一种用于检测鸡APOA1基因的引物及其检测方法和试剂盒与流程

一种用于检测鸡apoa1基因的引物及其检测方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测鸡apoa1基因的引物及其检测方法和试剂盒。


背景技术：

2.apoa1全称apolipoprotein a-i，也称为载脂蛋白a1，由apoa1基因编码，分子量在28kda左右，在肝脏合成产生，构成了机体内主要的血浆高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，hdl)组分，作为高密度脂蛋白主要结构成分(约占70％)，在将胆固醇从外周组织运至肝脏进行代谢的胆固醇逆转运过程中发挥重要作用。载脂蛋白是一类可与不溶于水的脂类结合的蛋白质，作为一种运载工具在机体循环系统和淋巴系统内不断穿梭循环，行使运输脂类物质的重要作用。此外，该蛋白在病毒感染过程中，也发挥举足轻重的作用。例如通过临床样本调查，新冠病毒感染者的血液中也检测到了显著不同于健康者的apoa1蛋白水平，而血清高密度脂蛋白和apoa1蛋白的水平过高，感染新型冠状病毒的风险性也越大。因此，该蛋白水平的变化可以作为新冠病毒感染的重要的预警信号，这些也揭示了血液中的apoa1蛋白水平可能是一种抵御病毒感染的功能蛋白，但在禽类病毒感染过程中的鸡apoa1蛋白变化情况以及是否发挥抵抗病毒感染的功能尚未可知，值得众多研究人员进一步探索。
3.实时荧光定量pcr技术于1996年由美国applied biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点。它通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，因此利用荧光pcr法检测鸡apoa1可以有效提高检测灵敏度和特异性。
4.但目前少有的文献报道的检测鸡apoa1方法较少且单一，仅有普通pcr方法，和考马斯亮蓝染色法，且检测灵敏度和特异性较低。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种用于检测鸡apoa1基因的引物及其检测方法和试剂盒，可快速检测出鸡apoa1含量，检测灵敏度高，特异性好。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种用于检测鸡apoa1基因的引物，该引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示。具体如下：
8.apoa1-f：tccttctggcagcacgatg；(seq id no.1)
9.apoa1-r：ccacagcagaggactcgaac。(seq id no.2)
10.进一步地，引物序列为与鸡apoa1基因中的序列互补的序列。
11.一种检测鸡apoa1基因的方法，以样品dna为模板，采用上述引物进行pcr扩增，扩
增产物经酶切电泳判定结果。
12.进一步地，pcr反应体系包括2
×
pro taqhs probe premix 12.5μl、10pmol/μl的上、下游引物各1μl、模板dna 2μl，最后用无菌水加至25μl。
13.进一步地，pcr程序为：55℃15min；95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；后两步进行39个循环。
14.一种检测鸡apoa1基因的试剂盒，包括上述引物。
15.进一步地，试剂盒中还包括用于pcr反应的一种或多种酶/试剂，以及任选的其他成分及用具。
16.本发明的有益效果：
17.本发明设计的引物序列和相应的pcr检测方法能够快速的检测出鸡apoa1含量，检测灵敏度高，特异性好。还能根据鸡apoa1含量来调整评价相应的日粮的能量和蛋白含量。
附图说明
18.图1为基因检测图谱；
19.图2为pcr电泳检测结果；
20.图3为荧光检测结果。
具体实施方式
21.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
22.实施例1鸡apoa1基因检测
23.1、材料
24.鸡apoa1基因由擎科生物技术有限公司合成，病毒基因组dna提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公；2
×
taq pcr master mix、dl2000 dna marker等购自宝生物工程(大连)有限公司。
25.2、检测方法
26.(1)设计引物
27.据ncbi参考核苷酸序列鸡apoa1(genbank登录号:nm_205525.4)，使用primer-blast在线设计针对apoa1基因特异性引物，引物由上海生工生物工程技术公司合成。目的片段基因长度127bp，位于apoa1chicken第143-169位核苷酸。引物详细信息如下表所示。
28.表1 apoa1引物
[0029][0030]
(2)提取待测样本基因
[0031]
取对照组(适量健康spf鸡)和试验组(感染病毒鸡)的组织经液氮研磨成细粉，加
入适量生理盐水，研磨均匀后(呈组织匀浆状)3000r/min离心3min，取上清液200μl于干净离心管中，然后使用rna提取试剂盒提取核酸。
[0032]
(3)pcr检测
[0033]
采用25μl反应体系，以相同浓度2μl合成基因为模板，荧光定量pcr反应体系总体积为25μl，其中包括：
[0034]2×
pro taqhs probe premix 12.5μl、上、下游引物(10pmol/μl)各1μl、模板dna2μl，最后用无菌水加至25μl。
[0035]
bio-rad cfx connect荧光定量pcr仪扩增程序如下：55℃15min；95℃30s；95℃10s；60℃30s；后两步进行39个循环。
[0036]
管家基因(actin)与目的基因均需要设置是3个平行重复。
[0037]
3、检测结果
[0038]
(1)先观察三个重复试验ct值差异是否较大(一般不会超过0.5)，再分别计算三个平行重复的ct值的平均值；
[0039]
(2)目的基因的均值减去管家基因的均值，即得到了
△
ct值；
[0040]
(3)计算对照组两个
△
值的均值，记为a；
[0041]
(4)用试验组和对照组的四个
△
值分别减去a，即得到了
△△
ct值。
[0042]
(5)计算2
‑△△
ct，即可以利用graphpad prism软件对计算结果进行显著性分析，结果见图1。
[0043]
实施例2重复性检验
[0044]
以合成的基因作为检测模板，在相同条件下，对对照组和试验组的核酸进行相对定量pcr扩增，每个核酸各设置3个平行重复试验，结果见图2、图3和表2。
[0045]
图2中，m1：600bp从下到上依次为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；m2：2000bp从下到上依次为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp；n：阴性对照；p：阳性对照；s：检测样品。
[0046]
表2 检测结果
[0047]
检测样品名称阳性对照样品1样品2样品3样品4样品5样品6检测结果ct值19.9726.8730.09nnnn
[0048]
表2中样品1和样品2为apoa1检测样品；样品3至样品6为验证特异性样品。
[0049]
根据图2、图3和表2的检测结果可知，在对样品进行多次重复性试验时，检测结果并无显著差异，可见，本技术方案具有良好的重复性。