用于检测牛带绦虫的引物、探针、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及用于检测牛带绦虫的引物、探针、试剂盒及应用。


背景技术：

2.牛带绦虫(taeniasaginata)又名牛肉绦虫、肥胖带绦虫或无钩绦虫，是扁形动物门(platyhelminths)绦虫纲(cestoda)圆叶目(cyclophyllidea)带科(taeniidae)带属(taenia)人畜共患寄生虫。其以人为其唯一终末宿主；牛科动物黄牛与水牛是最主要的中间宿主；野山羊、野猪、驯鹿、美洲驼、角马、狐、绵羊等也可作为中间宿主。
3.牛带绦虫病是由牛带绦虫成虫寄生人体小肠引起的一种肠绦虫病，主要在吃牛肉、尤其有生食牛肉习惯的地区中流行，一般地区则多为散发病例。
4.牛囊尾蚴病也称牛囊虫病，病原体是牛带绦虫的幼虫—牛囊尾蚴(cysticercusbovis)，其可寄生于牛全身各肌肉组织及肺、肝、脑等器官，造成机械损伤甚至神经症状，不仅影响畜牧业的发展，造成重大经济损失，而且该病还是一种人畜共患寄生虫病，给人体健康带来严重威胁，会严重影响畜牧业生产的经济效益，是肉品卫生检验的重点项目之一。
5.现有的用于检测牛带绦虫的方法包括涂片检测、免疫学检测、常规pcr检测，但其检测特异性、灵敏度均有待提高。因此，如何提供一种对牛带绦虫检测灵敏度高、特异性强的产品是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明公开了用于检测牛带绦虫的引物、探针、试剂盒，将其用于牛带绦虫的检测，灵敏度高，特异性强。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.用于检测牛带绦虫的引物，包括正向引物和反向引物，
9.正向引物与反向引物用于扩增牛带绦虫线粒体细胞色素c氧化酶1基因中的保守区域。
10.线粒体细胞色素c氧化酶1(cytochromecoxidasesubunit1,cox1)是呼吸链末端的限速酶，参与能量供应，细胞凋亡，新陈代谢，活性氧产生等重要的生理过程，本发明利用其基因保守区域设计引物，用于牛带绦虫的扩增检测，灵敏度高，特异性强。
11.优选地，正向引物核苷酸序列为：5'
‑
cgtttaaatgcttyaagtgcrtggtt
‑
3'，seqidno:3；
12.反向引物核苷酸序列为：5'
‑
ctacttgaaaataatgaygacgacaaag
‑
3'，seqidno:4。
13.上述用于检测牛带绦虫的引物在制备检测牛带绦虫的产品中的应用。
14.用于检测牛带绦虫的探针，与权利要求1或2引物扩增的牛带绦虫线粒体细胞色素
c氧化酶1基因的保守区域杂交。
15.优选地，上述探针核苷酸序列为5'fam
‑
gttcggttactatgataataggagtaccaacagg
‑
mgb 3'，seq id no:5。
16.上述用于检测牛带绦虫的引物在制备检测牛带绦虫的产品中的应用。
17.用于检测牛带绦虫的试剂盒，包括用于检测牛带绦虫的引物。
18.优选地，上述用于检测牛带绦虫的试剂盒，还包括上述用于检测牛带绦虫的探针。
19.优选地，上述用于检测牛带绦虫的试剂盒，还包括标准品，标准品为含有牛带绦虫线粒体细胞色素c氧化酶1基因的质粒。
20.本发明试剂盒可用于对牛带绦虫病流行区人群或有流行区途经史的人群进行检测，还可用于加强检疫，防止含牛带绦虫幼虫的牛肉及其制品流入市场，进而及时控制和预防其传播，有利于畜牧业的发展和经济的提高。
21.一种检测牛带绦虫的方法，提取待测样本dna作为模板，使用上述试剂盒进行实时荧光定量pcr检测。
22.综上所述，本发明引物、探针及试剂盒用于牛带绦虫的检测，灵敏度高，特异性强，适于推广应用。
附图说明
23.图1所示为牛带绦虫常规pcr检测结果；
24.其中，泳道1为健康组织dna，泳道2为牛带绦虫dna。
25.图2所示为real
‑
time pcr标准曲线。
26.图3所示为real
‑
time pcr敏感性实验结果；
27.其中，1、2：0.1ng；3、4：10pg；5、6：1pg；7、8：100fg；9、10：10fg； 11、12：1fg；13：0.1fg牛带绦虫dna。
28.图4所示为常规pcr敏感性实验结果；
29.其中，1：h2o；2
‑
9：分别为0.1ng、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg 和0.01fg牛带绦虫dna。
30.图5所示为real
‑
time pcr检测临床样品结果。
具体实施方式
31.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙等译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
33.实施例1牛带绦虫real
‑
time pcr检测方法的建立
34.1.牛带绦虫dna样本的制备
35.临床采集并分离的牛带绦虫成虫节片20mg左右，移到已预冷的研钵内，缓慢倒入
适量液氮快速用力研磨成匀浆，按照组织dna提取试剂盒说明书提取虫体基因组dna，测定浓度和纯度，用于方法建立检测模板。
36.2.靶标基因的克隆和重组阳性质粒的构建
37.根据genbank上已登陆的牛带绦虫线粒体cox1基因序列(ab271695.1)，设计特异性引物p1:5
’‑
atatttactttagatcataagcgg
‑3’
(seqidno.1)和p2:5
’‑
acgagaaaatatattagtcataaa
‑3’
(seqidno.2)为上下游引物，以步骤1中提取的牛带绦虫dna为模板进行常规pcr扩增。
38.常规pcr反应体系：
39.总体积25μl，包含2.5μl10
×
pcr缓冲液，2.5μl2mmdntp，0.2μl0.5uamplitaqgoldtaqdna聚合酶(appliedbiosystems,usa)，1μl10μmp1引物，1μl10μmp2引物，1μl(50ng)模板dna,和16.8μl去离子水。
40.常规pcr反应条件：
41.94℃预变性3min；94℃45s，52℃45s，72℃1min，共35个循环；循环结束后72℃延伸10min。
42.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可特异性扩增出513bp目的片段，且从健康组织提取的dna对照组没有扩增出目的片段。
43.使用dna胶回收试剂盒对特异性扩增产物进行回收纯化，纯化后的片段连接到pmd18
‑
t载体上，阳性质粒转化进入dh5α感受肽细胞，经过抗性培养基筛选，挑取阳性克隆。阳性克隆转接种到液体lb培养基上，提取质粒，对质粒序列进行测定，并与ncbi数据库中牛带绦虫的cox1基因进行比对验证，证实重组阳性质粒构建成功。
44.3.牛带绦虫real
‑
timepcr检测方法的建立及标准曲线的制作
45.设计real
‑
timepcr引物和探针：
46.引物p3:5'
‑
cgtttaaatgcttyaagtgcrtggtt
‑
3'(seqidno.3)；
47.引物p4:5'
‑
ctacttgaaaataatgaygacgacaaag
‑
3'(seqidno.4)；
48.探针(probe)：5'fam
‑
gttcggttactatgataataggagtaccaacagg
‑
mgb3'(seqidno.5)；
49.扩增片段大小为128bp。
50.以步骤2中构建好的重组阳性质粒作为标准品，用去离子水10倍倍比稀释8个梯度作为模板，使用上述real
‑
timepcr引物和探针进行扩增检测。
51.real
‑
timepcr反应体系：
52.premixextaq(probeqpcr)10μl，上下游引物(p3、p4)各1μl(200nm)，探针1μl(400nm)，模板dna1μl(50ng)，加去离子水使体系达到20μl；
53.real
‑
timepcr反应条件：
54.95℃10min预变性；95℃15s，60℃60s，40个循环。
55.real
‑
timepcr反应在appliedbiosystems7500荧光实时定量pcr仪上进行，结果通过荧光实时定量pcr自带软件进行分析，获得的real
‑
timepcr标准曲线如图2所示，标准曲线的相关性参数r2＝0.9903和扩增效率e＝1.02均较好。
56.实施例2牛带绦虫real
‑
timepcr检测方法的应用
57.1.real
‑
timepcr特异性试验
58.旋毛虫、锥虫、球虫和隐孢子虫均由本所农业部动物寄生虫重点实验室提供。提取所有虫体dna为模板，使用实施例1中的p3引物、p4引物、探针以及real
‑
time pcr反应体系、反应条件扩增cox1靶基因，观察其特异性。
59.结果显示，实施例1建立的牛带绦虫real
‑
time pcr检测方法只对牛带绦虫 dna具有很强的特异性，对其它寄生虫无特异性扩增。
60.2.real
‑
time pcr敏感性试验
61.纯化牛带绦虫提取的dna，倍比稀释8个梯度，分别采取常规pcr和 real
‑
time pcr两种方法在模板量一致的情况下进行对比检测，观察其检测下限。
62.常规pcr反应体系：
63.总体积25μl，包含2.5μl 10
×
pcr缓冲液，2.5μl 2mm dntp，0.2μl 0.5u amplitaq gold taq dna聚合酶(applied biosystems,usa)，1μl 10μm p3引物，1μl 10μm p4引物，1μl(50ng)模板dna,和16.8μl去离子水。
64.常规pcr反应条件：
65.94℃预变性3min；94℃45s，52℃45s，72℃1min，共35个循环；循环结束后72℃延伸10min。
66.real
‑
time pcr方法为实施例1中的p3引物、p4引物、探针以及real
‑
timepcr反应体系、反应条件。
67.结果如图3、4所示，起始浓度为0.1ng，10倍稀释8个梯度(0.1ng，10pg， 1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg和0.01fg)，real
‑
time pcr检测下限为1fg(图3，每份样品2个重复)，而常规pcr检测下限为100fg(图4)，由此可见real
‑
timepcr灵敏度是常规pcr的100倍。
68.3.动物感染牛带绦虫的临床检测
69.以提取的牛带绦虫dna做阳性对照，健康动物组织dna做阴性对照，分别采用常规pcr和real
‑
time pcr两种方法对样品进行检测。
70.对常规pcr检测阳性的样品进行real
‑
time pcr检测，real
‑
time pcr方法可从低浓度模板中检测到牛带绦虫的感染(图5)，图5中所有曲线分别为随机抽取的不同强弱阳性的样品。
71.对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。