酶和金属-有机框架(MOF)

酶和金属-有机框架(mof)
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年1月27日提交的美国临时专利申请no.62/966335的权益，其全部公开内容在此通过引用并入用于任何和所有目的。
3.领域
4.本技术通常涉及酶和金属-有机框架及其制备和使用方法。
5.背景
6.对于有用的酶，酶必须保持其功能和性能。然而，许多酶应用超出了正常的可能性，并导致酶变性，使得活性位点中的氨基酸残基与它们的协同功能相距过远并导致性能损失。例如，在非生理ph值或升高的温度条件下以及在有机溶剂或表面活性剂存在下发生酶变性。需要在不相容的变性条件下实现酶稳定性的技术和方法。
7.概述
8.在一个方面中，本技术提供了一种组合物，其包含限定内部体积的框架、布置在内部体积内的酶，以及表面活性剂。在任何实施方案中，所述框架限定了孔隙空间。在任何实施方案中，所述酶可以是水解酶(例如，肽酶、脂肪酶和/或葡糖苷酶)。在任何实施方案中，所述组合物可包含大于0ppm至约1500ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可具有中性至碱性的ph值。在任何实施方案中，mof可包括zif-8、mof-74、mil-53、maf-7、zif-90，或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述组合物可为洗衣清洁组合物、洗碗清洁组合物、硬表面清洁组合物、个人护理清洁组合物，或其两种或更多种的组合。
9.在另一方面中，本技术提供了一种制备所述组合物的方法，包括制备所述组合物。
10.在另一方面中，本技术提供了一种使用所述组合物的方法。
11.附图简述
12.图1是根据实施例的从mof前体和酶开始制备mof的合成方案，所述mof包括限定内部体积的框架和布置在内部体积内的酶。
13.图2是根据实施例的具有孔隙空间(即，框架平面内的空间)和外部空间(即，mof外的空间)的没有布置酶的mof的示意图。
14.图3是示意根据实施例的在存在表面活性剂混合物的情况下在水中在37℃下储存的酶活性的图。
15.图4是示意根据实施例在蛋白酶存在下在22℃下在水中储存的酶活性的图。
16.详细描述
17.下文描述了各种实施方案。应指出的是，具体实施方案并非旨在作为详尽的描述或作为对本文讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施方案描述的一个方面并不必然限于该实施方案并且可与任何其他实施方案一起实施。
18.如本文所用，“约”将被本领域技术人员理解并且将在一定程度上根据使用它的上下文而变化。如果使用本领域技术人员不清楚的术语，考虑到使用它的上下文，“约”将意味着至多为该特定术语的正负10％。
19.在描述要素的上下文中(尤其是在随后权利要求的上下文中)使用术语“一个”和“一种”和“所述”以及类似的指称将被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非本文另有说明，否则本文对值范围的引用仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的值如同在本文中单独提及那样并入说明书中。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)仅旨在更好地阐明实施方案，而非对权利要求的范围施加限制，除非另有说明。说明书中没有语言应被解释为表明任何未要求保护的要素是必要的。
20.如本文所用，“金属-有机框架”或“mof”是指一类具有与有机配体配位的金属离子或簇以形成三维结构的化合物。mof是配位聚合物的一个子类，特殊的特点是它们通常是多孔的，具有内部体积。
21.如本文所用，“zif-8”应被本领域技术人员理解为指衍生自2-甲基咪唑和金属盐的金属-有机框架。例如，zif-8描述于lee等，chem.eng.j.2015，271，272-280中，其通过引用并入本文。
22.如本文所用，“mof-74”应被本领域技术人员理解为指衍生自2,5-二羟基对苯二甲酸和金属盐的金属-有机框架。例如，mof-74描述于rosi等，j.am.chem.soc.，2005，127，1504-1518中，其通过引用并入本文。
23.如本文所用，“mil-53”应被本领域技术人员理解为指衍生自对苯二甲酸和金属盐的金属-有机框架。例如，mil-53描述于pu等，appl.catal.，a，2018，549，82-92和loiseau等，chem.eur.j.2004，10(6)，1373-1382中，其通过引用并入本文。
24.如本文所用，“maf-7”应被本领域技术人员理解为指衍生自3-甲基-1,2,4-三唑和金属盐的金属-有机框架。例如，maf-7描述于zhang等，adv.mater.2011，23，126-1271中，其通过引用并入本文。
25.如本文所用，“zif-90”应被本领域技术人员理解为指衍生自咪唑-2-甲醛和金属盐的金属-有机框架。例如，zif-90描述于morris等，j.am.chem.soc.2008，130，12626-12627中，其通过引用并入本文。
26.此外，zif-8、mof-74、mil-53、maf-7和zif-90还描述于yaghi等，introduction to reticular chemistry：metal-organic frameworks and covalent organic frameworks；wiley-vch：weinheim，2019中，其通过引用并入本文。
27.如本文所用，“布置的”是指酶不能自由移动到内部体积之外。术语“布置的”可以容易地与术语“包封的”、“包裹的”或“包埋的”互换。在任何实施方案中，至少一部分酶布置在内部体积内。在任何实施方案中，至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的酶布置在内部体积内。在任何实施方案中，mof可有助于酶维持其四级和/或三级结构。在任何实施方案中，mof可有助于酶维持其功能和性能。
28.在一个方面中，本技术提供了一种组合物，其包含mof，所述mof包括限定内部体积的框架、布置在内部体积内的酶，以及表面活性剂。在任何实施方案中，mof由包含反应以形成框架的有机化合物和金属盐的前体构建。通常，mof是结晶的。在本技术中，mof在酶的存在下形成，使得框架的形成将酶布置在内部体积内，如图1所示。在任何实施方案中，酶和mof不是共价键合的。
29.内部体积由框架限定。例如，如图2所示，框架具有内部体积(即，框架内的空间)。
在任何实施方案中，mof包括由框架限定的平面。在任何实施方案中，平面将内部体积与围绕mof的外部空间分开，其中平面由框架的顶点和边缘限定。在任何实施方案中，内部体积被框架围绕，并且平面由框架限定。在任何实施方案中，框架限定平面内的孔隙空间。孔隙允许组分进出通过mof的内部体积。在任何实施方案中，孔具有不允许酶从内部体积逸出的尺寸。在任何实施方案中，孔的尺寸可以允许分子量比酶小的化合物从外部空间进入内部体积。在任何实施方案中，孔的尺寸可以允许分子量比酶小的化合物离开内部体积并进入外部空间。在任何实施方案中，所述化合物可具有比酶小至少约25％，比酶小至少约30％，比酶小至少约40％，比酶小至少约50％，比酶小至少约60％，比酶小至少约70％，比酶小至少约75％，比酶小至少约80％，比酶小至少约85％，比酶小至少约90％，或比酶小至少约95％的分子量。在任何实施方案中，孔的尺寸可以防止分子量等于或大于酶的化合物从外部空间进入内部体积。在任何实施方案中，孔的尺寸可以防止分子量为酶的至少75％的化合物从外部空间进入内部体积。在任何实施方案中，孔的尺寸可以防止酶(例如，蛋白酶)从外部空间进入内部体积。在任何实施方案中，孔的尺寸可以防止其他大分子例如聚合物(例如，聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚糖及其共聚物及其两种或更多种的组合)从外部空间进入内部体积。
30.在任何实施方案中，酶可以是水解酶。酶的非限制性实例包括肽酶、脂肪酶、葡糖苷酶或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述组合物可包含大于0ppm至约1500ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约40-约200ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约40-约200ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约40-约100ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约500-约900ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约700-约900ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约800-约900ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约300-约600ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约400-约500ppm的酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约40-约200ppm、约40-约100ppm或约40-约70ppm的脂肪酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约500-约900ppm、约700-约900ppm或约800-约900ppm的肽酶。在任何实施方案中，所述组合物可包含约50-约500ppm、约100-约250ppm或约150-约250ppm的葡糖苷酶。
31.在任何实施方案中，mof包括反应的mof前体。在任何实施方案中，mof前体包括有机化合物和金属盐。
32.在任何实施方案中，所述有机化合物包括具有咪唑基团、三唑基团、至少两个羧酸基团或其两种或更多种的组合的化合物。在任何实施方案中，所述有机化合物包括2-甲基咪唑、3-甲基-1,2,4-三唑、任选被一个或多个羟基或多个氨基取代的对苯二甲酸或其组合。在任何实施方案中，所述有机化合物可包括2-甲基咪唑、咪唑酯-2-甲醛或其组合。在任何实施方案中，所述有机化合物可包括对苯二甲酸、2,5-二羟基对苯二甲酸或其组合。在任何实施方案中，所述有机化合物可包括3-甲基-1,2,4-三唑。
33.在任何实施方案中，所述金属盐可包含zn、al、co、fe、sc、ca、mg、mn、li、ni、cu、zr或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述金属盐可包含zn、al、fe、mg或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述金属盐可包含zn、al或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述金属盐可包括zn(no3)2、zn(oac)2、al(no)3，或本领域技术人员已知用于合成mof的任何其他金属盐。在任何实施方案中，所述金属盐可包含三价和/或二价金
属。在任何实施方案中，所述金属盐可包含三价金属。在任何实施方案中，所述金属盐可包含三价铝。
34.在任何实施方案中，mof可包括zif-8、mof-74、mil-53、maf-7、zif-90或其两种或更多种的组合。
35.在任何实施方案中，所述表面活性剂可包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或其两种或更多种的组合。
36.在任何实施方案中，所述表面活性剂可包括非离子表面活性剂。非离子表面活性剂可包括烷基烷氧基化醇(例如，具有1-50的平均烷氧基化度的c
8-c
18
烷基烷氧基化醇)、醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(pfa)、烷氧基化脂肪酸烷基酯(例如，乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多苷(apg)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(efam)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(pfam)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、葡糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(例如葡糖酰胺，ga，或脂肪酸葡糖酰胺，faga)，以商品名span和tween获得的产品，或其两种或多种的组合。
37.在任何实施方案中，所述表面活性剂可包括阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂可包括硫酸盐、磺酸盐或其组合。在任何实施方案中，磺酸盐可包括链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、烷基硫酸盐(as)或其组合。在任何实施方案中，as包括但不限于十二烷基硫酸钠(sds)、脂肪醇硫酸盐(fas)、伯醇硫酸盐(pas)、醇醚硫酸盐(aes，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，硫酸盐包括醇醚硫酸盐(aes)。在任何实施方案中，磺酸盐可包括直链烷基苯磺酸盐(las)、las的异构体、支化烷基苯磺酸盐(babs)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(aos)、烯烃磺酸盐、链烯磺酸盐、羟基链烷磺酸盐和二磺酸盐、仲烷磺酸盐(sas)、石蜡磺酸盐(ps)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses包括磺酸甲酯(mes))、烷基-或链烯基琥珀酸、十二碳烯基/十四碳烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸的二酯或单酯或皂，或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，磺酸盐可包括烷基苯磺酸盐(las)。
38.在任何实施方案中，所述表面活性剂可包括阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可包括烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基叔锍化合物或两种或更多种的组合。在任何实施方案中，烷基季铵化合物可具有通式(r)(r1)(r2)(r3)n

x-，其中r为直链或支化的取代或未取代的c
6-c
18
烷基或链烯基结构部分，r1和r2独立地选自甲基或乙基结构部分，r3为羟基、羟甲基或羟乙基结构部分，x为提供电荷中性的阴离子，合适的阴离子包括：卤离子，例如氯离子；硫酸根；和磺酸根。在任何实施方案中，阳离子表面活性剂可包括单-c
6-c
18
烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物。在任何实施方案中，阳离子表面活性剂可包括单-c
8-c
10
烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物、单-c
10-c
12
烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物和单-c
10
烷基单羟乙基二甲基季铵氯化物。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇胺季铵化物(admeaq)、鲸蜡基三甲基溴化铵(ctab)、二甲基二硬脂基氯化铵(dsdmac)和烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(aqa)化合物、酯季铵化物(季铵)及其两种或多种的组合。
39.在任何实施方案中，所述表面活性剂可包括两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂可包括氧化胺、甜菜碱类(例如，烷基二甲基甜菜碱和磺基甜菜碱)或其两种或更多
种的组合。
40.在任何实施方案中，所述组合物可包含约10-约98重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约50-约98重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约70-约98重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约10-约40重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约20-约30重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约12-约30重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约15-约25重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约20-约40重量％的表面活性剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约25-约35重量％的表面活性剂。
41.在任何实施方案中，所述组合物可具有中性至碱性的ph(例如约7或更高的ph)。在任何实施方案中，所述组合物可具有约7-约11的ph。在任何实施方案中，所述组合物可具有约7-约10的ph。在任何实施方案中，所述组合物可具有约7-约9的ph。在任何实施方案中，所述组合物可具有约7-约8的ph。
42.在任何实施方案中，所述组合物可配制成规则的、致密的或浓缩的液体；凝胶；糊剂；皂条；规则的或致密的粉末；粒状固体；均质或具有两个或更多个层(相同或不同相)的多层片剂；具有一个或多个隔室的小袋；单隔室或多隔室单位剂型；或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述组合物可呈固体形式。通常，固体形式可包含少于约10重量％的溶剂(例如，少于约5重量％、少于约2重量％、少于约1重量％或少于约0.5重量％)。在任何实施方案中，所述组合物可呈半固体(例如凝胶和/或糊剂)或液体形式。通常，半固体或液体形式可包含溶剂。在任何实施方案中，所述组合物可以是浓缩半固体组合物或浓缩液体组合物。
43.在任何实施方案中，溶剂可包括有机溶剂、水或其组合。有机溶剂包括但不限于c
1-c6醇，例如丙醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、己二醇和/或丁二醇。在任何实施方案中，溶剂可包括水。在任何实施方案中，所述组合物可包含至少约10重量％、至少约20重量％、至少约30重量％，至少约40重量％、至少约50重量％或至少约60重量％的溶剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约15-约75重量％的溶剂、约15-约70重量％的溶剂、约15-约60重量％的溶剂，或约15-约50重量％的溶剂。在任何实施方案中，所述组合物可包含约50-约95重量％的溶剂、约60-约90重量％的溶剂、约60-约80重量％的溶剂，或约60-约70重量％的溶剂。
44.在任何实施方案中，所述组合物可以是洗衣清洁组合物、洗碗清洁组合物、硬表面清洁组合物、个人护理清洁组合物或其两种或更多种的组合。在任何实施方案中，所述组合物可进一步包含一种或多种通常存在于洗碗清洁、硬表面清洁和/或个人护理清洁组合物中的组分。例如，所述组合物可以进一步包含通常包含在洗涤剂组合物中的荧光增白剂、聚丙烯酸酯、有机聚羧酸、螯合剂、电解质、染料、香料、抗再沉积剂、防腐剂、加工助剂、填料、漂白剂等。
45.在任何实施方案中，所述酶在升高的温度下储存至少28天显示出至少90％的残余活性。在任何实施方案中，升高的温度可为约30℃-约65℃、约30℃-约55℃，或约30℃-约45℃。
46.在另一方面中，本技术提供了一种制备mof的方法。在任何实施方案中，所述方法
可以通过共沉淀法进行。在任何实施方案中，共沉淀包括在水中沉淀。在任何实施方案中，可将本文提供的mof前体添加到包含酶的含水组合物中以提供含水混合物。在任何实施方案中，mof前体的添加可在连续搅拌下添加。在任何实施方案中，mof前体的添加可顺序添加。在任何实施方案中，可将含水混合物搅拌约2-约48小时(例如，约5-约36小时或约20-约28小时)。在任何实施方案中，在搅拌后，可将含水混合物离心。
47.在另一方面中，本技术提供了一种制备本文提供的组合物的方法。在任何实施方案中，可将布置有酶的mof添加到包含表面活性剂的容器中。
48.在另一方面中，本技术提供了一种使用本文提供的组合物的方法。在任何实施方案中，所述组合物可根据任何使用洗衣清洁组合物、洗碗清洁组合物、硬表面清洁组合物和/或个人护理清洁的常规方法使用。
49.如此一般性描述的本发明将通过参考以下实施例更容易地理解，所述实施例以说明的方式提供并且不旨在限制本发明。
实施例
50.脂肪酶购自sigma-aldrich(l0777)并用水稀释以提供酶浓度为5mg/ml的脂肪酶储备溶液。
51.使用bca测定法通过测量上清液中的酶含量来计算包封率。具体地，包封在mof中的酶作为起始酶量与上清液中的量之差测定。
52.实施例1.具有包封的脂肪酶的zif-8
53.在连续搅拌下将脂肪酶储备溶液加入到包含水的容器中，然后加入2-甲基咪唑(2m)和无水乙酸锌(0.4m)。溶液的最终浓度为0.25和0.125mg/ml脂肪酶、25-800mm 2-甲基咪唑和0.625-30mm二水乙酸锌。在室温下继续搅拌另外24小时。将溶液在6700x g下离心5分钟，随后移除上清液。上清液用于bca测定法。将再分散的粒料用水洗涤3次，然后类似地使用脂肪酶特异性测定法测定粒料和上清液的酶活性。包封的脂肪酶的活性为49％。
54.实施例2.具有包封的脂肪酶的mof-74
55.在连续搅拌下将脂肪酶储备溶液加入到包含水的容器中，然后加入2,5-二羟基对苯二甲酸(0.3m)和无水乙酸锌(0.4m)。溶液的最终浓度为0.25和0.125mg/ml脂肪酶、3-25mm 2,5-二羟基对苯二甲酸和7-58.6mm无水乙酸锌。在室温下继续搅拌另外24小时。将溶液在6700x g下离心5分钟，随后移除上清液。上清液用于bca测定法。将再分散的粒料用水洗涤3次，然后类似地使用脂肪酶特异性测定法测定粒料和上清液的酶活性。包封的脂肪酶的活性为33％。
56.实施例3.具有包封的脂肪酶的mil-53
57.在连续搅拌下将脂肪酶储备溶液加入到包含水的容器中，然后加入对苯二甲酸(0.1m)和九水合硝酸铝(1.3m)。溶液的最终浓度为0.25和0.125mg/ml脂肪酶、9-44mm对苯二甲酸和17-67mm九水合硝酸铝。在室温下继续搅拌另外24小时。将溶液在6700x g下离心5分钟，随后移除上清液。上清液用于bca测定法。将再分散的粒料用水洗涤3次，然后类似地使用脂肪酶特异性测定法测定粒料和上清液的酶活性。包封的脂肪酶的活性为75％。
58.实施例4.储存测试
59.测试1：用表面活性剂
60.制备包含蛋白酶和(a)脂肪酶(未包封/纯脂肪酶)、(b)实施例1、(c)实施例2和(d)实施例3的水基测试溶液。将各测试溶液分成两半。向一半的测试溶液中加入表面活性剂混合物。在加入表面活性剂混合物后开始测量脂肪酶活性。此外，在4小时、1天、2天、7天、14天、21天和28天时测量活性。所有溶液的终浓度为0.05mg/ml脂肪酶、0.9mg/ml蛋白酶和20％表面活性剂(如果存在)，并保持在22℃或37℃的温度下。
61.图3示意了在37℃的水中，在28天期间内，未包封/纯脂肪酶的脂肪酶活性降低。到第14天，未包封的脂肪酶活性为零。相反，实施例3的mof在37℃的水中在28天期间内保持至少约60％的脂肪酶活性。不希望受理论束缚，据信实施例3的mof由于高离子强度组合物如表面活性剂混合物中的三价铝而提供了增强的稳定性。相比之下，实施例1和2的mof包含二价锌，这对mof来说是一个挑战，并且可能导致它们解构。在低离子强度组合物如水溶液中，二价mof是稳定的，可以保护脂肪酶免于被蛋白酶降解。
62.测试2：无表面活性剂
63.制备包含蛋白酶和(a)脂肪酶(未包封/纯脂肪酶)、(b)实施例1、(c)实施例2和(d)实施例3的水基溶液。所有溶液的浓度为0.05mg/ml脂肪酶和0.9mg/ml蛋白酶并保持在22℃的温度下。在将蛋白酶添加到脂肪酶溶液后开始测量脂肪酶活性。此外，在4小时、1天、2天、7天、14天、21天和28天时测量活性。
64.图4示意了在22℃的水中，在28天期间内，未包封脂肪酶的脂肪酶活性迅速下降。到第7天，未包封的脂肪酶失活。相反，当脂肪酶包封在mof中时(即实施例1、2和3)，在22℃的水中，在28天的期间内，保持至少20％的脂肪酶活性。到第7天，mof包封的脂肪酶活性为约50％(实施例2)至约90％(实施例3)。不希望受理论束缚，据信未包封的脂肪酶由于蛋白酶的蛋白水解降解而变得无活性，并且mof阻止蛋白酶接近脂肪酶。
65.尽管已经示意和描述了某些实施例，但是应当理解，可以根据本领域的普通技术在其中做出改变和修改，而不背离所附权利要求所限定的更广泛方面的技术。
66.此处示例性描述的实施例可以在缺少此处未具体公开的任何一个要素或多个要素、一个限制条件或多个限制条件下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地理解而不受限制。此外，此处使用的术语和表述已被用作描述性术语而不是限制性术语，并且在使用该类术语和表述时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到在要求保护的技术范围内可以进行各种修改。此外，短语“基本上由
……
组成”将被理解为包括那些具体列举的要素和那些不实质影响要求保护的技术的基本和新颖特征的那些附加要素。短语“由
……
组成”不包括任何未指定的要素。
67.本公开不受本技术中描述的特定实施例的限制。可以做出许多修改和变化而不背离其精神和范围，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，在本公开范围内的功能等效的方法和组合物对于本领域技术人员而言从前面的描述将是显而易见的。该修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所享有的等同方案的全部范围的限制。应当理解，本公开不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，此处使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。
68.此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组来描述。
69.如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述并且能够将相同的范围分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围都可以很容易地分解为小的三分之一、中间的三分之一和大的三分之一等。本领域技术人员也将理解，所有语言，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所引用的数字并指代可以随后分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，一个范围包括每个单独的成员。
70.本说明书中提及的所有出版物、专利申请、已发布的专利和其他文件通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请、已发布的专利或其他文件被具体且单独地指示通过引用整体并入一样。以引用方式并入的文本中包含的定义在与本公开中的定义相抵触的程度上被排除在外。
71.其他实例在以下权利要求中阐述。