外地或可替代地，所述多个微载体在置于所述生物反应器中之前用生长基质包被。
10.在另一方面，所述方法包括孵育后的收获步骤。在一方面，使用非酶传代溶液将所述微载体与所述扩增的多能干细胞分离。另外地或可替代地，在一个方面，在用所述非酶传代溶液传代后，使所述多能干细胞和多个微载体通过筛网，所述筛网的筛孔尺寸足以允许所述多能干细胞通过，同时限制所述微载体的通过。在一个方面，所述筛孔尺寸为约10μm至约100μm。
11.此外，在另一方面，通过连续离心装置进行浓缩。在一方面，选择进入所述连续离心装置的流速，使得在约15分钟或更短时间内形成流化床。此外，在一个方面，所述流化床中的细胞保留率为约80％或更高。
12.另外地或可替代地，在一方面，冻存后的细胞保留率为约70％或更高。
13.在一个方面，在孵育期间，所述微载体和多能干细胞经受搅拌。在另一方面，所述搅拌具有初始速度，并且所述初始速度在约1至5天后增加至第二速度。此外，在一方面，所述第二速度在约1至5天后增加至第三速度。另外地或可替代地，在一个方面，所述搅拌具有初始速度，并且当细胞密度达到约1
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105个细胞/cm2至约10
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105个细胞/cm2时，所述初始速度增加至第二速度。此外，在一方面，在接种后的头24小时或更短时间期间，所述搅拌是不连续搅拌。
14.在另一方面，所述生物反应器是灌注生物反应器。
15.下面更详细地讨论本公开的其它特征和方面。
附图说明
16.在说明书的剩余部分(包括参考附图)，更具体地阐述了本公开的完整和可实现的公开，其中：
17.图1a示出了根据本公开的端到端平台的示意图；
18.图1b是根据本公开的生物反应器系统的截面视图；
19.图2示出了rtipsc3b和rtipsc4i hipsc生长和扩增随时间的图；
20.图3示出了使用小和大尺寸微载体的细胞生长和扩增的图；
21.图4示出了使用低细胞密度的rtipsc4i的细胞生长和扩增的图；
22.图5示出了使用低细胞密度的rtipsc3b的细胞生长和扩增的图；
23.图6示出了使用未包被和包被的微载体的细胞生长和扩增的图；
24.图7示出了使用和不使用微载体的细胞生长和扩增的图；
25.图8示出了使用2d培养细胞接种物的合并细胞密度和倍数扩增的图；
26.图9是细胞-微载体簇在100x放大倍数下的图像；
27.图10示出了根据本公开的hipsc的3升生物反应器悬浮培养中的营养物和代谢物浓度以及工艺参数的监测；
28.图11示出了在根据本公开的生物反应器中扩增的ipsc在100x放大倍数下的相衬图像；
29.图12示出了在根据本公开的生物反应器中扩增的ipsc的免疫荧光染色；
30.图13是通过流式细胞术对在根据本公开的生物反应器中扩增的细胞进行的hpsc相关标志物的定量分析的图；
31.图14示出了在根据本公开的生物反应器中通过胚层特异性标志物的免疫荧光染色扩增的细胞的多能性；
32.图15示出了rtipsc3b和lipsc18r细胞系的谱系特异性标志物的免疫荧光染色；
33.图16是示出了根据本公开的一方面的在流化床形成期间从ksep腔室逸出的活细胞的百分比的图；
34.图17是示出了根据本公开的一方面，每次运行从流化床逸出的活细胞的百分比对处理时间的图；
35.图18示出了平板接种后24小时和72小时浓缩后单细胞的相衬图像；
36.图19示出了根据本公开的一方面通过免疫荧光染色在生物反应器中扩增和浓缩的细胞的表达；
37.图20是根据本公开的一方面通过流式细胞术对在生物反应器中扩增并浓缩的细胞进行的hpsc相关标志物的定量分析的图；
38.图21示出了根据本公开的一方面的在生物反应器中扩增并通过直接分化为内胚层、神经干细胞和心肌细胞而浓缩的细胞的多能性；
39.图22示出了解冻后48至72小时冻存细胞在40x放大倍数下的相衬图像；
40.图23示出了在平板接种后3天(小瓶#2)和5天用ap染色试剂盒染色的细胞；
41.图24示出了在旋转烧瓶中直接解冻的细胞与新鲜接种的细胞的细胞生长和倍数扩增的图；
42.图25示出了根据本公开的一方面解冻到3升生物反应器中的细胞的细胞生长和倍数扩增的图；
43.图26示出了在100x放大倍数(比例尺：100μm)下的相衬图像，所述相衬图像展现了在生物反应器运行的不同天，微载体上的细胞生长；
44.图27示出了根据本公开的一方面解冻成悬浮液并在生物反应器中扩增的ipsc在从微载体释放之前和之后当平板接种到2d上时具有典型的ipsc形态；
45.图28示出了根据本公开的一方面通过免疫荧光染色在收获和浓缩后的细胞中检测hpsc相关标志物；
46.图29是根据本公开的一方面通过流式细胞术对收获后的细胞和收获后浓缩的细胞进行的hpsc相关标志物的定量分析的图；
47.图30示出了根据本公开的一方面解冻成悬浮液、在生物反应器中扩增并浓缩的
ipsc的直接分化；
48.图31是根据本公开的一方面使用3d种子培养作为接种物的实验设计的示意图；
49.图32示出了根据本公开的一方面在微载体上从旋转烧瓶收集并接种在3升生物反应器中的lipsc18r的细胞生长和倍数扩增的图；
50.图33示出了根据本公开的一方面作为单细胞从微载体释放并接种在3升生物反应器中的rtipsc3b的细胞生长和倍数扩增的图；
51.图34示出了在3d培养的不同天，微载体上生长的细胞在100x放大倍数(比例尺200μm)下的相衬图像；
52.图35示出了在平板接种后五天由在根据本公开的一方面的生物反应器中扩增的细胞所形成的集落在40x放大倍数(比例尺：100μm)下的相衬图像；
53.图36示出了根据本公开的一方面在100x放大倍数下由hpsc相关标志物的免疫荧光染色对通过3d种子培养扩增的hipsc进行的质量评估；
54.图37是根据本公开的一方面对通过3d种子培养扩增的hipsc的hpsc相关标志物进行的定量分析的图；
55.图38示出了根据本公开的一方面在通过3d种子培养扩增的hipsc的拟胚体(eb)上的胚层特异性标志物的免疫荧光染色；
56.图39示出了2d中的两周细胞扩增的图表；
57.图40示出了汲取管/灌注管线；
58.图41示出了培养基进料管线；
59.图42示出了收获管线延伸组合件；
60.图43示出了气体管线组合件；
61.图44示出了气体管线组合件；
62.图45示出了2d搅拌速度表征曲线；
63.图46示出了收获方案；以及
64.图47示出了集成有65μm筛网过滤器的柔性概念袋。
65.在本说明书和附图中的附图标记的重复使用是为了表示本发明的相同或类似的特征或元件。
66.定义和缩略语
67.应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制本发明的范围。在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
68.如本文所用，术语“约”、“近似”或“大致”，当用于修饰一个值时，表示值可以提高或降低10％，并保持在所公开的实施例内。
69.如本文所用，术语“无异源”是指含有按重量计约5％或更少的动物或人类衍生成分的培养基，例如按重量计约2％或更少的动物或人类衍生成分，例如按重量计约1％或更少的动物或人类衍生成分，并且在一方面，可以是指完全不含动物成分、人类成分或人类和动物成分两者的培养基。
70.缩略语：
71.hpsc人多能干细胞
72.hipsc人诱导多能干细胞
73.mc微载体
74.eb拟胚体
75.bsc生物安全柜
76.vvd每天容器容积
具体实施方式
77.本领域普通技术人员应当理解，本讨论仅是对示范性实施例的描述，并不旨在限制本公开的更广泛的方面。
78.一般而言，本公开涉及大规模、封闭系统、端到端平台和与其相关的方法，用于制造展现出优异生长、扩增、回收和活力的人多能干细胞(hpsc)。具体地，本公开开发了基于微载体的生物反应器悬浮平台，以使用无异源、完全限定的hpsc培养基将hipsc扩增至》2
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109个细胞/l的细胞密度，所述hpsc培养基具有用于hipsc收获和浓缩的封闭的自动化过程，并广泛表征了扩增的hipsc。例如，本公开已经发现，根据本公开的端到端平台和相关方法允许优异的细胞生长和扩增，即使当使用比先前认为的更低的接种密度和/或当使用更大的微载体时。此外，本公开已经发现，即使在浓缩和冻存之后，根据本公开的端到端平台和相关方法也可以表现出显著改善的细胞回收和活力。此外，本发明出乎意料地发现，根据本公开扩增的细胞可用于接种进一步扩增，从而允许避免2d种子培养生长。
79.首先参考图1a，将讨论端到端hpsc扩增平台100及其相关方法的示范性示意图。当然，如上所述，在一个方面，步骤二(104)和三(106)可以通过使用根据本文所述的端到端平台100和方法扩增的冻存细胞来消除。
80.然而，在一个方面，冻存细胞用于接种2d种子培养烧瓶104。冻存细胞102可以是本领域通常已知的冻存细胞，例如在cryostor10中冻存的细胞，并且是可商购的。然而，在一个方面，冻存细胞102可以是根据本文所述的端到端平台100和方法冻存的细胞116。因此，在一个方面，冻存细胞102是在前一批扩增细胞中冻存的细胞116。
81.不管冻存细胞102是根据本公开形成的还是以其它方式获得的，在一个方面，冻存细胞102可以解冻到2d种子培养烧瓶104中。可以以约0.01
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106个细胞/cm2至约0.1
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106个细胞/cm2，例如约0.015
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106个细胞/cm2至约0.05
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106个细胞/cm2，例如约0.02
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106个细胞/cm2至约0.04
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106个细胞/cm2的种子密度接种细胞。
82.在一个方面，除了营养基质之外，激酶抑制剂，例如含有rho相关卷曲螺旋的蛋白激酶抑制剂(rocki)最初可与2d种子培养烧瓶中的解冻细胞一起使用。然而，在一段时间后，例如约24小时或更少，例如约22小时或更少，例如约20小时或更少，例如约18小时或更少，例如约16小时或更少，用合适的细胞营养培养基/基质替代激酶和营养基质组合，在一个方面，所述培养基/基质通常不含激酶抑制剂。如本文所用，营养培养基或基质是指可增加生物产品的质量的任何流体、化合物、分子或物质，例如可由生物体用于生存、生长或以其它方式添加生物质的任何物质。例如，营养物进料可以包括用于呼吸或任何类型代谢的气体，例如氧气或二氧化碳。其它营养培养基可包括碳水化合物源。碳水化合物源包括复合糖和单糖，例如葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖及其混合物。营养培养基还可以包括氨基酸。氨基酸可包含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色
氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、其单一立体异构体及其外消旋混合物。术语“氨基酸”还可以指已知的非标准氨基酸，例如4-羟脯氨酸、ε-n,n,n-三甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、o-磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸、γ-n-乙酰赖氨酸、ω-n-甲基精氨酸、n-乙酰丝氨酸、n,n,n-三甲基丙氨酸、n-甲酰基甲硫氨酸、γ-氨基丁酸、组胺、多巴胺、甲状腺素、瓜氨酸、鸟氨酸、β-氰基丙氨酸、高半胱氨酸、重氮丝氨酸和s-腺苷甲硫氨酸。在一些实施例中，氨基酸是谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸或缬氨酸。
83.营养培养基还可以含有一种或多种维生素。可以包含在营养培养基中的维生素包括b族维生素，例如b12。其它维生素包括维生素a、维生素e、核黄素、硫胺素、生物素及其混合物。营养培养基还可以含有一种或多种脂肪酸和一种或多种脂质。例如，营养培养基进料可包括胆固醇、类固醇及其混合物。营养培养基也可以向生物反应器提供蛋白质和肽。蛋白质和肽包括例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白、胎球蛋白及其混合物。本公开中的生长培养基还可以包括生长因子和生长抑制剂、微量元素、无机盐、水解产物及其混合物。可以包括在生长培养基中的微量元素包括微量金属。微量金属的实例包括钴、镍等。例如，并且仅举例来说，在一个方面，营养培养基/基质可以是由龙沙(龙沙)出售的l7
tm hpsc基质培养基。
84.然而，将解冻的细胞接种以在2d种子培养烧瓶104中生长，并维持在2d种子培养烧瓶104中，直到细胞的汇合达到约50％至约100％，例如约55％至约95％，例如约60％至约90％，例如约70％至约85％的汇合。例如，在一个方面，细胞可以在2d种子培养烧瓶104中维持约3天至约9天，例如约4天至约8天，例如约5天至约7天，以实现期望的汇合和/或细胞数目。
85.在细胞达到适当的汇合后，可将包含在2d种子培养烧瓶104中的细胞传代至2d种子培养单层细胞堆叠106。虽然可以使用本领域已知的任何传代，但是在一个方面，为了进一步改善细胞活力和保留率，可以使用非酶细胞脱离制剂。例如，在一个方面，传代溶液可以是基于柠檬酸钠的传代溶液，例如高渗柠檬酸钠溶液，其在一个方面可以是非动物来源的。此外，在一个方面，柠檬酸钠传代溶液还可以包括至少一种盐和液体，例如仅由龙沙出售的l7
tm hpsc传代溶液。
86.不考虑所选择的传代溶液，将细胞以约0.01
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106个细胞/cm2至约0.05
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106个细胞/cm2，例如约0.015
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106个细胞/cm2至约0.04
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106个细胞/cm2，例如约0.02
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106个细胞/cm2至约0.03
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106个细胞/cm2的接种密度置于2d种子培养细胞堆叠106中。一旦接种，将细胞维持在2d种子培养细胞堆叠106中，直到细胞的汇合达到约50％至约100％，例如约55％至约95％，例如约60％至约90％，例如约70％至约85％的汇合。例如，在一个方面，细胞可以在2d种子培养托盘106中维持约3天至约9天，例如约4天至约8天，例如约5天至约7天，以实现期望的汇合和/或细胞数目。
87.然而，在获得期望的细胞数目和/或汇合之后，可以使用传代溶液收获包含在2d种子培养细胞堆叠106中的细胞。传代溶液可以与上面讨论的传代溶液相同，或者可以替代地使用第二传代溶液。不考虑所选择的传代溶液，收获的细胞可用于接种在本文中可称为生物反应器的搅拌釜式生物反应器108，以进行细胞扩增。
88.通常，可以使用任何合适的生物反应器。例如，生物反应器可包含发酵罐、搅拌釜式反应器、粘附生物反应器、波型生物反应器、一次性生物反应器等。在图1b所示的实施例
中，生物反应器10包含中空器皿或容器，所述中空器皿或容器包括用于接收流体生长培养基内的细胞培养物的生物反应器容积12。如图1b所示，生物反应器系统可以进一步包括联接到如双叶轮16和18之类的搅拌器的可旋转轴14。
89.生物反应器10可以由各种材料制成。在一个实施例中，例如，生物反应器10可以由如不锈钢之类的金属制成。金属生物反应器通常设计为可再利用的。
90.可替代地，生物反应器10可包含由刚性聚合物或柔性聚合物膜制成的一次性生物反应器。例如，当由刚性聚合物制成时，生物反应器壁可以是自立式的。可替代地，生物反应器可以由柔性聚合物膜或形状适应材料制成，所述柔性聚合物膜或形状适应材料可以是液体不可渗透的并且可以具有内部亲水表面。在一个方面，生物反应器10可以由柔性聚合物膜制成，所述柔性聚合物膜被设计成插入刚性结构中，例如用于呈现所需形状的金属容器。可用于制造刚性器皿或柔性聚合物膜的聚合物包括聚烯烃聚合物，例如聚丙烯和聚乙烯。可替代地，聚合物可以是聚酰胺。在另一个实施例中，柔性聚合物膜可以由多层不同的聚合物材料形成。在一个实施例中，柔性聚合物膜可以被γ辐照。
91.生物反应器10可以具有任何合适的容积。例如，生物反应器10的容积可以为0.1ml至约25,000l或更大。例如，生物反应器10的容积12可以大于约0.5l，例如大于约1l，例如大于约2l，例如大于约3l，例如大于约4l，例如大于约5l，例如大于约6l，例如大于约7l，例如大于约8l，例如大于约10l，例如大于约12l，例如大于约15l，例如大于约20l，例如大于约25l，例如大于约30l，例如大于约35l，例如大于约40l，例如大于约45l。生物反应器10的容积通常小于约25,000l，例如小于约15,000l，例如小于约10,000l，例如小于约5,000l，例如小于约1,000l，例如小于约800l，例如小于约600l，例如小于约400l，例如小于约200l，例如小于约100l，例如小于约50l，例如小于约40l，例如小于约30l，例如小于约20l，例如小于约10l。在一个实施例中，例如，生物反应器的容积可以为约1l至约5l。在另一个实施例中，生物反应器的容积可以为约25l至约75l。在另一个实施例中，生物反应器的容积可以为约100l至约350l。
92.除了叶轮16和18之外，生物反应器10可以包括允许培养和繁殖生物细胞的各种附加设备，例如挡板、喷雾器、气源、热交换器或热循环器端口等。例如，在图1b所示的实施例中，生物反应器10包括喷雾器20和挡板22。喷雾器20与用于向生物反应器10供应如二氧化碳、氧气和/或空气之类的气体的气源48流体连通。此外，生物反应器系统可以包括用于测量和监测压力、泡沫、ph、溶解氧、溶解二氧化碳等的各种探针。
93.如图1b所示，生物反应器10可以包括附接到叶轮16和18的可旋转轴14。可旋转轴14可以联接到用于使轴14和叶轮16和18旋转的电机24。叶轮16和18可由任何合适的材料制成，例如金属或生物相容性聚合物。适用于生物反应器系统的叶轮的实例包括水翼叶轮、高固相度倾斜叶片叶轮、高固相度水翼叶轮、rushton叶轮、倾斜叶片叶轮、柔和船用叶片叶轮等。当包含两个或更多个叶轮时，叶轮可以沿旋转轴14间隔开。
94.如图1b所示，生物反应器10还包括多个端口。所述端口可以允许供应管线和进料管线进出生物反应器10以用于添加和去除流体和其它材料。另外，一个或多个端口可以用于连接到用于监测生物反应器10内的条件的一个或多个探针。此外，生物反应器10可与用于测量生物反应器内培养物的质量的测压元件联合放置。
95.在图1b所示的实施例中，生物反应器10包括与流出物28连接的底部端口26，用于
从生物反应器中连续或定期取出材料，例如在一个方面，用作灌注生物反应器。因此，在一个方面，底部端口可以包括筛网或过滤器系统，以便在去除废物和废基质材料的同时将细胞保持在生物反应器中。此外，生物反应器10包括多个顶部端口，例如端口30、32和34。端口30与第一流体进料口36流体连通，端口32与第二进料口38流体连通，并且端口34与第三进料口40流体连通。进料口36、38和40用于向生物反应器10进给各种不同的材料，例如营养培养基。
96.除了生物反应器10的顶部和底部上的端口之外，生物反应器可以包括沿着侧壁定位的端口。例如，图1b所示的生物反应器10包括端口44和46。
97.端口44和46与监测和控制系统连通，所述监测和控制系统可以维持生物反应器10中一个或多个参数的最佳浓度，用于繁殖细胞培养物或以其它方式生产生物制品。在所示的实施例中，例如，端口44与ph传感器52相关，而端口46与溶解氧传感器54相关。ph传感器52和溶解氧传感器54与控制器60通信。本公开的系统可以被配置成允许对包含在生物反应器10内的细胞培养物内的各种参数进行确定和测量。一些测量可以在线进行，例如ph和溶解氧。然而，可替代地，可以在线或离线进行测量。例如，在一个实施例中，生物反应器10可以与取样站连通。可以将细胞培养物的样品进给至取样站以进行各种测量。在另一个实施例中，细胞培养物的样品可以从生物反应器中取出并离线测量。
98.根据本公开，可以在生物反应器10内的细胞培养物生长期间测量多个参数。通常，由本公开的方法和系统所控制的参数与可影响所控制的参数的浓度的一个或多个其它参数一起测量。例如，在一个实施例中，结合至少一个其它乳酸盐影响参数测量细胞培养物内的乳酸盐浓度。乳酸盐影响参数可包含例如谷氨酸盐浓度、葡萄糖浓度、如天冬酰胺浓度的氨基酸浓度等。在一个实施例中，可使用如诺瓦生物医学公司(nova biomedical)出售的nova bioprofile 400分析仪之类的任何合适的仪器进行细胞培养物的在线或离线分析。上述分析仪能够结合一个或多个乳酸盐影响参数测量乳酸盐浓度。
99.根据本公开，除了生物反应器中的各种其它条件之外，还可以将乳酸盐浓度和一种或多种乳酸盐影响参数的浓度馈送至控制器60。控制器包括控制模型，其基于输入的数据，能够预测未来细胞培养物继续繁殖时的乳酸盐浓度。在一个实施例中，例如，控制器可提供预警系统，其产生关于细胞培养物孵育期结束时的乳酸盐浓度是否在预设限度内或细胞培养物是否将以乳酸盐积累状态结束的百分比概率。控制器60还可以被配置成精确地预测未来的乳酸盐浓度。例如，在一个实施例中，控制器可预测乳酸盐浓度轨迹，该轨迹预测整个孵育期直至收获细胞培养物的乳酸盐浓度。在一个实施例中，控制器还可以被配置成在乳酸盐浓度不在预设限度内的情况下建议或自动实施校正动作。例如，控制器可以被配置成确定营养物进料变化，或驱动乳酸盐浓度至期望值所需的其它操作条件的变化。为了确定校正动作，控制器可以运行多次迭代以基于改变生物反应器内的一种或多种条件直到选择一种或多种条件的优化变化来确定未来的乳酸盐浓度。
100.控制器60可以包含一个或多个可编程装置或微处理器。如图1b所示，控制器60可以与一个或多个进料口36、38和40、与一个或多个流出物28和/或与一个或多个叶轮16/18通信。此外，控制器60可以与ph传感器52、溶解氧传感器54和将气体供给到喷雾器20的气源48通信。控制器60可以被配置成基于乳酸盐浓度和一种或多种乳酸盐影响参数的浓度来增加或减少材料流入和流出生物反应器10。以这种方式，控制器60可以将乳酸盐浓度维持在
预设限度内。控制器60可以在开环控制系统中操作，或者可以在闭环控制系统中操作，其中对输入和/或输出装置的调节是完全自动的。在其它实施例中，控制器60可建议校正动作以影响乳酸盐浓度，并且校正动作可手动进行。
101.不管选择的生物反应器和/或生物反应器如何，在一个方面，从2d种子培养细胞堆叠106收获的细胞可以接种到含有营养培养基/培养基的生物反应器中，所述营养培养基/培养基可以是与上述相同的培养基。在一个方面，营养培养基可以以一定的量预先放置在反应器中，使得营养培养基的容积具有占生物反应器的容积的约30％或更少，例如生物反应器的容积的约40％或更少，例如生物反应器的容积的约50％或更少，例如生物反应器的容积的约60％或更少，例如生物反应器的容积的约66％或更少，例如生物反应器容积的约70％或更少的容积，并且在一个方面，可以将一定容积的营养培养基置于生物反应器中，使得营养培养基具有占生物反应器的容积的约60％至约70％的容积。
102.然而，在一个方面，在接种生物反应器之前，除了营养培养基之外，微载体也可存在于生物反应器中。在一个方面，微载体可与营养培养基一起引入生物反应器中，或可在营养培养基之后但在接种之前添加。在另一方面，上述容积的营养培养基可存在于生物反应器中，且微载体可在初始容积的营养培养基之后添加，但可作为第二容积的营养培养基的一部分引入。在此方面，含有微载体的营养培养基的第二容积可为生物反应器的容积的约10％或更少，例如生物反应器的容积的约15％或更少，例如生物反应器的容积的约20％或更少，例如生物反应器的容积的约25％或更少，例如生物反应器的容积的约20％或更少，例如生物反应器的容积的约33％或更少，例如生物反应器的容积的约35％或更少，并且在一个方面，可以将一定容积的营养培养基置于生物反应器中，使得营养培养基具有占生物反应器的容积的约30％至约40％的容积。
103.不管引入微载体的方式如何，在一个方面，将微载体添加到生物反应器中以促进细胞生长。例如，细胞可粘附于微载体的表面用于进一步生长和繁殖。以这种方式，微载体可以为细胞培养物在反应器内的生长提供更大的表面积。事实上，一些贴壁依赖性细胞，例如某些动物细胞，需要附着于表面以生长和分裂。在一些系统中，微载体在引入生物反应器之前、期间和/或之后因常规搅拌而悬浮于营养培养基内，这优化并最大化生物反应器系统内的生长条件。
104.微载体可由各种不同材料(包括聚合物)制成。微载体可具有任何合适的形状，且在一些应用中包含圆形珠粒。在一个方面，微载体的中值粒度通常可为约50μm至约350μm，例如约75μm至约300μm，例如约100μm至约250μm，例如约125μm至约225μm，或其间的任何范围或值。以前认为小微载体(例如约90至150μm)是最佳扩增所必需的。然而，本发明出乎意料地发现，较大的微载体(例如，大于125μm)可与本文所述的方法组合使用，且产生与用小微载体获得的结果相当或比用小微载体获得的结果更好的扩增结果。因此，在一个方面，微载体的中值粒径为约125μm或更大，例如约150μm或更大，例如约175μm或更大，例如约200μm或更大，例如约210μm或更大，例如约350μm或更小，例如约325μm或更小，例如约300μm或更小，例如约275μm或更小，例如约250μm或更小，或其间的任何范围或值。这提供了进一步的益处，因为难以获得小微载体，通常需要专门的设备，因此较大的粒度允许在端到端扩增平台的放大具有更大的灵活性。
105.此外，在一个方面，微载体也可在引入生物反应器和/或悬浮于营养培养基中之前
用营养培养基包被。特别地，本公开已经发现，与未包被微载体相比，当与包被微载体一起使用时，ipsc显示出改善的生长和扩增。因此，在一个方面，微载体可用如上文所论述的营养基质(例如上文所论述的营养基质)包被。此外，在一个方面，可将微载体包被在其悬浮(或将悬浮)于其中的相同培养基中，或可替代地，可包被在与其将承载微载体的营养培养基不同的培养基中。在又一个方面，包被培养基和承载培养基可以大致相同，但是包被培养基和/或承载培养基可以具有一种或多种不同的添加剂。
106.尽管选择了营养培养基和微载体，生物反应器可以用上述细胞以约0.01
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2，例如约0.02
×
106个细胞/cm2至约0.15
×
106个细胞/cm2，例如约0.03
×
106个细胞/cm2至约0.1
×
106个细胞/cm2，例如约0.04
×
106个细胞/cm2至约0.07
×
106个细胞/cm2的接种密度接种。特别地，如上所述，以前认为对于3l或更大的生物反应器，0.2
×
106个细胞/cm2的高接种密度是必需的，以产生良好的扩增结果。然而，如以下将关于图4和5更详细地讨论的，本公开已经发现小的接种密度(例如，低于0.2
×
106个细胞/cm2)可以与本公开结合使用，并且产生优异的扩增结果。
107.例如，本公开已经发现，低接种密度实际上可以允许比更高接种密度更高的倍数扩增，例如倍数膨胀为约50倍或更大，例如约60倍或更大，例如约70倍或更大，例如约80倍或更大，例如约90倍或更大，例如约100倍或更大，例如在一个方面，约50倍至约120倍的，例如约60倍至约100倍，例如约70倍至约95倍，例如约80倍至约90倍，或其间的任何范围或值。此外，本公开已经出乎意料地发现，与以更高接种密度开始的孵育相比，扩增可能花费更少的时间。例如，上述扩增可在约7至约18天内发生，例如约8至约16天，例如约9至约14天，并且在一个方面，可以在小于以高接种密度接种的平台的时间达到期望的扩增(或接种密度)。
108.如上文所论述，在一个方面，在已将营养培养基、微载体和接种物引入生物反应器之后，可使生物反应器的内容物经受搅拌。在一个方面，生物反应器可以在约25rpm至约125rpm，例如约35rpm至约110rpm，例如约40rpm至约100rpm，例如约45rpm至约95rpm，例如约50rpm至约90rpm，或其间的任何范围或值下经受连续温和搅拌。然而，在另一方面，本公开已经发现，通过基于细胞密度的分级搅拌可以进一步改善细胞扩增。例如，在一个方面，通过将rpm增加至少约5rpm，例如至少约10rpm，例如至少约15rpm，例如至少约20rpm，例如至少约25rpm，例如约30rpm或更小，可以每隔一天，例如每隔三天，例如每隔四天，例如每隔五天增加搅拌。
109.另外地或可替代地，rpm的增加可以基于细胞密度测量。例如，在一个方面，初始搅拌速度可以设定为约25rpm至约75rpm，例如约35rpm至约65rpm，例如约40rpm至约60rpm，例如约45rpm至约55rpm。可进行细胞密度测量，并且当细胞密度达到约1
×
105个细胞/cm2至约10
×
105个细胞/cm2，例如约3
×
105个细胞/cm2至约8
×
105个细胞/cm2，例如约5
×
105个细胞/cm2至约7
×
105个细胞/cm2时，搅拌速度可增加约5rpm，例如至少约10rpm，例如至少约15rpm，例如至少约20rpm，例如至少约25rpm，例如约30rpm或更少。
110.此外，在一个方面，搅拌速度可以至少第二次增加。例如，细胞密度测量可再次进行(或连续进行)，并且当细胞密度达到约4
×
105个细胞/cm2至约5
×
106个细胞/cm2，例如约4.5
×
105个细胞/cm2至约4
×
106个细胞/cm2，例如约5
×
105个细胞/cm2至约3
×
106个细胞/cm2时，搅拌速度可再次增加约5rpm，例如至少约10rpm，例如至少约15rpm，例如至少约
20rpm，例如至少约25rpm，例如约30rpm或更少。
111.在一个方面，本公开还发现在接种日(孵育的头24小时)的不连续搅拌可进一步改善细胞活力和扩增。此外，本公开已经发现，不连续搅拌也可以是级联搅拌，使得较早的搅拌较短，随着时间的推移搅拌的长度增加并且搅拌之间的静止减少。例如，请参考下文5.20.3中的表征曲线。在此方面，不连续和/或不连续级联搅拌可以在接种后的头24小时或更少，例如接种后约20小时或更少，例如约18小时或更少，例如约14小时或更少，例如约10小时或更少发生。
112.然而，当达到期望的细胞密度时，可以收获扩增的细胞110。即，在一个方面，扩增的细胞可通过非酶传代溶液传代并与微载体分离，所述非酶传代溶液可以是与上述相同的传代溶液，或可以是第二传代溶液。另外，应当理解，上述传代溶液还可以包括激酶抑制剂。此外，在一个方面，传代溶液还可以与营养培养基组合用于将细胞从生物反应器传代到收获袋110。无论如何，在一个方面，通过使用适当的传代溶液将细胞与微载体分离，且使其穿过具有经选择以捕获微载体的筛孔尺寸的筛网，同时允许细胞穿过管道前进到收获袋。例如，在一个方面，收获袋组合件可具有筛孔尺寸为约10μm至约100μm，例如约25μm至约75μm，例如约50μm至约70μm，或其间的任何范围或值的筛网。
113.在收获了扩增的细胞之后，可以例如通过离心来浓缩细胞112。在一个方面，基于流化床的形成来选择通过离心机的流速。例如，可以优化流速以最小化建立流化床所需的时间，最大化细胞回收和维持细胞活力和增殖。特别地，本公开已经发现，通过在短时间内(在一个方面，例如约15分钟或更少，例如约9分钟至约13分钟，例如约10分钟至约12分钟)建立流化床并且通过使从流化床逸出的细胞的百分比最小化，可以增加细胞保留率和活力。例如，在一个方面，优化的流化床可以保留约70％或更多的细胞，例如约80％或更多，例如约90％或更多的进入流化床的细胞。
114.然而，在浓缩之后，细胞可被填充114并通过本领域已知的冻存来保存。
115.虽然已经在图1的几个步骤期间讨论了传代，但是应该理解和认识到，出乎意料的是，在孵育时间期间不需要传代，即在根据本公开的连续悬浮培养中可以实现大于10倍的扩增。
116.此外，如上所述，虽然已经关于图1讨论了2d种子培养步骤104和106，但是应当理解，本公开还发现根据本公开形成的3d种子培养细胞可以用于直接接种生物反应器108。因此，在一个方面，步骤104和106可以省略，并且相反，冻存细胞116可以用作冻存细胞102，并直接置于生物反应器步骤108中。这一发现对继续扩大平台很重要，因为较大的端到端平台(例如较大容积的平台)需要越来越多的细胞用于接种。因此，用于生产3d种子培养细胞的方法使得能够继续扩大生长规模，因为通过3l端到端平台生产的细胞的数目远超过相同时间段内的2d种子培养生产。
117.例如，本公开已发现使用根据本公开的方法的端到端平台可产生约1百万个细胞/ml至约5百万个细胞/ml，例如约1.5百万个细胞/ml至约4.5百万个细胞/ml，例如约2百万个细胞/ml至约4百万个细胞/ml。另外，本公开已发现，根据本公开的方法和平台可在约70％或更大，例如约75％或更大，例如约80％或更大，例如约85％或更大，例如约90％或更大的浓度之后表现出细胞保留。此发现还提供了进一步的益处，因为2d种子培养除了耗时和困难之外还具有高的污染风险。因此，用3d种子培养直接接种也可以改善降低的污染风险。
118.另外，本公开已经发现，端到端平台可以被配置成封闭系统，并且在一个方面，可以使用一次性使用的容器和管道。因此，端到端平台可以进一步降低污染的风险。
119.此外，虽然到目前为止，讨论集中于人多能干细胞，但应当理解，可根据本文讨论的方法和平台选择其它合适的细胞进行扩增。另外，如本领域技术人员可以理解的，本文讨论的ipsc可以用作任何数目的细胞的中间体，如下文将更详细地讨论的，本文扩增的ipsc显示出优异的活力和分化。
120.然而，现在将关于图2至47和示范性标准操作过程讨论本公开的其它方面。
121.除非另有说明，图2至47和这些图下面的实例使用以下材料和方法：
122.l7
tm hpsc培养系统
123.龙沙l7
tm
培养系统被开发用于在无饲养层的环境中培养hesc和hipsc，并且允许以每隔一天更换培养基的时间表进行饲养。培养系统由重组无异源和确定成分的l7
tm hpsc基质(龙沙公司(龙沙)，fp-5020)，无异源的l7
tm
hpsc基础培养基、无异源的l7
tm hpsc培养基补充物和非酶传代溶液组成，以使细胞附着：l7
tm hpsc传代溶液(产生细胞团块，龙沙，fp-5013)或f3 hpsc传代溶液(产生单细胞)。本文所述工作中使用的l7
tm hpsc基础培养基通过用相应的重组组分替换天然的基于动物的组分来进行修饰。本文称为l7
tm tfo2hpsc基础培养基。
124.人ipsc系
125.人lipsc18r ipsc系如前所述从cd34 脐带血细胞生成(参见，例如baghbaderani,b.a.等人,为治疗应用制造的人诱导多能干细胞的详细表征(detailed characterization of human induced pluripotent stem cells manufactured for therapeutic applications)。干细胞评论报告(stem cell rev.reports)(2016)doi:10.1007/s12015-016-9662-8)。rtipsc3b和rtipsc4i由两个不同供体的人外周血单核细胞(pbmnc，龙沙，cc-2702)生成。将冻存的pbmnc解冻，并在包含无动物的hpgm
tm
(造血祖细胞生长培养基(hematopoietic progenitor growth medium)，相当于龙沙，pt-3926，其中天然组分用相应的重组组分替换)、补充有100ng/ml重组人(rh)干细胞因子(scf)(派普泰克(peprotech)，af-300-07)、40ng/ml胰岛素样生长因子(igf)-1(派普泰克，af-100-11)、10ng/ml白介素(il)-3(派普泰克，af-200-03)、1μm地塞米松(sigma，d1756)、100μg/ml全运铁蛋白(安迪生物(r&d systems)，2914-ht)和200μm 1-硫代甘油(sigma，m6145)的引发培养基中培养6天。将pbmnc以2-4
×
106个细胞/ml的密度接种在6孔板(康宁(corning)，353046)中。在第3天，细胞被收集、计数并以0.5-1
×
106个细胞/ml的密度接种在新鲜引发培养基中。在第6天，细胞被收集，并且进行细胞重编程。
126.为了对细胞进行重编程，用附加型质粒pce-hoct3/4、pce-hsk、pce-hul、pce-mp53dd和pcxb-ebna-1[37]对1
×
106个pbmnc进行核转染。使用4d-nucleofector
tm
系统和p3溶液试剂盒(龙沙，v4xp-3012)进行核转染。在核转染后，在含有0.5mm丁酸钠(stemgent，04-0005)的引发培养基中，将细胞接种到用l7
tm hpsc基质预包被的6孔板上，以增强重编程效率。将板置于37℃加湿培育箱(5％的co2和3％的o2)中。平板接种后两天，向孔中加入l7
tm hpsc培养基而不除去引发培养基(1:1比例)。在第4天，吸出培养基并加入含有0.5mm丁酸钠的新鲜l7
tm hpsc培养基。以每隔一天的方式进行培养基更换，并且将细胞在37℃加湿培育箱(5％的co2和3％的o2)中孵育，直到形成hipsc集落并且分离用于进一步扩增和表征。对
这些ipsc系进行表征，显示出正常的核型、关键hpsc相关标志物的表达并且展现出分化为三个胚层的细胞的潜力。
[0127]
2d培养hipsc
[0128]
在2d中培养人ipsc，为的是在悬浮容器(旋转烧瓶或搅拌釜式生物反应器)中扩增用于接种的细胞，并且在悬浮扩增后进行表征。使用无动物的l7
tm tfo2培养基和无异源的l7
tm hpsc培养基补充物在龙沙l7
tm hpsc培养系统中培养hipsc。用l7
tm hpsc传代溶液(龙沙，fp-5013)将维持在培养中的细胞传代并收获为细胞团块，或用f3传代溶液收获为单细胞以产生单细胞并在平板接种时补充10μm y27632(stemgent，04-0012)。
[0129]
为了在接种之前在3l生物反应器中培养2d种子培养，将人ipsc解冻并平板接种到l7
tm hpsc基质包被的t-75培养烧瓶上，并以0.02-0.04
×
106活细胞/cm2的细胞密度维持在l7
tm tfo2培养基中。当2d培养物达到70％至80％汇合时，使用l7
tm hpsc传代溶液将ipsc集落解离成细胞团块，并以0.02-0.03
×
106活细胞/cm2的细胞密度范围平板接种于1层细胞堆叠(cellstack)(康宁，05-539-094)上。当2d培养物达到70％至80％汇合时，使用l7
tm hpsc传代溶液将ipsc集落解离成细胞团块，并将62-120
×
106个活细胞接种于3l生物反应器中。使用nucleocounter nc-200(chemometec，丹麦)评估生物反应器细胞接种物的数目和活力。
[0130]
微载体包被
[0131]
将塑料微载体(mc)(solohill牌聚苯乙烯90至150μm，颇尔公司(pall corporation)，p-215-020或125-212μm，颇尔公司，p-221-020)悬浮于含有钙和镁的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs / ，龙沙，17-513f)中并用l7
tm hpsc基质包被。将mc和l7
tm hpsc基质在37℃下孵育2小时。然后抽吸dpbs / 溶液，并将mc再悬浮于l7
tm tfo2 hpsc基础培养基中，并在室温下搅拌孵育过夜。为了在125ml旋转烧瓶中扩增，将600mg mc用540μg l7
tm hpsc基质进行孵育。为了在3l搅拌釜式生物反应器中扩增，将20g mc与18mg l7
tm hpsc基质孵育。
[0132]
在旋转烧瓶中培养hipsc
[0133]
将人ipsc作为细胞团块从2d收获或作为单细胞直接解冻到含有100ml l7
tm
培养基和l7
tm hpsc基质包被的微载体(mc)的125ml旋转烧瓶(康宁，3152)中。将在2d中培养的hipsc用l7
tm hpsc传代溶液传代以生成细胞团块或f3传代溶液以将集落解离成单细胞。用0.04
×
106个细胞/ml的细胞团块或冻存的单细胞接种旋转烧瓶。如果接种单细胞，则培养基补充有10μm y27632(stemgent，04-0012)。将旋转烧瓶培养物在含有5％的co2的37℃加湿培育箱中孵育过夜。24小时后，将旋转烧瓶置于磁力搅拌板上，搅拌速度为25rpm。根据需要增加搅拌速度以确保hipsc-mc保持悬浮。用于支持细胞密度》2
×
106个细胞/ml的最大搅拌速度为90rpm。使用l7
tm tfo2培养基和无异源的l7
tm hpsc培养基补充物，以每隔一天的方式更换培养基。为了测定培养中的hipsc的生长，获得5ml样品并且使用f3hpsc传代溶液将hipsc从微载体解离以生成单细胞。使用nucleocounter nc-200(chemometec，丹麦)测定细胞数目和活力。
[0134]
搅拌釜式生物反应器中的hpsc扩增
[0135]
根据制造商的说明书(艾本德(eppendorf)，1386000300)设置bioblu一次性生物反应器容器。简言之，3l容器配备有在线监测(梅特勒托利多(mettler toledo))关键参数
(包括溶解氧(do)百分比、ph和温度)所需的探针。使用g3实验室通用控制器(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))控制生物反应器。在接种之前，引入l7
tm hpsc基质包被的塑料微载体，并且如前所述[16]用补充有l7
tm
hpsc培养基补充物的l7
tm tfo2培养基来校准容器。在第0天，在设定为50rpm的初始搅拌速率下，在37℃下用62-120
×
106个2d培养的细胞(0.02-0.04
×
106个细胞/ml)或204
×
106个冻存的单细胞接种3l容器。在第1天，以每天一个容器容积(vvd)的速率开始用补充有新鲜l7
tm tfo2的培养基进行灌注。使用专有设计的微载体保留过滤器进行灌注。为了监测关键代谢物的变化，在运行的各个时间点从生物反应器中取出5ml样品。使用bioprofile flex分析仪(诺瓦生物医学公司)进行离线监测以确定如ph的参数和关键营养物的变化。为了测定细胞生长和倍数扩增，在运行的各个时间点一式两份地取15ml样品，并且使用f3 hpsc传代溶液将hipsc从微载体解离以生成单细胞。使用nucleocounter nc-200(chemometec，丹麦)测量细胞数目和活力。
[0136]
从搅拌釜式生物反应器中收获hipsc
[0137]
在达到约》2
×
106个细胞/ml时收集3l生物反应器中的人ipsc。在连续搅拌下，首先从容器中除去培养基。在连续搅拌下将温热的f3传代溶液引入容器。为了验证hipsc与微载体的分离，在用f3传代溶液孵育25至30分钟后获得5ml样品。然后将含有单细胞hipsc和微载体的溶液转移通过30至65μm孔大小的过滤袋(flex concepts，fcc03475.01)。将单细胞最终转移到含有补充有l7
tm hpsc培养基补充物的l7
tm tfo2培养基的3l袋中。对收获的细胞进行各种试验，包括性能评价、表征、下游处理和冻存。在旨在浓缩和冻存细胞以备将来使用的生物反应器运行中，在用f3传代溶液处理后将10μm y27632(stemgent，04-0012)加入到l7
tm tfo2培养基中。
[0138]
下游处理：用于流化床形成的流速优化
[0139]
ksep(赛多利斯(sartorius))配有400.50转子，其功能为ksep400的1/3.5比例缩小的模型。然后安装相关的400.50一次性套件(腔室套件和阀套件)。从生物反应器收获3l psc悬浮液并连接作为进料源。使用plasmalyte-a(百特(baxter))和(0.25％)人血清白蛋白(octapharma)的溶液灌注系统并洗涤细胞。使用782g的静态离心速度。为了优化流化床的形成，以递增的顺序测试3个流速(25，30，35ml/min)。在每次运行之前，一式三份地对进料源进行取样以测定进入ksep的细胞密度。对于整个浓缩过程，从离开ksep腔室的流中抽取5ml样品，并使用nucleocounter nc-200(chemometec，丹麦)测试以监测从流化床逸出的细胞量。在处理1l细胞悬浮液后，停止ksep，排空腔室，并且收集浓缩的细胞。重置ksep，吹扫管道和腔室，并且重复该过程，直到测试了所有流速且进料源耗尽。
[0140]
下游处理：全收获后hpsc浓缩
[0141]
将从生物反应器收获的含有过滤的psc悬浮液的袋一式三份地取样，并且接着使用nucleocounter nc-200测定活力和细胞密度。平均活细胞密度(vcd)用于使用等式1计算通过ksep收获的浓缩体积。
[0142][0143]
ksep400(赛多利斯)配有相应的一次性套件(腔室套件和阀套件)。使用10l的dpbs(-/-)袋(龙沙)灌注系统(不进行洗涤步骤)。然后将进料袋焊接到ksep阀套件上。工艺配方
灌注系统，将离心机倾斜至1000g，然后以120ml/min的速率将细胞悬浮液泵入1个腔室中(3.5x优化实验中确定的值，下舍入)。保持这些设置直到通过ksep处理全部进料。在整个过程中，周期性地从离开ksep腔室的流中抽取5ml样品，并使用nucleocounter nc-200测试以监测从流化床逸出的细胞量。在进料袋排空后，收获浓缩的细胞。验证浓缩物的体积，并且进行取样以测定活力和细胞密度。将剩余的浓缩物冻存。
[0144]
冻存
[0145]
将人ipsc悬浮于含有10μm y-27632(stemgent，04-0012)的冻存溶液(cs10，biolife solutions inc，210102)中。将冷冻管通过cryomed
tm
程控降温仪(赛默飞世尔科技公司，model 7456)冻存，并且随后储存在液氮中备用。
[0146]
免疫荧光染色
[0147]
将2d培养的细胞用4％多聚甲醛(santa cruz，sc 281692)固定，用含有10％驴血清和0.1％triton x-100的pbs-/-封闭溶液封闭。将细胞用一抗进行孵育，然后进行二抗孵育和dapi染色。使用olympus ix73显微镜观察免疫荧光。以下一抗用于检测hpsc相关标志物：oct4/pou5f1(艾博抗(abcam)，ab19857)、nanog(安迪生物，af1997)、tra-1-81(stemgent，09-0011)、tra-1-60(密理博(millipore)，mab4360)、ssea-4(密理博，mab4304)。以下一抗用于检测胚层特异性标志物的表达：sox17(安迪生物，af1924)、foxa2(艾博抗，ab108422)、nestin(安迪生物，mab1259)、pax6(biolegend，#901301)、α-辅肌动蛋白(sigma，a7811)和sma(密理博，cbl171)。
[0148]
流式细胞术
[0149]
使用如前所述的流式细胞术进行hpsc相关标志物的定量检测(参见，例如shafa,m、panchalingam,k.m、walsh,t、richardson,t.和baghbaderani,b.a。计算流体动力学建模，一种用于开发可扩展细胞疗法制造工艺的新颖且有效的方法。生物技术与生物工程(biotechnol.bioeng.)(2019)doi:10.1002/bit.27159；baghbaderani,b.a.等人cgmp制造的人诱导多能干细胞可用于临床前和临床应用。干细胞报告(stem cell reports)(2015)doi:10.1016/j.stemcr.2015.08.015；shafa,m、yang,f、fellner，t、rao，m.s.和baghbaderani,b.a。使用目前符合良好生产规范的方法生产的人诱导多能干细胞从三个胚层分化成临床相关细胞。医学前沿(front.med.)(2018)doi:10.3389/fmed.2018.00069)。简言之，对单细胞进行细胞表面标志物的活染：tra-1-81(bd生物科学(bd biosciences)，#560161)、tra-1-60(bd生物科学，#560884)和ssea-4(bd生物科学，#560126)。细胞也被固定、透化并且进行oct4/pou5f1染色(cell signaling，#5177s)。使用facscanto
tm
ii(美国bd公司(becton dickinson))或facscelesta
tm
(美国bd公司)对样品进行处理，使用bd facsdiva软件获取数据，随后使用flowjo v10软件(flowjo)分析。
[0150]
碱性磷酸酶染色
[0151]
使用stemab碱性磷酸酶染色试剂盒ii(stemgent，00-0055)，按照制造商说明书进行碱性磷酸酶染色。
[0152]
核型分析
[0153]
将活细胞接种到t-25烧瓶上，用l7
tm hpsc基质预包被并维持在l7
tm tfo2 hpsc培养基中。在labcorp(新墨西哥圣达菲(santa fe,new mexico))进行核型分析(g显带)。
[0154]
胚状体形成
[0155]
通过在含有knockout dmem f-12(gibco，12660-012)、20％knockout血清(gibco，10828-028)、非必需氨基酸-1x(gibco，11140-050)和glutamax-1x(gibco，35050-061)的培养基中将单细胞平板接种在aggrewell800(干细胞技术公司(stem cell technologies)，34811)中来进行胚状体(eb)形成。48小时后更换培养基，并且随后以每隔一天的方式更换直到第7天。在第7天，收集eb球并平板接种在涂有0.1％明胶(密理博，es-006-b)和含有dmem(gibco 11965-092)、20％fbs(gibco，sh30071)、非必需氨基酸-1x(gibco，11140-050)和glutamax-1x(gibco，35050-061)的培养基的平板上。每隔一天更换培养基，共7天。在平板接种后第7天，用4％多聚甲醛(santa cruz，sc-281692)固定eb，并用针对以下抗原的抗体染色以检测三个胚层的细胞：sox17(安迪生物，af1924)用于内胚层，pax6(biolegend，prb-278p)用于外胚层，以及sma(密理博，cbl171)用于中胚层。
[0156]
定形内胚层分化
[0157]
如前所述[39]将人ipsc分化成定形内胚层(de)。简言之，在第0天用含有l7
tm hpsc培养基补充物和10μm y27632(stemgent，04-0012)的l7
tm tfo2培养基将0.25
×
106个单细胞接种到l7
tm hpsc基质包被的24孔板上。在第1天，根据制造商的方案使用stemdiff
tm
定形内胚层试剂盒(干细胞技术公司，05110)诱导de分化。洗涤细胞，在第5天固定，并用de-特异性标志物sox17(安迪生物，af1924)和foxa2(艾博抗，ab108422)染色。
[0158]
神经干细胞分化
[0159]
如前所述[39]，将人ipsc分化成神经干细胞(nsc)。简言之，在第0天用含有l7
tm hpsc培养基补充物和10μm y27632(stemgent，04-0012)的l7
tm tfo2培养基将0.25
×
106个单细胞接种到l7
tm hpsc基质包被的6孔板上。在第1天，用神经诱导培养基(nim)更换培养基，所述神经诱导培养基由b-27 神经元培养系统(gibco，a3653401)与1x glutamax(gibco，35050-061)、4μm chir99021(stemgent，04-0004-02)、3μm sb431542(stemgent 04-0010-10)和10ng/ml hlif(派普泰克，300-00-250)组成。以每隔一天的方式更换nim。当细胞达到95至100％汇合时，使用f3传代溶液将细胞作为单细胞传代。将1
×
106和0.25
×
106个细胞分别接种在6-和24-孔板上(nsc-p1)。第二天和每隔一天补充nim，直到细胞固定并用神经祖细胞标志物、nestin(安迪生物，mab1259)和pax6(biolegend，901301)染色。用于nsc培养的细胞培养板通过与20μg/ml聚-l-鸟氨酸(sigma p4957)在无菌细胞培养级水(龙沙17-524f)中在37℃下孵育2小时来预包被。然后用不含钙和镁的dpbs(dpbs-/-)(龙沙，17-512f)洗涤板，接着在37℃下用再悬浮于dmem/f12(赛默飞世尔科技公司，11330032)或pbs-/-(龙沙，17-516f)中的15μg/ml层粘连蛋白(sigma，11243217001)孵育1小时。
[0160]
心脏分化
[0161]
使用如前所述的gsk3抑制剂和wnt抑制剂(giwi)方案将人ipsc分化成心肌细胞。(参见例如lian,x.等人通过在完全确定的条件下调节wnt/β-连环蛋白信号传导来指导人多能干细胞的心肌细胞分化。自然实验手册(nat.protoc.)(2013)doi:10.1038/nprot.2012.150；lian,x.等人通过典型wnt信号传导的时间调节进行从人多能干细胞的强健心肌细胞分化。美国科学院院报(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)(2012)doi:10.1073/pnas.1200250109；zhang,j.等人来源于人诱导多能干细胞的功能性心肌细胞。循环研究(circ.res.)(2009)doi:10.1161/circresaha.108.192237)。简言之，在10μm y27632(stemgent，04-0012)存在下，将1
×
106个单细胞/ml接种到l7
tm hpsc基质包被的6孔板上。
用含有l7
tm hpsc培养基补充物的l7
tm tfo2培养基维持细胞直至汇合，在此期间用6至12μm chir99021(tocris bioscience，4423)在rpmi/b27-胰岛素培养基中处理细胞(第0天)。24小时后，将培养基更换为新鲜的rpmi/b27-胰岛素(第1天)。在第3天加入5至7.5μm iwp2(tocris bioscience，3533)，在第5天加入新鲜培养基。从第7天开始，将细胞维持在rpmi/b27培养基中，以每隔一天的方式更换培养基，直到观察到自发收缩。此后，使用10x tryple
tm
选择酶(赛默飞世尔科技公司，12563011)在37℃将ipsc衍生的心肌细胞解离为单细胞5至10分钟。将细胞平板接种在涂有含0.1％明胶(密理博，es-006-b)的eb20培养基的24孔板上，所述培养基由dmem/f12(赛默飞世尔科技公司，11330032)、fbs(通用电气医疗集团(ge healthcare)，sh30071.01)、mem非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司，11140050)、glutamax
tm
supplement(赛默飞世尔科技公司，35050061)和2-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，21985023)组成。固定细胞并用中胚层特异性标志物、α-actinin(sigma，a7811)和平滑肌肌动蛋白(sma)(密理博，cbl171)染色。
[0162]
附图和实例
[0163]
首先参见图2，并且如上所述，示出了根据本公开的方法在17天的时间段内产生大于10的倍数扩增。例如，本文讨论的hpsc培养系统，其在本实例中包括l7
tm tfo2 hpsc培养基和基质，支持在手动操作、开放的旋转烧瓶和自动、封闭、搅拌釜式生物反应器中测试的hipsc的扩增。特别地，在补充了为长期生长而优化的生长因子和细胞因子的无异源营养培养基中培养的rtipsc4i和rtipsc3b细胞显示出优异的生长和扩增。因此，在本实例中，l7
tm tfo2 hpsc培养基支持从如成纤维细胞和pbmnc之类的体细胞生成人ipsc。此外，虽然数据未显示，但也支持在常规2d细胞培养平台中维持各种hesc和hipsc系，所述常规2d细胞培养平台利用包被有l7
tm hpsc基质的细胞培养容器来支持细胞附着。为了评估l7
tm tfo2 hpsc培养基支持悬浮中的hpsc生长的能力，将2d培养的rtipsc3b和rtipsc4i细胞作为细胞团块收获，并用包被有l7
tm
hpsc基质的直径为90至150μm的微载体以0.2
×
106个细胞/ml的细胞密度接种在l7
tm tfo2 hpsc培养基中。如图2a和2b所示，在悬浮的头几天期间观察到细胞数的初始减少，随后细胞数增加，在第17天达到》2
×
106个细胞/ml(》10倍扩增)。结果表明l7
tm tfo2培养基支持悬浮中的hpsc的基于mc的扩增，并且该10倍扩增可以在17天内的连续悬浮培养中实现而不需要细胞传代。
[0164]
如图3中所示，本公开已发现，与先前教示相反，较大直径微载体(mc)支持hpsc的扩增，且(如果不是更好的话)支持较小直径微载体的扩增。在90至150μm(小)或125至212μm(大)尺寸的包被有l7
tm hpsc基质的mc存在下，用0.2
×
106个细胞/ml的rtipsc3b接种旋转烧瓶。当使用小尺寸和大尺寸mc时，观察到17天内相似的细胞生长和扩增。在两种条件下，在培养期间，细胞在相似的一天达到》2
×
106个细胞/ml和》10倍扩增。这些结果证实了使用较大尺寸的mc进行细胞扩增。
[0165]
在图4和图5中，本公开已经表明，与现有教导相反，较低的接种密度不损害细胞产量，而是导致较高的倍数扩增。为了在如3l生物反应器之类的悬浮系统中以0.2
×
106个细胞/ml的接种细胞密度生成高细胞数目，在接种时需要600
×
106个细胞。用rtipsc4i细胞以两种不同的细胞密度接种旋转烧瓶：0.2
×
106个细胞/ml和0.04
×
106个细胞/ml。将细胞悬浮培养17天，并在扩增期间的不同时间点测定细胞计数。图4示出了在两种接种物细胞密度下实现了相当的细胞密度。用较高细胞密度接种的旋转烧瓶产生3
×
106个细胞/ml，而用较
低细胞密度接种在第17天产生2.5
×
10
6个
细胞/ml。扩增倍数结果的比较表明，较高密度接种导致了到第17天时约15倍的扩增，这与上述图2中的扩增倍数相当。然而，较低接种密度的接种物，其在接种时使用的hipsc少5倍，在第17天导致90倍扩增。该倍数扩增比使用较高接种密度获得的高约6倍。
[0166]
为了用不同的hipsc系证实这些发现，本公开以0.04
×
106个细胞/ml的细胞密度用小或大尺寸的包被的mc接种rtipsc3b细胞。图5展现了16天内的细胞生长和倍数扩增。细胞产量达到》1.6
×
106个细胞/ml，在小或大尺寸mc上的扩增倍数》40。因此，本公开发现以较低细胞密度接种的hipsc能够实现更高倍的扩增，减轻了在3d悬浮培养中接种之前在2d细胞培养平台中大规模扩增的负担。
[0167]
接下来参考图6和7，如上文所论述，本公开已发现在营养基质中包被微载体可进一步使hpsc附着于微载体。使用l7
tm
传代溶液从2d细胞培养物收获细胞，并以0.2
×
106个细胞/ml的密度作为细胞团块接种在旋转烧瓶中。两个烧瓶都含有微载体，其中一个烧瓶中的微载体用l7
tm hpsc基质包被，并且另一个烧瓶中的微载体未包被。虽然在第0天(接种日)的细胞活力被确定为85％，但是在第3天进行的细胞计数显示细胞数减少。该观察结果与先前的结果相匹配，即在悬浮中头几天细胞密度降低(图2和3)。然而，在第7天，用l7
tm hpsc基质包被的mc接种的细胞显示高活力(90％)和2倍扩增。用未包被的mc接种的细胞不能显示生长和扩增。结果表明，包被mc改善了细胞扩增。以0.04
×
106个细胞/ml的较低接种细胞密度重复实验。将lipsc18r细胞接种在具有包被或未包被的mc的旋转烧瓶中。监测细胞生长超过7天表明，与细胞用包被的mc进行孵育的旋转烧瓶中第7天的10倍扩增相比，细胞用未包被的mc进行孵育的旋转烧瓶中的扩增最小。
[0168]
为了排除细胞在没有mc的情况下扩增的可能性，将rtipsc4i细胞在具有和不具有用l7
tm hpsc基质包被的大尺寸mc的旋转烧瓶中进行接种，如图7所示。在具有mc的烧瓶中，细胞在10天内达到70倍扩增，而在不具有mc的烧瓶中没有检测到扩增。
[0169]
接下来参考图8和9，本公开还发现本文所述的方法可升级至更大的生物反应器。旋转烧瓶实验表明，使用l7
tm hpsc基质包被的mc在l7
tm tfo2培养基中扩增的hipsc导致高倍数扩增。为了展现可扩展性，在1l(数据未显示)和3l搅拌釜式生物反应器中进行3d扩增系统。使用从2d培养收获的作为细胞团块的三种不同hipsc系进行十次3l生物反应器运行。将细胞用l7
tm
hpsc基质包被的mc(125至212μm)以0.02-0.04
×
106个细胞/ml的细胞密度范围进行接种，并维持在l7
tm tfo2培养基中，以每天1个容器容积(vvd)灌注。对从mc释放的单细胞进行的细胞计数显示在前5至9天扩增5至20倍，并且向前扩增》10倍，导致》2
×
106个细胞/ml(图8)。在这些培养条件下，所有三种hipsc细胞系在培养9至16天内实现平均93倍扩增。值得注意的是，尽管rtipsc4i运行2在接种时仅使用0.027
×
106个细胞/ml，但在11天内仍实现约80倍扩增。该结果支持旋转烧瓶实验中的发现，表明较低的接种物细胞密度不损害细胞产量，支持平台稳健性。在生物反应器运行的不同天的细胞活力被确定为高(》85％，数据未显示)。在不同时间点取自生物反应器的细胞-mc样品的图像显示细胞随时间的扩增(图9)。
[0170]
此外，参考图10，在孵育期间监测各种代谢物。令人惊讶地，本公开已经发现ipsc细胞可以具有优异的生长和扩增，具有低于先前认为的溶解氧水平。然而，在运行期间监测如葡萄糖之类的关键营养素和如乳酸盐之类的代谢物。图10示出了葡萄糖水平的降低，对
应于当细胞在培养中扩增时葡萄糖消耗的增加。即使当生物反应器中的细胞密度达到3.05
×
106个细胞/ml时(lipsc18r运行2)，葡萄糖浓度也不会下降到2.4g/l以下。相反，观察到乳酸盐产量随着最大浓度1.79g/l而增加(lipsc18r运行2)。对于其它细胞系，即使对于5.6
×
106个细胞/ml(rtipsc3b)或5.1
×
106个细胞/ml(rtipsc4i)的高细胞密度，乳酸盐水平也不超过1.6g/l。此外，使用来自finesse solutions的trubio dv软件实时密切监测ph和溶解氧(do)。与营养物水平类似，ph水平受细胞扩增的影响。当设定点为7.2时，随着细胞扩增，ph水平下降至约6.8。将溶解氧设定为50％并维持运行的头几天。然而，随着细胞扩增，do水平下降，并且finesse控制器不能维持所设置的目标。对于接近2
×
106个细胞/ml的细胞密度，do水平下降至30％。对于》4
×
106个细胞/ml的较高细胞密度，do水平低于10％。
[0171]
以前的研究已经表明o2水平调节hpsc代谢通量，但是在20％或5％的o2中培养的hpsc中多能性和分化标志物的表达没有改变。此外，如下面将更详细讨论的，没有观察到增殖的差异，表明低o2改善了hpsc干性。其它人还显示30％的do是支持hpsc扩增的最佳条件。与本研究一致，我们没有观察到对以约2.5
×
10
6个
细胞/ml的细胞密度收获的细胞质量的不利影响，其中do水平保持》30。此外，以》5
×
106个细胞/ml的细胞密度和10％的对应do水平从3l生物反应器收获的细胞的表征显示所述细胞具有正常核型，表达hpsc相关标志物并且能够分化成三个胚层的细胞。这些发现表明o2水平对在本文讨论的端到端平台中扩增的细胞的质量的影响最小。
[0172]
此外，参考图11至13，本公开发现根据本公开形成的hpsc表现出hpsc相关标志物的优异形态和表达。即，在生物反应器内部以封闭方式进行从生物反应器收获细胞。将培养基泵出，并且泵入f3非酶传代溶液以从微载体释放细胞。作为f3传代溶液处理的结果，细胞作为单细胞从微载体释放。然后将单细胞和微载体在f3传代溶液中的所得溶液以封闭方式转移通过分离袋以将细胞与微载体分离。细胞通过过滤袋直接进入含有l7
tm tfo2 hpsc培养基的收集袋。为了评估从生物反应器中收获后扩增的hipsc的质量，对细胞的形态、hpsc相关标志物进行表征，验证它们的核型，并确定它们的多能性。
[0173]
为了评估形态，将mc上的hipsc或mc释放的hipsc接种到用l7
tm hpsc基质包被的2d细胞培养板上。图11示出了从3l生物反应器中收获后在2d培养板中培养的rtipsc3b和lipsc18r细胞具有典型的hpsc集落形态，包括限定的边缘和具有大细胞核和稀少细胞质的紧密堆积的细胞。此外，两种细胞系的免疫荧光染色显示hpsc相关标志物的定性表达(图12)，而流式细胞术结果进一步证实，在生物反应器中扩增的》85％的ipsc在收获后表达hpsc相关标志物(图13)。在下表1中反映的核型分析显示从生物反应器收获并在2d中培养一代或多代的细胞中没有基因组异常。
[0174]
表1
[0175][0176]
此外，如图14和15所示，通过胚状体(eb)形成或通过定向分化评估扩增的hipsc分化成三个胚层的细胞的潜力。图14示出了由在3l生物反应器中扩增的rtipsc3b细胞形成的平板接种的eb的免疫荧光染色图像。胚层特异性标志物的阳性检测表明在生物反应器中扩增的细胞保留了它们在收获后产生三个胚层的细胞的潜力。从3l生物反应器收获后，在rtipsc3b和lipsc18r细胞上进行hipsc向定形内胚层(de，内胚层胚层)\神经干细胞(nsc，外胚层胚层)和心肌细胞(cm，中胚层胚层)的定向分化。如图15所示，对胚层特异性标志物的免疫染色证实扩增的细胞保留了多能性和直接分化为de\ncs和cm的能力。如材料和方法部分所述，在观察自发收缩后进行cm特异性标志物的免疫染色。
[0177]
接下来参考图16和17，随着细胞疗法的制造朝着生物反应器中更大规模培养的方向发展，更多的细胞将用于接种，并且在收获后需要处理更多的细胞。生物反应器收获后ipsc的常见现有处理是操作者洗出培养基，通过台式离心对细胞进行浓缩，并且接着再悬浮于冷冻保护剂中。朝着大规模gmp生产的方向发展，该开放步骤对于产品和最终对于将接受它的患者是关键的污染风险，并且难以缩放。一种解决方案是利用连续离心装置，例如ksep400连续离心系统。
[0178]
流化床形成期间流速的优化定义为(1)最小化建立流化床所需的时间，(2)最大化细胞回收，和(3)维持细胞活力和增殖能力。当进入ksep腔室的大部分细胞被保留时，流化床的建立得以实现，并且因此逸出细胞的百分比达到最小。定量地，这可以定义为逸出百分比下降低于10％，意味着流化床捕获90％或更多的进入细胞。
[0179]
30ml/min和35ml/min在10至11分钟内建立流化床，并且25ml/min流速在13至14分钟后建立床(图6a)。取来自30和35ml/min测试的细胞用于细胞计数和培养。细胞计数显示细胞活力不受浓缩过程的负面影响，并且两种方案都具有回收率≥80％(参见下表2)。选择35ml/min的流速用于ksep 400.50中ipsc的浓缩。当移动到ksep400中时，该流速按比例增加到120ml/min。
[0180]
表2
[0181][0182]
在为流化床设置和浓缩步骤确定了可能的流速(120ml/min)后，使用ksep400浓缩五个生物反应器收获物。对于这些运行中的四个，定期取样离开ksep腔室的废物流以监测流化床的形成和稳定性(图17)。进行第五次运行，但不监测流化床的形成。在所有四个监测运行中，流化床在约8分钟内形成(图17)。在所有5次运行中，细胞回收率》90％且活力的任何损失为≤1.3％(参见下表3)。可以将细胞浓缩至最高2.26
×
108个活细胞/ml。浓缩后，将来自每次运行的细胞平板接种到2d上并进行质量测试(参见下面图18至21的讨论)。在所有ksep400运行中，在连续浓缩的最末阶段，观察到从流化床逸出的活细胞的百分比的轻微上升(达到额外的5％)。这种微升不太可能是由于超过了腔室容量；在运行1(腔室中构3
×
109个hipsc)中观察到运行3(腔室中约12
×
109个hipsc)中观察到的相同模式。不希望受理论束缚，这可能是由于进料袋中的细胞沉降，导致扰乱流化床的浓缩细胞(或细胞团块)的突然流入。
[0183]
表3
[0184][0185]
参考图18至21，ksep后扩增的hipsc的质量评价包括细胞附着、形态、hpsc相关标志物表达、核型和多能性。ksep后，将单细胞hipsc(rtipsc3b和lipsc18r细胞系)以两种不同的细胞密度平板接种在包被有l7
tm hpsc基质的2d细胞培养板上。在l7
tm tfo2培养基中培养的细胞附着良好并表现出典型的hpsc形态(图18)。同样，细胞表达hpsc标志物，如通过免疫荧光染色定性测定和通过流式细胞术定量测定(分别为图19和29)。
[0186]
为了确定通过ksep浓缩的细胞是否也能够产生所有三个胚层，进行ksep后rtipsc3b和lipsc18r细胞的定向分化。如图21所示，在生物反应器中扩增后，作为单细胞收获并通过ksep浓缩的细胞能够直接分化成神经干细胞，如通过对pax6和nestin的阳性染色所见；定形内胚层，如foxa2和sox17的阳性染色所示；和收缩后的心肌细胞，如sma和α-actinin的阳性染色所示。来自两个独立的生物反应器运行，随后是ksep浓缩的lipsc18r的核型被确定为正常(参见上表1)。
[0187]
下面参考图22和23，基于细胞的治疗产品的冻存是细胞治疗的关键方面。ipsc的主细胞库和工作细胞库可容易地用于随后几轮扩增和分化成所需细胞治疗产品。然而，关
键的障碍是维持冻存细胞的活力和性能。
[0188]
如上所述，将在3l生物反应器中扩增并通过ksep浓缩的人ipsc冻存在1ml的冻存溶液中。将》85％的高活力的细胞以各种细胞密度冻存。在冻存后约2周时将冻存细胞解冻，并且测定细胞活力和活性。解冻细胞的活力在各种冻存细胞密度上是相似的，但低于冻存前的活力(见下表4)。在平板接种到2d细胞培养板上后，附着的、扩增的细胞具有hpsc典型的形态，并且碱性磷酸酶染色呈阳性(图22和23)。该数据还显示了将hipsc冻存至120和240
×
106个细胞/ml的高细胞密度的可行性。这将缩短用于涉及细胞扩增和分化的进一步过程的2d种子培养。
[0189]
因此，图22和23表明了在收获和随后通过ksep浓缩之后以高细胞密度冻存的hipsc可以成功地回收。细胞保留hpsc特征，如在2d平板接种时的形态和hpsc相关标志物、碱性磷酸酶的表达所示。
[0190]
表4
[0191][0192]
接着，检查冻存细胞是否可用于接种3l生物反应器容器(不需要2d种子培养)，同时保持其自我更新和分化的能力。为了为较大的生物反应器提供足够的接种物而在2d种子培养中生成足够的细胞是耗时的，高度手动的并且涉及易受污染的过程。此外，考虑到细胞系之间通常观察到的可变性，通过2d种子培养培养hpsc依赖于主观决策，并且通常需要经过高度培养有素的人员，能够监测培养不规则性，这可能对随后在生物反应器中的细胞扩增产生不利影响。为了克服这些挑战，本公开已经测试了通过将冻存细胞解冻到悬浮培养中是否可以避免2d种子培养。
[0193]
将冻存为单细胞的lipsc18r解冻并以0.04
×
106个细胞/ml的细胞密度接种到旋转烧瓶中。同时，将2d培养的lipsc18r细胞解离并以相同的细胞密度作为单细胞接种到另一个旋转烧瓶中。生长和扩增图表明冻存和新鲜单细胞接种物在第9天达到相当的细胞密度和倍数扩增(图24)。为了表明这些发现的可扩展性，用先前在3l生物反应器中扩增的lipsc18r细胞接种3l生物反应器，通过ksep400浓缩并冻存(0.068
×
10
6个
细胞/ml接种密度)。接种后9天，获得3.5
×
106个活细胞/ml的细胞密度和》50倍的总扩增(图25)。代表性相衬图像显示lipsc18r在l7
tm hpsc基质包被的mc上随着时间在悬浮培养中的持续扩增(图26)。收获、浓缩和冻存这些细胞后，评价扩增细胞的质量。图27示出了在mc上扩增的单细胞或细胞簇形成具有典型形态的集落。此外，代表性免疫荧光图像和流式细胞术分析证实了hpsc相关标志物的表达(分别为图28、29)。通过细胞谱系特异性标志物的免疫染色也证实了这些细胞定向分化为三个胚层(图30)。这些结果表明冻存的hipsc接种物能够在基于mc的悬浮系统中扩增，从而产生大量高质量的hipsc。
[0194]
特别地，在搅拌釜式生物反应器中接种0.02-0.07
×
106个细胞/ml时，获得》2
×
106个hipsc/ml的细胞密度(参见表5)。随着生物反应器的容积增加，接种物的量需要成比例地增加。在传统手动和开放式2d过程中生成这种接种物是不理想的，增加了执行失败的风险。
[0195]
表5
[0196][0197]
然而，本公开表明了用冻存细胞接种3l生物反应器并实现约50倍扩增的可行性，显示2d种子培养可完全被封闭的3d种子培养替代。然而，为了满足接种50l或更大的生物反应器所需的细胞数目，仍然需要来自2d细胞培养或悬浮培养系统的相当大尺寸的工作细胞库。为了克服这种障碍并减轻大规模制造hpsc所涉及的挑战，本公开表明了3d种子培养的可行性。特别地，参考图31，测试了两种条件：将细胞-mc簇从旋转烧瓶再接种到3l生物反应器(conlipsc18r细胞)，并将从旋转烧瓶收获的单细胞转移到3l生物反应器(rtipsc3b细胞)。在这两种条件下，接种时的细胞密度为0.04
×
106个细胞/ml，并且细胞用l7
tm hpsc基质包被的mc扩增。来自旋转烧瓶的细胞-mc簇产生2.92
×
106个lipsc18r细胞/ml的最大细胞密度，对应于在12天内》70倍扩增(图32)，这与以上图10中所示的结果相当。从旋转烧瓶收获的单细胞在第15天导致rtipsc3b细胞的约70倍扩增，如通过来自完全收获的细胞计数所确定的(图33)，但是有趣的是，表现出更长的
‘
停滞期’，其可归因于作为单细胞而不是细胞团块接种。在运行的第2天和第12天从生物反应器取样的细胞-mc簇的代表性相位图像，显示细胞扩增(图34)。图35示出了在mc上扩增的单细胞或细胞簇在收获后5天形成具有典型形态的集落，并平板接种到2d培养板上。
[0198]
另外，代表性的免疫荧光图像(图36)显示了通过3d种子培养在3l生物反应器中扩增的rtipsc3b细胞(从旋转烧瓶收获的单细胞)的hpsc相关标志物的表达。流式细胞术实验证实，》90％的细胞表达oct3/4、ssea-4、tra-1-81和tra-1-60(图37)。胚状体形成试验显示这些细胞保留了hpsc分化潜力(图38)。基于上述结果，能够成功地表明3d种子培养可导致高质量细胞的高倍数扩增，从而为hpsc的商业规模生产铺路。
[0199]
因此，本公开已经显示基于微载体的生物反应器悬浮平台，以使用无异源、完全限定的hpsc培养基将hipsc扩增至》2
×
109个细胞/l的细胞密度，所述hpsc培养基具有用于hipsc收获和浓缩的封闭的自动化过程，并广泛表征了扩增的hipsc。端到端平台hpsc培养系统，其包括l7
tm tfo2 hpsc培养基和基质，支持在手动操作、开放的旋转烧瓶和自动、封闭、搅拌釜式生物反应器中测试的hipsc的扩增。在接种有0.2
×
106个细胞/ml和微载体的
旋转烧瓶中进行的可行性实验在17天内导致10倍扩增而不需要细胞传代。当评估hesc在层粘连蛋白包被的mc上的生长时，结果与先前公布的结果相当。然而，如本文所讨论的，细胞不需要通过在静态培养条件下用mc预处理而适应悬浮培养；相反，它们可以直接接种。
[0200]
除了hpsc在其中扩增的培养基的组成之外，优化细胞接种密度是悬浮系统中hipsc扩增的一个因素。特别地，当比较较低和较高的接种细胞密度时，它表明使用较低的接种密度可以实现较高的倍数扩展。此外，接种密度不仅影响扩增的速率和质量，而且影响与在接种时实现必要的细胞密度相关的成本、劳动和时间支出。
[0201]
此外，本文所述的方法表明了在1l或3l生物反应器容器中的可扩展性。特别地，每3l生物反应器运行成功产生6-15
×
109个细胞，(取决于细胞系和收获日)满足许多临床适应症所需的细胞数目。此外，当使用2d培养的细胞作为生物反应器接种物时，在9至16天内实现超过90倍的扩增，这是比在旋转烧瓶培养物中实现的扩增更高的倍数。不希望受理论束缚，这可能归因于更好地控制了影响hipsc扩增速率的关键参数。通过灌注实现的连续培养基改变有助于控制关键营养物和代谢物，如葡萄糖和乳酸盐。通过单侧控制方案控制ph，其中当ph漂移超过设定点7.2时使用co2降低ph。图10示出了这防止了ph升高超过设定点0.1个单位。然而，没有主动控制来提高ph(例如碱的加入)，由co2的废气引起的ph的被动逐渐增加。因此，随着细胞扩增，ph逐渐降低至约6.8'。
[0202]
然而，当细胞扩增增加时，观察到do水平的降低，其不能维持在50％的设定目标，并且在细胞密度》3
×
106个细胞/ml时达到10％。以前的研究已经表明o2水平调节hpsc代谢通量，但是在20％或5％的o2中培养的hpsc中多能性和分化标志物的表达没有改变。此外，没有观察到增殖的差异，表明低o2改善了hpsc干性。其它人还显示30％的do是支持hpsc扩增的最佳条件。与本公开一致，没有观察到对以约2.5
×
106个细胞/ml的细胞密度收获的细胞质量的不利影响，其中do水平保持》30。此外，以》5
×
106个细胞/ml的细胞密度和10％的对应do水平从3l生物反应器收获的细胞的表征显示所述细胞具有正常核型，表达hpsc相关标志物并且能够分化成三个胚层的细胞。这些发现表明o2水平对在根据本公开的平台中扩增的细胞的质量的影响最小。
[0203]
为了增加cgmp过程顺应性，本公开表明了在搅拌釜式生物反应器中扩增的细胞可以以封闭和自动化的方式收获和浓缩。迄今为止，仅有另一报道使用ksep浓缩hpsc，使约1.2
×
109个hpsc浓缩十倍，活细胞回收率为65％。在本文所述的方法中，平均而言，ksep过程保留了所有收获细胞的94％，并且能够在30分钟内处理3l生物反应器，从而将细胞浓缩至105倍。因此，本文的数据显示每ksep 400周期可收获至少48
×
109个hpsc(12
×
109个细胞/腔室
×
4个腔室)，尽管需要进一步的实验以找到最大容量。该最大容量将是主要的扩展约束：虽然120ml/min的流速可以在125分钟内合理地处理50l生物反应器，但是从这种生物反应器收获的总细胞(100
×
109)可能超过ksep 400容量。这可以通过平行处理两个ksep单元，或通过在两个连续循环中从一个单元收获细胞来克服。
[0204]
使用ksep400的封闭的自动浓缩步骤的无缝实施，以及随后的高质量hipsc的回收，展现了根据本公开的平台的适应性。鉴于cgmp政策的持续演进和大规模制造的创新，需要开发稳健、灵活且可适应的过程。因此，这里讨论的基于mc和下游处理兼容平台允许大规模生产hipsc而不损害扩展的hipsc的质量。
[0205]
大规模制造基于细胞的疗法的另一个关键要素是保持冻存细胞的活力，使得这些
细胞的治疗潜力保持完整。如上所示，根据本公开产生的冻存hipsc在解冻后表现出确认的质量和活力。
[0206]
为了成本效益和减轻如污染的风险，本公开表明了将冻存细胞直接接种到3d中的能力。用于接种物的冻存细胞显示出高倍数扩增和质量，如通过细胞形态、hpsc相关标志物的表达和直接分化的能力所证实的。该平台的进一步开发显示了3d种子培养的可行性，使得例如在3l生物反应器中扩增的细胞可以在更大的生物反应器容器中再接种。假定保守的细胞数目为2
×
109个细胞/l，来自一个3l生物反应器的细胞可潜在地用作3
×
50l生物反应器的接种物。假定在生物反应器中通过较长的培养期可获得甚至更高的细胞产量，一个3l生物反应器可用作几个50l生物反应器或甚至一个250l生物反应器的接种物。总之，这使得完全无2d、封闭、自动化且需要最少劳动的扩增过程成为可能。这将使得需要大量细胞的临床适应症实现商业化，从而增加基于细胞的疗法的可用性。
[0207]
然而，以下参考本文所述的过程/端到端平台的示范性标准操作程序。
[0208]
eppendorf bioblu 3c生物反应器设置和操作
[0209]
1.0目的：
[0210]
本文件概述了相对于ipsc扩增和使用系统的下游处理使用finesse控制器设置和操作eppendorf bioblu 3c生物反应器的程序。
[0211]
2.0参考文献：
[0212]
2.1.nova bioprofile flex操作的nova手册
[0213]
2.2.ph探针校准草案sop
[0214]
2.3.光学do探针校准草案sop
[0215]
3.0材料和设备：
[0216]
3.1.材料
[0217]
3.1.1.hpsc系
[0218]
3.1.2.袋中l7-tfo2(l7-nao)，由引导操作定制
[0219]
3.1.2.1. 2
×
13l袋
[0220]
3.1.2.2. 2
×
10l袋
[0221]
3.1.2.3. 1
×
4l袋
[0222]
3.1.2.4. 1
×
2l袋
[0223]
3.1.2.5. 1
×
1.5l袋(用于收获)
[0224]
3.1.3. 500ml瓶中的l7-tfo2(l7-nao)，由引导操作定制
[0225]
3.1.3.1. 6
×
500ml瓶
[0226]
3.1.4.l7-hpsc supplement
tm
，龙沙，p/nfp-5020(10ml/l培养基)
[0227]
3.1.4.1. 2
×
100ml等分试样(2
×
10l袋)
[0228]
3.1.4.2. 2
×
130ml等分试样(2
×
13l袋)
[0229]
3.1.4.3. 1
×
20ml等分试样(1
×
2l袋)
[0230]
3.1.4.4. 1
×
40ml等分试样(1
×
4l袋)
[0231]
3.1.4.5. 1
×
30ml等分试样(1
×
3l袋：收获袋1.5l f3溶液 1.5l l7 tfo2)
[0232]
3.1.4.6. 6
×
5ml等分试样(对于6
×
500ml瓶)
[0233]
3.1.5. 1
×
＝1.5l f3溶液(对于收获日)
[0234]
3.1.6. 1
×
500ml f3溶液瓶(用于取样)
[0235]
3.1.7.管道：
[0236]
3.1.7.1.透明c-flex管道(1/8"id
×
1/4"od)，科尔帕默(cole parmer)，p/n 06422-05
[0237]
3.1.7.2.硅胶管道(1/8"id
×
1/4"od)，科尔帕默，p/n 06411-67
[0238]
3.1.7.3.masterflex pharmmed bpt l/s#16管道(3.1"id)，科尔帕默，
[0239]
p/n ew-06508-16
[0240]
3.1.8.连接器(或软管倒钩)：
[0241]
3.1.8.1.直通管接头，带经典系列倒钩1/8"id至1/8"id，威璐塑件(value plastics)，p/n cc-6005
[0242]
3.1.8.2. 1/8"id x 1/16"id的减速耦合器，科尔帕默，p/n ew-40703-41
[0243]
3.1.8.3.连接器1/8"id
×
1/4"id，科尔帕默，p/n ew-30703-50
[0244]
3.1.8.4.公鲁尔一体式锁环与500系列倒钩(male luer integral lock ring to 500series barb)，1/8"id管道，科尔帕默，p/n 30800-18
[0245]
3.1.8.5.母鲁尔螺纹型帽(female luer thread style cap)，科尔帕默，p/n 30800-12
[0246]
3.1.9.缆线扎带5.5"，龙沙，p/n 03210或等同产品(耐高压灭菌)
[0247]
3.1.10.缆线扎带尼龙(cable ties nylon)4"，科尔帕默，p/n ew-06830-52或等同产品(耐高压灭菌)
[0248]
3.1.11.whatman过滤器，ge生命科学(ge life sciences)，p/n 6713-0425
[0249]
3.1.12.sartofluor过滤器，赛多利斯，p/n 518507t7-hh-a 0.2μm ptfe膜p/n 4251
[0250]
3.1.13. 50ml锥形管，龙沙，p/n 04621或等同产品
[0251]
3.1.14.延长套件(extension set)，龙沙，p/n cs6226
[0252]
3.1.15.用于细胞培养的辐照solohill塑料微载体(125-212μm)，pall solohill，产品目录号pir-221-020，产品代码ps102-1521
[0253]
3.1.16.含钙和镁( / )的dpbs，龙沙，p/n 17-513f或等同产品
[0254]
3.1.17.不含钙和镁(-/-)的dpbs，龙沙，p/n17-512q或等同产品
[0255]
3.1.18. 500ml无菌瓶，龙沙，p/n 00525120或等同产品
[0256]
3.1.19. 600ml转移包，龙沙，p/n 03833或等同产品
[0257]
3.1.20. 1l nalgene cap，龙沙，p/n 05102951或等同产品
[0258]
3.1.21.用于细胞培养应用的水，龙沙，p/n 17-724q或等同产品
[0259]
3.1.22.rock抑制剂，派普泰克，cat#1293823-10mg
[0260]
3.1.23.夹钳和/或止血钳
[0261]
3.1.24.灭菌袋，10"
×
15"，飞世尔科技(fisher scientific)，p/n 01-812-57或等同产品
[0262]
3.1.25. 100mm盘(或6孔板)
[0263]
3.1.26.各种血清学移液管
[0264]
3.1.27.吸移液管，龙沙，p/n cs0075或等同产品
[0265]
3.1.28. 30ml鲁尔锁注射器，龙沙，p/n 08095或等同产品
[0266]
3.1.29. 60ml鲁尔锁注射器，龙沙，p/n 06009或等同产品
[0267]
3.1.30. 20l空培养基袋
[0268]
3.1.31. 12孔组织培养板，龙沙，p/n 04692或等同产品
[0269]
3.1.32.cell liberator-asi tcs-378，asi p/n tcs-378rev c
[0270]
3.1.33.via-1盒，龙沙，p/n 00527228
[0271]
3.1.34. 12孔组织培养板，龙沙，p/n 04692或等同产品
[0272]
3.1.35. 70％异丙醇
[0273]
3.1.36.石蜡膜
[0274]
3.1.37.箔
[0275]
3.1.38.实验室胶带
[0276]
3.1.39.用于高压灭菌过滤器的滤纸
[0277]
3.1.40.橡胶带
[0278]
3.2.设备
[0279]
3.2.1.finesse控制器和设备
[0280]
3.2.2.天平，赛多利斯或等同产品
[0281]
3.2.3.do探针，梅特勒托利多
[0282]
3.2.4.ph探针，梅特勒托利多
[0283]
3.2.5.温度探针(rtd)
[0284]
3.2.6.加热套，finesse
[0285]
3.2.7.ii类a/b3型层流生物安全柜(laminar flow biosafety cabinet，bsc)
[0286]
3.2.8.nucleocounter nc-200或等同产品
[0287]
3.2.9.tscd无菌接管机(sterile tubing welder)或等同器械
[0288]
3.2.10.赛多利斯生物焊机tc或等同产品
[0289]
3.2.11.一次性焊接机刀片，赛多利斯，p/n 16389-012
[0290]
3.2.12.尼康eclipse ti-s显微镜，或等同产品
[0291]
3.2.13.iv架
[0292]
3.2.14.masterflex l/s蠕动泵，带有容纳ls25管道的堆叠泵，或等同产品
[0293]
3.2.15.压力释放阀，6.4psi
[0294]
3.2.16.拉紧工具，科尔帕默，或等同产品
[0295]
3.2.17.eisco蒸馏器底座(retort base)，带杆，费希尔(fisher)，p/n 12-000-103，或等同产品
[0296]
3.2.18.fisherbrand castaloy三叉延伸夹(three-prong extension clamp)，27cm，费希尔，p/n 05-769-8q或等同产品
[0297]
3.2.19.troemner talboys labjaws常规夹持器(regular clamp holder)，费希尔，p/n02-217-121
[0298]
3.2.20.赛多利斯400系
[0299]
3.2.21.plasmalyte-a注射液ph 7.4，百特，p/n 2b2544x
[0300]
3.2.22.人血清白蛋白，龙沙，p/n 01459
[0301]
3.2.23.ksep400浓缩-洗涤-收获试剂盒，赛多利斯，ksep400-set-cwh
[0302]
3.2.24.阀一次性套件，赛多利斯，p/n ksep400-ts-cwhrv
[0303]
3.2.25.ksep腔室套件，赛多利斯，p/n ksep400.50-cs
[0304]
4.0权限和职责：
[0305]
4.1.部门主管或指定人员将负责培训本程序的人员。
[0306]
4.2.执行本程序时，技术人员将负责阅读并遵循本sop。
[0307]
5.0程序：
[0308]
从第一次解冻开始约2周的2d细胞扩增，如图39中所示
[0309]
5.1. 2d种子培养的开始
[0310]
注：通过接种冻存细胞可以避免2d种子培养。
[0311]
5.1.1.对于细胞接种密度为0.04
×
106个细胞/ml的3l生物反应器，接种当天总共需要120
×
106个细胞。以前的经验表明，在3l生物反应器中以细胞密度为0.02-0.04
×
106个细胞/ml总共接种60-120
×
106个细胞的情况下，可以实现》2
×
109个细胞/l的细胞产量。
[0312]
5.1.1.1.自解冻：将细胞解冻到1xt-75中以具有0.02-0.04
×
106个细胞/cm2(2-3
×
106个细胞/t-75烧瓶)。解冻时加入rocki，并且第二天用新的15ml不含rocki的完全l7-tfo2培养基替换。当细胞达到70-80％汇合时(通常在5至7天内)，使用l7传代溶液将细胞从t-75传代至1
×
1层细胞堆叠。接种密度应当在0.02-0.03
×
106个细胞/cm2之间，这对应于将15-20
×
106个细胞接种到1
×
1层细胞堆叠中。当细胞达到70-80％的汇合时(通常在5-7天内)，在1
×
1层细胞堆叠中应该有大约100-150
×
106个细胞。
[0313]
5.1.1.2.从t-75烧瓶收获细胞到1层细胞堆叠的程序
[0314]
取出培养基。
[0315]
用dpbs-/-洗涤一次。
[0316]
加入12ml l7传代溶液。在37℃下孵育并在培养中每5分钟密切观察以形成孔。等待10分钟。
[0317]
轻敲t-75烧瓶以从烧瓶中分离细胞。
[0318]
将l7传代溶液转移到无菌50ml锥形管中。
[0319]
向烧瓶中加入12ml完全l7-tfo2培养基。
[0320]
执行细胞计数。
[0321]
5.1.1.3.从1层细胞堆叠收获细胞的程序：
[0322]
取出培养基。
[0323]
用dpbs-/-洗涤一次。
[0324]
加入75ml温热的l7传代溶液。在37℃下培养，并在培养中每5分钟密切观察以形成孔。等待15分钟。
[0325]
一旦形成孔，轻敲1
×
1层细胞堆叠以释放细胞。
[0326]
多次轻敲烧瓶以从底部分离细胞。
[0327]
将细胞收集在250ml锥形管中，并向烧瓶中加入75ml完全l7-tfo2培养基。
[0328]
执行细胞计数。
[0329]
solohill微载体需要0.04
×
106个细胞/ml的接种密度。对于3l工作容积实验，总共得到120
×
106个活细胞。
[0330]
5.1.2.在ipsc的2d培养在约5至7天中，根据hpsc系可预期约100-150
×
106个细胞/1
×
1层细胞堆叠。
[0331]
5.1.3.应每隔一天更换一次完全l7-tfo2培养基。
[0332]
5.1.4.应在70-80％汇合时收获细胞；较高的汇合可导致较低的细胞活性，并因此可影响附着。
[0333]
生物反应器设置前几天(设置发生在周二，接种在周三，制备在周四至周五之前开始)
[0334]
5.2.用l7-基质包被1
×
6-孔板和24-孔板的8个孔和t-25烧瓶用于2d对照。
[0335]
5.3.如需要，针对2d分化、核型分析等，包被更多的板。
[0336]
5.4.管道组合件
[0337]
5.4.1.管道组合件应提前完成。
[0338]
5.4.2.所有组合件的一般注释：
[0339]
5.4.3.在组装管时使用硅胶手套和纸巾，以防止手指上形成疮。
[0340]
5.4.3.1.使用缆线扎带和拉紧工具将管道固定到软管倒钩/连接器上。设置应设为3。
[0341]
5.4.3.2.用蓝色纸覆盖所有过滤器，并用橡胶带固定-这是为了保持过滤器干燥。
[0342]
5.4.4.组装汲取管/灌注输出管线：
[0343]
5.4.4.1.组装汲取管/灌注输出管线，如图40所示
[0344]
5.4.4.2.测试备用容器中顶板适配器/螺钉的高度-确保筛网接近但不接触容器底部。
[0345]
5.4.4.3.轻柔地将管卷成圈，并用5"的缆线扎带松散地(不使用拉紧工具)固定。在环形管上使用拉紧工具可能导致管闭合，从而在高压灭菌期间阻塞管，或者撕裂管，使得组合件不适合使用。
[0346]
5.4.4.4.轻轻地将汲取管放入大的高压灭菌袋(12"
×
18")中，其中末端的顶部指向正常打开的末端，使得可以在无菌条件下容易地将其拉出。具有第二袋的双层包装，以防筛网撕裂穿过第一袋。
[0347]
5.4.5.培养基进料管线
[0348]
5.4.5.1.组装培养基进料管线，如图41所示。
[0349]
5.4.5.2.轻轻捆扎并置于高压灭菌袋(10"
×
15")中。
[0350]
5.4.6.收获管线延伸组合件(如果预期完全收获)：
[0351]
(
→
构件连接)
[0352]
(1)whatman过滤器
→
(2)3"长硅胶管道
→
(3)1/8mpc耦合体
→
(4)1/4mpc耦合插件
→
(5)10"长cflex 1/4"-3/8"管道
→
(6)1/4"至3/16"复位器
→
(7)25"pharmed l/s#16管道
→
(8)3/16"至3/16"连接器
→
(9)20"长cflex 1/8"-1/4"管道
→
(10)whatman过滤器。每个连接的两侧通过如图42所示的拉链带固定。
[0353]
eppendorf bioblu 3c生物反应器在其收获线的末端具有mpc耦合体，上述延伸组合件的1/4mpc耦合插件将以无菌状态附着在bsc内部。
[0354]
5.4.6.1.轻轻捆扎并置于高压灭菌袋中。
[0355]
5.4.7.在干燥高压灭菌循环中对所有组合件进行高压灭菌：
[0356]
将纸侧朝上(袋的塑料侧朝向高压灭菌器表面)。
[0357][0358]
5.4.8.高压灭菌循环完成后，在小心取出高压灭菌袋，喷洒70％乙醇并放入bsc之前，使袋略微冷却。使用前使袋完全干燥(尤其是易于撕破湿袋的灌注浸量尺)。
[0359]
5.5.包被和制备辐照的微载体：接种日前4天
[0360]
5.5.1.在无菌条件下将20g(10g瓶中的2个)solohill塑料微载体置于1l无菌nalgene瓶中。
[0361]
5.5.2.向瓶中加入300ml(预热30分钟，如果是冷的)dpbs以及钙和镁(dpbs / )。
[0362]
5.5.3.加入l7基质，使得每225mg微载体有1mg/ml的l7基质。
[0363]
5.5.3.1.对于20g大mc，这将是浓度为1mg/ml的约18ml l7基质(总共18mg l7基质)。请参见文档结尾处的重构方案。
[0364]
5.5.4.使载体在37℃下孵育至少2小时。
[0365]
5.5.5.让mc沉降并抽吸尽可能多的dpbs / 溶液。
[0366]
5.5.6.加入约300ml不完全l7-tfo2并在30rpm速度的振荡器上孵育过夜，用铝箔包裹瓶。
[0367]
5.5.7.第二天，向同一瓶中加入700ml不完全l7-tfo2培养基至1l。
[0368]
5.5.8.如果不立即使用，储存于4℃。
[0369]
5.5.8.1.经包被的微载体在使用前已于4℃下储存长达1.5周。未测试更长的贮存期。
[0370]
5.6.接种培养基和灌注培养基制备
[0371]
灌注用培养基的制备
[0372]
(这不一定必须在第-4天完成，只要培养基袋在第1天准备好用于灌注启动。)
[0373]
5.6.1.引导操作通过以下方式在袋和瓶中制备培养基：
[0374]
5.6.1.1.用于d-1的1
×
7l袋(2l与1l l7基质包被的微载体混合。在第2天更换培养基袋时，剩余部分将保存至收获日)。
[0375]
5.6.1.2.用于第2天灌注的2
×
7l袋
[0376]
5.6.1.3.用于第6天培养基袋更换的2
×
7l袋
[0377]
5.6.1.4.用于第9天培养基袋更换的1
×
7l袋
[0378]
5.6.1.5.如有必要，第12天1或2
×
7l袋
[0379]
5.6.1.6.
[0380]
5.6.2.在更换培养基袋前一天或同一天，袋应补充适量的l7-补充物(每升培养基10ml补充物)。
[0381]
5.6.3.在收获当天，应将rocki(10μm终浓度)加入将用于淬灭1.5l f3溶液的1.5l l7培养基中。这将增加单细胞存活。
[0382]
第-2天：周一
[0383]
5.7.ph探针校准
[0384]
5.7.1.用于电化学的(标准)ph探针：
[0385]
5.7.1.1.使用sop校准：ph探针校准草案sop
[0386]
5.7.1.2.高压灭菌ph探针。确保探针的加盖端位于易于打开的袋侧。
[0387]
5.7.1.3.确保探针的电子端加盖，并将探针双重包裹在高压灭菌袋中。在液体设定下进行高压灭菌。
[0388]
5.7.1.4.在继续之前允许冷却：约30至60分钟。
[0389]
5.7.1.5.冷却后，将探针转移至bsc。
[0390]
第-1天：周二
[0391]
5.8.bsc中的生物反应器容器制备
[0392]
5.8.1.当天开始，将2l l7-培养基袋置于前移式培育箱中加温，以便促进培养基的氧饱和。
[0393]
5.8.2.用70％ipa喷洒以下物质并带入bsc：
[0394]
●
bioblu 3c容器(s/n：________________)，exp：
[0395]
●
ph探针(s/n：_____________________)
[0396]
●
管道套件(汲取管/灌注输出、培养基输入、收获管线)
[0397]
●
2x延长套件
[0398]
●
do探针(s/n：_____________________)
[0399]
5.8.3.从生物反应器中取出塑料包装。确保所有物品均已附着和关闭。注意容器的pg13.5端口上的两个白色帽，以插入探针。检查容器是否有任何裂缝或破损部分，并丢弃有裂缝或破损的容器。
[0400]
5.8.4.插入ph探针：
[0401]
5.8.4.1.轻轻向下摆动ph探针，确保感应端无气泡。
[0402]
5.8.4.2.松开标有ph的红色帽，但不要将其取出。
[0403]
5.8.4.3.打开装有ph探针的高压灭菌袋。仅握住带帽的探针，并在无菌条件下将探针从袋中滑出。
[0404]
5.8.4.4.从生物反应器上的端口取出红色帽。倾斜生物反应器，以便观察开口。
[0405]
5.8.4.5.小心且在无菌条件下引导ph探针通过开口而不接触生物反应器的任何外部部分。仅使用帽固定ph探针。可能需要保持生物反应器管道以防止它们接触探针。将探针拧入端口。
[0406]
5.8.5.插入汲取管：
[0407]
5.8.5.1.松开标有“备用1”的白色帽，但不要将其取出。
[0408]
5.8.5.2.打开装有灌注浸量尺和管道的高压灭菌袋。仅可触及螺钉上方的浸量尺/管道的部分。
[0409]
5.8.5.3.在无菌条件下将灌注浸量尺的网状端插入第三生物反应器端口。需要小心以确保管道不接触待容纳在反应器内的灌注棒的部分且浸量尺的筛网不弯曲。
[0410]
5.8.5.4.注意不要将筛网弯向容器底部，否则可能会使其断裂。
[0411]
5.8.5.5.将灌注管道拧入端口，确保灌注管道不会缠结。使灌注浸量尺的上部部分远离生物反应器的叶轮。
[0412]
5.8.6.确保ph探针和灌注浸量尺紧紧拧在生物反应器中，并将石蜡膜包裹在所有
螺口周围。
[0413]
5.8.7.在生物反应器上的“收获”管线上，除去公型mpc接头，留下暴露的母型接头。
[0414]
5.8.8.通过在无菌条件下取出mpc耦合体部件并将装配管线上的公型接头插入生物反应器上的母型接头，附接收获管线组合件
[0415]
5.8.9.使用延长套件上的公鲁尔接头将延长套件附接到生物反应器上的两个鲁尔锁母型接头上。需要延长套件接头的两个鲁尔锁端口标记为la2(液体添加，用于取样)和样品(用作“备用”la2管线)。
[0416]
5.8.10.在两处关闭每条管线：在顶板(使用建立在容器上的roberts夹)和管线远端(使用止血钳)处。
[0417]
5.8.11.双重检查所有物品是否牢固附接以及所有端口是否关闭以打开空气。然后从bsc中取出反应器。
[0418]
5.8.12.将培养基输入管线焊接到la1管线(这也可以在灌注设置期间进行)。
[0419]
5.9.finesse控制器上的生物反应器设置
[0420]
5.9.1.重置finesse控制器：
[0421]
5.9.1.1.点击controllers off按钮。
[0422]
5.9.1.2.点击“reset all total and timers”(气体mfc和泵模块)。
[0423]
5.9.2.将组装好的生物反应器带到finesse控制器。
[0424]
5.9.3.使用物理皮重按钮对天平确定皮重，并将生物反应器置于预定天平上，靠近适当的控制器塔。
[0425]
5.9.4.将重量记录为“连接至控制器前的生物反应器容器重量”，连接至控制器前的生物反应器容器重量：______________。
[0426]
5.9.5.如果第一次在finesse控制器上设置生物反应器，则在finesse控制器上创建设置和默认文件。否则，加载现有文件。
[0427]
do探针
[0428]
5.9.6.插入do探针(首先，您需要拧开顶板上的do孔入口以用于220mm探针)。确保探针头端紧紧压在底部的薄膜上。
[0429]
5.9.7.将do探针连接到j-box。验证j-box是否有电源并连接到g3上的do输入。
[0430]
ph探针(电化学/标准)
[0431]
5.9.8.从ph探针上取下帽，并使用标有ph的电线连接到finesse控制器。
[0432]
rtd(温度探针)
[0433]
5.9.9.插入rtd探针并连接至finesse控制器。
[0434]
5.9.9.1.如果使用电线rtd，确保将其向下捆扎。
[0435]
电机
[0436]
5.9.10.将电机附接到生物反应器顶部的中心：
[0437]
5.9.10.1.电机应安装在生物反应器顶板上的凹槽中。电机可能撞击do探针，并且可能需要进行一些调整。
[0438]
5.9.10.2.通过测试50rpm下的搅拌来测试电机是否牢固放置。如果叶轮旋转不平稳或过程值超过设定点的
±
5rpm，停止搅拌并重新调节电机。
[0439]
加热套
[0440]
5.9.11.将加热套固定在生物反应器周围。确保电线从毯子顶部移动到控制器(以确保每次取出加热套以检查生物反应器中的团块时重量不波动)。确保加热套不接触天平，从而使容器重量读数偏移。
[0441]
气体管线
[0442]
5.9.12.将标记有hs(顶部空间)的mfc的气体管线(通过公鲁尔接头使硅胶管道附接其上)连接到具有母型鲁尔接头过滤器的气体入口管线。
[0443]
5.9.12.1.确保压力释放阀已附接到mfc的管线上。如果没有，通过切割并将管道从任一端滑到安全阀上，在hs端口的硅胶管线中附接安全阀。该安全阀防止了在由于堵塞而导致一次或二次排气故障的情况下容器的过压。
[0444]
5.9.13.如图43所示，用拉链扎带将废气和气体进入管线固定到电机上。
[0445]
5.9.14.如图44所示，将培养基输入和培养基输出管线向下捆扎至桌子。
[0446]
5.9.15.此时，生物反应器准备填充培养基。将重量记录为“生物反应器探针和附件的添加重量”：_____________。
[0447]
5.9.16.对天平确定皮重。从这一点开始，天平的重量对应于生物反应器内的液体质量。
[0448]
5.9.16.1.如果trubio中的“容器重量”未读数为零，则使用容器重量面板窗口左下角的放大镜图标手动对其确定皮重，选择1pt标准化并输入零。
[0449]
5.9.17.在trubio中输入批次id(根据实验)，并且点击batch start。
[0450]
5.10.用培养基填充生物反应器
[0451]
5.10.1.将7l l7补充培养基袋焊接到la2延长套件管道。
[0452]
5.10.2.将搅拌设定为自动模式，设定点为50rpm。
[0453]
5.10.3.从袋与生物反应器之间的管道中取出夹钳。使用静脉输液架抬高袋以产生压力梯度并允许培养基进入生物反应器。确保根据生物反应器重量变化仅加入2l培养基。
[0454]
5.10.4.将带有包被有mc 培养基的1l瓶置于bsc中，并在无菌条件下用带有管道的nalgene瓶盖替换nalgene瓶盖。通过使用pvc焊机焊接将1l瓶的内容物转移至生物反应器。在将mc 培养基转移到袋中时，频繁轻轻摇动瓶以避免mc沉降。
[0455]
5.10.5.打开进气管线和排气管线上的夹钳。所有其它管线均应关闭。
[0456]
5.10.6.夹紧并在无菌条件下密封管道，保持足够的管道长度，以便在附接止血钳的情况下，将其放在工作台上，而对管道无压力。在管道上保持一定长度对于将来的无菌焊接和取样是重要的。留出足够的长度以能够接触焊机。
[0457]
5.11.空气平衡
[0458]
5.11.1.点击配置》容器设置管理》容器载荷
[0459]
5.11.2.加载“3l bioblu空气平衡设置”。一旦加载，根据实验给文件命名，并在此处注明名称：_________________。
[0460]
5.11.3.加载“3l bioblu空气平衡默认值”。一旦加载，根据实验给文件命名，并在此处注明名称：_________________。
[0461]
5.11.4.检查以通过将排气过滤器浸入水帽中并确保有气泡产生来确保空气在系
统中顺利流动。
[0462]
5115验证以下关键控制参数：
[0463]
温度sp37℃搅拌100rpm空气流速*2lpm所有其它气体关闭
[0464]
*您必须使用最右边的空气模块来实现平衡过程的速率大于0.5lpm。确保关闭左侧的空气控制，其读数为默认设置的0.5lpm(将其设置为“0”，更改为手动)。
[0465]
5.11.6.“3l bioblu空气平衡设置”加载文件的完整细节可参见附录a。
[0466]
5.11.7.使反应器孵育以变得空气饱和。这需要几个小时。使用过程历史视图跟踪do水平。当do水平平稳时达到饱和。
[0467]
5.12.在系统用空气饱和后，将do校准至100％饱和度
[0468]
5.12.1.1.使用3l容器的光学do探头校准sop完成光学do探针的两点校准。
[0469]
5.13.ph校正(电化学/标准)
[0470]
5.13.1.通过注射器通过la(s)管线取5ml样品。
[0471]
5.13.2.读取nova上的样品。
[0472]
5.13.3.如果nova读数偏离trubio读数0.05或更多单位，点击ph面板》详细信息》1-点标准化，校正ph。
[0473]
5.14.为接种准备生物反应器设定点
[0474]
5.14.1.点击配置》容器设置管理》加载文件(关于如何创建文件，请参阅步骤5.7.5)。
[0475]
5.14.2.加载“3l bioblu接种前设置”并命名为“psc 3l run#接种前设置”。在未退出窗口的情况下，再次点击容器载荷。
[0476]
5.14.3.加载“3l bioblu接种前默认值”并命名为“psc 3l运行#接种前默认值”。
[0477]
5.14.4.验证以下关键控制参数：
[0478]
温度sp35℃ph sp7.2do sp50％n2、co2、o2级联空气自动，0.1lpm搅拌55rpm
[0479]
5.14.5.“3l bioblu接种前设置”加载文件的完整细节可参见附录a。
[0480]
5.14.6.在每日生物反应器检查表中填写以下内容(其余为n/a)：
[0481]
●
气泡试验
[0482]
●
检查气罐水平
[0483]
5.14.7.将系统放置过夜。如有可能，请在离开当天检查系统。
[0484]
第0天(接种)：周三
[0485]
5.15.填写每日生物反应器检查表。验证ph/do/温度是否稳定。
[0486]
5.16.用30ml的l7 hpsc补充物补充生物反应器：
[0487]
5.16.1.喷洒2ml吸移液管，带鲁尔锁的适当尺寸的注射器和70％ipa的延长套件，并置于bsc中。
[0488]
5.16.2.将注射器在无菌条件下连接到吸移液管上。
[0489]
5.16.3.确保吸入10ml空气，将溶液全部收集在注射器内，并在注射后清理管线。
[0490]
5.16.4.使用注射器，收集l7-补充物
[0491]
5.16.5.翻转注射器
[0492]
5.16.6.取出吸移液管
[0493]
5.16.7.将延长套件的母型端连接到注射器上的鲁尔锁上。
[0494]
5.16.8.现在可以将含有l7-补充物的注射器-延长套件从bsc中取出，并通过将l7-补充物转移至生物反应器的pvc焊机焊接至生物反应器。
[0495]
5.17.检查ph
[0496]
5.17.1.通过注射器通过la(s)管线取5ml样品。
[0497]
5.17.2.读取nova上的样品。
[0498]
5.17.3.如果nova读数偏离trubio读数0.05或更多单位，点击面板》详细信息》1-点标准化，校正ph。
[0499]
5.18.从2d收获细胞，转移至封闭的注射器
[0500]
5.18.1.根据龙沙l7-传代方案使用l7-传代溶液从2d培养收获细胞。记录收获开始时间和接种时间：
[0501]
5.18.1.1.从细胞堆叠抽吸培养基
[0502]
5.18.1.2.用75ml dpbs洗涤细胞堆叠-/-[0503]
5.18.1.3.加入75ml l7传代溶液
[0504]
5.18.1.4.孵育细胞5至15分钟(根据l7-传代方案监测孔)。
[0505]
5.18.1.5.当细胞准备收获时，轻敲1
×
1层细胞堆叠几次。
[0506]
5.18.1.6.将细胞收集到无菌的250ml锥形管中。
[0507]
5.18.1.7.将75ml完成的l7-tfo2培养基加入到1
×
1层细胞堆叠中。
[0508]
5.18.1.8.使锥形管以200g/5min离心。
[0509]
5.18.1.9.弃去上清液，并将沉淀物再悬浮于30ml完全l7-tfo2培养基中。
[0510]
5.18.1.10.使用nc-200和溶液10对细胞进行计数，“聚集细胞试验”。
[0511]
5.18.1.10.1.将100μl和200μl细胞溶液置于两个单独的eppendorf管中。
[0512]
5.18.1.10.2.在管1上标记“细胞与溶液10”，并在管2上标记“细胞”。
[0513]
5.18.1.10.3.从4℃除去溶液10。
[0514]
5.18.1.10.4.转至nc-200，并将100μl溶液10添加至标记为“细胞与溶液10”的管中。
[0515]
5.18.1.10.5.仅将管与溶液10涡旋混合。对于仅包含细胞的管，由于涡流可能影响细胞的活力，仅轻敲和使管打旋。
[0516]
5.18.1.10.6.根据制造商的方案，将nc-200上的程序设置为“活力和细胞计数-聚集细胞试验”。
[0517]
5.18.1.10.7.按压运行。系统将提示您添加装有细胞的盒以及添加溶液10。使用via-1盒从含有溶液10的管中取出细胞并插入nc-200中。机器将读取读数，并且接着提示您
放入没有溶液的新的盒。这就是您从标有“细胞”的管中取出细胞的地方(无溶液10)。
[0518][0519]
5.18.2.将120
×
106个细胞转移到3l生物反应器中。
[0520]
5.18.3.注：如果接种单细胞或直接来自冷冻管的细胞，向生物反应器中加入rocki。需要溶于3ml dmso(10μm终浓度)的10mg rocki瓶。
[0521]
5.18.4.喷洒2ml吸移液管，带鲁尔锁的适当尺寸的注射器和70％ipa的延长套件，并置于bsc中。
[0522]
5.18.5.将注射器在无菌条件下连接到吸移液管上。
[0523]
5.18.6.使用所述注射器，收集接种所需的分离的细胞容积。确保还吸入一些空气以将溶液全部收集在注射器内。
[0524]
5.18.7.取出吸移液管
[0525]
5.18.8.将延长套件的母型端连接到注射器上的鲁尔锁上。
[0526]
5.18.9.现在可以从bsc中取出包含细胞的注射器延长套件。
[0527]
5.19.通过注射器接种生物反应器
[0528]
5.19.1.将注射器延长套件管道无菌焊接到la(s)管线上(相同的管线用于添加培养基和微载体)。
[0529]
5.19.2.松开所述管道。
[0530]
5.19.3.保持注射器向下，使得柱塞被推向地面，推出细胞溶液，直到细胞和培养基溶液离开注射器。
[0531]
5.19.4.倒置注射器，使活塞朝上，并将细胞 培养基溶液推出管道，并进入生物反应器。当空气被推动通过管道时，可以观察到溶液移动。
[0532]
5.19.5.夹紧生物反应器顶部附近的管道末端。
[0533]
5.19.6.无菌密封管线。
[0534]
5.19.7.记录接种时间：
[0535]
5.20.接种后设置
[0536]
5.20.1.点击配置》容器设置管理》加载文件。
[0537]
5.20.1.1.加载“3l bioblu接种后设置”并将其命名为“psc 3l run#接种后设置。
[0538]
5.20.1.2.在不退出窗口的情况下，加载“3l bioblu接种后默认值”并将其命名为“psc3l run#接种后默认值”。
[0539]
5.20.2.退出窗口并验证以下关键控制参数：
[0540][0541]
5.20.3.验证配置窗口下表征曲线1下的搅拌速度
[0542]
接种日搅拌方案(表征曲线1)：
[0543][0544][0545]
5.21.培养2d对照
[0546]
在l7-基质包被的6孔板的1个孔中，以0.04
×
106个细胞/ml的密度接种细胞，并培养作为用于生物反应器和facs分析的2d对照细胞。在用于核型分析的t-25烧瓶和用于if的24孔板的8个孔中接种细胞，细胞密度为0.04
×
106个细胞/ml。
[0547]
当接种单个细胞时，向孔中加入rocki(10μm终浓度)，并在24小时后替换为新鲜培养基。
[0548]
第1天
[0549]
5.22.设定搅拌速度
[0550]
5.22.1.点击配置》容器设置管理》容器载荷
[0551]
5.22.2.加载“psc 3l bioblu第1天至第16天默认值”。加载文件后，控制器将要求您命名文件。应命名该文件以反映实验。在此注明名称：_________________。
[0552]
5.22.3.注：搅拌速度将取决于给定细胞系的生长模式和扩增速率。根据下表的细胞密度，在“搅拌”面板中手动设置培养结束时的搅拌速率。如果每天不对细胞进行计数并且细胞 mc不能混合并沉降在容器底部，则需要相应地增加搅拌速度。
[0553]
rpm细胞密度范围(细胞/ml)50第1至6天
×
105705
×
105至2
×
10690》2
×
106[0554]
5.22.4.通过点击定时器1重置定时器1，点击暂停，点击重置，且然后点击开始。确保搅拌速度级联。
[0555]
5.22.5.验证表征曲线#1具有图45的值。否则，进行校正并点击“应用值”。
[0556]
6.0在第1天准备培养基进料用于灌注启动
[0557]
6.1.如第5.14节所述，用70ml l7补充物补充两个7l l7-tfo2培养基袋。
[0558]
6.2.连接废物袋和进料袋
[0559]
废物袋：
[0560]
6.2.1.准备20l空袋(带有1/8
×
1/4"c-flex管线)，通过闭合所有夹具用作废物袋。
[0561]
6.2.2.将袋的1/8
×
1/4"c-flex无菌焊接到灌注输出管线末端的c-flex上。保持管线足够长，以便废物袋到达地板上的天平。
[0562]
6.2.3.在生物反应器附近的地面上放置天平；放置大塑料容器将废物袋固定在其上。
[0563]
6.2.4.将袋子放入该容器内并对天平确定皮重。
[0564]
6.2.5.将pharmed管道(灌注输出线路的一部分)插入finesse控制器上的灌注输出泵(#4)。
[0565]
6.2.6.检查从生物反应器到废物袋的管道，并取出任何夹钳并解开管道中的任何扭结。
[0566]
培养基进料袋：
[0567]
6.2.7.确保培养基进料袋上的所有夹钳均闭合。
[0568]
6.2.8.将培养基输入管线上的1/8
×
1/4c-flex无菌焊接到la(1)管线。
[0569]
6.2.9.将进料袋上的1/8
×
1/4"c-flex无菌焊接到培养基输入管线远端的c-flex管道上。
[0570]
6.2.10.将培养基进料袋悬挂在iv架或等同物上。如果存在工作台空间，则培养基进料袋可以放置在料仓中。
[0571]
6.2.11.将培养基输入管线的pharmed部分插入泵控制器泵#3，培养基输入。
[0572]
6.2.12.确保覆盖培养基袋，防止其受光照。
[0573]
6.3.预充管线
[0574]
6.3.1.注：
[0575]
6.3.1.1.在泵送液体之前，务必确保整个通路被松开并且无扭结。
[0576]
6.3.1.2.根据所需的流向检查泵的方向。这可以通过按下每个泵旁边的按钮来完成。被指定为灌注输出的泵必须具有从生物反应器取出培养基并将其引导到废物袋的顺时
针运动。指定为培养基输入的泵必须具有逆时针运动以将新鲜培养基带到生物反应器。
[0577]
6.3.1.3.如需对与泵相关的问题进行故障排除，请参考附录a确保其配置正确。这种配置不应该随运行而变化。
[0578]
6.3.2.松开从灌注汲取管到废物袋的通路。
[0579]
6.3.3.通过从生物反应器容器中推进培养基来预充废物管线，直到看到它进入废物袋。
[0580]
6.3.4.松开从进料袋到生物反应器的通路。
[0581]
6.3.5.通过从进料袋中推进培养基来预充进料管线，直至看到培养基滴入生物反应器容器中。
[0582]
6.4.校准灌注输出泵
[0583]
6.4.1.在生物反应器附近的地面上放置天平；放置大塑料容器将废物袋固定在其上。
[0584]
6.4.2.将袋子放入该容器内并对天平确定皮重。
[0585]
6.4.3.将pharmed ls 16管道，即灌注浸量尺上的部分，放入finesse控制器上的灌注输出泵(#4)中。
[0586]
6.4.4.检查从生物反应器到废物袋的管道，并取出任何夹钳并解开管道中的任何扭结。
[0587]
6.4.5.点击主finesse控制器屏幕左下角附近的配置。
[0588]
6.4.6.识别屏幕右侧的泵类别。
[0589]
6.4.7.第四个泵是灌注输出泵，并且它被标记为灌注输出。
[0590]
6.4.8.点击泵模块，并且将出现一个窗口，泵#4配置。
[0591]
6.4.9.验证在该窗口左侧的“速度/流量”框下选择流量控制。
[0592]
6.4.10.识别从生物反应器到废物袋的流动方向(可以在cw和ccw之间的窗口上改变方向)。确保选择正确方向。
[0593]
6.4.11.在此窗口右侧的控制模式框中，确保选择标准(远程设定点)。
[0594]
6.4.12.点击应用值。
[0595]
6.4.13.点击main返回主finesse控制器屏幕。
[0596]
6.4.14.为了测试泵是否工作，双重检查管线是否无扭结和夹紧，并开始按下泵旁边的按钮，以测试泵。检查管线中的液体移动。当以一致的速度移动时，继续直到培养基进入废物袋。可替代地，代替连续地按下泵旁边的按钮，灌注输出泵的输出值可以被设置为该预充步骤的50至80％。仔细检查管道是否有任何泄漏。如果发生任何泄漏，立即停止泵，将管道夹在生物反应器上，使废物袋上的夹钳闭合，并呼叫主管以确定进一步的行动过程。
[0597]
校准泵
[0598]
6.4.15.点击灌注输出泵面板，选择放大镜并选择校准。这装载了trubio校准模块。
[0599]
6.4.16.分别将泵速1、2和3调节到5％、10％和15％。
[0600]
6.4.17.将激活时间设置为120秒，且然后点击开始。
[0601]
6.4.18.选择“自动附接的天平”。
[0602]
6.4.19.点击开始。
[0603]
6.4.20.选择“从天平中泵送液体”(测量容器重量减少)。
[0604]
6.4.21.点击开始。
[0605]
6.4.22.选择预充。由于您已经预充了所述管线，一开始点击stop(或者如果您没有预充所述管线，现在点击stop)。
[0606]
6.4.23.点击开始，请勿触摸天平。
[0607]
6.4.24.校准结束时，输入用户名：管理员，密码：δv。点击应用，然后退出。
[0608]
6.4.25.在主屏幕上，点击泵4面板，并检查100％输出值(g/min)，记录成批记录。
[0609]
6.5.开始灌注
[0610]
6.5.1.点击屏幕右上角的容器重量面板。
[0611]
6.5.2.设置为自动，并根据生物反应器设置旁边的天平输入当前容器重量作为sp。
[0612]
6.5.3.对容纳废物袋的天平确定皮重。
[0613]
6.5.4.将培养基输入泵(泵3)设置为级联“容器重量输出”。
[0614]
6.5.5.将灌注输出泵(泵4)设置为自动设定值为1vvd(针对3000ml为2.08g/min，进行相应调整)。
[0615]
6.5.6.将灌注开始时间记录成批记录。
[0616]
6.5.7.在每日生物反应器检查表的“灌注检查”部分记录以下内容：
[0617]
6.5.7.1.废物重量(g)(am或pm，进行相应选择)
[0618]
6.5.7.2.灌注输出率，目标
[0619]
注：从该步骤开始，如果需要触碰容器，则将灌注输出和培养基输入设置为自动和零。
[0620]
6.5.7.3.灌注开始后2小时，检查：
[0621]
1.对于因焊接不当导致的任何泄漏
[0622]
2.废物袋和培养基袋
[0623]
3.sp上的容器重量反映了6.5.2中输入的数值。
[0624]
6.6.培养基袋在以下日子更换：周五和周二直至运行结束
[0625]
6.6.1.建议在预定培养基袋切换前一天或同一天准备培养基。完成的培养基在4℃下的保存时间不得超过2周或在室温下保存不得超过4天。
[0626]
6.6.2.在更换培养基袋之前或周五，制备2个7l l7完全培养基袋，每个补充70ml l7补充物。
[0627]
6.6.2.1.这足以进行4天的1次vvd灌注(4
×
3l)加2l额外灌注。
[0628]
6.6.3.在更换培养基袋之前或周二，制备2个7l完全培养基袋，每个补充70ml l7补充物。
[0629]
6.6.3.1.这足以进行3天的1次vvd灌注(3
×
3l)加2l额外灌注。
[0630]
7.0任选的：dapi染色(通常在24小时后)
[0631]
7.1.倒置注射器以悬浮载体并将载体样品沉积到12孔板的孔中。需要单层载体。
[0632]
7.2.允许载体沉降，小心取出培养基，以免干扰载体。
[0633]
7.3.加入1ml dpbs / ，使其打旋并使载体沉降。
[0634]
7.4.小心取出dpbs，以免干扰载波。
[0635]
7.5.加入1ml cytofix/cytoperm。
[0636]
7.6.在细胞培育箱中孵育20分钟。
[0637]
7.7.取出cytofix/cytoperm溶液，而不干扰载体。
[0638]
7.8.加入1ml dpbs / ，使其打旋并使载体沉降。
[0639]
7.9.小心取出dpbs，以免干扰载波。
[0640]
7.10.加入1ml 1x-dapi并使样品在黑暗中静置5分钟。
[0641]
7.10.1.注：可以在运行开始时从5mg/ml dapi溶液的储备液制备100x工作溶液，在-20℃下冷冻储存。该100x溶液可用于制备含有dpbs(含有钙和镁)的1x dapi溶液用于每日染色。
[0642]
7.11.图像-使用荧光显微镜拍摄每个样品的图像。
[0643]
第1天至收获前一天
[0644]
8.0日常活动
[0645]
8.1.填写本文件末尾提供的每日反应器检查表。
[0646]
8.2.取样日
[0647]
虽然没有严格的取样要求(我们通常每周取样3次)，但推荐以下指南：
[0648]
如果接种发生在周三：
[0649]
细胞计数取样2,5,7,9,12,15,16ph/nova取样，与细胞计数相同
[0650]
如果接种发生在周四：
[0651]
细胞计数取样4,6,8,10,13,15,16ph/nova取样，与细胞计数相同
[0652]
细胞计数信息可参见8.4。
[0653]
8.3.填写本文件末尾提供的样品nova数据表。注：如果nova仪器出现故障或需要维修，则在-20℃下冷冻nova 5ml样品，以用于随后的代谢物分析。
[0654]
8.4.灌注开始后取样
[0655]
8.4.1.推荐的取样计划参见第8.1节。
[0656]
8.4.2.在每日生物反应器检查表中记录预取样容器重量。
[0657]
8.4.2.1.取样前停止灌注(见上，“更换培养基进料和/或废物袋”)
[0658]
8.4.2.2.将搅拌设置为自动，并将搅拌速度临时增加10rpm。等待2分钟。
[0659]
8.4.2.3.照例取样(vcd为2
×
15ml，nova为1
×
5ml)将0.5ml nova样品置于24孔板中并在显微镜下记录图像。
[0660]
8.4.2.3.1.确保所有注射器都有额外的空气空间。
[0661]
8.4.2.3.2.通过la(s)管线移出约10ml细胞，然后通过管线将细胞推回，保持推动直到看到气泡从反应器中的la(s)管线出来。
[0662]
8.4.2.3.3.抽取15ml样品。
[0663]
8.4.2.3.4.对下一个样品重复相同的方法，依此类推。
[0664]
8.4.2.4.将搅拌速度恢复至其先前设定点。
[0665]
8.4.2.5.记录新的(降低的)容器重量，并将容器重量面板设定为该新的重量作为其设定点(在取样之前不要将系统“稀释”回原始重量，重新调整重量以反映培养基添加或
灌注输出没有变化)。
[0666]
8.4.2.6.将搅拌设置为级联。重新开始灌注(见上，“更换培养基进料和/或废物袋”)。
[0667]
f3释放细胞计数：每周取样约3次，在工作日隔天取样一次
[0668]
f3释放：取2
×
15ml个样品进行细胞计数，并且微载体和细胞用2
×
7.5ml f3(15mm柠檬酸钠)处理。
[0669]
将15ml f3溶液等分到50ml锥形管中，并将其置于培育箱中10分钟。使其达到37℃。
[0670]
每个生物反应器sop取2
×
15ml样品。
[0671]
将样品注入两个单独标记的50ml管中(“样品1”和“样品2”，样品1应为取自生物反应器的第一个样品，而样品2应为第二个)。
[0672]
使mc-细胞沉降(约5至8分钟)。
[0673]
取出约1ml上清液，并置于eppendorf管中，使用nc-200进行上清液细胞计数。
[0674]
上清液细胞计数
[0675]
日
ꢀꢀꢀꢀ
活力％
ꢀꢀꢀꢀ
活细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
死亡细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
总细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
[0676]
日
ꢀꢀꢀꢀ
活力％
ꢀꢀꢀꢀ
活细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
死亡细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
总细胞/ml
ꢀꢀꢀꢀ
[0677]
在不抽吸mc 细胞的情况下尽可能多地从样品中除去上清液。
[0678]
再悬浮于7.5ml f3溶液中(1/2初始取样容积至f3溶液)。
[0679]
翻转管数次。
[0680]
在37℃下孵育15至20分钟，每约5分钟翻转管。
[0681]
15至20分钟后，可在显微镜下(在管中)检查细胞以确保大多数细胞已从载体上脱离。
[0682]
注：当聚集物变得更大时(即培养后期)，可能需要20至25分钟的孵育时间。
[0683]
在孵育期间，用7.5ml(1/2
×
原始f3体积)温热的l7-tfo2培养基(其可为完全或不完全培养基)制备两个50ml管。
[0684]
孵育完成后，吸移mc 细胞溶液2至3次(不要超过吸移管，因为这影响活力)。
[0685]
制作单细胞悬浮液：用15ml l7-tfo2中和，通过70μm细胞过滤筛过滤mc 细胞以将游离载体移入50ml管中。
[0686]
以200xg旋转细胞5分钟。
[0687]
在第1天至第10天之间将细胞沉淀物再悬浮于1ml培养基中，并在第10天至第16天之间将细胞沉淀物再悬浮于15ml培养基中(在下表中指定紧挨着指定天的1ml或15ml)。
[0688]
在较早的细胞培养日中，没有许多细胞，因此为了用nc-200获得可检测的细胞计数，最好将细胞沉淀物再悬浮在小容积中。
[0689]
记住考虑再悬浮于1ml培养基中的样品的稀释因子(它们将比原始取样容积小15倍，且因此细胞计数将小15倍)。
[0690]
通过nc-200计数以确定细胞数目和活力。
[0691]
细胞计数法：细胞聚集方案(2盒方法)
[0692][0693]
在生物反应器数据excel表中记录结果。
[0694]
8.5.测量灌注精度
[0695]
8.5.1.如下测量灌注精度(在生物反应器每日检查表的“灌注检查”部分记录该信息)：
[0696]
8.5.1.1.早晨检查废物，记录重量和时间。
[0697]
8.5.1.2.实际灌注率计算如下：
[0698][0699]
8.5.1.3.如果实际灌注率偏离目标(针对1vvd为2.08)10％以上，按如下调整泵4的设定点：
[0700][0701]
8.5.1.4.如果灌注稳定且在靶上，则不需要下午检查。
[0702]
8.5.1.5.如果灌注偏离超过正常值，建议进行下午检查。
[0703]
8.6.任选的/仅适用时：增加搅拌速率
[0704]
8.6.1.如果数值不够(微载体正在沉降)，参见5.22.3。不推荐高于150rpm的速度。
[0705]
8.7.更换培养基进料和/或废物袋
[0706]
8.7.1.每次只能使用3至4天的培养基，因此每3至4天，需要更换袋子(如果需要，也可以更频繁地更换)。
[0707]
8.7.2.在更换培养基袋的同时更换废物袋。
[0708]
8.7.2.1.更换新袋后，请勿忘记对天平确定皮重。
[0709]
8.7.2.2.绝不允许废物袋完全填满，因为将其从地板上提起来有安全隐患，并且袋中需要足够的空间用于漂白。
[0710]
8.7.2.3.如需处置所述袋：
[0711]
8.7.2.3.1.将袋转移到水槽中，使袋子竖立，使其不会翻倒。
[0712]
8.7.2.3.2.从顶部切开所述袋。
[0713]
8.7.2.3.3.加入约10％漂白剂。
[0714]
8.7.2.3.4.等待约20分钟。
[0715]
8.7.2.3.5.将漂白后的废物处理到排水管中。
[0716]
8.7.3.如果进料和/或废物袋需要更换：
[0717]
8.7.3.1.1.预先准备新的废物袋或进料袋。
[0718]
8.7.3.1.2.将灌注输出泵的设定点记录成批记录。
[0719]
8.7.3.1.3.通过将泵4上的输出设置为零并将泵3设置为手动然后设置为零来停止灌注。
[0720]
8.7.3.1.4.使用hot lips封口机密封c-flex管线(尽可能靠近进料/废物袋密封)。
[0721]
8.7.3.1.5.切割封口。
[0722]
8.7.3.1.6.使用1/8
×
1/4"c-flex管线焊接新的进料或废物袋。
[0723]
8.7.3.1.7.在旧的进料袋处设置新的进料袋，或在地板上的天平上设置废物袋(并再次对天平确定皮重)。
[0724]
8.7.3.1.8.通过将灌注输出泵设置为之前的设定点，并将泵中的介质设置为cas，恢复灌注。
[0725]
收获前和收获日活动检查表
[0726]
用l7-基质进行包被
[0727]
■4×
6孔板(用于2d对照-细胞-mc和单细胞)
[0728]
■4×
24孔板(用于if)
[0729]
■1×
t-25烧瓶(用于核型分析)
[0730]
■1×
6-孔板(用于外胚层、内胚层和中胚层定向分化)
[0731]
制备100ml不完全wicell培养基用于eb形成(如果计划eb形成试验)
[0732]
○
knockout dmem f-12(1x)
→
78ml
[0733]
○
20％knockout血清
→
20ml
[0734]
○
neaa(非必需氨基酸)(1x)
→
1000μl
[0735]
○
glutamax(1x)
→
1000μl
[0736]
rocki(10mm)溶液
[0737]1×
500ml f3溶液
[0738]
完全l7培养基
[0739]
如果计划定向分化，准备分化培养基。
[0740]
■
stemdiff内胚层分化培养基和说明书
[0741]
■
用于外胚层分化的神经基础培养基和补充物
[0742]
■
中等分化培养基
[0743]
从生物反应器中取样：
[0744]
■3×
15ml样品用于细胞计数
[0745]
■1×
5ml样品用于nova和图像
[0746]
■1×
5ml样品用于在24孔板中进行2d平板接种
[0747]
对15ml样品进行细胞计数
[0748]
○
使用来自15ml样品的细胞进行以下操作：
[0749]
在6孔板中将约200,000个细胞接种到l7m包被的3个孔中
[0750]
在l7m包被的t25烧瓶中平板接种约500,000个细胞
[0751]
遵循用于eb生成的aggrewell方案
[0752]
冻存4
×
106，10
×
106，40
×
106，120
×
106，240
×
106和320
×
106个细胞/小瓶。
[0753]
4-5
×
106个细胞用于facs。
[0754]
收集2d细胞用于fac。
[0755]
从ln2中取阴性对照细胞用于fac并进行平板接种
[0756]
3l生物反应器的收获前一天和收获当日
[0757]
活动：
[0758]
对于流动活动：
[0759]
i.在触摸底座前一周，由facs机器负责人确保其工作。
[0760]
ii.在流动前一天或流动当天清晨运行cst。
[0761]
收获前一天进行取样和成像：
[0762]
a.2
×
32ml样品用于细胞和活力计数。15ml f3，且接着用15ml l7培养基淬灭
[0763]
b.nova样品-5ml
[0764]
c.从细胞释放前的细胞样品：
[0765]
i.2d上的平板接种：6孔板中的1ml/孔，2个孔。总计2ml。总细胞#：n/a
[0766]
ii.2d上的平板接种：24-孔板中的1ml/4个孔，8个孔。需要2ml。总细胞#：n/a
[0767]
d.从细胞释放后的细胞样品：
[0768]
i.2d上的平板接种：6孔板中的200,000个细胞/孔，2个孔。带有rocki。总细胞#：0.4
×
106个细胞
[0769]
ii.2d上的平板接种：24孔板中的50,000个细胞/孔，8个孔。rocki。总细胞#：0.4
×
106个细胞
[0770]
iii.定向分化：
[0771]
外胚层：需要低密度。6孔板中以250,000个细胞/孔进行平板接种。一个孔。500,000个细胞/孔。一个孔。总细胞#0.75
×
106个细胞。应拍摄图像。
[0772]
内胚层：需要汇合培养。6孔板中的1
×
106/孔。一个孔。6孔板中的2
×
106/孔。一个孔。总共3
×
106个细胞。对于if：24孔板中的1
×
106/4孔和24孔板中2
×
106/4孔。总共3
×
106个细胞。总计：6
×
106个细胞。
[0773]
中胚层：6孔板中的1
×
106个细胞/孔。两个孔。总共2
×
106个细胞。
[0774]
iv.核型分析：500,000个细胞/t-25。总共0.5
×
106个细胞。
[0775]
v.eb形成试验：1.2
×
106个细胞/孔。四个孔。总共4.8
×
106个细胞。
[0776]
vi.冻存：4
×
106个细胞/ml
×
10个小瓶＝40
×
106个细胞。冻存：20
×
106个细胞/ml
×
3个小瓶。如果细胞计数高于2
×
106个细胞/ml，则使用mr.frosty/cool-cell冻存更多。
[0777]
收获日进行取样和成像：
[0778]
如果facs机器有问题，则固定细胞：300,000个细胞/管
×
15个管。
[0779]
a.2
×
18ml样品用于细胞和活力计数。9ml f3，且接着9ml l7培养基
[0780]
e.nova样品-5ml
[0781]
f.从细胞释放前的细胞样品：
[0782]
i.2d上的平板接种：6孔板中的1ml/孔，2个孔。总计2ml。总细胞#：n/a
[0783]
ii.2d上的平板接种：24-孔板中的1ml/4个孔，8个孔。需要2ml。总细胞#：n/a
[0784]
g.从细胞释放后的细胞样品：
[0785]
i.2d上的平板接种：6孔板中的200,000个细胞/孔，2个孔。带有rocki。总细胞#：0.4
×
106个细胞
[0786]
ii.2d上的平板接种：24孔板中的50,000个细胞/孔，8个孔。rocki。总细胞#：0.4
×
106个细胞
[0787]
iii.定向分化：
[0788]
外胚层：需要低密度。6孔板中以250,000个细胞/孔进行平板接种。一个孔。500,000个细胞/孔。一个孔。总细胞#0.75
×
106个细胞。应拍摄图像。
[0789]
内胚层：需要汇合培养。6孔板中的1
×
106/孔。一个孔。6孔板中的2
×
106/孔。一个孔。总共3
×
106个细胞。对于if：24孔板中的1
×
106/4孔和24孔板中2
×
106/4孔。总共3
×
106个细胞。总计：6
×
106个细胞
[0790]
中胚层：6孔板中的1
×
106个细胞/孔。两个孔。总计2
×
106个细胞
[0791]
iv.核型分析：500,000个细胞/t-25。总计0.5
×
106个细胞
[0792]
v.eb形成试验：1.2
×
106个细胞/孔。四个孔。总计4.8
×
106个细胞
[0793]
vi.冻存：4
×
106个细胞/ml，10
×
106个细胞/ml，20
×
106个细胞/ml，40
×
106个细胞/ml，120
×
106个细胞/ml和240
×
106个细胞/ml。crf型号7456和以下程序：
[0794]
1.在4.0℃下等待。
[0795]
2.在腔室＝4.0℃下等待，直至样品＝5.0℃。
[0796]
3.以1℃/min升温直至样品＝-6℃。
[0797]
4.以25.0℃/min升温直至腔室＝-47.0℃。
[0798]
5.以15.0℃/min升温直至腔室＝-14.0℃。
[0799]
6.以1.0℃/min升温直至腔室＝-40.0℃。
[0800]
7.以10.0℃/min升温直至腔室＝-90℃。
[0801]
8.结束
[0802]
9.0收获日
[0803]
注：使用这些扩增细胞接种另一个搅拌釜式生物反应器(3d种子培养)是可行的。
[0804]
9.1.第10节包含收获日“检查表”样品
[0805]
9.2.将1.5l的f3溶液袋温热至37℃
[0806]
9.3.将1.5l的l7-tfo2基础培养基袋温热至37℃
[0807]
9.3.1.记录所述生物反应器的重量：
[0808]
9.3.2.将1.5l的l7-tfo2培养基袋上的cflex管道焊接到筛网过滤袋上的cflex管上(用于收获分离的微载体)。将袋的这一侧指定为“细胞”侧并保持面朝下。
[0809]
9.3.3.将1.5l培养基转移至新的5l培养基袋中。
[0810]
9.3.4.也使用30ml注射器将3ml的10mm rocki溶液转移到培养基袋中。(为了使容积更大以转移袋中的所有rocki，加入15ml的l7培养基 3ml的rocki并转移到培养基袋中)。
[0811]
9.3.5.将筛网过滤袋上的另一cflex管道附接至收获管线的cflex管道末端。
[0812]
9.4.通过cflex管道末端将新的5l空袋(密封所有管道端口)附接到灌注管线上，该袋将是在通过灌注管线取出培养基时使用的“废物”袋。
[0813]
9.5.当细胞被搅拌时，开始通过灌注输出管线将培养基从生物反应器中移出并进入废物袋。这可以使用finesse系统上的泵(使用可泵送的管，例如pharmed管)或使用单独的泵以200g/min进行。
[0814]
9.5.1.微载体可能“粘住”灌注管线的筛网过滤器末端。这是正常的，只需猛敲/轻敲容器或灌注浸量尺以将一些载体敲掉。
[0815]
9.5.2.取出一半体积(约1.5l)时取出加热套。
[0816]
9.5.3.每减少1/3体积，将搅拌速度降低10rpm，一旦叶轮顶部可见，停止搅拌。
[0817]
9.5.4.将留下少量培养基(连同微载体)，10％的原始体积是合适的。
[0818]
9.6.将f3溶液袋(1.5l)连接到收获管线上，以避免直接滴在细胞上。
[0819]
9.7.确保保持pharmed管道，以便在需要时以400g/min的速度更快地泵送溶液。
[0820]
9.8.泵或使用重力用f3溶液填充生物反应器，同时不搅拌。
[0821]
9.9.一旦生物反应器半满，将其置于加热套上并将生物反应器置于天平的中心。
[0822]
9.10.一旦生物反应器充满f3溶液，以90rpm连续搅拌30分钟。
[0823]
9.10.1.在15至20分钟的f3处理后，可以通过取样管线取5ml样品以观察细胞在显微镜(置于容器中-即10cm盘或6w平板)下的外观。
[0824]
9.10.2.如果大多数细胞看起来与mc分离(25至30分钟)，则开始过滤过程，否则保持在f3中孵育直至细胞成功分离(注：由于f3是非酶的，较长的孵育将不会损害细胞，某些类型的机械应力将例如过度吸移)。
[0825]
9.11.确保细胞以90rpm的转速进行搅拌，并开始通过收获管线将细胞移至筛网过滤器中-您可以使用finesse泵或单独的泵(单独的泵将更快)。
[0826]
9.11.1.当叶轮顶部可见时，将搅拌降低至30rpm。
[0827]
9.11.2.最后，可以将生物反应器向收获管线取出区域倾斜，以尽可能多地获得细胞。
[0828]
9.12.现在将细胞与微载体分离，溶液总量为3l。
[0829]
9.13.为了从过滤袋取样，将收获管线取样器附接到称为“细胞”侧的筛网过滤袋的cflex端，并取样3
×
5ml。
[0830]
9.14.执行细胞计数。
[0831]
日期
ꢀꢀꢀ
日
ꢀꢀꢀ
活力％
ꢀꢀꢀ
活细胞/ml
ꢀꢀꢀ
死亡细胞/ml
ꢀꢀꢀ
总细胞/ml
ꢀꢀꢀ
细胞直径(μm)
ꢀꢀꢀ
％合计5或更多
ꢀꢀꢀ
[0832]
全部或部分收获(参见收获方案)
[0833]
拆解反应器：漂白剂
[0834]
丢弃废物袋：漂白剂
[0835]
9.15.在finesse屏幕的主窗口上，点击“reset all timers and totals”和“controllersoff”按钮，然后点击“batch stop”。取出容器与控制塔之间的所有连接-do、ph连接、加热毯，从热井中取出rtd。处置生物危害容器中的所有生物材料。清洁并储存所有其它组件，如do、ph探针和灌注浸量尺。
[0836]
10.数据输出：
[0837]
a.切换至historian pc。
[0838]
b.在桌面上，打开文件夹“使用此文件夹”。
[0839]
c.在此文件夹中，点击标题为“copy of finesse_historian_template_v01.20b_tot.xlsm”的文件
[0840]
d.historian应为ap01。
[0841]
e.点击容器编号(例如v1)。它将成为下拉菜单。选择要访问的容器编号。
[0842]
f.选择待提取数据的间隔。
[0843]
g.键入适当的开始日期和时间(例如，开始间歇搅拌)。
[0844]
h.键入适当的停止日期和时间(例如，在取出培养基进行收获之前)。
[0845]
i.验证计算的天数是否对应于输出的生物反应器运行数据，并验证日期时间格式为美国。
[0846]
j.点击导出。
[0847]
k.将所输出的数据保存为新出现的excel文件。
[0848]
l.使用usb驱动器从cpu传输数据。
[0849]
m.关闭excel
[0850]
n.将键盘、鼠标和监视器连接返回至塔控制器cpu。
[0851]
11.下游处理：ksep400
[0852]
12.1按照uswv-20415，使用ksep400可以进一步浓缩收获的细胞。
[0853]
i.用于流化床形成的流速优化
[0854]
1.将ksep与400.50转子配合。
[0855]
2.安装相关的400.50一次性套件(腔室套件和阀套件)。
[0856]
3.将从所述生物反应器收获的所述3l psc悬浮液连接至所述进料源。
[0857]
4.预充系统并用plasmalyte-a和0.25％人血清白蛋白的溶液洗涤细胞。
[0858]
5.使用782g的静态离心速度。
[0859]
6.为了优化流化床的形成，以递增的顺序(25、30和35ml/min)测试3个流速。
[0860]
7.在每次运行之前，一式三份地对进料源取样以测定进入ksep的细胞密度。
[0861]
8.对于整个浓缩过程，从离开ksep腔室的流中抽取5ml样品，并使用nucleocounter nc-200监测从流化床逸出的细胞量。
[0862]
9.停止ksep，清空所述腔室，并且在处理1l细胞悬浮液后收集浓缩细胞。
[0863]
10.重置ksep，清洗管道和腔室并重复该过程，直到测试了所有流速且进料源耗尽。ii.完全收获后的hpsc浓缩
[0864]
1.一式三份地对含有从生物反应器收获的过滤的psc悬浮液的袋进行取样。
[0865]
2.使用nucleocounter nc-200测定细胞活力和密度。
[0866]
3.使用平均活细胞密度(vcd)计算收ksep收获的浓缩容积。见等式1。
[0867]
等式1：
[0868][0869]
4.为ksep400配备相应的一次性套件(腔室套件和阀套件)。
[0870]
5.使用10l的dpbs-/-袋预充系统。
[0871]
6.将袋焊接到ksep阀套件上。
[0872]
7.使用工艺配方(附录b-c)预充系统，将离心机倾斜至1000g，并将细胞悬浮液以120ml/min的速率泵入1个腔室中。
[0873]
8.保持该设置，直到全部进料由ksep处理。
[0874]
9.定期从离开ksep腔室的流中抽取5ml样品，并使用nucleocounter nc-200监测从流化床逸出的细胞量。
[0875]
10.排空进料袋后，收获浓缩的细胞。
[0876]
11.通过使用nucleocounter nc-200取样以确定活力和细胞密度来验证浓缩细胞的容积。
[0877]
12.如上所述冻存剩余的浓缩物。
[0878]
附录b：ksep400.50的配方参数。
[0879]
参数值单元主动容器an/a速度782g生物反应器容积50l生物反应器预充容积30ml周期容积禁用(3.33)l/ch设立床(床设置流速)30ml/min设立床时间600min流速斜坡时间0min正常流速25、30或35ml/min/ch再循环洗涤0ml再循环持续时间0min再循环周期0周期洗涤流速0ml/min#洗涤0#/ch第2次清洗流速0ml/min/ch#洗涤0#/ch混合和收获速度782g混合床流速0ml/min/ch混合床持续时间0sec混合床循环0周期
收获流速50ml/min/ch初始倾倒容积33ml收获容积40ml
[0880]
附录c：ksep400的配方参数。
[0881]
参数值单元主动容器an/a速度1000g生物反应器容积1l生物反应器预充容积20ml周期容积禁用(99.0)l/ch设立床(床设置流速)120ml/min设立床时间60min流速斜坡时间0min正常流速120ml/min/ch再循环洗涤0ml再循环持续时间0min再循环周期0周期洗涤流速204ml/min#洗涤0#/ch第2次清洗流速204ml/min/ch#洗涤0#/ch混合和收获速度1000g混合床流速204ml/min/ch混合床持续时间0sec混合床循环0周期收获流速120ml/min/ch初始倾倒容积变量-取决于焊接后管道的长度ml收获容积变量-取决于收获袋中的细胞浓度ml
[0882]
12.建议：
[0883]
在mc包被期间减少l7基质数量。
[0884]
减少mc包被的开放步骤。
[0885]
通过使用1/2vvd减少培养基消耗，直到大约1.3
×
106个细胞的扩增。
[0886]
将冻存细胞直接解冻到3l生物反应器中(避免2d种子培养)。
[0887]
将扩增的细胞从一个悬浮容器转移到另一个(能够进行3d种子培养)。
[0888]
收获方案
[0889]
b.样品收获活动检查表：
[0890]
收获日活动检查表
[0891]
2018年3月29日
[0892]
psc 3l运行2
[0893]
获得以下材料
[0894]
3l的f3
[0895]
6l的基础l7tfo2
[0896]
加热以下材料：
[0897]
基础l7tfo2培养基
[0898]
已完成l7tfo2
[0899]
解冻knockout血清(-20c)
[0900]
knockout dmem
[0901]
包被以下内容：
[0902]
具有l7基质的24孔板中的8个孔
[0903]
实验：psc 3l运行___容器编号：___
[0904]
[0905][0906]
[0907][0908][0909]
配制1mg/ml l7-基质溶液，共18mg
[0910]
(将用于bioblu 3c生物反应器设置sop的步骤5.3.3中)
[0911]
试剂：
[0912]
组织培养级水
[0913]
l7-基质，3瓶5mg
[0914]
l7-基质，3瓶1mg
[0915]
步骤1：将3瓶5mg冻干l7-基质重新配制成1mg/ml溶液。
[0916]
将12ml细胞培养水放入50ml锥形管中。
[0917]
在1ml水中重构每个小瓶并使其轻轻打旋。不要涡旋。
[0918]
将小瓶放置5分钟以溶解
[0919]
将每个小瓶的内容物转移至含有12ml细胞培养水的50ml锥形管中
[0920]
步骤2：重构3瓶1mg冻干l7-基质，并加入到步骤1制备的溶液中，得到18mg的1mg/ml溶液。
[0921]
在1ml水中重构每个小瓶并使其轻轻打旋。不要涡旋。
[0922]
将小瓶放置5分钟以溶解。
[0923]
步骤3：包被mc
[0924]
将18ml的l7-基质溶液(1mg/ml)加入到300ml的dpbs / 中，如bioblu 3c生物反应器设置sop的步骤5.3.3中所示。
[0925]
运行期间的偏差应在下表中提及：
[0926]
运行名称偏离事件原因缓解措施
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[0927]
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以实施对本发明的这些和其他修改和变化，本发明的精神和范围在所附权利要求中更具体地阐述。此外，应当理解，各种实施例的方面可以整体或部分互换。此外，本领域普通技术人员将会理解，前面的描述仅仅是示例性的，并不旨在限制在所附权利要求中进一步描述的本发明。