通过调控种子重量实现转基因种子分选的方法及其应用与流程

1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种分选转基因和非转基因种子的新方法，该方法通过构建一种表达载体来调控水稻种子的淀粉合成，进而控制种子的形态和重量，再以风选和重力选的方式通过重量差异实现转基因和非转基因种子的分选。本发明应用于第三代杂交水稻技术中可实现对保持系和不育系种子的高效准确分选。


背景技术：

2.水稻是我国重要的粮食作物。从上世纪80年代起，以雄性不育为基础的杂交水稻育种技术极大的提高了水稻的单产，在保障我国粮食安全中发挥关键性作用。第三代杂交水稻技术以分子设计为核心，是继以核质互作花粉不育为核心的“三系法”和以光温敏核不育为核心的“两系法”之后得到成功应用的新一代杂交水稻技术，该技术也被称为“智能不育杂交育种技术”。该技术以遗传稳定的隐性雄性核不育材料为基础，将与该不育材料相对应的育性恢复基因和花粉失活基因及分选标记基因作为紧密连锁的元件导入其中，构成保持系。导入元件中的育性恢复基因使保持系的育性恢复，导入元件的存在使保持系在生殖生长过程中等比例产生两种类型的雌雄配子，一种不含导入元件仅含雄性不育突变基因，另一种则同时含有导入元件和雄性不育突变基因，含导入元件的花粉在花粉失活基因的作用下失去活性，不含导入元件的花粉活性不受影响；而导入元件不影响雌性育性，因此保持系自交可以产生两种类型的种子，分别是不含导入元件的不育系和含有导入元件的保持系，这两种类型的种子可以通过导入元件中的分选标记(如红色荧光蛋白)进行分选，分选后不育系可用于杂交制种，保持系则用于不育系的繁殖。
3.分选标记是对保持系和不育系种子进行区分的主要依据，对保持系和不育系种子进行分选本质上即是对转基因和非转基因种子进行分选。现有的生产应用中通常采用红色荧光蛋白基因dsred2作为分选标记基因，由带有35s增强子的大麦启动子ltp2驱动的dsred2可在种子的糊粉层表达，使糊粉层呈现粉红色，在合适的光源照射下dsred2可以被有效地激发并发出明亮的红色荧光。专用的色选设备将成像系统和机械分拣系统相结合，根据红色荧光实现对保持系和不育系种子的大批量高效分选。但在实际生产中，往往出现发育不良的种子，造成转基因种子荧光较弱，色选设备无法准确分选；另外，色选设备高昂的设计和维护成本也提高了育种公司的生产成本。寻找一种高效且低成本的新的分选方法以区分保持系和不育系种子对第三代杂交水稻技术的应用和推广有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明要解决的是第三代杂交水稻技术中保持系和不育系种子分选工作成本高、效率和精度不足的技术问题。本发明提供一种利用水稻籽粒重量的不同来提高水稻不育系和保持系种子分选精度和效率的方法，具体为通过基因沉默技术特异性地调控保持系种子胚乳中淀粉合成关键基因的转录水平，从而减少胚乳中淀粉的积累，降低保持系种子比重；而不育系种子发育正常，籽粒饱满。利用该方法获得的保持系种子相较不育系种子比重减
轻，能够通过风选和重力选机器区分，适用于机械化制种。
5.本发明提出的技术方案为：
6.一种利用水稻种子比重的不同来提高第三代杂交水稻技术中水稻不育系和保持系种子筛选精度和效率的方法，其特征在于：
7.a)利用转基因技术，将包含可影响种子组成成分积累的dna(deoxyribonucleic acid)片段以及第三代杂交水稻技术中的其它关键元件导入雄性不育系水稻中，并进行种植；
8.b)混收全部种子，收获后根据种子比重不同对混收种子进行分选；
9.c)分选后，比重较重的种子为不育系，比重较轻的种子为保持系。
10.上述方法中，所述的可影响种子组成成分积累的方式包括但不限于干扰参与淀粉合成的关键基因的表达，其中所述的参与淀粉合成的关键基因包括但不限于osagpl2、osagps2等。进一步的，具体实施例中选择了具有降低osagpl2(adp-glucose pyrophosphorylase large subunit 2,loc_os01g44220)或osagps2(adp-glucose pyrophosphorylase small subunit2,loc_os08g25734)等基因转录水平功能的核苷酸序列。种子发育过程中osagpl2和osagps2的互作对水稻胚乳中淀粉的积累十分重要，对osagpl2基因进行突变或沉默会可以抑制其表达，使种子灌浆期胚乳细胞淀粉合成和复合颗粒形成方面存在缺陷，具体表现为不完全灌浆表型，且种子的比重减轻。同理，对osagps2基因进行突变或沉默也可以通过类似原理影响种子的比重。特异性地在发育的种子中突变或沉默上述两个基因不影响植株的其它性状。
11.本发明中用于上述基因突变或沉默的技术包括但不限于artificial microrna、反义rnai、病毒rnai、发夹式rnai以及其它通过转基因手段抑制基因转录水平或蛋白翻译水平的技术等。
12.上述的方法，进一步的，所述载体还包括其他元件，包括如由育性恢复元件和具有使转基因花粉失活功能的核苷酸序列等连锁形成的序列。其中育性恢复元件包括但不限于osnp1等隐性核雄性不育基因；具有使转基因花粉失活功能的核苷酸序列包括但不限于造粉体信号肽编码序列与α-淀粉酶基因组成的融合序列，其中造粉体信号肽包括但不限于来源于水稻的asp1、来源于玉米的bt1等，α-淀粉酶基因包括但不限于来源于水稻的osaa、来源于玉米的zm-aa1、来源于玉米的zm-aa2等基因。
13.上述的方法，进一步的，所述分选方法包括但不限于重力选和风选或重力选/风选组合，更进一步，可使用垂直气流风选机。
14.具体地，本发明在实施例中提供一种包含可影响种子组成成分积累的核苷酸序列的载体，其核苷酸序列可选自下列所述：
15.a)第一表达盒，含有育性恢复基因；
16.b)第二表达盒，含有可使转基因花粉失活的dna片段；
17.c)第三表达盒，含有可影响种子组成成分积累的dna片段。
18.其中所述的育性恢复基因包括但不限于osnp1等，更具体的，osnp1的核苷酸序列如seq id no:5所示，包含上游2044bp、3040bp基因序列和下游448bp。
19.其中所述的可使转基因花粉失活的dna片段包括但不限于造粉体信号肽编码序列与α-淀粉酶基因组成的融合序列，其中造粉体信号肽包括但不限于来源于水稻的asp1、来
源于玉米的bt1等，α-淀粉酶基因包括但不限于来源于水稻的osaa基因、来源于玉米的zm-aa1基因、来源于玉米的zm-aa2基因等。更具体的，融合序列中造粉体信号肽asp1编码序列与α-淀粉酶基因osaa为水稻来源，其核苷酸序列如seq id no:7所示。
20.其中，第二表达盒具有一个花粉特异性表达的启动子，优选所述花粉特异性表达启动子为lsp3，其核苷酸序列如seq id no:6所示。
21.其中，第二表达盒具有终止子，优选所述终止子为in2-1，其核苷酸序列如seq id no:8所示。
22.其中，第三表达盒中可影响种子组成成分积累的方式包括但不限于干扰参与淀粉合成的关键基因的表达，其中所述的参与淀粉合成的关键基因包括但不限于osagpl2、osagps2等。
23.其中所述的干扰参与淀粉合成的关键基因的表达包括但不限于对关键基因突变或沉默，所使用的技术包括但不限于artificial microrna、反义rnai、病毒rnai、发夹式rnai以及其它通过转基因手段抑制基因转录水平或蛋白翻译水平的技术等。
24.其中所述的可影响种子组成成分积累的核苷酸序列优选为osagpl2干扰片段miragpl2或osagps2干扰片段miragps2，其核苷酸序列分别如seq id no：2或3所示。
25.其中，第三表达盒具有一个胚乳特异启动子，优选所述启动子为水稻来源的启动子p44220，其核苷酸序列如seq idno:1所示。其中，第三表达盒具有终止子，优选所述终止子为pin ii term，其核苷酸序列如seq id no:4所示。
26.本发明的有益效果为：
27.本发明通过特异调控转基因水稻种子胚乳中淀粉的合成，从而影响种子比重，并通过风选和重力选达到准确高效分选转基因和非转基因种子，其有益效果包括：
28.1.相比于原第三代杂交水稻技术中根据红色荧光对保持系和不育系种子进行分选，本发明中的分选过程不涉及视觉或图像分辨，避免了因光线遮挡或荧光强度不足导致的判断错误。
29.2.本发明对非转基因种子的筛选效果可以达到100％，通过使用更严格的筛选条件可将所有转基因种子彻底筛除，同时还可以除去非转基因种子中部分发育不良或因病虫害产生的秕谷。
30.3.相比于使用红色荧光标记及配套的色选设备，本发明使第三代杂交水稻技术中保持系和不育系种子的分选可以使用具备比重选功能的扬场机或粮食清选机等常用农机来完成，大幅度降低了对设备的要求。
31.4.原第三代杂交水稻技术，实际制种过程中采用保持系给不育系授粉来生产不育系种子，制种成本高，效率低；而风选广三系可以直接通过保持系自交，结合谷粒风选和重力选，实现保持系和不育系种子的机械化制种，大大提高了制种效率，节约了制种成本。
附图说明
32.图1为水稻种子分选标记表达载体p1300-miragpl2的结构示意图。
33.图2为转基因水稻阳性植株种子表型图，其中左图为转基因阳性株产生的正常种子，右图为转基因阳性株产生的比重减轻的种子，bar＝2mm。
34.图3为植物表达载体posfx的结构示意图。
35.图4为水稻植株花粉i
2-ki染色结果，其中左图为野生型植株花粉染色结果，右图为转基因阳性植株花粉染色结果，bar＝250μm。
36.图5为转基因阳性植株种子风选效果图，其中左图为风选前的种子，右上图左侧为正常种子，右侧为比重减轻的种子，右下图为右上图种子除去外壳，bar＝2cm。
37.图6为转基因水稻阳性植株所产生的正常种子产生的植株生长表型图，其中左图为野生型植株，右图为正常比重种子产生的植株。
38.图7为转基因水稻阳性植株所产生比重减轻的种子产生的植株生长表型图，其中左图为野生型植株，右图为比重减轻的种子产生的植株。
39.图8为植物表达载体posfx2的结构示意图。
40.图9为水稻植株花粉i
2-ki染色结果，其中左图为野生型植株花粉染色结果，右图为转基因阳性植株花粉染色结果，bar＝250μm。
41.图10为转基因阳性植株种子风选效果图，其中左图为风选前的种子，右上图左侧为正常种子，右侧为比重减轻的种子，右下图为右上图种子除去外壳，bar＝2cm。
42.图11为转基因水稻阳性植株所产生的正常种子产生的植株生长表型图，其中左图为野生型植株，右图为正常比重种子产生的植株。
43.图12为转基因水稻阳性植株所产生比重减轻的种子产生的植株生长表型图，其中左图为野生型植株，右图为比重减轻的种子产生的植株。
具体实施方式
44.以下实施例仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
45.若未特别指明，实施例中所用的各种技术手段为本领域技术人员所通用的常规手段。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
46.实施例1：水稻种子分选标记表达载体p1300-miragpl2的构建
47.通过装配miragpl2表达盒的各个元件，发明人构建了图1所示的p1300-miragpl2载体。该表达盒结构为p44220::miragpl2::pin ii term，包含来自水稻基因组的启动子p44220(seq id no:1所示)，具备干扰osagpl2基因表达功能的核苷酸序列miragpl2(seq id no:2所示)和来源于马铃薯的终止子pin ii term(seq id no:4所示)。将上述表达盒连入pcambia1300载体，测序验证后最终得到植物表达载体p1300-miragpl2。
48.实施例2：水稻转化与表型考察
49.取野生型水稻武运粳品种的种子诱导产生愈伤组织，利用电击法将实施例1中得到的质粒p1300-miragpl2转入农杆菌agl0菌株，利用农杆菌转化法对上述愈伤组织进行遗传转化，取转基因阳性植株产生的种子进行观察。结果如图2所示，转基因阳性株的种子出现了胚乳形状和比重方面的表型分离，具体表现为，虽然所有种子的外观无明显差异，但其中一部分种子的胚乳因淀粉积累不足而皱缩，导致种子比重减轻，而另一部分种子的胚乳
和比重不受影响。表明水稻表达载体p1300-miragpl2可以调控水稻植株的灌浆过程，最终影响转基因种子的胚乳形状和比重。
50.实施例3：水稻表达载体posfx的构建
51.在构建水稻的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的每个表达盒单独进行了水稻转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化水稻时都能工作良好，达到预期的设计效果。
52.进一步，发明人构建了图3所示的水稻表达载体posfx。如图所示，该载体含有3个表达盒，其中，第一表达盒为水稻雄性育性基因osnp1的表达盒，该表达盒为osnp1基因全长序列，包含上游2044bp、3040bp基因序列和下游448bp，如序列表中seq id no:5所示；第二表达盒为花粉失活功能表达盒lsp3::asp1::osaa::in2-1，包含来自水稻基因组的花粉特异表达启动子lsp3(seq id no:6所示)、造粉体信号肽asp1的编码序列与α-淀粉酶基因osaa组成的融合序列(seq id no:7所示)和来自玉米基因组的终止子in2-1(seq id no:8所示)；第三表达盒为分选标记表达盒p44220::miragpl2::pin ii term，包含来自水稻基因组的启动子p44220(seq id no:1所示)，具备干扰osagpl2基因表达功能的核苷酸序列miragpl2(seq id no:2所示)和来源于马铃薯的终止子pin ii term(seq idno:4所示)。
53.将上述三个表达盒连入pcambia1300载体，测序验证后最终得到植物表达载体posfx。
54.实施例4：水稻转化
55.取osnp1/osnp1基因型水稻植株所结的种子诱导产生愈伤组织，利用电击法将质粒posfx转入农杆菌agl0菌株，利用农杆菌转化法对上述愈伤组织进行遗传转化，得到25株转基因阳性植株，其中有11株背景基因型为osnp1隐性纯合。具体的转化受体材料为水稻武运粳7号品种背景。
56.实施例5：转基因水稻植株的花粉育性检测
57.对实施例4所得到的25株转基因阳性水稻植株进行分析发现，转基因阳性植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。
58.对posfx构建体转化水稻得到的转基因植株材料和野生型水稻对照分别进行花粉可染率检测。采用的方法为：在水稻开花期，从转基因植株和野生型对照植株各随机抽取单株，每株各取一朵小花，置于载玻片中央，滴加一滴1％的i
2-ki溶液，在液滴中用镊子将花药夹碎，释放其中的花粉，盖上盖玻片，在显微镜下观察染色情况，着色为深蓝色的为可育花粉，不能够着色的为败育花粉。
59.分析转基因植株的花粉可染率，结果如图4所示：对照野生型植株的可染花粉占98％～100％；而在5个随机抽取的转基因植株中，正常花粉与败育花粉的比例接近1:1，表明水稻表达载体posfx能够达到预期的花粉失活功能。
60.实施例6：转基因水稻植株所产生种子比重的分离分析
61.将实施例4和实施例5中所述背景基因型为osnp1隐性纯合、正常花粉与败育花粉的比例接近1:1的转基因水稻植株所结的t1代种子根据比重进行分选，本实施例中采用垂直气流风选机来进行种子的分选，由于两类种子外观和体积无明显差异，但保持系种子的比重减轻，比重与不育系种子有明显差异(如图5所示)，所以在合适的风场中，保持系种子随气流上升，最终从轻料口出料，而不育系则在重力作用下下降，最终从重料口出料。结果
表明这些植株产生不同比重的种子均显示1:1的分离比，表明水稻表达载体posfx能够达到预期的调控种子比重的功能。
62.实施例7：转基因水稻植株所产生不同比重种子的育性分析
63.将实施例6中分选的两类种子分别进行种植并考察育性，结果表明比重正常的种子全部为不育系(如图6所示)，比重减轻的种子全部为可育的保持系(如图7所示)。结果表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达能够实现预期的育性恢复功能、花粉失活功能和种子筛选标记功能。
64.实施例8：水稻表达载体posfx2的构建与作用效果分析
65.将实施例3中的miragpl2(seq id no:2所示)替换为miragps2(seq id no:3所示)，构建了如图8所示的posfx2载体。将测序验证后的posfx2载体按实施例4的操作进行水稻转化，并按实施例5～7的操作对该载体的作用效果进行分析。如图9所示，转基因植株中，正常花粉与败育花粉的比例接近1:1，表明水稻表达载体posfx2能够达到预期的花粉失活功能。如图10所示，转基因植株产生不同比重的种子均显示1:1的分离比，表明水稻表达载体posfx2能够达到预期的调控种子比重的功能。比重正常的种子全部为不育系(如图11所示)，比重减轻的种子全部为可育的保持系(如图12所示)，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达能够实现预期的育性恢复功能、花粉失活功能和种子筛选标记功能。
66.以上实施例表明本发明所提供的利用水稻种子比重的不同来提高水稻不育系和保持系种子筛选精度和效率的方法具有可操作性，实际使用效率为100％，没有发生转基因逃逸，可确保生物安全性。