干细胞的染色体稳定剂的制作方法

1.本发明涉及一种能够防止在干细胞的培养、传代过程中发生染色体异常的材料以及使用该材料的干细胞的染色体稳定剂。


背景技术：

2.以多能干细胞为代表的干细胞是具有自我更新能力的未分化细胞，并且是可分化成各种细胞的细胞。近年来，将干细胞或由干细胞分化诱导得到的细胞移植于患者的受损组织中并谋求其功能再生的再生医疗正在得到广泛研究。在再生医疗中，由于需要准备大量干细胞或其分化细胞，因此使干细胞有效增殖的方法或使干细胞有效分化的方法的开发很盛行。
3.但是，干细胞在培养期间变长或传代次数变多时，有时会引起染色体异常。在染色体异常中，除了2条成对的染色体形成为1条的单体性(染色体)、3条的三体性(染色体)等非整倍性异常之外，还有易位、倒位、部分重复、部分缺失等结构异常。倘若在干细胞中发生这样的染色体异常，则不仅干细胞保持的增殖能力和分化能力丧失，而且一旦将从该干细胞分化的细胞或组织用于再生医疗等时，则还存在突变为癌细胞或形成肿瘤的危险性。在癌细胞或肿瘤中有时发生染色体异常，近年来有更准确地检测染色体异常的方法被报道出来(例如，参照专利文献1和2)。
4.另一方面，烟酰胺单核苷酸(nmn)是辅酶nad

的生物合成中间代谢产物。近年来，有报道称nmn具有改善衰老小鼠的胰岛素分泌能力的效果，在因高脂饮食、衰老而引起的2型糖尿病的小鼠模型中具有显著改善胰岛素敏感性、分泌的效果(例如，参照专利文献3)，具有显著提高衰老的肌肉的线粒体功能的效果等。此外，还报道了通过在nmn存在下培养多能干细胞，可以提高其增殖能力和分化能力(例如，参照专利文献4和5)。现有技术文献专利文献
5.专利文献1：日本特开2019-213537号公报专利文献2：日本特开2019-144097号公报专利文献3：美国专利第7737158号说明书专利文献4：国际公开第2018/143258号专利文献5：国际公开第2019/182044号


技术实现要素：

发明要解决的课题
6.本发明的目的是提供一种能够防止在干细胞的培养和传代过程中发生染色体异常的材料、使用该材料的干细胞的染色体稳定剂、干细胞的培养方法和干细胞的染色体稳定化方法。用于解决问题的手段
7.本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在β-nmn的存在下，干细胞中的染色体的稳定性提高，染色体异常得到抑制
·
防止，从而完成了本发明。
8.即，本发明提供以下的干细胞的染色体稳定剂、干细胞的培养方法以及干细胞的染色体稳定化方法。项[1]一种干细胞的染色体稳定剂，其特征在于，以β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上允许的盐或者它们的溶剂合物为有效成分。项[2]如上述项[1]所述的染色体稳定剂，其以β-烟酰胺单核苷酸换算计0.015mm～5mm添加于干细胞的培养基中。项[3]如上述项[1]或项[2]所述的染色体稳定剂，其用于选自由胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞和造血干细胞所构成的组中的一种以上的干细胞的染色体稳定化。项[4]一种干细胞的培养方法，其特征在于，在含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐或者它们的溶剂合物的培养基中培养多能干细胞。项[5]如上述项[4]所述的培养方法，其中，所述培养基的β－烟酰胺单核苷酸浓度为0.01mm～5mm。项[6]如上述项[4]或项[5]所述的培养方法，其中，所述干细胞选自由胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞和造血干细胞所构成的组中的一种以上。项[7]一种干细胞的染色体稳定化方法，其特征在于，在含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐或者它们的溶剂合物的培养基中培养干细胞。发明效果
[0009]
本发明的干细胞的染色体稳定剂通过对干细胞起作用可以提高该干细胞的染色体稳定性，抑制或防止染色体异常的发生。因此，通过在培养基中含有该染色体稳定剂，可以提高干细胞的染色体稳定性，抑制或防止染色体异常的发生，能够更稳定地培养干细胞。此外，通过使用该染色体稳定剂，能够降低从干细胞分化的细胞或组织的癌化
·
肿瘤化的风险。
附图说明
[0010]
图1的(a)是实施例2中用pi染色细胞的荧光照片，图1的(b)是实施例2中用抗γh2a.x抗体进行细胞的免疫染色的荧光照片，图1的(c)是将(a)和(b)合并的照片。图2是示出用pi染色的全部细胞中的γh2a.x阳性细胞核的比率的图表。
具体实施方式
[0011]
在本发明及本技术说明书中，干细胞是指具有自体复制能力且具有分化能力(能够分化为多种细胞种类的能力)的未分化细胞，例如除了es细胞(胚胎干细胞)、ips细胞(诱导多能干细胞)等多能干细胞以外，还可以举出间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等成体干细胞(体性干细胞)。优选能够分化成为外胚层、中胚层以及内胚层来源的任何细胞的干细胞、能够分化成为中胚层来源的细胞的干细胞等。
[0012]
本发明的干细胞的染色体稳定剂(以下有时称为“本发明的染色体稳定剂”)是以nmn(化学式：c
11h15
n2o8p)作为有效成分，在培养
·
传代干细胞时添加到其培养基中的物质。
通过在nmn存在下培养
·
传代干细胞，可以提高干细胞的染色体稳定性并抑制或防止染色体异常的发生。
[0013]
在nmn中，作为光学异构体存在α、β两种，作为本发明的染色体稳定剂的有效成分的nmn为β-nmn(cas编号：1094-61-7)。β-nmn的结构如下所示。
[0014][0015]
作为有效成分的β-nmn可以用任何方法制备。例如可以使用将通过化学合成法、酶法、发酵法等人工合成的β-nmn纯化而成的物质作为有效成分。另外，由于β-nmn是广泛存在于生物体的成分，因此，也可以使用通过从动物、植物、微生物等天然原料中提取
·
纯化而得到的β-nmn作为有效成分。另外，也可以使用市售的经纯化的β-nmn。
[0016]
作为合成β-nmn的化学合成法，例如可以通过使nam与l-四乙酰核糖反应并将得到的烟酰胺单核苷进行磷酸化而制造β-nmn。另外，作为酶法，例如可以利用尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)由nam和5
’‑
磷酸核糖-1
’‑
焦磷酸(prpp)制造β-nmn。作为发酵法，例如可以利用表达nampt的微生物的代谢系统由nam制造β-nmn。
[0017]
作为本发明的染色体稳定剂的有效成分，也可以是β-nmn的药理学上可接受的盐。作为β-nmn的药理学上可接受的盐，可以是无机酸盐，也可以是具有胺这样的碱性部位的有机酸盐。作为构成这样的酸盐的酸，例如可举出乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。另外，作为β-nmn的药理学上可接受的盐，可以是碱盐，也可以是具有羧酸这样的酸性部位的有机盐。作为构成这样的酸盐的碱，例如可举出：作为碱金属盐或碱土金属盐的碱的氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌，以及由氨、三甲基氨、三乙基氨、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n’－二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、n－苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)－氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等碱衍生的碱。
[0018]
作为本发明的染色体稳定剂的有效成分，也可以是游离的β-nmn或β-nmn的药理学上可接受的盐的溶剂合物。作为形成该溶剂化物的溶剂，可举出水、乙醇等。
[0019]
本发明的染色体稳定剂除了含有β-nmn以外，还可以含有其它有效成分。与β-nmn并用的其它有效成分可以仅为一种也可以是两种以上的组合。作为上述其它有效成分，可以列举例如：白蛋白、抗坏血酸、α-生育酚、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、rock抑制剂等已知可提高干细胞的生存效率或增殖效率的成分；可以从诸如已知可提高干细胞分化效率的成分的二甲亚砜、地塞米松、丁酸、曲古抑菌素(trichostatin)a、gsk3抑制剂、bmp抑制剂、wnt抑制剂、激活素(activin)、头蛋白等中适当选择使用。
nmn至0.25mm而制备的。
[0028]
《传代培养》在预先用2.5μg/cm2纤连蛋白包覆的培养用培养皿中，以成为5
×
103cells/cm2的方式接种了间充质干细胞，并使用基础培养基进行培养。接种1天后，更换为基本培养基或添加有β-nmn的培养基。此后，每两或三天进行一次培养基更换。在培养用培养皿内的细胞密度达到约80～90％的汇合时，进行传代培养。
[0029]
首先，去除培养上清，用1
×
pbs(-)洗涤后，用1
×
tryple select(产品编号：12563011，thermo fisher公司制)剥离细胞，在37度、5％co2的条件下静置4分钟。通过移液操作使细胞形成单细胞化后，加入基本培养基或添加有β-nmn的培养基，进行离心分离处理。将回收的细胞悬浮于各培养基中后，进行细胞计数，以5
×
103个细胞/cm2接种于预先涂布的培养用培养皿中。培养基更换使用基本培养基或添加有β-nmn的培养基，每2天或3天进行一次。
[0030]
实施5次上述传代培养后，使用细胞冻结用保存液“stem-cellbanker dmso free gmp grade”(产品编号cb061，日本全药工业株式会社制)，通过参照制造商的推荐方案来冻结细胞。
[0031]
将冻结的细胞以5
×
103个细胞/cm2的量接种到包覆的培养皿中，接种1天后更换培养基。然后，每两或三天进行一次培养基更换。
[0032]
进行一次传代培养，在t25烧瓶中以5
×
103个细胞/cm2的方式进行接种。接种三天后，在t25烧瓶内装满培养基的状态下，发送至染色体安全性试验的试验委托机构(株式会社日本基因研究所)以用于染色体分析。
[0033]
《染色体稳定性试验》对于培养后的间充质干细胞，通过g带分染法确认染色体的状态。染色体条数的测定结果如表1所示，核型分析结果如表2所示。另外，分析结果按照基于国际规定的染色体核型记载法(iscn：international system for human cytogenomic nomenclature)进行了记载。
[0034]
表1
[0035]
表2
[0036]
试验区1表示用基本培养基培养的间充质干细胞(adsc供体1，男性)，试验区2表示用基本培养基培养的间充质干细胞(adsc供体2，女性)。另一方面，试验区3表示用添加有β-nmn的培养基培养的间充质干细胞(adsc供体1，男性)，试验区4表示用添加有β-nmn的培养基培养的间充质干细胞(adsc供体2，女性)。
[0037]
在用基本培养基培养的间充质干细胞中，两个供体(试验区1和2)的染色体条数均出现异常(表1)。即，在各试验区测定50个细胞的染色体数的结果，在试验区1中，4个细胞中的染色体数从46增加到47(增加了1)。另外，在试验区2中，在一个细胞中染色体数从46减少到45(减少了1)。另一方面，在添加有β-nmn的培养基中培养的间充质干细胞中，两个供体(试验区3和4)的染色体数量均为46，这是人的正常染色体数量。核型分析结果表明供体不同编号的染色体出现异常(表2)。在各试验区对20个细胞的染色体核型分析的结果，在试验区1中，三个细胞中5号染色体增加1条，变成三体性(染色体)。试验区2中，一个细胞中染色体7号和18号分别减少了1条，来源不明的标记染色体增加了1条。与此相对，在添加有β-nmn的培养基中培养的间充质干细胞中，两个供体(试验区3和4)的染色体核型均未见异常(表2)。正常情况下，试验区3的男性供体记载为“46,xy”，试验区4的女性供体记载为“46,xx”。从这些结果可确认到β-nmn具有提高干细胞染色体稳定性的效果。[实施例2]
[0038]
在培养人多能干细胞(ipsc)时，调查了β-nmn对染色体的效果。《培养基
·
培养》作为人多能干细胞(ipsc)，使用201b7株，在预先用细胞外基质(matrigel：康宁公司)包覆的24孔的细胞培养用板中，在5％的co2、37℃下培养至80％左右的细胞密度，然后供于试验。
[0039]
作为培养基，使用在基础培养基(dmem-f12)中添加了ipsc的保持传代培养所必需的已知的细胞因子或盐类(胰岛素、转铁蛋白、tgfβ、fgf、亚硒酸钠、抗坏血酸、碳酸氢钠)的基本培养基，设置了在基本培养基中进行培养的β-nmn无添加区(nmn(-))和在基本培养基中添加了β-nmn以使最终浓度成为1mm的β-nmn添加区(nmn( ))。
[0040]
分别在上述β-nmn无添加区和β-nmn添加区中添加ncx4016(sigma-aldrich公司，产品编号为sml1669)，使最终浓度成为5μm，通过培养2小时，诱发染色体损伤。然后，为了研究染色体的损伤程度，通过进行磷酸化的组蛋白h2a.x(γh2a.x)标记来检测核基因组dna损伤的细胞。
[0041]
《免疫染色》
在添加ncx4016的条件下培养的细胞用0.99％的甲醛固定，用0.10％的tritonx-100进行透过处理后，用抗γh2a.x抗体(thermo fisher公司，产品编号为14-9865-82)和用fitc荧光标记的抗小鼠igg抗体(thermo fisher公司，产品编号11-4015-82)进行免疫染色，在荧光显微镜下观察，由此检测γh2a.x。另外，为了能同时观察所有细胞的核，用碘化丙啶(nacalai tesque株式会社，产品编号为19174-31)对dna进行荧光染色。
[0042]
《结果》如图1的(b)所示，用γh2a.x染色的细胞核(用圆圈表示)在β-nmn添加区(nmn( ))明显少于β-nmn无添加区(nmn(-))。另外，如图2所示，用碘化丙啶(pi)染色的全部细胞核中的γh2a.x阳性的细胞核的比率，在β-nmn添加区(nmn( ))中统计学显著性地少于β-nmn无添加区(nmn(-))(总体率差的检验，p《0.05，n》8000)。图2中，柱状图表示各区的γh2a.x阳性的细胞核的比率，误差棒表示其标准误差的幅度。该结果显示，在干细胞中通过添加β-nmn可缓和对成为染色体异常原因的基因组dna的损伤。