一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法

技术特征：
1.一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法，其特征在于，包括以下步骤：1)将样品与孵育缓冲液混合、孵育、静置，得到静置液；所述孵育缓冲液包括：50mm二乙醇胺、1mm mgcl2和200～1000μm对硝基苯磷酸二钠，ph值为7.5～11.0；所述孵育的温度为4～45℃，所述孵育的时间为15～120min；2)将所述步骤1)得到的静置液与量子点溶液混合，得到混合液，以310nm激发，测定所述混合液在405nm和585nm下的荧光强度，得到585nm与405nm的荧光强度比值，定义为r，将空白样品的荧光强度比值定义为r0，得到r/r0；所述量子点溶液包括：10mg/ml mn:zns和0.1mg/ml znse@zns；3)将所述步骤2)得到的r/r0代入以下公式，得到样品中碱性磷酸酶活力；当所述样品为alp溶液时，公式为：r/r0＝0.03688c
alp
0.7513，r2＝0.9969，其中c
alp
的单位为u/l；当所述样品为血清时，公式为：r/r0＝0.02085c
alp
1.098，r2＝0.9907，其中c
alp
单位为：u/l；当所述样品为hepg2细胞裂解液时，公式为：r/r0＝0.0597c
hepg2
0.9932，r2＝0.9983其中c
hepg2
的单位：个/ml。2.根据权利要求1所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述mn:zns的制备方法包括以下步骤：a、将硬脂酸锌、硬脂酸和1-十八烯在140℃下混合，得到锌储备液；b、将硬脂酸锌、硬脂酸锰、硫粉、油胺和1-十八烯在100℃下混合，得到澄清溶液；c、将所述步骤a得到的锌储备液与步骤b得到的澄清溶液在250℃下混合，温度持续30min，将得到的混合物抽滤、洗涤，将得到的沉淀物干燥，得到油溶性mn:zns；d、将所述步骤c得到的油溶性mn:zns与氯仿、3-巯基丙酸混合、超声、离心，得到沉淀；e、将所述步骤d得到的沉淀与四甲基氢氧化铵溶液混合、超声、离心，得到上清液，调节上清液的ph值为7～8后进行真空干燥，得到水溶性mn:zns，即得到mn:zns。3.根据权利要求2所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述步骤a中硬脂酸锌的摩尔、硬脂酸的摩尔与1-十八烯的体积比为10mmol:10mmol:10ml；所述步骤b硬脂酸锌的摩尔、硬脂酸锰的摩尔、硫粉的摩尔、油胺的摩尔和1-十八烯的体积比为1mmol:0.05mmol:5mmol:7.5mmol:50ml；所述步骤c锌储备液与澄清溶液的体积比为1:5。4.根据权利要求2所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述步骤d油溶性mn:zns的质量与氯仿的体积、3-巯基丙酸的体积比为1.5g:10ml:1.6ml；所述超声的时间为30min；所述离心的条件包括：离心力为2500g，离心时间为2min。5.根据权利要求2所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述步骤e沉淀的质量与四甲基氢氧化铵溶液的体积比为1.5g:10ml；所述超声的时间为5min；所述离心的条件包括：离心力为2500g，离心时间为2min；
所述真空干燥的温度为50℃。6.根据权利要求2所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述znse@zns的制备方法包括以下步骤：a、将硒粉、硼氢化钠和去离子水混合、搅拌、冰浴，收集上清液；b、将硫酸锌、还原型谷胱甘肽、去离子水混合，调节ph值为10.5后加入步骤a得到的上清液，依次搅拌、回流，得到znse量子点溶液；c、将所述步骤b得到的znse量子点溶液与硫酸锌、3-巯基丙酸混合，调节ph值为10.5后，依次搅拌、回流得到znse@zns溶液，与无水乙醇混合、离心，得到的沉淀为znse@zns。7.根据权利要求6所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述步骤a中硒粉的摩尔、硼氢化钠的摩尔和去离子水的体积比为0.1mmol:0.6mmol:1ml；所述搅拌的时间为40min；所述冰浴的时间为10min；所述步骤b中硫酸锌的摩尔与还原型谷胱甘肽的摩尔、去离子水的体积比为0.4mmol:0.5mmol:100ml；所述搅拌的时间为30min；所述回流的时间为1.5h。8.根据权利要求6所述的比率荧光分析法，其特征在于，所述步骤c中znse量子点溶液的体积与硫酸锌的摩尔、3-巯基丙酸的体积比为20ml:0.1mmol:26μl；所述搅拌的时间为1h；所述回流的时间为1h；所述离心的条件包括：离心力为2500g，离心时间为30min。9.根据权利要求1所述的的比率荧光分析法，其特征在于，所述孵育缓冲液中对硝基苯磷酸二钠的含量为600μm，所述孵育缓冲液的ph值为10.0；所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为75min。

技术总结
本发明提供了一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法，属于酶活力检测技术领域。包括：将样品与孵育缓冲液混合、孵育、静置，得到静置液；将静置液与量子点溶液混合，得到混合液，以310nm激发，测定所述混合液在405nm和585nm下的荧光强度，得到585nm与405nm的荧光强度比值，定义为R，将空白样品的荧光强度比值定义为R0，得到R/R0；将R/R0代入公式，得到样品中碱性磷酸酶活力。本发明提出的基于内滤效应的比率荧光分析法具有无标记检测、无需样品前处理、较低的生物基质干扰的明显优势，为复杂生物基质中碱性磷酸酶活力检测提供了一种简便、灵敏、选择性、样品消耗少的新方法。消耗少的新方法。消耗少的新方法。


技术研发人员：舒畅 胡鹏辉 黄锐艳 尹君 杨玉 梁媛
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2022.09.06
技术公布日：2022/11/11