用于加工多核苷酸的方法和系统1.本技术是申请日为2017年12月22日、申请号为201780084495.2、发明名称为“用于加工多核苷酸的方法和系统”的中国专利申请(其对应pct申请的申请日为2017年12月22日、申请号为pct/us2017/068320)的分案申请。2.交叉引用3.本技术要求2016年12月22日提交的美国临时专利申请号62/438,341的优先权，并且还要求2017年9月29日提交的美国专利申请15/720,085的优先权。上述申请各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
背景技术：
：：4.在分析和表征生物和生物化学材料和系统方面的重大进展已经带来在了解生命、健康、疾病和治疗的机制方面的前所未有的进展。在这些进展中，以生物系统的基因组组成为目标和特征的技术已经产生了一些最具开创性的结果，包括使用和利用基因扩增技术以及核酸测序技术的进展。5.核酸测序可用于获得包括诊断学、预后、生物技术和法医生物学在内的各种生物医学背景中的信息。测序可涉及基本方法，包括maxam‑gilbert测序和链终止方法，或从头测序方法(包括鸟枪测序和桥式pcr)，或下一代方法(包括聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、illumina测序、solid测序、iontorrent半导体测序、heliscope单分子测序、测序等)。核酸测序技术(包括下一代dna测序)已经用于细胞群体的基因组和蛋白质组学分析。技术实现要素：6.本文认识到对用于分析来自单独细胞或细胞小群体的基因组和蛋白质组学信息的方法、组合物和系统的需要。此类细胞包括但不限于癌细胞、胎儿细胞和参与免疫应答的免疫细胞。本文提供了用于分析单独细胞或细胞小群体的方法、组合物和系统，包括来自这些单独细胞或细胞群体的核酸和蛋白质的分析以及核酸和蛋白质归属于这些单独细胞或细胞群体。7.在一个方面，本公开提供了一种表征细胞的方法。所述方法包括(a)提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，其中所述至少一种标记剂(i)能够结合至所述细胞的细胞表面特征并且(ii)偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定所述至少一种标记剂，其中所述分区包含能够与所述报告寡核苷酸条形码相互作用的锚寡核苷酸；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子；以及(c)对所述核酸分子进行测序以鉴定所述标记剂或所述细胞。8.在一些实施方案中，在(a)中，所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征。在一些实施方案中，在(a)之前，使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，当所述细胞和所述至少一种标记剂不含所述分区时，进行使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，在(a)之前，将所述至少一种标记剂偶联至所述报告寡核苷酸。9.在一些实施方案中，在(b)中，使所述报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生所述核酸分子。在一些实施方案中，所述引物延伸反应包括使所述报告寡核苷酸经受适于使所述锚寡核苷酸与所述报告寡核苷酸杂交并使用所述报告寡核苷酸作为模板延伸所述锚寡核苷酸的条件。10.在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒。在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒，并且所述方法还包括在所述合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。在一些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述释放包括使所述珠粒经受使所述珠粒降解的刺激。在一些实施方案中，所述刺激是化学刺激。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝。11.在一些实施方案中，在(c)之前，所述核酸分子从所述分区释放。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述至少一种标记剂。在一些实施方案中，(c)包括从鉴定所述至少一种标记剂鉴定所述细胞表面特征。在一些实施方案中，(c)包括确定所述细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述细胞。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述至少一种标记剂和所述细胞。12.在一些实施方案中，所述报告寡核苷酸包含独特分子标识(umi)序列。在一些实施方案中，所述umi序列允许鉴定所述细胞。在一些实施方案中，(c)包括确定所述umi序列的序列并鉴定所述细胞。13.在一些实施方案中，所述分区是乳液中的微滴。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂选自由以下组成的组：抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。在一些实施方案中，所述分区仅包含一个细胞。14.在一些实施方案中，所述细胞结合至所述至少一种标记剂中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种相同的标记剂。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约5种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约10种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约50种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约100种不同的标记剂。在一些实施方案中，(c)包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。15.在一些实施方案中，所述方法还包括(i)从所述细胞释放核酸和(ii)对所述核酸或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，所述核酸从所述细胞释放到所述分区中。16.在一个方面，本公开提供了一种用于表征细胞的系统。所述系统包括电子显示屏，所述电子显示屏包括用户界面，所述用户界面显示用户可访问的图形元素以执行用于表征所述细胞的方案；以及计算机处理器，所述计算机处理器耦接至所述电子显示屏并被编程为在所述用户选择图形元素时执行所述方案，所述方案包括：(a)提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，其中所述至少一种标记剂(i)能够结合至所述细胞的细胞表面特征并且(ii)偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定所述至少一种标记剂，其中所述分区包含能够与所述报告寡核苷酸条形码相互作用的锚寡核苷酸；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子；以及(c)对所述核酸分子进行测序以鉴定所述标记剂或所述细胞。17.在一些实施方案中，在方案(a)中，所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征。在一些实施方案中，在方案(a)之前，使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，当所述细胞和所述至少一种标记剂不含所述分区时，进行使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，在方案(a)之前，将所述至少一种标记剂偶联至所述报告寡核苷酸。18.在一些实施方案中，在方案(b)中，使所述报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生所述核酸分子。在一些实施方案中，所述引物延伸反应包括使所述报告寡核苷酸经受适于使所述锚寡核苷酸与所述报告寡核苷酸杂交并使用所述报告寡核苷酸作为模板延伸所述锚寡核苷酸的条件。19.在一些实施方案中，在方案(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒。在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒，并且所述方法还包括在所述合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。在一些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述释放包括使所述珠粒经受使所述珠粒降解的刺激。在一些实施方案中，所述刺激是化学刺激。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝。20.在一些实施方案中，在方案(c)之前，所述核酸分子从所述分区释放。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述至少一种标记剂。在一些实施方案中，方案(c)包括从鉴定所述至少一种标记剂鉴定所述细胞表面特征。在一些实施方案中，方案(c)包括确定所述细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述细胞。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述至少一种标记剂和所述细胞。21.在一些实施方案中，所述报告寡核苷酸包含独特分子标识(umi)序列。在一些实施方案中，所述umi序列允许鉴定所述细胞。在一些实施方案中，方案(c)包括确定所述umi序列的序列并鉴定所述细胞。22.在一些实施方案中，所述分区是乳液中的微滴。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂选自由以下组成的组：抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。在一些实施方案中，所述分区仅包含一个细胞。23.在一些实施方案中，所述细胞结合至所述至少一种标记剂中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种相同的标记剂。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约5种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约10种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约50种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约100种不同的标记剂。在一些实施方案中，方案(c)包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。24.在一些实施方案中，方案还包括(i)从所述细胞释放核酸和(ii)对所述核酸或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，所述核酸从所述细胞释放到所述分区中。25.本公开的另一方面提供了一种用于分析物表征的方法。所述方法包括：(a)提供多个分区，其中所述多个分区中的给定分区包括多个条形码分子和多种分析物。在一些情况下，所述多个条形码分子包括至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列，并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述方法还包括(b)在所述给定分区中，(i)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(ii)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子。26.在一些实施方案中，所述方法还包括对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子的衍生物进行测序以表征所述第一分析物和/或所述第二分析物。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述测序基于所述第一分析物或所述第二分析物的表征重复(a)‑(c)。在一些实施方案中，所述方法还包括基于在重复(a)‑(c)时从测序或随后测序获得的第一分析物或第二分析物的表征来选择所述第一分析物或所述第二分析物。27.在一些实施方案中，(b)还包括：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。28.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或信使rna(mrna)。29.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体、抗体片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述给定分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述给定分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。30.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。31.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是信使核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述标记剂杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原或蛋白质。32.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸分子是信使核糖核酸。在一些实施方案中，所述核酸分子是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。33.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。34.在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)之后，从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码。在一些实施方案中，所述给定分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。35.在一些实施方案中，所选择的给定分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述第一核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。在一些实施方案中，所述方法还包括在从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之后进行一个或多个反应。36.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的组合物。所述组合物包含分区，所述分区包含多个条形码分子和多种分析物。所述多个条形码分子可包含至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。37.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或是信使rna(mrna)。38.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。39.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。40.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与偶联至所述标记剂的第三核酸分子杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。41.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸序列是核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含核酸序列，所述核酸序列是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。42.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述给定分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。在一些实施方案中，所述给定分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述第一核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。43.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的系统。所述系统包括用于提供包含多个条形码分子和所述多种分析物的分区的分配单元，其中：(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子包含第一核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第一分析物；并且(ii)所述多个条形码分子的第二单个条形码分子包含第二核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第二分析物，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述系统还包括耦接至所述分配单元的控制器，其中所述控制器被编程为(i)指导所述分配单元提供所述分区；(ii)使所述分区经受足以以下的条件：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子；以及(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或其衍生物的测序表征所述第一分析物或所述第二分析物。44.在一些实施方案中，所述分配单元包括多个通道。在一些实施方案中，所述分配单元还包括至少一个通道接点，其中所述至少一个通道接点被配置为提供所述分区。在一些实施方案中，所述系统还包括(i)第一通道，所述第一通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供第一流体；(ii)和第二通道，所述第二通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供与所述第一流体不混溶的第二流体。45.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或信使rna(mrna)。46.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。47.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。48.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与偶联至所述标记剂的第三核酸分子杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。49.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸序列是信使核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。50.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。51.在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。在一些实施方案中，所述分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。在一些实施方案中，所述分区包含至少1,000个条形码分子。52.本公开的额外方面和优点从以下详细说明变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的说明性实施方案。应当认识到，本公开能够具有其它以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种不同方面做出修改，所有均不脱离公开内容。因此，附图和说明书本质上被认为是说明性的而不是限制性的。53.通过引用结合54.本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请在此通过引用结合，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用结合的相同的程度。附图说明55.本发明的新颖特征在附属权利要求中具体阐述。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也为“图(figure)”和“图(fig.)”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，其中：56.图1示意性地示出用于分配单独细胞或细胞小群组的微流体通道结构；57.图2示意性地示出用于共分配细胞和包含另外试剂的微胶囊(例如珠粒)的微流体通道结构；58.图3a‑图3f示意性地示出用于扩增和条形编码(barcoding)细胞的核酸的示例性过程；59.图4提供在将序列数据归属于单独细胞或细胞群组以用于其表征中使用细胞核酸的条形编码的示意图；60.图5提供与标记的细胞结合配体缔合的细胞的示意图；61.图6提供使用本文所述的方法用于进行rna分析的示例性工作流程的示意图；62.图7提供使用本文所述的方法用于分析核糖核酸(rna)的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；63.图8提供与单独携带条形码的珠粒一起共分配的单独细胞的图像；64.图9a‑图9e提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和用于进行rna分析的示例性操作；65.图10提供用于rna的示例性分析的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和使用序列用于体外转录；66.图11提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和用于进行rna分析的示例性操作；67.图12a‑图12b提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；68.图13a‑图13c提供分区中来自模板转换逆转录和pcr的示例性产率的说明；69.图14a‑图14b提供具有不同细胞数量的分区中来自逆转录和cdna扩增的示例性产率的说明；70.图15提供在不同输入细胞浓度下来自cdna合成和实时定量pcr的示例性产率的说明，以及在固定细胞输入浓度下改变引物浓度对产率的影响；71.图16提供来自体外转录的示例性产率的说明；72.图17示出被编程或以其它方式配置来实现本文提供的方法的示例性计算机控制系统；73.图18提供示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；74.图19示出用于进行rna分析的示例性操作；75.图20示出根据实施方案的用于表征细胞的方法；76.图21示出具有可防止被聚合酶延伸的修饰的寡核苷酸；77.图22示出包含u切除元件的寡核苷酸；78.图23a示出与包含靶特异性引物的寡核苷酸和具有聚‑t引物的寡核苷酸偶联的珠粒；图23b示出与多种寡核苷酸偶联的珠粒，所述寡核苷酸各自包含靶特异性引物；图23c示出与多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含聚‑t引物)偶联的珠粒；79.图24示出与多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含用于总rna的随机n‑聚体引物)偶联的珠粒；80.图25a‑图25c示出包含衔接子和测定引物的示例性寡核苷酸；81.图26示出具有包含转换寡核苷酸的衔接子的寡核苷酸；82.图27a示出具有包含p7和r2序列的主链和聚‑t引物的寡核苷酸；图27b示出具有包含r1序列的主链和聚‑t引物的y寡核苷酸；图27c示出具有p5、r1和r2序列和聚‑t引物的寡核苷酸；图27d示出具有r1序列和随机n‑聚体引物的寡核苷酸；83.图28示出使用抗体结合蛋白用于在抗体上缀合dna条形码的工作流程；84.图29示出在制备具有磁性颗粒的凝胶珠粒的过程中的溶胀条件和消溶胀条件；85.图30示出包含支架和紧紧围绕支架的液体的单位细胞；86.图31示出包埋有带条形码磁性颗粒的微胶囊；87.图32示出用于对细胞中的dna分子和rna分子进行平行测序的方法；88.图33示出用于制备抗体‑报告寡核苷酸缀合物的各种方法；89.图34示出抗体‑报告寡核苷酸缀合；90.图35a‑图35c示出用于分析来自单细胞的mrna分子和蛋白质的方法；91.图36a示出凝胶珠粒的直径与所述凝胶珠粒内部的试剂之间的关系；图36b示出凝胶珠粒的直径与具有多于一个细胞的微滴数量之间的关系；92.图37示出cd3蛋白质‑单链dna(ssdna)缀合物的分析结果；93.图38示出来自被标记的抗体结合的细胞的荧光信号；94.图39a示出用于使寡核苷酸与抗体缀合的方法；图39b示出带条形码抗体的分析结果；95.图40示出官能化抗体结合蛋白和官能化寡核苷酸的缀合物；96.图41示出二苯并环辛炔(dbco)并入的程度与输入二苯并环辛炔‑n‑羟基琥珀酰亚胺酯(dbco‑nhs)浓度之间的关系；97.图42示出缀合程度与寡核苷酸等价性之间的示例性关系；98.图43示出通过流式细胞术测量的标记的细胞的荧光信号；99.图44示出用于产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒的方法；100.图45a示出与多种寡核苷酸偶联的珠粒。图45b示出来自珠粒的凝胶电泳分析的结果。在珠粒上，0％、5％、15％或25％的偶联寡核苷酸含有抗体靶引物；101.图46a‑图46e示意性地描绘本文描述的示例性多测定方案的组分；102.图47a‑图47b描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；103.图48描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；104.图49a和图49b描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；105.图50a示意性地描绘包含具有两个不同功能性序列的寡核苷酸的示例性珠粒；106.图50b和图50c示意性地描绘可偶联至珠粒的示例性序列；107.图51a描绘在实施例xii中描述的示例性实验中使用的序列；图51b图解地描绘来自实施例xii中描述的示例性实验的数据；108.图52a描绘从实施例xiii中描述的示例性实验获得的数据；109.图52b示意性地描绘用于连接条形码的示例性延伸方案；110.图53a和图53b提供从实施例xiii中描述的示例性实验获得的数据；111.图54和图55提供从实施例xiv中描述的示例性实验获得的数据；并且112.图56a‑图56c示意性地描绘包括主要组织相容性复合物的示例性条形编码方案。113.图57a‑图57b图解地描绘示例性带条形码链霉抗生物素蛋白复合物。114.图58a‑图58b示出带条形码链霉抗生物素蛋白复合物的示例性分析。图58a示出代表性变性琼脂糖凝胶，而图58b示出代表性sds‑page凝胶。115.图59示出从如实施例xv中描述的示例性带条形码mhc四聚体t细胞实验获得的数据的结果。116.图60示出从如实施例xv中描述的示例性ebv扩增的t细胞加标实验获得的数据的结果。117.图61a‑图61d示意性地描绘crispr引导rna的示例性条形编码方案。具体实施方式118.尽管本文已示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。在不背离本发明的情况下本领域的技术人员可想到众多变体、变化、以及替代。应了解可使用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。119.在将值描述为范围的情况下，应理解，这种公开内容包括在此类范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入此类范围内的特定数值，而不管特定数值或特定子范围是否明确说明。120.如本文所用，术语“条形码”通常是指可以是分析物的一部分以传达关于所述分析物的信息的标记或标识符。除了分析物的内源性特征(例如，分析物的大小或末端序列)之外，条形码可以是附接至分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可具有各种不同的格式，例如，条形码可包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以可逆或不可逆的方式附接至分析物。在样品测序之前、期间和/或之后，可将条形码添加至例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)样品的片段。条形码可允许实时鉴定和/或定量单独测序读数。121.如本文所用，术语“受试者”通常是指动物，如哺乳动物物种(例如人)或禽类(例如鸟)物种，或其它生物体，如植物。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、小鼠、灵长类动物、猿猴或人。动物可包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康个体、患有或疑似患有疾病或所述疾病倾向的个体或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。122.如本文所用，术语“基因组”通常是指受试者的遗传信息的整体。基因组可以在dna或rna中编码。基因组可包含编码蛋白质的编码区以及非编码区。基因组可包含生物体中所有染色体一起的序列。例如，人基因组具有总计46个染色体。所有这些的序列一起可构成人基因组。123.术语“衔接子(adaptor)”、“衔接子(adapter)”和“标签”可同义使用。衔接子或标签可偶联至多核苷酸序列以通过任何方法(包括连接、杂交或其它方法)“标记”。124.如本文所用，术语“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna)。测序可通过目前可用的各种系统进行，如但不限于illumina、pacificbiosciences、oxfordnanopore或lifetechnologies(iontorrent)的测序系统。此类装置可提供对应于受试者(例如人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如通过所述装置从受试者提供的样品产生的。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组学信息一起使用。125.如本文所用，术语“变体”通常是指遗传变体，如包含多态性的核酸分子。变体可以是结构变体或拷贝数变体，其可以是大于单核苷酸变体或短插入缺失的基因组变体。变体可以是受试者的核酸样品或基因组中的改变或多态性。单核苷酸多态性(snp)是多态性的一种形式。多态性可包括单核苷酸变异(snv)、插入、缺失、重复、小插入、小缺失、小重复、结构变体连接、可变长度串联重复和/或侧翼序列。拷贝数变体(cnv)、颠换和其它重排也是遗传变异的形式。基因组改变可以是碱基变化、插入、缺失、重复、拷贝数变异或颠换。126.如本文所用，术语“珠粒”通常是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶。珠粒可以由聚合物材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。127.如本文所用，术语“样品”通常是指受试者的生物样品。样品可以是组织样品，如活组织检查、芯活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是面颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞(或无细胞)样品。无细胞样品可包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可从身体样品分离，所述身体样品可选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰液、粪便和泪液。128.如本文所用的术语“核酸”通常是指任何长度的核苷酸的单体或聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物或变体。核酸分子可包含一种或多种未修饰的或修饰的核苷酸。核酸可具有任何三维结构，并且可执行任何功能。以下是核酸的非限制性实例：核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运核糖核酸(rna)、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核酶、互补脱氧核糖核酸(cdna)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的dna、具有任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，如肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)、苏糖核酸(tna)、2'‑氟、2'‑ome和硫代磷酸化dna。核酸可包含选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的一个或多个亚单位。在一些实例中，核酸是dna或rna或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以是环状的。129.如本文所用的术语“核苷酸”通常是指核酸亚单位，其可包括a、c、g、t或u，或其变体或类似物。核苷酸可包含可并入增长核酸链中的任何亚单位。这种亚单位可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u具有特异性、或与嘌呤(即，a或g或其变体或类似物)或嘧啶(即，c、t或u或其变体或类似物)互补的任何其它亚单位。亚单位可使得单独核酸碱基或碱基群组(例如，aa、ta、at、gc、cg、ct、tc、gt、tg、ac、ca或其尿嘧啶对应物)能够得以拆分。130.如本文所用，术语“分析物”通常是指用于鉴定、如检测(例如，经由测序检测)的物质或其一种或多种成分。分析物的实例包括但不限于dna、rna、标记剂、抗体和蛋白质。分析物可以是细胞或细胞的一种或多种成分。131.分析物可具有不同类型。在一些实例中，在多种分析物中，给定分析物具有与多种其它分析物不同的结构或功能类别。不同类型的分析物的实例包括dna和rna；核酸分子和标记剂；转录物和基因组核酸；多个核酸分子，其中每个核酸分子具有不同的功能，如不同的细胞功能。样品可具有多种不同类型的分析物，如dna和rna分子的混合物，或核酸分子和标记剂的混合物。在一些情况下，不同类型的分析物不包括用于分离细胞的细胞表面特征的标记剂。132.如本文所用的术语“表位结合片段”通常是指能够与完整抗体结合相同表位的完整抗体的一部分，尽管不一定达到相同程度。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但表位结合片段通常包含(例如，通过二硫键)保持在一起的至少一对重链和轻链可变区(分别vh和vl)以保留抗原结合位点，并且不包含fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可通过任何合适的技术(例如，重组dna技术或完整抗体的酶或化学裂解)从给定抗体获得，并且通常可以筛选完整抗体相同的方式筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包含f(ab’)2片段、fab'片段、fab片段、fd片段或fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体来源的多肽，如单链可变片段(scfv)、双抗体或其它多聚体scfv、重链抗体、单结构域抗体或包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(cdr))的其它多肽以赋予多肽特异性抗原结合能力。133.核酸测序技术在测序生物材料方面取得了实质性结果，包括提供关于个体生物体以及相对纯的生物样品的实质性序列信息。然而，这些系统传统上不能有效地鉴定和表征单细胞水平的细胞。134.核酸测序技术可衍生出它们从自组织或其它样品(如生物流体(例如血液、血浆等))获得的细胞集合测序的核酸。可加工细胞(例如，在整体方法中全部一起)以提取代表细胞群体的平均值的遗传材料，然后可将其加工成被配置用于给定测序技术的测序简易dna文库。尽管经常就dna或核酸而言论述，但是源自细胞的核酸可包括可进行加工以产生用于测序的cdna的dna或rna，包括例如mrna、总rna等。135.除了不能将特征归属于细胞或单独细胞的特定子集外，此类整体样品制备方法可从一开始就倾向于主要鉴定和表征细胞样品中的大多数成分，并且可能不被设计成挑选少数成分，例如，样品中由一个细胞、一些细胞或一小部分总细胞贡献的遗传或蛋白质组学材料。同样地，在分析例如mrna或细胞表面蛋白的表达水平时，整体方法可倾向于从就表达水平而言不均匀的细胞群体呈现潜在不准确的数据。在一些情况下，在所分析的群体中的少数细胞中表达高并且在所述群体的大多数细胞中不存在时，整体方法可指示整个群体的低水平表达。136.通过用于从这些样品产生测序文库的加工操作，可进一步放大这些不准确性。一些下一代测序技术(例如，大规模平行测序)可依赖于核酸片段的几何扩增(如经由聚合酶链式反应)，以产生用于测序文库的足够dna。然而，这种扩增可偏向于扩增样品中的大多数成分，并且可能无法保持此类少数成分和多数成分的起始比例。虽然这些困难中的一些可通过利用不同的测序系统(如不需要扩增的单分子系统)来解决，但单分子系统以及其它下一代测序(ngs)系统的整体测序方法也可具有大的输入dna要求。例如，一些单分子测序系统可具有500纳克(ng)至高于10微克(μg)的样品输入dna要求，这可能不能从单独细胞或细胞小亚群获得。同样地，可优化其它ngs系统以使样品中样品dna的起始量为大约50纳克(ng)至约1微克(μg)。dna的起始量可以是至少约1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg或100μg。137.本文公开了用于表征细胞小群体的表面特征、蛋白质和核酸，并且在一些情况下用于表征单独细胞的表面特征、蛋白质和核酸的方法和系统。本文描述的方法可划分单独细胞或细胞小群体(包括例如单独细胞或细胞小群组的细胞表面特征、蛋白质和核酸)的分析，并且然后允许所述分析归属回至所述细胞表面特征、蛋白质和核酸所来源于的单独细胞或细胞小群组。无论细胞群体是代表细胞类型的50/50混合物、细胞类型的90/10混合物还是几乎任何细胞类型比例以及不同细胞类型的完全异质混合物或者这些之间的任何混合物，都可实现这一点。不同的细胞类型可包括来自个体的不同组织类型或来自不同个体的相同组织类型或生物有机体如来自不同属、种、菌株、变体或任何或所有前述的任何组合的微生物的细胞。例如，不同的细胞类型可包括来自个体的正常和肿瘤组织、从人受试者获得的各种细胞类型如各种免疫细胞(例如，b细胞、t细胞等)、来自环境、法医、微生物组或其它样品的多种不同的细菌物种、菌株和/或变体或细胞类型的任何各种其它混合物。138.在一个方面，本文描述的方法和系统提供将来自含有细胞的样品材料的单独细胞的核酸内容物划分、沉积或分配到离散的区室或分区(在本文中可互换地称为分区)，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。在另一个方面，本文描述的方法和系统提供将单独细胞从含有细胞的样品材料划分、沉积或分配到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。在另一个方面，本文所述的方法和系统提供在已经将至少一种标记剂结合至细胞的细胞表面特征之后，将来自含有细胞的样品材料的单独细胞划分、沉积或分配到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。可在先前、随后或同时将独特标识符(例如条形码)递送至保持划分的或分配的细胞的分区，以便允许稍后将单独细胞的特征归属于特定区室。此外，独特标识符(例如，条形码)可偶联至标记剂并且在先前、随后或同时递送至保持划分的或分配的细胞的分区，以便允许稍后将单独细胞的特征归属于特定区室。条形码可经由任何合适的机制例如在寡核苷酸上递送至分区。139.在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸经由微胶囊递送至分区。在一些情况下，带条形码寡核苷酸最初与微胶囊缔合，并且然后在施加刺激时从所述微胶囊释放，所述刺激允许所述寡核苷酸解离或从所述微胶囊释放。在一些实施方案中，锚寡核苷酸经由微胶囊递送至分区。在一些情况下，锚寡核苷酸最初与微胶囊缔合，并且然后在施加刺激时从所述微胶囊释放，所述刺激允许所述锚寡核苷酸解离或从所述微胶囊释放。140.微胶囊可以是或可包括固体载体或固体颗粒，如珠粒。固体载体或固体颗粒可以是珠粒。微胶囊可以是微滴。在一些实施方案中，微胶囊可以是或可包含珠粒。在一些实施方案中，珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的或流体的。在一些实施方案中，珠粒可以是可溶解的、可破裂的或可降解的。在一些情况下，珠粒可能不可降解。在一些实施方案中，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可由分子前体，如聚合物或单体物质形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在一些情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。141.在一些实施方案中，珠粒可含有分子前体(例如，单体或聚合物)，其可经由所述前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经由例如化学交联进行进一步聚合的已经聚合的物质。在一些情况下，前体包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可包含预聚物，所述预聚物是能够进一步聚合的低聚物。例如，可使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些情况下，珠粒可含有可进一步聚合在一起的单独聚合物。在一些情况下，可经由不同前体的聚合产生珠粒，以使得它们包含混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。142.珠粒可包含天然和/或合成材料。例如，聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。在一些情况下，珠粒可包含天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、刺梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)以及其组合(例如共聚物)。珠粒也可由除聚合物以外的材料，包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其它无机材料等形成。143.在一些情况下，化学交联剂可以是用于在单体聚合期间交联单体的前体和/或可用于将寡核苷酸(例如，带条形码寡核苷酸)附接至珠粒。在一些情况下，聚合物可进一步与交联剂物质或其它类型的单体聚合以产生另外的聚合物网络。化学交联剂(本文中也称为“交联剂(crosslinker)”或“交联剂(crosslinkeragent)”)的非限制性实例包括胱胺、戊二醛、辛二亚氨酸二甲酯、n‑羟基琥珀酰亚胺交联剂bs3、甲醛、碳二亚胺(edc)、smcc、磺基‑smcc、乙烯基硅烷、n,n’二烯丙基酒石酸二酰胺(datd)、n,n’‑双(丙烯酰基)胱胺(bac)或其同系物。在一些情况下，本公开中使用的交联剂含有胱胺。144.交联可以是永久性的或可逆的，这取决于所用的特定交联剂。可逆交联可允许聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可允许结合至珠粒表面的材料的可逆附接。在一些情况下，交联剂可形成二硫连键。在一些情况下，形成二硫连键的化学交联剂可以是胱胺或改性的胱胺。145.在一些实施方案中，二硫连键可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或并入珠粒中的前体与寡核苷酸之间形成。胱胺(包括改性的胱胺)例如是包含二硫键的有机剂，其可用作珠粒的单独单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包含胱胺(例如，改性的胱胺)的物质存在下聚合，以产生包含二硫连键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原的交联剂的可化学降解的珠粒)。所述二硫连键可允许珠粒在所述珠粒暴露于还原剂时降解(或溶解)。146.在一些实施方案中，壳聚糖(线性多糖聚合物)可经由亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可通过化学反应来实现，所述化学反应通过热、压力、ph的变化和/或辐射引发。147.在一些实施方案中，珠粒可包含聚合物前体(例如，单体、低聚物、线性聚合物)、寡核苷酸、引物和其它实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键包含碳‑碳键或硫醚键。148.在一些情况下，珠粒可包含acrydite部分，其在某些方面可用于将一种或多种寡核苷酸(例如条形码序列、带条形码寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)附接至珠粒。在一些情况下，acrydite部分可指由acrydite与一种或多种物质的反应，如acrydite与其它单体和交联剂在聚合反应期间的反应产生的acrydite类似物。acrydite部分可被修饰为与待附接的物质如寡核苷酸(例如条形码序列、带条形码寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)形成化学键。acrydite部分可用能够形成二硫键的硫醇基团修饰，或者可用已经包含二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(经由二硫化物交换)可用作待附接的物质的锚定点，或者acrydite部分的另一部分可用于附接。在一些情况下，附接是可逆的，以使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂存在下)，附接的物质从珠粒释放。在其它情况下，acrydite部分包含可用于附接的反应性羟基。149.用于附接寡核苷酸的珠粒的官能化可通过多种不同的方法实现，所述方法包括活化聚合物内的化学基团、在聚合物结构中并入活性或可活化的官能团或者在珠粒生产中的预聚物或单体阶段附接。150.例如，聚合以形成珠粒的前体(例如单体、交联剂)可包含acrydite部分，以使得当产生珠粒时，所述珠粒也包含acrydite部分。所述acrydite部分可附接至寡核苷酸如引物(例如，用于扩增靶核酸的引物、带条形码寡核苷酸等)以并入珠粒中。在一些情况下，所述引物包含用于附接至用于illumina测序的测序流动池的p5序列。在一些情况下，所述引物包含用于附接至用于illumina测序的测序流动池的p7序列。在一些情况下，所述引物包含条形码序列。在一些情况下，所述引物还包含独特分子标识符(umi)。在一些情况下，所述引物包含用于illumina测序的r1引物序列。在一些情况下，所述引物包含用于illumina测序的r2引物序列。151.在一些情况下，包含反应性或能够被活化以使其变得反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以产生包含活化的或可活化官能团的凝胶珠粒。然后可使用官能团来将另外的物质(例如，二硫化物接头、引物、其它寡核苷酸等)附接至凝胶珠粒。例如，包含羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包含cooh官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包含游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可共聚合在一起以产生包含游离cooh基团的凝胶珠粒。可活化凝胶珠粒的cooh基团(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉鎓(dmtmm))，以使得它们是反应性的(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团然后可与适当的物质(例如，包含胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应，所述物质包含待连接至珠粒的部分。152.在其聚合物网络中包含二硫连键的珠粒可经由将一些二硫连键还原成游离硫醇而用另外的物质官能化。二硫连键可经由例如还原剂(例如dtt、tcep等)的作用来还原以产生游离硫醇基团而不溶解珠粒。珠粒的游离硫醇然后可与物质或包含另一个二硫键的物质的游离硫醇(例如，经由硫醇‑二硫化物交换)反应，以使得所述物质可连接至珠粒(例如，经由产生的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离硫醇可与任何其它合适的基团反应。例如，珠粒的游离硫醇可与包含acrydite部分的物质反应。珠粒的游离硫醇基团可经由迈克尔加成化学与丙烯酸酯反应，以使得包含acrydite的物质连接至珠粒。在一些情况下，可通过包含硫醇封端剂如n‑乙基马来酰胺或碘乙酸酯来防止不受控制的反应。153.可控制珠粒内二硫连键的活化，以使得仅活化少量二硫连键。可例如通过控制用于产生游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些情况下，低浓度(例如，小于或等于约10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000、10000000000或100000000000的还原剂:凝胶珠粒比率的分子)的还原剂可用于还原。控制被还原为游离硫醇的二硫连键的数量可用于确保官能化期间的珠粒结构完整性。在一些情况下，光学活性剂(如荧光染料)可经由珠粒的游离硫醇基团与珠粒偶联，并用于量化珠粒中存在的游离硫醇的数量和/或追踪珠粒。154.在一些情况下，在凝胶珠粒形成后向凝胶珠粒添加部分可以是有利的。例如，在凝胶珠粒形成后添加寡核苷酸(例如，带条形码寡核苷酸)可避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质的损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接的部分的单体或交联剂)可用于聚合，并且由于粘性效应可最小程度地阻止生长链端。在一些情况下，在凝胶珠粒合成后的官能化可使物质(例如，寡核苷酸)的暴露最小化，以负载潜在的破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境。在一些情况下，所产生的凝胶可具有上临界溶解温度(ucst)，其可允许温度驱动的溶胀和珠粒的塌陷。在随后用寡核苷酸官能化珠粒期间，这种功能可帮助寡核苷酸(例如，引物)渗入珠粒中。生产后官能化也可用于控制珠粒中物质的负载比例，以使得例如负载比例的可变性最小化。物质负载也可在分批过程中进行，以使得多个珠粒可在单个批次中用所述物质官能化。155.在一些情况下，连接至前体的acrydite部分、连接至前体的另一种物质或前体本身包含不稳定键，如化学、热或光敏感键，例如二硫键、uv敏感键等。一旦acrydite部分或包含不稳定键的其它部分并入到珠粒中，所述珠粒也可包含不稳定键。不稳定键可例如用于将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)至珠粒。在一些情况下，热不稳定键可包括基于核酸杂交的附接，例如，其中寡核苷酸与附接至珠粒的互补序列杂交，以使得杂合体的热解链从所述珠粒或微胶囊释放寡核苷酸，例如含条形码的序列。156.向凝胶珠粒添加多种类型的不稳定键可导致产生能够响应于不同刺激的珠粒。每种类型的不稳定键可对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度等)敏感，以使得可通过施加适当的刺激来控制经由每个不稳定键附接至珠粒的物质的释放。这种功能可用于从凝胶珠粒中控制释放物质。在一些情况下，包含不稳定键的另一种物质可在凝胶珠粒形成后经由例如如上所述的凝胶珠粒的活化的官能团连接至凝胶珠粒。如将理解的，可释放地、可裂解地或可逆地附接至本文所述的珠粒的条形码包括通过裂解条形码分子与珠粒之间的连键而释放或可释放或通过下面的珠珠粒本身的降解释放的条形码，从而允许条形码通过其它试剂访问或可访问，或两者。157.附接至固体支载体(例如珠粒)的物质(例如，包含条形码的寡核苷酸)可包含允许所述物质从珠粒释放的u‑切除元件。在一些情况下，所述u切除元件可包含含有至少一个尿嘧啶的单链dna(ssdna)序列。所述物质可经由ssdna序列附接至固体载体。所述物质可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(例如，以除去尿嘧啶)和核酸内切酶(例如，以诱导ssdna断裂)的组合释放。如果核酸内切酶从裂解产生5'磷酸基团，则可在下游加工中包括额外的酶处理以例如在连接额外的测序柄元件(例如，illumina完整p5序列、部分p5序列、完整r1序列和/或部分r1序列)之前消除磷酸基团。158.如本文所述可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可通过从珠粒(或本文所述的其它合适类型的分区)释放条形码来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的背景下还设想了其它可活化配置。159.除了热可裂解的键、二硫键和uv敏感键以外，可偶联至前体或珠粒的不稳定键的其它非限制性实例包括酯连键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解)、邻位二醇连键(例如，可经由高碘酸钠裂解)、狄尔斯‑阿尔德(diels‑alder)连键(例如，可经由热裂解)、砜连键(例如，可经由碱裂解)、甲硅烷基醚连键(例如，可经由酸裂解)、糖苷连键(例如，可经由淀粉酶裂解)、肽连键(例如，可经由蛋白酶裂解)或磷酸二酯连键(例如，可经由核酸酶(例如，dna酶)裂解))。160.不参与聚合的物质也可在珠粒产生期间(例如，在前体聚合期间)包封在珠粒中。此类物质可进入聚合反应混合物中，以使得产生的珠粒在珠粒形成时包含所述物质。在一些情况下，可在形成后将此类物质添加至凝胶珠粒。此类物质可包括，例如，寡核苷酸(例如带条形码寡核苷酸和/或锚寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dntp、辅因子(例如，离子辅因子))(包括本文所述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物)或用于核酸修饰反应如聚合、连接或消化的试剂。捕获此类物质可通过在前体聚合期间产生的聚合物网络密度、控制凝胶珠粒内的离子电荷(例如，经由连接至聚合物质的离子物质)或通过释放其它物质来进行控制。在珠粒降解时和/或通过施加能够从珠粒释放物质的刺激，可从珠粒释放包封的物质。161.珠粒可具有均匀的尺寸或不均匀的尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可以是约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm。在一些情况下，珠粒可具有至少约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大的直径。在一些情况下，珠粒可具有小于或等于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm的直径。在一些情况下，珠粒可具有在约40‑75μm、30‑75μm、20‑75μm、40‑85μm、40‑95μm、20‑100μm、10‑100μm、1‑100μm、20‑250μm或20‑500μm的范围内。162.在某些方面，珠粒被提供为一群或多个具有相对单分散尺寸分布的珠粒。这种单分散性可在分区内提供相对一致量的试剂并维持相对一致的珠粒特性。特别地，本文所述的珠粒可具有尺寸分布，所述尺寸分布具有小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约15％、小于或等于约10％或小于或等于约5％的其横截面尺寸的变异系数。163.珠粒可具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、卵形、椭圆形、无定形、圆形、圆柱形以及其变化。164.除了珠粒与相关分子(例如，以上所述的含有条形码的寡核苷酸)之间的可裂解连键之外或作为其替代，珠粒可自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、ph变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)时可降解、可破坏或可溶解。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，以使得珠粒的材料组分在暴露于特定化学物质或环境变化(如变化温度或ph变化)时溶解。在一些情况下，凝胶珠粒在升高的温度和/或在碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，以使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，热)时，所述珠粒降解。结合至物质(例如，寡核苷酸，例如带条形码寡核苷酸)的珠粒的降解或溶解可导致所述物质从所述珠粒释放。165.可降解珠粒可包含一种或多种具有不稳定键的物质，以使得当所述珠粒/物质暴露于适当的刺激时，键被破坏并且珠粒降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些情况下，用于产生珠粒的交联剂可包含不稳定键。在暴露于适当的条件下，可破坏不稳定的键并且珠粒降解。例如，在将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时，可破坏胱胺的二硫键并且珠粒降解。166.与不降解的珠粒相比，当将适当的刺激施加至珠粒时，可降解的珠粒可用于更快地从珠粒释放附接的物质(例如，寡核苷酸、条形码序列、引物等)。例如，对于与多孔珠粒的内表面结合的物质或在包封的物质的情况下，所述物质在珠粒降解后可具有更大的迁移率和对溶液中其它物质的可接近性。在一些情况下，物质也可经由可降解的接头(例如，二硫化物接头)附接至可降解的珠粒。可降解的接头可与可降解珠粒响应于相同的刺激，或者两种可降解物质可响应于不同的刺激。例如，条形码序列可经由二硫键附接至包含胱胺的聚丙烯酰胺珠粒。在带条形码珠粒暴露于还原剂后，所述珠粒降解并且条形码序列在条形码序列与珠粒之间的二硫连键以及珠粒中胱胺的二硫连键两者断裂时释放。167.可将可降解珠粒引入分区，如乳液或孔的微滴，以使得所述珠粒在分区内降解，并且当施加适当的刺激时，任何缔合的物质(例如，寡核苷酸)在所述微滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸)可与分区中包含的其它试剂相互作用。例如，包含胱胺并经由二硫键连接至条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒可与油包水乳液的微滴内的还原剂组合。在微滴内，还原剂可使各种二硫键断裂，从而导致珠粒降解并将条形码序列释放到微滴的水性内部环境中。在另一个实例中，在碱性溶液中加热包含珠粒结合的条形码序列的微滴也可导致珠粒降解并将附接的条形码序列释放到微滴的水性内部环境中。168.如将从以上公开内容理解，虽然称为珠粒的降解，但降解可指结合或夹带的物质从珠粒解离，有或没有结构上降解物理珠粒本身。例如，由于例如改变化学环境，可通过渗透压差从珠粒释放夹带的物质。举例来说，由于渗透压差所致的珠粒孔径的改变通常可在没有珠粒本身的结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠粒的渗透膨胀所致的孔径增加可允许珠粒内的夹带物质的释放。在其它情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可使得珠粒更好地保留夹带的物质。169.在提供可降解珠粒的情况下，避免使此类珠粒暴露于在给定时间之前引起这种降解的一种或多种刺激是有用的，以避免过早珠粒降解和由这种降解引起的问题，包括例如较差流动特性和聚集。举例来说，其中珠粒包含可还原的交联基团如二硫化物基团，避免使此类珠粒与还原剂例如dtt或其它二硫化物裂解试剂接触可能是有用的。在此类情况下，对本文所述珠粒的处理在一些情况下将在不含还原剂如dtt的情况下提供。因为通常在商业酶制剂中提供还原剂，所以可提供不含还原剂(或不含dtt)的酶制剂来处理本文所述的珠粒。此类酶的实例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及可用于处理本文所述珠粒的许多其它酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含dtt”制剂可指具有小于或等于约1/10、小于或等于约1/50或小于或等于约1/100的用于降解珠粒的此类材料的较低范围。例如，对于dtt，不含还原剂的制剂通常将具有小于或等于约0.01mm、0.005mm、0.001mmdtt、0.0005mmdtt或0.0001mmdtt。在一些情况下，dtt的量将不可检测到。170.在一些情况下，可使用刺激来触发珠粒的降解，其可导致内容物从珠粒释放。通常，刺激可引起珠粒结构的降解，如共价键或其它类型的物理相互作用的降解。这些刺激可用于诱导珠粒降解和/或释放其内容物。如下文更全面描述的，可使用的刺激的实例包括化学刺激、热刺激、光刺激(例如光)以及其任何组合。171.可使用许多化学触发剂来触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠粒内组分的完整性的变化、珠粒的组分经由交联键裂解的降解和珠粒的组分的解聚。172.在一些实施方案中，珠粒可由包含可降解化学交联剂如bac或胱胺的材料形成。此类可降解交联剂的降解可通过许多机制完成。在一些实例中，珠粒可与化学降解剂接触，所述化学降解剂可诱导氧化、还原或其它化学变化。例如，化学降解剂可以是还原剂，如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的另外实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1,4‑二巯基丁烷(二硫代丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解在形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，并且因此降解珠粒。在其它情况下，溶液的ph变化(如ph的增加)可触发珠粒的降解。在其它情况下，暴露于水溶液(如水)可触发水解降解，并且因此触发珠粒的降解。173.在施加热刺激时，还可诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可引起珠粒的各种变化。例如，热可引起固体珠粒液化。热的变化可引起珠粒熔融，以使得珠粒的一部分降解。在其它情况下，热可增加珠粒组分的内部压力，以使得珠粒破裂或爆炸。热还可作用于用作构建珠粒的材料的热敏聚合物。174.本公开的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的剂一起使用以降解珠粒。在一些实施方案中，温度或ph的变化可用于降解珠粒内的热敏性或ph敏感性键。在一些实施方案中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其它化学变化降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，如dtt，其中dtt可降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在一些实施方案中，可添加还原剂以降解珠粒，其可以或可以不引起珠粒释放其内容物。还原剂的实例可包括二硫苏糖醇(dtt)、β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1,4‑二巯基丁烷(二硫代丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可以约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm或10mm的浓度存在。还原剂可以至少约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm、10mm或更高的浓度存在。还原剂可以至多约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm或10mm的浓度存在。175.任何合适数量的核酸分子(例如，引物、带条形码寡核苷酸、锚寡核苷酸)可与珠粒缔合，以使得在从珠粒释放时，所述核酸分子(例如，引物、带条形码寡核苷酸、锚寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择这种预定浓度以促进用于在分区内产生测序文库(例如扩增)的某些反应。在一些情况下，预定浓度的引物受到产生带有寡核苷酸的珠粒的方法的限制。176.在一些方面，分区是指容器或器皿(如孔、微孔、管、小瓶、纳米阵列基底(例如biotrove纳米阵列)中的贯通端口或其它容器)。在一些方面，区室或分区包括可在流体流内流动的分区。这些分区可包括例如具有包围内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡，或在一些情况下它们可包括能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。在一些方面，分区包括非水性连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。不同器皿的实例描述于美国专利申请公布号2014/0155295中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。用于在非水性或油连续相中产生稳定微滴的乳液体系的实例详细描述于美国专利申请公布号2010/0105112中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。177.在乳液中的微滴的情况下，将单独细胞分派至离散分区通常可通过以下方式来实现：将细胞于水性流体中的流动流引入非水性流体的流动流中，以使得在两种流的接点处产生微滴。通过在一定浓度的细胞中提供水性细胞的流，可控制所得分区的占用率(例如，每个分区的细胞数)。在实现单细胞分区的情况下，可选择流体的相对流速，以使得所述分区平均每个分区含有少于一个细胞，以便确保那些被占用的分区主要是单一占用的。在一些实施方案中，可选择流体的相对流速，以使得大多数分区被占用，例如从而允许仅一小部分未占用的分区。在一些方面，控制流量和通道结构以确保一定数目的单一占用分区、低于某一水平的未占用分区以及低于某一水平的多重占用分区。178.可操作本文描述的系统和方法，以使得大多数被占用的分区包括每个被占用的分区不超过一个细胞。在一些情况下，进行分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有多于一个细胞，并且在一些情况下，少于20％的被占用的分区具有多于一个细胞。在一些情况下，少于10％或少于5％的被占用的分区包括每个分区多于一个细胞。179.在一些情况下，避免创建过量的空分区可能是有用的。例如，从成本角度和/或效率角度来看，最小化空分区的数量可能是有帮助的。虽然这可通过将足够数量的靶细胞提供至分配区中来实现，但泊松分布(poissoniandistribution)预期可增加可包括多个细胞的分区的数量。因此，根据本文所描述的方面，进行被定向至分配区中的一个或多个细胞或其它流体的流量，以使得在一些情况下，不超过50％的所产生的分区、不超过25％的所产生的分区或不超过10％的所产生的分区未被占用。此外，在一些方面，控制这些流以便呈现单个占用分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未占用分区。可实现未占用分区的上述范围，同时仍然提供上述任何单一占用率。例如，使用本文描述的系统和方法产生具有小于或等于约25％、20％、15％、10％或5％的多重占用率、同时具有小于或等于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的未占用分区的所得分区。180.如将理解，上述占用率也适用于包含细胞和另外的试剂和剂的分区，包括但不限于携带带条形码寡核苷酸的微胶囊、携带锚定寡核苷酸的微胶囊、标记剂、包含报告寡核苷酸的标记剂、包含含有核条形码序列的报告寡核苷酸的标记剂和具有与一种或多种细胞表面特征结合的一种或多种标记剂的细胞。在一些方面，相当大百分比的全部被占用的分区可包括包含条形码或锚定寡核苷酸的微胶囊(例如珠粒)和有或无结合的标记剂的细胞。181.虽然在上文中就提供大体上单一占用的分区进行了描述，但在某些情况下，提供例如在单一分区内含有包含带条形码寡核苷酸或锚寡核苷酸的两个、三个、四个或更多个细胞和/或微胶囊(例如，珠粒)的多重占用分区可能是有用的。因此，可控制含有细胞和/或珠粒的流体和分配流体的流动特征以提供此类多重占用分区。特别地，可控制流动参数以提供分区的大于或等于约50％、大于或等于约75％或大于或等于约80％、90％、95％或更高的占用率。182.在一些情况下，使用另外的微胶囊来将另外的试剂递送至分区。在此类情况下，可能有利的是从不同珠粒来源(即含有不同的所缔合的试剂)通过进入共同的通道或微滴产生接点的不同通道入口将不同珠粒引入这种共同的通道或微滴产生接点中。在此类情况下，可控制不同珠粒进入通道或接点的流量和频率以从各来源提供合适比率的微胶囊，同时确保配对或组合的此类珠粒进入具有所需数量的细胞的分区。183.本文描述的分区可包括小体积，例如，小于或等于10□l、5□l、1□l、900皮升(pl)、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl、1pl、500纳升(nl)、100nl、50nl或更低。184.例如，在基于微滴的分区的情况下，所述微滴可具有小于或等于1000pl、900pl、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl或1pl的总体积。在与微胶囊共同分配的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积(例如包括共分配的细胞)可小于或等于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或小于上述体积。185.如本文其它地方所述，分配物质可产生群体或多个分区。在此类情况下，可产生任何合适数量的分区以产生多个分区。例如，在本文所描述的方法中，可产生包含至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区或至少约1,000,000,000个分区的多个分区。此外，多个分区可包含未占用的分区(例如空分区)与被占用的分区两者。186.微流体通道网络可用于产生如本文所述的分区。在分配单独细胞时还可采用替代机制，所述替代机制包括多孔膜，细胞的水性混合物穿过所述多孔膜被挤压至非水性流体中。187.用于分配单独细胞的简化微流体通道结构的实例在图1中示出。如本文所述，细胞可在有或无与细胞表面特征结合的标记剂的情况下进行分配。如本文所述，在一些情况下，大多数被占用的分区包括每个被占用的分区不超过一个小细胞，并且在一些情况下，所产生的分区中的一些未被占用。但是，在一些情况下，所述被占用的分区中的一些可包括多于一个细胞。在一些情况下，可控制分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有超过一个细胞，并且在一些情况下，少于20％的被占用的分区具有超过一个细胞，而在一些情况下，少于10％或少于5％的被占用的分区每个分区包括超过一个细胞。如所示，所述通道结构可包括在通道接点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中，包括悬浮细胞114的第一水性流体112可沿着通道区段102输送到接点110中，而与水性流体112不混溶的第二流体116从通道区段104和106递送到接点110以产生包括单独细胞114的水性流体的离散微滴118，从而流入通道区段108中。188.在一些方面，此第二流体116包含油，如氟化油，其包括用于稳定所得微滴、例如抑制所得微滴的随后聚结的含氟表面活性剂。分配流体和含氟表面活性剂的实例描述于美国专利申请公布号2010/0105112中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。189.在其它方面，除了基于微滴的分配之外或作为其替代，细胞(如本文所述，有或无与细胞表面特征结合的标记剂)可包封在包含外壳或层或多孔基质的微胶囊内，在所述微胶囊内夹带一个或多个单独细胞或细胞小群组，并且可包括其它试剂。细胞的包封可通过各种方法进行。此类方法将含有待分析的细胞的水性流体与聚合物前体材料组合，所述聚合物前体材料在对聚合物前体施加特定刺激时能够形成凝胶或其它固体或半固体基质。此类刺激包括例如热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过前体的交联、聚合引发(例如，通过添加的引发剂)等。190.包含细胞的微胶囊的制备可通过各种方法进行。例如，气刀微滴或气溶胶发生器可用于将前体流体的微滴分配到胶凝溶液中，以形成包括单独细胞或细胞小群组的微胶囊。同样地，基于膜的包封系统可用于产生包含如本文所述的包封细胞的微胶囊。在一些方面，微流体系统如图1中所示的微流体系统可容易地用于包封如本文所述的细胞。特别地并且参考图1，包含细胞和聚合物前体材料的水性流体流入通道接点110中，其中其通过非水性流体116的流动分配呈包含单独细胞114的微滴118。在包封方法的情况下，非水性流体116还可包括引发剂，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，以形成包括夹带的细胞的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例描述于美国专利申请公布号2014/0378345中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。191.例如，在聚合物前体材料包含线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、peg或其它线性聚合物材料)的情况下，活化剂可包含交联剂或活化所形成的微滴内的交联剂的化学品。同样，对于包含可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包含聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包含丙烯酰胺单体与n,n’‑双‑(丙烯酰基)胱胺(bac)共聚单体的混合物时，可在通道区段104和106中的第二流体流内提供诸如四乙基亚甲基二胺(temed)的剂，所述剂引发丙烯酰胺和bac共聚成交联聚合物网络或水凝胶。192.在第二流体流116与第一流体流112在接点110处接触形成微滴后，temed可从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性第一流体112中，其将活化所述微滴内的聚丙烯酰胺的交联，从而导致形成呈夹带细胞114的固体或半固体珠粒或颗粒形式的凝胶(例如水凝胶)、微胶囊118。尽管就聚丙烯酰胺包封而言进行了描述，但是其它‘可活化的’包封组合物也可用于本文所述的方法和组合物的背景中。例如，形成藻酸盐微滴、然后暴露于二价金属离子(例如ca2 )可用作使用所述方法的包封过程。同样地，琼脂糖微滴也可通过基于温度的胶凝(例如在冷却后等)转化成胶囊。在一些情况下，例如通过时间推移或者在施加特定刺激后，包封的细胞可选择性地从微胶囊释放，使所述微胶囊充分降解以允许细胞或其内容物从所述微胶囊例如释放到分区(如微滴)中。例如，在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下，微胶囊的降解可通过引入适当的还原剂如dtt等来完成，以裂解使聚合物基质交联的二硫键。参见例如美国专利申请公布号2014/0378345，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。193.包封的细胞或细胞群体提供可储存并且比基于微滴的分配细胞更便携的某些潜在优点。此外，在一些情况下，可将待分析的细胞孵育选择的一段时间，以便在存在或不存在不同刺激的情况下表征此类细胞随时间推移的变化。在此类情况下，单独细胞的包封可允许比在乳液微滴中分配更长的孵育，尽管在一些情况下，微滴分配的细胞也可孵育不同的时间段，例如，至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。细胞的包封可构成细胞的分配，其它试剂共分配到所述细胞中。或者，如上所述，包封的细胞可容易地沉积到其它分区(例如液滴)中。194.根据某些方面，细胞可与裂解试剂一起分配，以释放分区内细胞的内容物。在此类情况下，可在将细胞引入分配接点/微滴产生区中(例如通过通道接点110上游的另外一个或多个通道)同时或之前不久使裂解剂与细胞悬浮液接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡球菌素、labiase、kitalase、溶细胞酶和可从例如sigma‑aldrich,inc.(stlouis,mo)获得的各种其它裂解酶以及其它可商购的裂解酶。其它裂解剂可另外或可替代地与细胞共分配以引起细胞的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞。在一些情况下，裂解溶液可包括非离子型表面活性剂，例如像tritonx‑100和tween20。在一些情况下，裂解溶液可包括离子型表面活性剂，例如像肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。在某些情况下也可使用电穿孔、热、声学或机械细胞破裂，例如基于非乳液的分配，如可除了微滴分配之外或代替微滴分配的细胞的包封，其中包封物的任何孔径足够小以在细胞破裂后保留合适大小的核酸片段。195.除了与上述细胞共分配的裂解剂之外，其它试剂也可与细胞共分配，所述其它试剂包括例如dna酶和rna酶灭活剂或抑制剂，如蛋白酶k、螯合剂(如edta)和用于除去或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸的随后加工的负面活性或影响的其它试剂。另外，在包封的细胞的情况下，可使细胞暴露于适当的刺激以从共分配的微胶囊释放细胞或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可与包封的细胞共分配，以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，这种刺激可与本文其它地方描述的用于从其各自的微胶囊(例如珠粒)释放寡核苷酸的刺激相同。在替代方面，这可以是不同的和非重叠的刺激，以允许包封的细胞在与寡核苷酸释放到同一分区中的不同时间释放到分区中。196.另外的试剂也可与细胞共分配，如用于使细胞的dna片段化的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增细胞的核酸片段并将条形码寡核苷酸附接至扩增的片段的dntp。另外的试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸(switcholigos)”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可用于增加cdna的长度。在一些情况下，模板转换可用于将预定义的核酸序列附加至cdna。在模板转换的一个实例中，cdna可从模板(例如细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以模板独立方式向cdna添加额外的核苷酸，例如聚c。转换寡核苷酸可包括与另外的核苷酸(例如聚g)互补的序列。cdna上的另外核苷酸(例如聚c)可与转换寡核苷酸上的另外核苷酸(例如聚g)杂交，由此所述转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。模板转换寡核苷酸可包含杂交区和模板区。杂交区可包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如前所述，杂交区包含一系列g碱基以补充cdna分子的3'端的突出c碱基。所述系列g碱基可包含1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或多于5个g碱基。模板序列可包含待并入cdna中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2、3、4、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2'‑脱氧肌苷、supert(5‑羟基丁炔基‑2'‑脱氧尿苷)、superg(8‑氮杂‑7‑脱氮杂鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2'氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)或任何组合。197.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250个核苷酸或更长。198.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。199.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。200.另外的剂也可与细胞共分配，如能够结合至细胞的一种或多种细胞表面特征的一种或多种标记剂。细胞表面特征可包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。标记剂可包括抗体、抗体片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架。所述标记剂可通过如本文所述的偶联方法偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定标记剂，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，与标记剂偶联的核酸条形码序列可包含独特分子标识符(umi)序列区段。201.标记剂可包含抗原呈递颗粒。在一些情况下，抗原呈递颗粒可在其表面上或附近包含抗原。抗原呈递颗粒例如通过抗原呈递颗粒上的抗原可结合至样品中的细胞表面上的一个或多个分子。在一些情况下，抗原呈递颗粒可用作免疫细胞(例如t细胞或b细胞)的标记剂。这种抗原呈递颗粒可结合至t细胞受体和/或b细胞受体。在一些情况下，抗原呈递颗粒包含被免疫细胞识别(例如，结合)的抗原。抗原呈递颗粒可以是细胞，例如癌细胞或其它抗原呈递细胞。抗原呈递颗粒可以是病原体，例如细菌、真菌、微生物或病毒。在某些情况下，抗原呈递颗粒(例如，细胞或病毒)可包含在颗粒的表面上表达抗原的抗原表达载体。抗原表达载体可包含用于鉴定抗原的核酸或氨基酸序列的条形码。202.使用抗原呈递颗粒来分析细胞的示例性方法可包括以下操作中的一个或多个。将包含免疫细胞(例如，血液或其部分)的样品与抗原呈递颗粒群体混合，并孵育以允许免疫细胞和抗原呈递颗粒相互作用。使用选择性地结合至免疫细胞的抗体纯化与免疫细胞结合的免疫细胞和抗原呈递颗粒。将结合的免疫细胞和抗原呈递颗粒分配到具有珠粒(例如凝胶珠粒)的微滴中。所述珠粒各自包含锚寡核苷酸，所述锚寡核苷酸包含mrna分子的引物、条形码和umi。所述微滴中的至少一个含有免疫细胞、抗原呈递颗粒和凝胶珠粒。裂解微滴中的免疫细胞和抗原呈递颗粒。释放来自免疫细胞和抗原呈递颗粒的mrna分子。用mrna分子和来自珠粒的锚寡核苷酸进行逆转录。因此，用来自锚寡核苷酸的条形码和umi标记所得cdna。然后在测序仪(例如，illumina测序仪)上对所得cdna进行测序，例如至每个细胞的高深度。利用序列读数，组装免疫细胞的v(d)j区，并且还确定抗原呈递颗粒的特征。当抗原呈递颗粒是癌细胞时，可用序列读数确定突变和/或单核苷酸多态性(snp)以鉴定由具有相应v(d)j序列的免疫细胞靶向的肿瘤细胞的亚群。当抗原呈递颗粒是病毒时，可组装病毒基因组以鉴定由具有相应v(d)j序列的免疫细胞靶向的病毒的亚克隆。所述方法可产生成对的v(d)j序列和抗原鉴定序列(例如，肿瘤细胞的mrna或病毒的基因组)，其可用于开发针对特定病毒株的个性化免疫疗法或疫苗。203.由标记剂(例如，由条形码标记的抗体)标记的蛋白质可用作结合测定中的探针。蛋白质可以是抗体或细胞表面蛋白，例如细胞受体，如t细胞受体和b细胞受体。标记剂可包含条形码和/或umi。在一些情况下，包含相同条形码和/或umi的另一种标记剂可用于分析与所述蛋白质来自相同细胞的核酸。来自相同细胞的核酸和蛋白质可通过条形码和/或umi鉴定。在一些情况下，可使用用于分析核酸的标记剂来确定细胞表面蛋白的核酸序列，以使得也可确定细胞表面蛋白的氨基酸序列。来自细胞的标记的蛋白质然后可用作针对靶分子(例如蛋白质)的结合测定中的探针。例如，在结合测定中，可确定标记的细胞表面蛋白是否能够结合至靶蛋白。可例如通过变性将细胞表面蛋白的标记与细胞表面蛋白分离。然后可对标签上的条形码和/或umi进行测序。条形码和/或umi的序列可用于将结合测定结果与细胞表面蛋白的序列相关联。因此，蛋白质与靶分子的相互作用可与蛋白质的序列相关联。在一些情况下，可使用umi量化蛋白质与靶分子之间的相互作用。204.一旦细胞的内容物释放到它们各自的分区中，其中包含的核酸可在所述分区内进一步加工。根据本文所述的方法和系统，可为单独细胞的核酸内容物提供独特的标识符，以使得在表征那些核酸时，它们可归属为源自一种或多种相同的细胞。通过将独特标识符具体地分配至单独细胞或细胞群组来提供将特征归属于单独细胞或细胞群组的能力。可将例如呈核酸条形码形式的独特标识符指定或与单独细胞或细胞群体相关联，以便用所述独特标识符标记(tag)或标记(label)细胞的组分(并且因此标记其特征)。然后，可使用这些独特标识符将细胞的组分和特征归属于单独细胞或细胞群组。在一些方面，这通过将单独细胞或细胞群组与独特标识符共分配来实现。在一些方面，独特标识符以寡核苷酸(在本文中也称为锚寡核苷酸)的形式提供，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可附接至单独细胞的核酸内容物或以其它方式与单独细胞的核酸内容物相关联，或附接至细胞的其它组分，并且特别是那些核酸的片段。可分配寡核苷酸，以使得在给定分区中的寡核苷酸之间，其中包含的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分区之间，所述寡核苷酸可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表大量在给定分析中跨越所有分区的不同条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可与给定分区相关联，尽管在一些情况下，可存在两个或更多个不同的条形码序列。205.核酸条形码序列可包含在寡核苷酸的序列内的6至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在单个相邻核苷酸区段中，或者它们可分成两个或多个分开的子序列，所述子序列被1个或多个核苷酸分开。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以是约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。206.共分配的寡核苷酸还可包含可用于加工来自共分配的细胞的核酸的其它功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，所述序列用于扩增来自分区内的单独细胞的基因组dna、同时附接相关联的条形码序列、对引物或引物识别位点进行测序、杂交或探测序列，例如用于鉴定序列的存在或用于提取带条形码的核酸；或任何许多其它潜在的功能序列。也可使用共分配寡核苷酸的其它机制，包括例如两个或更多个微滴的聚结，其中一个微滴含有寡核苷酸，或寡核苷酸微分配到分区，例如微流体系统内的微滴中。可进行寡核苷酸和相关条形码以及其它功能序列或标记以及如本文所述的样品材料的共分配，例如，如美国专利申请公布号2014/0227684中所描述，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。207.简言之，在一个实例中，提供微胶囊如珠粒，其各自包含可释放地附接至珠粒的大量上述带条形码寡核苷酸(本文中也称为锚寡核苷酸)，其中附接至特定珠粒的所有寡核苷酸将包含相同的核酸条形码序列，但是其中大量不同的条形码序列在所使用的珠粒群体中表示。在一些实施方案中，水凝胶珠粒(例如，包含聚丙烯酰胺聚合物基质)用作寡核苷酸进入分区的固体载体和递送媒介物，因为它们能够携带大量寡核苷酸分子，并且可被配置为在暴露于特定刺激时释放那些寡核苷酸，如本文其它地方所描述。在一些情况下，珠粒群体将提供多样的条形码序列文库，所述条形码序列文库包括至少1,000个不同的条形码序列、至少5,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少50,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少5,000,000个不同的条形码序列或至少10,000,000个不同的条形码序列。另外，每个珠粒可提供有大量附接的寡核苷酸分子。特别地，单独珠粒上的包含条形码序列的寡核苷酸分子的数量可以是至少1,000个寡核苷酸分子、至少5,000个寡核苷酸分子、至少10,000个寡核苷酸分子、至少50,000个寡核苷酸分子、至少100,000个寡核苷酸分子、至少500,000个寡核苷酸、至少1,000,000个寡核苷酸分子、至少5,000,000个寡核苷酸分子、至少10,000,000个寡核苷酸分子、至少50,000,000个寡核苷酸分子、至少100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少10亿个寡核苷酸分子。208.此外，当分配珠粒群体时，所得到的分区群体还可包括多样的条形码文库，所述条形码文库包括至少1,000个不同的条形码序列、至少5,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少50,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少5,000,000个不同的条形码序列或至少10,000,000个不同的条形码序列。另外，所述群体的每个分区可包括至少1,000个寡核苷酸分子、至少5,000个寡核苷酸分子、至少10,000个寡核苷酸分子、至少50,000个寡核苷酸分子、至少100,000个寡核苷酸分子、至少500,000个寡核苷酸、至少1,000,000个寡核苷酸分子、至少5,000,000个寡核苷酸分子、至少10,000,000个寡核苷酸分子、至少50,000,000个寡核苷酸分子、至少100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少10亿个寡核苷酸分子。209.在一些情况下，可将多个不同的条形码并入在给定分区内，或者附接至所述分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合的但已知的条形码序列集可在后续加工中提供更大的鉴定保证，例如通过向给定分区提供更强的条形码地址或属性，作为来自给定分区的输出的重复或独立的确认。210.在向珠粒施加特定刺激时，寡核苷酸可从所述珠粒释放。在一些情况下，所述刺激可以是光刺激，例如通过释放寡核苷酸的光不稳定性连键的裂解。在其它情况下，可使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将导致连键的裂解或寡核苷酸从珠粒的其它释放。在仍然其它情况下，使用化学刺激，所述化学刺激裂解寡核苷酸与珠粒的连键，或以其它方式使得寡核苷酸从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包含上述用于包封细胞的聚丙烯酰胺基质，并且可通过暴露于还原剂如dtt而降解以释放附接的寡核苷酸。其它系统和方法的实例描述于美国专利申请公布号2014/0155295和美国专利申请公布号2014/0378345中，所述专利申请各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。211.根据本文所述的方法和系统，包含附接的寡核苷酸的珠粒可与单独细胞共分配，以使得单个珠粒和单细胞包含在单独分区内。当单细胞/单个珠粒占用是一种可能的状态时，应了解，可能经常存在多重占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)，或未占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)。图2中示意性地示出用于共分配细胞和包含条形码寡核苷酸的珠粒的微流体通道结构的实例。如本文其它地方所描述，在一些方面，相当大百分比的全部被占用的分区可包括珠粒和细胞两者，并且在一些情况下，所产生的分区中的一些可未被占用。在一些情况下，所述分区中的一些可具有未1:1分配的珠粒和细胞。在一些情况下，可提供多重占用分区，例如，在单一分区内含有两个、三个、四个或更多个细胞和/或珠粒。如所示，通道区段202、204、206、208和210在通道接点212处流体连通地设置。使包含单独细胞214的水性流通过通道区段202流向通道接点212。如上所述，这些细胞可在分配过程之前悬浮在水性流体中，或者可能已经预先包封。212.同时，包含携带条形码的珠粒216的水性流通过通道区段204流向通道接点212。非水性分配流体216从每个侧通道206和208引入通道接点212中，并且合并的流流动到出口通道210中。在通道接点212内，将来自通道区段202和204的两种组合水性流合并在一起，并且分配至微滴218中，所述微滴包括共分配的细胞214和珠粒216。通过控制在通道接点212处合并的流体中的每一者的流动特征以及控制通道接点的几何结构，可优化分配以在所产生的分区218内实现合适的珠粒、细胞或两者的占用水平。213.在一些情况下，可将裂解剂(例如细胞裂解酶)与珠粒流一起引入分区中，例如流动通过通道区段204，以使得细胞可在分配时或分配之后裂解。在一些情况下，如本文后面所述，细胞膜保持完整，如以允许表征细胞表面标志物。另外的试剂也可添加至呈这种构型的分区，如用于使细胞的dna片段化的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增细胞的核酸片段并将条形码寡核苷酸附接至扩增的片段的dntp。可使用化学刺激(如dtt)来使条形码从它们各自的珠粒释放到分区中。在此类情况下，化学刺激可与通道区段202中的含细胞的流一起提供，以使得条形码的释放仅在两个流已经组合例如在分区218内之后发生。然而，在细胞被包封的情况下，引入常见的化学刺激，例如使寡核苷酸从其珠粒释放并且使细胞从其微胶囊释放的化学刺激通常可从通道接点212上游或连接至所述通道接点的单独的额外侧通道(未示出)提供。214.许多其它试剂可与细胞、珠粒、裂解剂和化学刺激共同分配，包括例如保护试剂如蛋白酶k、螯合剂、核酸延伸、复制、转录或扩增试剂如聚合酶、逆转录酶、可用于基于转座子的方法(如nextera)的转座酶、核苷三磷酸或ntp类似物、引物序列和另外的辅因子(如此类反应中使用的二价金属离子)、连接反应试剂(如连接酶和连接序列)、染料、标记或其它标记试剂。215.例如如本文所描述的通道网络可流体联接至适当的流体部件。例如，入口通道区段(例如通道区段202、204、206以及208)流体联接至它们要递送至通道接点212的适当的材料来源。例如，通道区段202可流体联接至待分析的细胞214的水性悬浮液的来源，而通道区段204可流体联接至珠粒216的水性悬浮液的来源。然后，通道区段206和208可流体连接至非水性流体的一个或多个来源。这些来源可包括从微流体装置的本体结构中所限定或与微流体装置的本体结构连接的简单储库到递送来自装置外来源、歧管的流体的流体导管等多种不同流体部件中的任一种。同样地，出口通道区段210可流体联接至所分配的细胞的接收容器或导管。再次，这可以是微流体装置的本体中所限定的储库，或其可以是用于将所分配的细胞递送至后续工艺操作、仪器或部件的流体导管。216.图8示出与含条形码寡核苷酸的珠粒一起共分配于油乳液中的水性微滴中的单独jurkat细胞的图像。如所示，单独细胞可容易地与单独珠粒共分配。如将理解的，可通过多种方法(包括通过将细胞群体的稀释液提供到微流体系统中)进行单独细胞负载的优化，以实现如本文其它地方所述的每个分区的合适的细胞负载。217.在操作中，一旦裂解，单独细胞的核酸内容物然后可用于在分区内进一步加工，包括例如片段化、扩增和条形编码以及其它功能序列的附接。片段化可通过剪切酶(如核酸内切酶)的共分配来完成，以便将核酸片段化成更小的片段。这些核酸内切酶可包括限制性核酸内切酶，包括ii型和ii型限制性核酸内切酶以及其它核酸裂解酶，如切口核酸内切酶等。在一些情况下，可不实施片段化，并且全长核酸可保留在分区内，或者在包封的细胞或细胞内容物的情况下，可在分配之前例如通过酶方法(例如本文所述的那些)，或通过机械方法(例如机械、声学或其它剪切)进行片段化。218.一旦共分配并且细胞裂解以释放其核酸，置于珠粒上的寡核苷酸就可用于条形编码和扩增那些核酸的片段。简言之，在一个方面，存在于与细胞共分配的珠粒上的寡核苷酸从其珠粒释放到具有细胞的核酸的分区中。寡核苷酸可连同条形码序列包括在其5'端的引物序列。此引物序列可以是意图随机引发细胞的核酸上的许多不同区域的随机寡核苷酸序列，或者它可以是靶向引发细胞的基因组的特定靶向区域的上游的特异性引物序列。219.一旦释放，寡核苷酸的引物部分可与细胞的核酸的互补区退火。也可与细胞和珠粒共分配的延伸反应试剂(例如dna聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 ))然后使用细胞的核酸作为模板延伸引物序列，以产生与引物退火的细胞核酸的链的互补片段，所述互补片段包含寡核苷酸及其相关的条形码序列。将多个引物退火和延伸至细胞核酸的不同部分将产生大量核酸的重叠互补片段，所述片段各自具有指示其所产生的分区的其自身的条形码序列。在一些情况下，这些互补片段本身可用作由分区中存在的寡核苷酸引发的模板，以产生补体的互补序列，其再次包含条形码序列。在一些情况下，配置这种复制过程，以使得当第一互补序列被复制时，它在其末端或其末端附近产生两个互补序列，以允许形成可降低分子为产生进一步迭代拷贝的基础的能力的发夹结构或部分发夹结构。如本文所述，细胞的核酸可包括细胞内的任何核酸，包括例如细胞的dna(例如基因组dna)、rna(例如信使rna)等。例如，在一些情况下，本文描述的方法和系统用于表征表达的mrna，包括例如这种mrna的存在和定量，并且可包括rna测序过程作为表征过程。或者或另外，与细胞一起分配的试剂可包括用于将mrna转化为cdna的试剂(例如逆转录酶和试剂)，以促进使用dna测序的测序过程。在一些情况下，其中待表征的核酸包含rna(例如mrna)，这一点的一个实例的示意图在图3中示出。220.如所示，包含条形码序列的寡核苷酸与样品核酸304一起共分配在例如乳液中的微滴302中。寡核苷酸308可提供在与样品核酸304共分配的珠粒306上，所述寡核苷酸可从珠粒306释放，如图a所示。除了一个或多个功能序列(例如序列310、314和316)外，寡核苷酸308还可包含条形码序列312。例如，寡核苷酸308被示出为包含条形码序列312，以及可用作给定测序系统的附接或固定序列的序列310，例如用于附接于illumina或系统的流动池中的p5序列。如所示，寡核苷酸还包含引物序列316，其可包含用于引发样品核酸304的部分的复制的随机或靶向n‑聚体。寡核苷酸308内还包含序列314，其可提供用于通过测序系统中的合成反应引发聚合酶介导的模板指导的测序的测序引发区，如“读段1”或r1引发区。如将理解的，可选择功能序列以与各种不同的测序系统，例如454测序、iontorrentproton或pgm、illuminax10等以及其要求兼容。在一些情况下，条形码序列312、固定序列310和r1序列314可为附接至给定珠粒的所有寡核苷酸共有。引物序列316对于随机n‑聚体引物可变化，或者对于某些靶向应用可为给定珠粒上的寡核苷酸共有。此外，在一些情况下，可如美国专利公布号20160257984中所描述产生带条形码寡核苷酸，所述专利以引用的方式整体并入本文。221.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含使其不能被聚合酶延伸的修饰。当结合至样品中的核酸用于引物延伸反应时，寡核苷酸可充当模板，而不是引物。当寡核苷酸还包含条形码(例如，寡核苷酸是报告寡核苷酸)时，这种设计可通过增加寡核苷酸与未条形编码的样品核酸之间的亲和力来增加分子条形编码的效率，并消除衔接子伪影的潜在形成。在一些情况下，寡核苷酸可包含随机n‑聚体序列，其用使其不能被聚合酶延伸的修饰加帽。在一些情况下，可设计随机n‑聚体序列的组成以最大化与游离未条形编码的ssdna分子的结合效率。所述设计可包括具有较高gc含量的随机序列组成、在特定位置具有固定g或c的部分随机序列、鸟苷的使用、锁核酸的使用或其任何组合。222.用于通过聚合酶阻断引物延伸的修饰可以是不同长度的碳间隔基团或双脱氧核苷酸。在一些情况下，所述修饰可以是具有脱嘌呤或脱嘧啶结构的无碱基位点、碱基类似物或磷酸主链的类似物，如通过酰胺键连接的n‑(2‑氨基乙基)‑甘氨酸的主链、四氢呋喃或1’,2’‑双脱氧核糖。所述修饰还可以是尿嘧啶碱基、2'ome修饰的rna、c3‑18间隔区(例如，具有3‑18个连续碳原子的结构，如c3间隔区)、乙二醇多聚体间隔区(例如，间隔区18(六乙二醇间隔区)、生物素、二脱氧核苷酸三磷酸、乙二醇、胺或磷酸酯。223.图21示出具有这种修饰的寡核苷酸。双链寡核苷酸2110包含在其3'端具有随机n‑聚体序列的单链dna(ssdna)退火区。来自样品的未条形编码的ssdna2120结合至寡核苷酸2110。寡核苷酸2110的随机n‑聚体序列在3'端上具有修饰(显示为“x”)。当寡核苷酸2110和未条形编码的ssdna2120在引物延伸反应中彼此结合时，可使用寡核苷酸3310作为模板延伸仅未条形编码的ssdna2120。224.在一些情况下，具有随机n‑聚体序列的寡核苷酸可经由u‑切除元件(例如具有尿嘧啶的ssdna序列)与固体载体(例如珠粒)偶联。图22示出这种寡核苷酸的实例。双链寡核苷酸2210包含ssdna退火区，所述ssdna退火区在其3'端含有随机n‑聚体序列。寡核苷酸2210经由具有尿嘧啶的ssdna2211偶联至珠粒。寡核苷酸2210还包含防止通过聚合酶延伸的修饰。寡核苷酸2210可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(以除去尿嘧啶)和核酸内切酶(以诱导ssdna断裂)从珠粒释放，从而产生释放的寡核苷酸2230。寡核苷酸2220包含ssdna引发区，其具有与寡核苷酸2210类似的设计。在一些情况下，ssdna退火区与ssdna引发区之间的差异分别是存在或不存在封闭基团(例如，“x”)。未封闭的ssdna可延伸并充当引物，而封闭的ssdna可充当被动退火序列。225.如将理解的，在一些情况下，功能序列可包括可用于rna‑seq应用的引物序列。例如，在一些情况下，所述寡核苷酸可包含用于引发rna‑seq的rna逆转录的聚‑t引物。在其它情况下，除了常见的条形码序列之外，给定分区中的寡核苷酸(例如包含在单独珠粒上)可包含多种类型的引物序列，如dna测序和rna测序引物，例如包含在与珠粒偶联的寡核苷酸内的聚‑t引物序列。在此类情况下，单个分配的细胞可进行dna和rna测序过程两者。226.标记剂或锚定剂上的引物(例如，用于rna‑seq应用的引物)可以是靶特异性引物。靶特异性引物可结合至rna分子或dna分子(例如来自rna的互补dna(cdna)或来自细胞的内源性dna)中的特定序列。例如，所述特定序列可以是不在rna分子的聚‑a尾或其cdna中的序列。在一些情况下，靶特异性引物可结合至rna分子，如mrna分子或非编码rna分子，例如rrna、trna、mrna或mirna分子。在一些情况下，靶特异性引物可结合至引入细胞的rna分子。在一些情况下，引入细胞的rna分子可以是用于基因编辑方法中的rna分子(例如，成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)rna(crrna)或用于crispr基因编辑的引导rna)。例如，靶特异性引物可结合至crrna以用于鉴定引入细胞的crrna和/或确定crrna对细胞的转录组的影响。在一些情况下，靶特异性引物可用于确定疾病(例如癌症)相关基因的拷贝数，同时分析转录组的其余部分。在其它情况下，靶特异性引物可用于分析来自感染细胞的病原体的rna分子，例如用于区分病原体感染的细胞和非病原体感染的细胞和/或确定病原体如何改变细胞转录组。在一些情况下，靶特异性引物可结合至dna分子，例如来自细胞的内源性dna分子，或合成dna分子。例如，靶特异性引物可结合至条形码，例如细胞的条形码(例如，细胞内或细胞表面上)、蛋白质的条形码(例如，抗体条形码)或核酸的条形码(例如，crispr条形码)。227.靶特异性引物可与一种或多种条形码、一种或多种umi、mrna的一种或多种聚‑t引物和/或用于相同不同寡核苷酸中的总rna的一种或多种随机n‑聚体引物(随机物)组合。在一些情况下，例如，如图23a所示，本文公开的珠粒可包含具有靶特异性引物的寡核苷酸和具有聚‑t引物的一种或多种寡核苷酸。在一些情况下，例如，如图23b所示，珠粒可具有多种寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含靶特异性引物。在一些情况下，例如，如图23c所示，珠粒可具有多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含聚‑t引物)。在一些情况下，例如，如图24所示，珠粒可具有多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含用于总rna的随机n‑聚体引物)。228.在珠粒上，可调整具有靶特异性引物的寡核苷酸与具有非特异性(聚‑t或随机n‑聚体)引物的寡核苷酸的比例以匹配特定应用的需要。在一些情况下，珠粒上的至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的寡核苷酸可包含靶特异性引物。在一些情况下，珠粒上的至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的寡核苷酸可包含非特异性(聚‑t或随机n‑聚体)引物。寡核苷酸可通过在珠粒上附接(例如，通过连接)一个或多个寡核苷酸主链且然后将一个或多个引物序列附接(例如，通过连接)至主链来制备。229.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可以是夹板寡核苷酸。夹板寡核苷酸可包含两种或更多种不同的引物。所述引物可具有不同的功能。例如，夹板寡核苷酸可包含以下中的两种或更多种：聚‑t引物、随机n‑聚体引物和靶特异性引物。230.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含能够结合或连接至测定引物的衔接子。衔接子可允许锚定剂或标记剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定中。测定引物可包含引发区和能够结合或连接至衔接子的序列。在一些情况下，所述衔接子可以是非特异性引物(例如，5'突出端)，并且测定引物可包含可连接至5'突出端的3'突出端。测定引物上的引发区可以是本文所述的任何引物，例如聚‑t引物、随机n‑聚体引物、靶特异性引物或标记剂捕获序列。图25a示出示例性衔接子和测定引物。寡核苷酸2510包含衔接子2511，其是包含10个核苷酸的5'突出端。衔接子2511可连接至测定引物，所述测定引物各自包含与衔接子2511的5'突出端互补的包含10个核苷酸的3'突出端。锚寡核苷酸可通过附接至为所述测定设计的测定引物而用于任何测定中。图26b示出示例性衔接子和测定引物，所述衔接子和测定引物允许锚定剂或标记剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定中。带条形码的衔接子寡核苷酸2561附接至珠子2560如凝胶珠粒，并且包含聚(dt)序列2562。图26c示出示例性夹板寡核苷酸，其包含促进与带条形码的衔接子寡核苷酸2561偶联的聚‑a序列和促进与测定引物偶联的第二序列(显示为“xxx”、“yyy”和“zzz”)。测定引物包含与夹板寡核苷酸第二序列互补的序列(显示为“x'x'x'”、“y'y'y'”和“z'z'z'”)和确定测定引物功能性的测定特异性序列(例如，如本文所述的聚‑t引物、随机n‑聚体引物、靶特异性引物或标记剂捕获序列)。231.在一些情况下，带条形码的衔接子包含例如具有3'端3rg的转换寡核苷酸。图26示出珠粒(如凝胶珠粒)，其包含能够进行模板转换(例如，逆转录酶模板转换)、但对任何特定测定不具有特异性的用3rg序列官能化的带条形码衔接子寡核苷酸。添加至反应的测定引物通过结合质靶向分子确定特定测定，并通过逆转录酶/聚合酶延伸，随后模板转换到带条形码的衔接子寡核苷酸上以并入条形码和其它功能序列。引发区确定所述测定，并且在一些实施方案中，包含用于mrna分析的聚‑t序列、用于gdna分析的随机引物或可结合与标记剂(例如，抗体)偶联的核酸分子或可经由靶向引发序列在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列。232.基于引物序列316的存在，寡核苷酸可引发样品核酸，如图b所示，其允许使用也与珠粒306和样品核酸304共分配的聚合酶和其它延伸试剂延伸寡核苷酸308和308a。如图c所示，对于随机n‑聚体引物在可与样品核酸304的多个不同区域退火的寡核苷酸延伸之后；产生核酸的多个重叠互补序列或片段，例如片段318和320。尽管包含与样品核酸的部分互补的序列部分，例如序列322和324，但这些构建体在本文中通常称为包含样品核酸304的片段，其具有附接的条形码序列。233.如图d所示，然后可例如通过序列分析对带条形码的核酸片段进行表征，或者可在所述过程中进一步扩增它们。例如，也从珠粒306释放的另外的寡核苷酸(例如寡核苷酸308b)可引发片段318和320。这对于片段318示出。特别地，再次，基于寡核苷酸308b中的随机n‑聚体引物316b(其在一些情况下可与给定分区中的其它随机n‑聚体，例如引物序列316不同)的存在，寡核苷酸与片段318退火并且延伸以产生片段318的至少一部分的互补序列326，所述片段318包含序列328，其包含样品核酸序列的一部分的重复。继续延伸寡核苷酸308b，直至其通过片段318的寡核苷酸部分308复制。如图d所示，寡核苷酸可被配置成例如在通过片段318内包含的寡核苷酸308的序列316和314复制之后在给定点通过聚合酶促使复制的终止。如本文所述，这可通过包括例如并入不能被所用聚合酶加工的不同核苷酸和/或核苷酸类似物在内的不同的方法实现。例如，这可包括在序列区312内包含含尿嘧啶的核苷酸，以防止非尿嘧啶耐受性聚合酶停止所述区域的复制。结果，产生片段326，其在一端包含全长寡核苷酸308b，包括条形码序列312、附接序列310、r1引物区314和随机n‑聚体序列316b。在所述序列的另一端可包括第一寡核苷酸308的随机n‑聚体的互补序列316'，以及r1序列的全部或一部分的互补序列，如序列314'所示。r1序列314及其互补序列314'然后能够一起杂交以形成部分发夹结构328。如将理解的，因为随机n‑聚体在不同寡核苷酸之间不同，这些序列及其互补序列可能不预期参与发夹形成，例如序列316'(其是随机n‑聚体316的互补序列)可能不预期与随机n‑聚体序列316b互补。对于其它应用，例如靶向引物，情况可能并非如此，其中n‑聚体可能在给定分区内的寡核苷酸中是共有的。234.通过形成这些部分发夹结构，它允许从进一步复制中除去样品序列的第一级重复，例如防止拷贝的迭代复制。部分发夹结构还为随后加工所产生的片段(例如片段326)提供有用的结构。235.通常，进行细胞核酸的扩增，直到分区内的带条形码的重叠片段构成细胞基因组的特定部分或全部至少1x覆盖，所述基因组或其相关目标部分的至少2x、至少3x、至少4x、至少5x、至少10x、至少20x、至少40x或更多覆盖。一旦产生带条形码片段，它们就可在适当的测序系统(例如illumina或x10系统)上直接测序，或者它们可进行另外的加工，如进一步扩增、附接用于反向读数的其它功能序列(例如第二测序引物)、样品索引序列等。236.然后可汇集来自多个不同分区的所有片段以在如本文所述的高通量测序仪上进行测序，其中汇集的片段包含源自不同细胞或细胞小群体的核酸的大量片段，但其中来自给定细胞的核酸将共享相同的条形码序列。特别地，因为每个片段关于其原始分区编码，并且因此编码其单细胞或细胞小群体，所以所述片段的序列可基于条形码的存在归属回至所述细胞或那些细胞，其还将有助于将来自多个分区的各种序列片段应用于不同细胞的单独基因组的组装。这在图4中示意性地示出。如一个实例中所示，来自第一细胞400的第一核酸404和来自第二细胞402的第二核酸406各自与它们自身的多组条形码寡核苷酸一起分配，如上所述。核酸可包含染色体、整个基因组或来自细胞的其它大核酸。237.在每个分区内，然后加工每个细胞的核酸404和406以分别提供一个或多个第一片段的第二片段的重叠集，例如第二片段集408和410。这种加工还为第二片段提供条形码序列，所述条形码序列对于源自特定第一片段的每个第二片段是相同的。如所示，第二片段集408的条形码序列由“1”表示，而片段集410的条形码序列由“2”表示。可使用条形码的多样文库来差异地条形编码化大量不同的片段集。然而，不必将来自不同第一片段的每个第二片段集用不同的条形码序列进行条形编码。在一些情况下，可同时加工多个不同的第一片段以包含相同的条形码序列。本文其它地方详细描述了不同的条形码文库。238.然后可汇集例如来自片段集408和410的带条形码片段以用于使用例如可通过从illumina或thermo‑fisher,inc的iontorrent分部获得的合成技术的序列进行测序。一旦测序，序列读数412可归属于它们各自的片段集，例如，如聚集的读数414和416所示，至少部分地基于所包含的条形码，并且在一些情况下，部分地基于片段本身的序列。然后组装每个片段集的归属序列读数以提供每个细胞核酸的组装序列，例如序列418和420，其进而可归属于单独细胞，例如细胞400和402。239.虽然在分析细胞内存在的遗传物质方面进行了描述，但本文所述的方法和系统可具有更广泛的适用性，包括通过允许将试剂和/或剂分配至单独细胞并响应于那些试剂和/或剂提供那些细胞的归因分析或表征来表征单独细胞或细胞群体的其它方面的能力。这些方法和系统在能够表征细胞以例如用于研究、诊断或病原体鉴定方面可能是有价值的。举例来说，广泛范围的不同细胞表面特征(例如细胞表面蛋白如分化簇或cd蛋白质)在如癌症的疾病的表征中具有显著诊断相关性。240.在一个特别有用的应用中，本文描述的方法和系统可用于表征细胞特征，如细胞表面特征。细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。特别地，本文所述的方法可用于将一种或多种标记剂附接至这些细胞特征，所述细胞特征当如上所述分配时可例如使用dna测序技术进行条形编码并分析，以确定单独细胞或细胞群体的此类细胞特征的存在并且在一些情况下相对丰度或量。241.在特定实例中，可提供与第一组核酸报告分子相关的潜在细胞表面特征标记剂的文库，例如，其中不同的报告寡核苷酸序列与特定标记剂相关，并且因此能够结合至特定细胞表面特征。细胞表面特征标记剂可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架。在一些方面，所述文库的不同成员可通过不同的寡核苷酸序列标记的存在来表征，例如，针对第一类型的细胞表面蛋白或受体的抗体可具有与其缔合的第一已知的报告寡核苷酸序列，而针对第二受体蛋白的抗体可具有与其缔合的不同的已知报告寡核苷酸序列。在共分配之前，可将细胞与标记剂文库一起孵育，所述标记剂文库可代表针对广泛的不同细胞表面特征(例如受体，蛋白质等)的抗体，并且包含它们相关的报告寡核苷酸。可从细胞洗去未结合的标记剂，并且然后可将细胞与上述条形码寡核苷酸一起共分配。结果，分区可包含一种或多种细胞，以及结合的标记剂和它们已知的相关报告寡核苷酸。242.不需要裂解分区内的细胞，然后可使报告寡核苷酸进行上述用于细胞核酸的条形编码操作，以产生带条形码的报告寡核苷酸，其中报告寡核苷酸的存在可指示特定细胞表面特征的存在，并且条形码序列将允许基于与给定单独细胞或细胞群体共分配的条形码序列将不同细胞表面特征的范围归属于所述细胞或细胞群体。结果，可在更广泛的细胞群体内产生细胞表面特征的逐细胞概况。下文更详细地描述本文所述述的方法和系统的这个方面。243.此实例在图5中示意性地示出。如所示，将由细胞502和504代表的细胞群体与细胞表面相关标记剂(例如抗体、抗体片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架等)文库，其中每种不同类型的结合基团包含与其缔合的相关核酸报告分子，显示为标记剂和相关的报告寡核苷酸506、508、510和512(其中报告寡核苷酸由不同阴影的圆圈表示)。当细胞表达由标记剂文库结合的表面特征时，标记剂及其相关的报告寡核苷酸可变得与细胞表面特征缔合或偶联。然后可如本文所述将单独细胞与它们的相关标记剂/报告寡核苷酸一起分别分配到单独的分区，例如，微滴514和516，以及如本文其它地方所述含有单独条形码寡核苷酸(例如，锚寡核苷酸)的珠粒(例如珠粒518和520)中。与本文所述的其它实例一样，带条形码寡核苷酸可从珠粒释放并用于将条形码序列与具有条形码的每个分区内存在的报告寡核苷酸附接，所述条形码是给定分区共有的，但在不同的分区之间广泛变化。例如，如图5所示，与分区514中的细胞502缔合的报告寡核苷酸用条形码序列522条形编码，而与分区516中的细胞504缔合的报告寡核苷酸用条形码序列524条形编码。结果，一者提供有反映细胞的表面特征的寡核苷酸文库，如报告分子所反映的，但由于共同的条形码序列基本上可归属于单独细胞，从而允许细胞的表面特征的单细胞水平剖析。如将理解的，这种方法不限于细胞表面受体，而是可用于鉴定多种特定细胞结构、化学或其它特征的存在。244.本文描述的单细胞加工和分析方法以及系统可用于多种应用，包括特定单独细胞的分析、不同细胞类型的群体内的不同细胞类型的分析、用于环境、人类健康、流行病学法医学或任何多种不同应用的大细胞群体的分析和表征。245.本文所述的单细胞分析方法的特别有价值的应用是在患病细胞的测序和表征中。患病细胞可具有改变的代谢性质、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的实例包括炎性病症、代谢病症、神经系统病症和癌症。246.特别感兴趣的是癌细胞。特别地，传统的分析技术(包括上文提到的整体测序方法)在挑选癌细胞的基因组构成的小变异方面不是很擅长，特别是其中那些存在于大量正常组织细胞中。此外，即使在肿瘤细胞之间，也可存在广泛变异并且可通过测序的整体方法掩蔽(参见，例如，patel等人,single‑cellrna‑seqhighlightsintratumoralheterogeneityinprimaryglioblastoma,sciencedoi:10.1126/science.1254257(2014年6月12日在线公开)。癌细胞可源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或作为循环肿瘤细胞获得，并进行上述分配过程。通过分析，可将单独细胞序列鉴定为源自单细胞或细胞小群组，并区分那些与正常组织细胞序列。247.癌细胞的非限制性实例包括诸如以下的癌症的细胞：棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性成髓细胞白血病伴成熟、急性髓系树突状细胞白血病、急性髓系白血病、急性前髓细胞性白血病、成釉细胞瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺样瘤、肾上腺皮质癌、成人t细胞性白血病、侵袭性nk细胞白血病、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、间变性甲状腺癌、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、b细胞白血病、b细胞淋巴瘤、bellini导管癌、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发部位不明的癌症、类癌瘤、瘤、原位癌、阴茎癌、原发部位不明癌、癌肉瘤、卡斯特莱曼病、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、慢性中性粒细胞性白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、德戈斯病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促纤维增生性小圆细胞瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、胚胎性癌、内胚层窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、内膜样瘤、与肠病相关的t细胞淋巴瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤文氏家族肿瘤、尤文氏家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节神经胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、胚组织瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠性滋养层细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、大脑神经胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺胚细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞性白血病、毛细胞性白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾t细胞淋巴瘤、遗传性乳腺‑卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒‑单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、肝门胆管癌、库肯勃瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇及口腔癌、脂肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴系白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、malt淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵膈生殖细胞瘤、纵膈肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、麦克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、转移性膀胱上皮癌、苗勒氏混合瘤、单核细胞白血病、口腔癌、粘液性瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓系白血病、髓系肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、赘生瘤、神经细胞瘤、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、乳房佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、神经节细胞瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周围上皮样细胞瘤、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前驱t‑淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假性粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上的nut基因的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里希特转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、雪旺氏细胞瘤、皮脂腺癌、继发性瘤、精原细胞瘤、浆液瘤、塞‑莱二氏细胞瘤、性索‑间质肿瘤、塞泽里综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、蓝色小圆形细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩展性黑素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮‑间质瘤、滑膜肉瘤、t细胞急性成淋巴细胞性白血病、t细胞大颗粒淋巴细胞白血病、t细胞白血病、t细胞淋巴瘤、t细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、末期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、凡‑莫二氏综合征、疣状癌、视路胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、沃辛瘤、维尔姆斯肿瘤以及其组合。248.在待分析癌细胞的情况下，可用于附接条形码序列和/或扩增反应的任何各种操作中的引物序列可包含靶向与癌症相关或疑似与癌症相关的基因或基因区域的基因特异性序列。例如，这可包括基因或基因区域，其中与癌性病状相关的突变(例如，插入、缺失、多态性、拷贝数变化和基因融合)的存在疑似存在于细胞群体中。249.与癌细胞分析一样，通过分析胎儿细胞来分析和诊断胎儿健康或异常是使用常规技术的困难任务。特别地，在不存在相对侵入性程序的情况下，如获得胎儿细胞样品的羊膜穿刺术可采用从母体循环收获那些细胞。如将理解的，此类循环胎儿细胞构成所述循环的总体细胞群体的极小部分。结果，进行复杂分析以表征所获得的数据可能来源于胎儿细胞而不是母体细胞。然而，通过采用本文所述的单细胞表征方法和系统，可将遗传构成归属于单独细胞，并基于它们各自的遗传构成将那些细胞分类为母体或胎儿。此外，胎儿细胞的遗传序列可用于鉴定许多遗传病症中的任一种，包括例如非整倍性如唐氏综合症、爱德华兹综合征和帕陶综合征(patausyndrome)。此外，胎儿细胞的细胞表面特征可用于鉴定许多病症或疾病中的任一种。250.同样感兴趣的是免疫细胞。本文公开的方法、组合物和系统可用于免疫组库的序列分析，包括基因组学、蛋白质组学和细胞表面特征。对免疫组库的潜在信息的分析可在理解免疫系统的状态和功能方面提供显著改进。251.可使用本文描述的方法分析的免疫细胞的非限制性实例包括b细胞、t细胞(例如，细胞毒性t细胞、天然杀伤t细胞、调控性t细胞和t辅助细胞)、天然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞；骨髓细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突细胞。在一些实施方案中，使用本文公开的方法分析单独t细胞。在一些实施方案中，使用本文公开的方法分析单独b细胞。252.免疫细胞表达与免疫功能相关的各种适应性免疫受体，如t细胞受体和b细胞受体。t细胞受体和b细胞受体通过特异性地识别和结合至抗原并帮助其破坏而在免疫应答中起作用。253.t细胞受体或tcr是在t细胞表面上发现的分子，其通常负责识别作为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽的抗原片段。tcr通常是两条链的异二聚体，所述链各自是免疫球蛋白超家族的成员，具有n‑末端可变(v)结构域和c末端恒定结构域。在人中，在95％的t细胞中，tcr由α(α)和β(β)链组成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链组成。此比例可在个体发生和患病状态以及不同物种中变化。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)接合时，通过信号转导活化t淋巴细胞。254.tcr的两条链各自含有基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段、多样性‘d’基因区段和连接‘j’基因区段。tcrα链通过v和j区段的重组产生，而β链通过v、d和j区段的重组产生。类似地，tcrγ链的产生涉及v和j基因区段的重组，而tcrδ链的产生通过v、d和j基因区段的重组发生。这些特定区域(对于α或γ链为v和j，或对于β或δ链为v、d和j)的交叉对应于对抗原‑mhc识别重要的cdr3区。互补决定区(例如，cdr1、cdr2和cdr3)或高变区是抗原受体(例如，t细胞受体和免疫球蛋白)的可变结构域中可补充抗原的序列。在cdr3中发现大多数多样性cdr，其中多样性由t淋巴细胞发育期间的体细胞重组事件产生。在基因排列过程中出现的独特核苷酸序列可称为克隆型。255.b细胞受体或bcr是在b细胞表面上发现的分子。bcr的抗原结合部分由膜结合抗体组成，所述膜结合抗体与大多数抗体(例如免疫球蛋白)一样具有独特且随机确定的抗原结合位点。bcr的抗原结合部分包括一种同种型的膜结合的免疫球蛋白分子(例如，igd、igm、iga、igg或ige)。当b细胞通过其与同源抗原首次相遇活化时，所述细胞增殖并分化以产生分泌抗体的血浆b细胞和记忆b细胞群体。各种免疫球蛋白同种型的生物学特征、结构、靶特异性和分布不同。存在多种分子机制以产生初始多样性，包括多个位点处的遗传重组。256.bcr由编码抗体重链和轻链的两种基因igh和igk(或igl)组成。免疫球蛋白通过基因区段之间的重组、这些区段的接点处的序列多样化以及整个基因的点突变形成。每个重链基因含有三个不同基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段、多样性‘d’基因区段和连接‘j’基因区段。每个轻链基因含有蛋白质的可变区的两个不同基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段和连接‘j’基因区段。重组可产生具有v、d和j区段中的每一个之一的分子。此外，可缺失若干碱基，并且在两个接点中的每一个处添加其它碱基(称为n和p核苷酸)，从而产生进一步多样性。在b细胞活化后，发生通过体细胞超突变的亲和力成熟过程。在此过程中，活化的b细胞的子代细胞在整个基因中累积不同的体细胞突变，在cdr区中具有更高的突变浓度，从而导致产生对抗原具有更高亲和力的抗体。除了体细胞超突变之外，活化的b细胞经历同种型转换过程。具有相同可变区段的抗体可具有不同的形式(同种型)，这取决于恒定区段。尽管所有初始b细胞表达igm(或igd)，但活化的b细胞主要表达igg，但也表达igm、iga和ige。从igm(和/或igd)转换为igg、iga或ige的这种表达通过重组事件发生，从而引起一个细胞专门产生特定同种型。在基因排列过程中出现的独特核苷酸序列可类似地称为克隆型。257.在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析来自免疫细胞的各种tcr和bcr序列，例如各种克隆型。在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析tcrα链、tcrβ链、tcrδ链、tcrγ链或其任何片段(例如，包括vdj或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合以及其片段的组合)的序列。在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析b细胞受体重链、b细胞受体轻链或其任何片段(例如，包括vdj或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合以及其片段的组合)的序列。258.在待分析免疫细胞的情况下，可用于附接条形码序列和/或扩增反应的任何各种操作中的引物序列可包含靶向免疫细胞蛋白(例如免疫受体)的基因或基因区域的基因特异性序列。此类基因序列包括但不限于以下各项的序列：各种t细胞受体α可变基因(trav基因)、t细胞受体α连接基因(traj基因)、t细胞受体α恒定基因(trac基因)、t细胞受体β可变基因(trbv基因)、t细胞受体β多样性基因(trbd基因)、t细胞受体β连接基因(trbj基因)、t细胞受体β恒定基因(trbc基因)、t细胞受体γ可变基因(trgv基因)、t细胞受体γ连接基因(trgj基因)、t细胞受体γ恒定基因(trgc基因)、t细胞受体δ可变基因(trdv基因)、t细胞受体δ多样性基因(trdd基因)、t细胞受体δ连接基因(trdj基因)以及t细胞受体δ恒定基因(trdc基因)。259.mhc(包括全部或部分mhc‑肽)可用作与寡核苷酸偶联的标记剂，所述寡核苷酸包含鉴定其相关mhc(并且因此例如mhc的tcr结合配偶体)的条形码序列。在一些情况下，mhc用于分析t细胞(如tcr)的一种或多种细胞表面特征。在一些情况下，多个mhc在较大的复合物中缔合在一起，以经由多种配体结合协同作用改善mhc与tcr的结合亲和力。260.例如，如图56a中所示，mhc肽可单独与生物素缔合并结合至链霉抗生物素蛋白部分，以使得链霉抗生物素蛋白部分包含多个mhc部分。这些部分中的每一个都可结合至tcr，以使得链霉抗生物素蛋白经由多重mch/tcr结合相互作用结合至靶t细胞。这些多重相互作用协同作用并且能够显著提高结合亲和力。这种改善的亲和力可改善t细胞的标记并且还降低标记将从t细胞表面解离的可能性。261.如图56b所示并且继续此实施例，带条形码寡核苷酸5601可用链霉抗生物素蛋白5602修饰并与多个生物素化的mhc5606分子接触，以使得生物素化的mhc5606分子与链霉抗生物素蛋白缀合的带条形码寡核苷酸5601偶联。结果是带条形码mhc多聚体复合物5608。如图56b所示，寡核苷酸5601条形码序列5602可将mhc5604鉴定为其相关的标记，并且还包括用于与其它寡核苷酸杂交的序列(例如，包含‘间隔区ccc’的序列5603和包含‘间隔区pcr柄’的序列5605)。一种这样的其它寡核苷酸是寡核苷酸5611，其包含互补序列5615(例如，对应于ccc的rgrgrg)、条形码序列5613以及例如像如图56c中所示的umi5614。在一些情况下，寡核苷酸5611可首先与珠粒缔合并从珠粒释放。然而，在任何情况下，寡核苷酸5611可与mhc‑寡核苷酸复合物5608的寡核苷酸5601杂交。然后可在引物延伸反应中延伸杂交的寡核苷酸5611和5601，以使得产生包含对应于两个条形码序列5613和5604中的每一个的序列的构建体。在一些情况下，这些相应序列中的一个或两个可以是寡核苷酸5611或5601中的原始序列的互补序列。可任选地进一步加工所得构建体中的一种或两种(例如，以添加任何另外的序列和/或用于清除)并进行测序。如本文其它地方所述，源自条形码序列5613的这种构建体中的序列可用于鉴定分区或分区内的细胞，并且源自条形码序列5604的序列可用于鉴定细胞表面上的特定tcr，从而允许多测定分析。262.此外，尽管图56b和图56c中所示的实例显示链霉抗生物素蛋白直接与其寡核苷酸偶联，所述链霉抗生物素蛋白也可与杂交寡核苷酸偶联，所述杂交寡核苷酸然后与鉴定的带条形码寡核苷酸杂交，类似于图52b(图ii)中所示的示例性方案和本文其它地方描述的。263.从较大的不同细胞群体表征单独细胞的能力在环境测试以及法医学分析中也具有重要价值，其中样品可就其本质而言相对于正针对其测试样品的细胞由不同的细胞群体和其它“污染”样品的物质组成，例如在性侵犯和其它暴力犯罪等的法医学分析中用于例如环境和食品安全测试、受害者和/或犯罪者细胞的环境指示生物、有毒生物等。264.上述单细胞测序和表征方法的其它有用应用是在神经科学研究和诊断领域。特别地，神经细胞可包含长散布核元件(line)或可在基因组周围移动的‘跳跃’基因，其引起每个神经元与其相邻细胞不同。研究已经表明，人脑中line的数量超过其它组织(例如心脏和肝脏组织)，具有80与300个之间的独特插入(参见，例如，参见例如，coufal,n.g.等人nature460,1127–1131(2009))。这些差异被认为与个人对神经系统病症的易感性有关(参见例如，muotri,a.r.等人nature468,443–446(2010))，或者为大脑提供响应于挑战的多样性。因此，本文所述的方法可用于单独神经细胞的测序和表征。265.本文所述的单细胞分析方法也可用于分析基因表达，就rna转录物的鉴定和它们的定量而言。特别地，使用本文所述的单细胞水平分析方法，可分离和分析单独细胞、细胞群体或细胞群体子集中存在的rna转录物。特别地，在一些情况下，条形码寡核苷酸可被配置为引发、复制并因此从单独细胞产生rna的带条形码片段。例如，在一些情况下，条形码寡核苷酸可包含mrna特异性引发序列，例如允许在逆转录反应中引发和复制mrna的聚‑t引物区段或其它靶向引发序列。或者或另外，可使用条形码寡核苷酸的随机n‑聚体引物区段进行随机rna引发。266.图6提供使用本文所述的方法在单独细胞中用于rna表达分析的一种示例性方法的示意图。如所示，在操作602，针对活细胞分选含细胞的样品，将所述或细胞定量并稀释用于随后的分配。在操作604，单独细胞分别与带有如本文所述的条形编码寡核苷酸的凝胶珠粒共分配。在操作606，细胞被裂解并且带条形码寡核苷酸释放到分区中，其中它们在操作608例如借助于与mrna的聚‑a尾互补的聚‑t引物序列与mrna相互作用并与mrna杂交。使用聚‑t条形码寡核苷酸作为引发序列，在操作610进行逆转录反应以合成包含条形码序列的mrna的cdna。带条形码的cdna然后在操作612进行另外的扩增(例如使用pcr方法)，在操作614纯化，然后将它们置于核酸测序系统上以确定cdna序列及其相关的条形码序列。在一些情况下，如所示，操作602至608可在试剂保留在其原始微滴或分区中时发生，而操作612至616可在本体中发生(例如，在分区外)。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作612至616。在一些情况下，在乳液破乳后，可用核酸外切酶消化条形码寡核苷酸。在引物消化后，可通过乙二胺四乙酸(edta)抑制核酸外切酶活性。在一些情况下，操作610可基于逆转录混合物(例如逆转录酶和相关试剂)的共分配在分区内进行，或者它可在本体中进行。267.除寡核苷酸条形码序列外，条形码寡核苷酸的结构可包含许多序列元件。如上所述用于rna分析的条形码寡核苷酸的一个实例示于图7中。如所示，整个寡核苷酸702通过可释放的连键706(如二硫化物接头)与珠粒704偶联。寡核苷酸可包括用于后续加工的功能序列，如功能序列708，其可包括以下中的一种或多种：测序仪特异性流动细胞附接序列，例如用于illumina测序系统的p5序，以及测序引物序列，例如用于illumina测序系统的r1引物。条形码序列710包含在用于条形编码样品rna的结构内。mrna特异性引发序列，如聚‑t序列712也包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段714以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。此锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，这将确保聚‑t区段更可能在mrna的聚‑a尾的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段716。在一些情况下，这一另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，例如，作为跨与单个珠粒偶联的单独寡核苷酸变化的随机序列(例如，如随机n‑聚体序列)，而条形码序列710在栓系至单独珠粒的寡核苷酸中可以是恒定的。此独特序列用于提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以允许定量原始表达的rna的数量。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。这种独特分子标识符(umi)序列区段可包含寡核苷酸序列内的5至约8个或更多个核苷酸。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更长。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更长。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更短。在一些情况下，寡核苷酸可包含靶特异性引物。靶特异性引物可结合至rna分子或源自其的dna分子中的特定序列。例如，特定序列可以是不在聚‑a尾中的序列。268.在操作中，并且参考图6和图7，细胞与带有条形码的珠粒共分配并裂解，同时带条形码寡核苷酸从所述珠粒释放。释放的条形码寡核苷酸的聚‑t部分然后与mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段然后引发mrna的逆转录以产生mrna的cdna，但其包含条形码寡核苷酸的序列区段708‑716中的每个。再次，因为寡核苷酸702包含锚定序列714，它将更可能与mrna的聚‑a尾的序列端杂交并在所述序列端处引发逆转录。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段710。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。转录物然后可扩增、净化并测序以鉴定mrna的cdna序列，以及对条形码区段和独特序列区段进行测序。269.虽然描述了聚‑t引物序列，但其它靶向或随机引发序列也可用于引发逆转录反应。同样地，尽管描述为将带条形码寡核苷酸与裂解的细胞的内容物一起释放到分区中，但是应当理解，在一些情况下，凝胶珠粒结合的寡核苷酸可用于杂交并捕获凝胶珠粒的固相上的mrna，以促进rna与其它细胞内容物的分离。270.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图9a中示出。如所示，整个寡核苷酸902可通过可释放的连键906(如二硫化物接头)与珠粒904偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列908，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如用于illumina测序系统的p5序列；以及功能序列910，其可包括测序引物序列，例如用于illumina测序系统的r1引物结合位点。条形码序列912包含在用于条形编码样品rna的结构内。rna特异性(例如，mrna特异性)引发序列，如聚‑t序列914也包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段(未示出)以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段916。这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，例如，作为跨与单个珠粒偶联的单独寡核苷酸变化的随机n‑聚体序列，而条形码序列912在栓系至单独珠粒的寡核苷酸中可以是恒定的。如本文其它地方所述，此独特序列可用于提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以允许定量原始表达的rna的数量，例如mrna计数。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。271.在细胞rna(例如，mrna)分析的示例性方法中并且参考图9a，将细胞与带有条形码的珠粒、转换寡核苷酸924和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作950中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，经由还原剂的作用)，并且释放的条形码寡核苷酸的聚‑t片段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作952中，使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。然后，转换寡核苷酸924可与添加至cdna的额外碱基杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段912。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列916，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。如本文其它地方所述，这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。在操作952之后，然后在操作954中用引物926(例如，pcr引物)扩增cdna922。接下来，然后在操作956中纯化扩增的产物(例如，经由固相可逆固定化(spri))。在操作958，然后剪切扩增的产物，将其连接至另外的功能序列并进一步扩增(例如，经由pcr)。功能序列可包括测序仪特异性流动细胞附接序列930，例如用于illumina测序系统的p7序列；以及功能序列928，其可包括测序引物结合位点，例如用于illumina测序系统的r2引物；以及功能序列932，其可包括样品索引，例如用于illumina测序系统的i7样品索引序列。在一些情况下，操作950和952可在分区中发生，而操作954、956和958可在本体溶液中(例如，在分区外的汇集混合物中)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作954、956和958。在一些情况下，可在分区中完成操作954。在一些情况下，在乳液破乳后，可用核酸外切酶消化条形码寡核苷酸。在引物消化后，可通过乙二胺四乙酸(edta)抑制核酸外切酶活性。尽管根据用于某些测序系统(例如illumina系统)的特定序列参考进行了描述，但应理解，对这些序列的提及仅出于说明目的，并且本文描述的方法可被配置用于与其它测序系统一起使用，所述其它测序系统并入在那些系统中使用的特异性引发、附接、索引和其它操作序列，例如可从iontorrent、oxfordnanopore、genia、pacificbiosciences、completegenomics等获得的系统。272.在如图9a所示用于rna(例如，细胞rna)分析的条形码寡核苷酸的替代实例中，功能序列908可以是p7序列，并且功能序列910可以是r2引物结合位点。此外，功能序列930可以是p5序列，功能序列928可以是r1引物结合位点，并且功能序列932可以是用于illumina测序系统的i5样品索引序列。由这种条形码寡核苷酸产生的构建体的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。273.图9b中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。转换寡核苷酸924可用另外的标签934(例如生物素)标记。在操作951中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。在操作953中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。接下来，可使用分离操作960来使cdna922与分区中的试剂和寡核苷酸分离。另外的标签934(例如生物素)可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。在操作960，可在操作955中扩增(例如，经由pcr)之前用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)分离cdna，然后在操作957中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作959中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，如所示，操作951和953可在分区中发生，而操作960、955、957和959可在本体溶液中(例如，在分区外的汇集混合物中)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作960。然后可在汇集转录物以用于加工后，在操作960之后执行操作955、957和959。274.图9c中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作961中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作963中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在操作961和操作963之后，在操作962中使mrna920和cdna922变性。在操作964，使第二链从具有另外的标签942(例如生物素)的引物940延伸，并与cdna922杂交。同样在操作964中，生物素标记的第二链可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。可在操作965中扩增(例如，经由聚合酶链式反应(pcr))之前用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)分离cdna，然后在操作967中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作969中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，操作961和963可在分区中发生，而操作962、964、965、967和969可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作962、964、965、967和969。275.图9d中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配。在操作971中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作973中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在操作966中，可使mrna920、cdna922和转换寡核苷酸924变性，并且cdna922可与用另外的标签946(例如生物素)标记的捕获寡核苷酸944杂交。在此操作中，与cdna杂交的生物素标记的捕获寡核苷酸944可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。在使用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)与其它物质(例如，过量带条形码寡核苷酸)分离后，可在操作975用引物926扩增(例如，经由pcr)cdna，然后在操作977中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作979中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的其它情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，操作971和973可在分区中发生，而操作966、975、977(纯化)和979可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作966、975、977和979。276.图9e中示出用于rna分析(包括细胞rna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将单独细胞与带有条形码的珠粒、转换寡核苷酸990和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作981中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，如图9a中所示的902)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来在操作983，然后在逆转录反应中延伸聚‑t区段，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸990然后可与cdna杂交并促进模板转换。与转换寡核苷酸序列互补并包含t7启动子序列的序列可并入cdna922中。在操作968，合成第二链，并且在操作970，t7启动子序列可由t7聚合酶用于在体外转录中产生rna转录物。在操作985，rna转录物可纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、逆转录以形成dna转录物，并且可针对每种dna转录物合成第二链。在一些情况下，在纯化之前，可使rna转录物与dna酶(例如，dna酶i)接触以分解残余dna。在操作987，然后将dna转录物片段化并连接至另外的功能序列，如序列928、932和930，并且在一些情况下进一步扩增(例如，经由pcr)。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，在除去dna转录物的一部分之前，可使所述dna转录物与rna酶接触以分解残余rna。在一些情况下，操作981和983可在分区中发生，而操作968、970、985和987可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作968、970、985和987。277.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图10中示出。如所示，整个寡核苷酸1002通过可释放的连键1006(如二硫化物接头)与珠粒1004偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1008，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p7序列；以及功能序列1010，其可包括测序引物序列，例如r2引物结合位点。条形码序列1012包含在用于条形编码样品rna的结构内。rna特异性(例如，mrna特异性)引发序列，如聚‑t序列1014可包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段(未示出)以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1016。这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。可包括另外的功能序列1020以用于体外转录，例如t7rna聚合酶启动子序列。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。278.在细胞rna分析的示例性方法中并且参考图10，将细胞与带有条形码的珠粒和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作1050中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸1002(例如，经由还原剂的作用)，并且释放的条形码寡核苷酸的聚‑t片段1014然后与mrna1020的聚‑a尾杂交。接下来在操作1052，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段，以产生所述mrna的cdna1022，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段1020、1008、1012、1010、1016和1014中的每一个。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段1012。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。如本文其它地方所述，这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。在操作1054，合成第二链，并且在操作1056，t7启动子序列可由t7聚合酶用于在体外转录中产生rna转录物。在操作1058，将转录物片段化(例如，剪切)，连接至另外的功能序列并逆转录。功能序列可包括测序仪特异性流动细胞附接序列1030，例如p5序列；以及功能序列1028，其可包括测序引物，例如r1引物结合序列；以及功能序列1032，其可包括样品索引，例如i5样本品索引序列。在操作1060，可将rna转录物逆转录为dna，扩增所述dna(例如，经由pcr)，并测序以鉴定mrna的cdna的序列，以及对条形码区段和独特序列区段进行测序。在一些情况下，操作1050和1052可在分区中发生，而操作1054、1056、1058和1060可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作1054、1056、1058和1060。279.在如图10所示用于rna(例如，细胞rna)分析的条形码寡核苷酸的替代实例中，功能序列1008可以是p5序列，并且功能序列1010可以是r1引物结合位点。此外，功能序列1030可以是p7序列，功能序列1028可以是r2引物结合位点，并且功能序列1032可以是i7样品索引序列。280.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图11中示出。如所示，整个寡核苷酸1102通过可释放的连键1106(如二硫化物接头)与珠粒1104偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1108，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1110，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1108是p7序列，并且序列1110是r2引物结合位点。条形码序列1112包含在用于条形编码样品rna的结构内。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1116。在一些情况下，这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。可包括另外的序列1114以有助于模板转换，例如聚g。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。281.在细胞mrna分析的示例性方法中并参考图11，将细胞与微胶囊(例如，带有带条形码寡核苷酸的珠粒)、聚t序列和其它试剂(如dna聚合酶、逆转录酶、寡核苷酸引物、dntp和还原剂)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。所述分区可用作反应体积。如本文其它地方所述，用作反应体积的分区可包括容器或器皿，如孔、微孔、小瓶、管、纳米阵列基底中的贯通端口或具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡、乳液或微滴。在一些方面，这些分区可包括非水性连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。在分区内，可裂解细胞，并且可从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂或其它刺激的作用)。细胞裂解和带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放可在分区(例如，乳液中的微滴)或反应体积中同时发生。在一些实施方案中，细胞裂解先于带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放先于细胞裂解。282.在细胞裂解和带条形码寡核苷酸从微胶囊释放之后，可对反应体积进行扩增反应以产生扩增产物。在示例性扩增反应中，如操作1150所示，聚t序列与从细胞释放的mrna1120的聚a尾杂交。接下来，在操作1152中，然后使用所述mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚t序列，以产生与所述mrna互补的cdna1122。逆转录酶的末端转移酶活性可以模板无关的方式向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。然后，添加至cdna的额外碱基(例如聚c)可与带条形码寡核苷酸1114杂交。这可促进模板转换，并且可将与带条形码寡核苷酸互补的序列并入所述cdna中。在各种实施方案中，带条形码寡核苷酸不与模板多核苷酸杂交。283.带条形码寡核苷酸在从微胶囊释放后可以任何合适的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm或500μm的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以至少约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm、500μm或更高的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以至多约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm或500μm的浓度存在于反应体积中。284.可进一步加工转录物(例如，扩增、除去部分、添加额外的序列等)，并如本文其它地方所述进行表征。在一些实施方案中，直接对转录物进行测序。在一些实施方案中，将转录物进一步加工(例如，除去部分、添加额外的序列等)且然后进行测序。在一些实施方案中，对反应体积进行第二扩增反应以产生另外的扩增产物。转录物或第一扩增产物可用作第二扩增反应的模板。在一些实施方案中，用于第二扩增反应的引物包含带条形码寡核苷酸和聚t序列。在一些实施方案中，用于第二扩增反应的引物包含与细胞共分配的另外的引物。在一些实施方案中，直接对这些另外的扩增产物进行测序。在一些实施方案中，将这些另外的扩增产物进一步加工(例如，除去部分、添加额外的序列等)且然后进行测序。通过这种方法产生的扩增产物(例如，第一扩增产物和第二扩增产物)的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。285.用于rna分析(包括细胞rna分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图12a中示出。如所示，整个寡核苷酸1202通过可释放的连键1206(如二硫化物接头)与珠粒1204偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1208，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1210，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1208是p7序列，并且序列1210是r2引物结合位点。条形码序列1212包含在用于条形编码样品rna的结构内。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1216。在一些情况下，这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。在使用这种条形码的细胞rna分析的示例性方法中，将细胞与带有条形码的珠粒和其它试剂(如rna连接酶和还原剂)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)。然后可通过rna连接酶将带条形码寡核苷酸连接至mrna转录物的5'端，同时在分区中。随后的操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))和进一步加工(剪切、功能序列的连接和随后扩增(例如，经由pcr))，并且这些操作可在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。286.用于rna分析(包括细胞rna分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图12b中示出。如所示，整个寡核苷酸1222通过可释放的连键1226(如二硫化物接头)与珠粒1224偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1228，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1230，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。条形码序列1232包含在用于条形编码样品rna的结构内。引发序列1234(例如，随机引发序列)也可包含在寡核苷酸结构，例如随机六聚体中。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1236。在一些情况下，这一另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。在使用图12b的条形码寡核苷酸的细胞mrna分析的示例性方法中，将细胞与带有条形码的珠粒和另外试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。在其它情况下，序列1228是p5序列，并且序列1230是r1引物结合位点。随机六聚体的引发序列1234可随机杂交细胞mrna。然后可使用来自细胞的mrna作为模板在逆转录反应中延伸随机六聚体序列以产生与mrna互补的cdna，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段1228、1232、1230、1236和1234中的每一个。随后的操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、进一步加工(剪切、功能序列的连接和随后扩增(例如，经由pcr))，并且这些操作可在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。可与带有条形码的珠粒一起共分配的另外试剂可包括用于阻断核糖体rna(rrna)的寡核苷酸和用于消化来自细胞的基因组dna和cdna的核酸酶。或者，可在另外的加工操作期间施加rrna去除剂。通过这种方法产生的构建体的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。287.本文描述的单细胞分析方法也可用于分析全转录组。返回参考图12b的条形码，引发序列1234可以是随机n‑聚体。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。在其它情况下，序列1228是p5序列，并且序列1230是r1引物结合位点。在使用这种条形码进行全转录组分析的示例性方法中，将单独细胞与带有条形码的珠粒、聚‑t序列和其它试剂(如逆转录酶、聚合酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。在这种方法的操作中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)，并且聚‑t序列与细胞mrna的聚‑a尾杂交。在使用mrna作为模板的逆转录反应中，可产生细胞mrna的cdna。然后可用rna酶降解rna。带条形码寡核苷酸中的引发序列1234然后可随机地与所述cdna杂交。寡核苷酸可使用聚合酶以及与类似于图3所示的珠粒和细胞共分配的其它延伸试剂延伸以产生扩增产物(例如，带条形码片段)，类似于图3(图f)中所示的示例性扩增产物。带条形码核酸片段可在一些情况下例如通过序列分析表征进行进一步加工(例如，扩增、添加额外序列、净化过程等，如本文其它地方所述)。在这种操作中，测序信号可来自全长rna。288.在示例性方法中，条形码序列可附加至模板多核苷酸序列(例如，mrna)的3'端。例如，如果待分析模板多核苷酸的3'端的序列，则这种构型可能是有用的。在一些实施方案中，条形码序列可附加至模板多核苷酸序列(例如mrna)的5'端。例如，如果待分析模板多核苷酸的5'端的序列，则这种构型可能是有用的。289.在另一方面，分区包含与具有与模板多核苷酸杂交的朝向3'端的序列的引物、具有朝向5'端的第一预定义序列的模板转换寡核苷酸和具有可释放地与其偶联的带条形码寡核苷酸的微胶囊(如珠粒)共分配的细胞。在一些实施方案中，与珠粒偶联的寡核苷酸包含相同的条形码序列(例如，所有寡核苷酸共有相同的条形码序列)。在一些方面，与珠粒偶联的寡核苷酸另外包含独特分子标识符(umi)序列区段(例如，具有不同独特分子标识符序列的所有寡核苷酸)。290.图18示出与珠粒偶联的带条形码寡核苷酸。如所示，整个寡核苷酸1802通过可释放的连键1806(如二硫化物接头)与珠粒1804偶联。所述寡核苷酸可包含适用于后续加工的功能序列，如功能序列1808，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1810，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1808是p7序列，并且序列1810是r2引物结合位点。条形码序列1812可包含在用于条形编码模板多核苷酸的结构内。可选择功能序列以与各种不同的测序系统，例如454测序、iontorrentproton或pgm、illuminax10等以及其要求兼容。在一些情况下，条形码序列1812、功能序列1808(例如，流动细胞附接序列)和1810(例如，测序引物序列)可为附接至给定珠粒的所有寡核苷酸共有。带条形码寡核苷酸还可包含序列1816以促进模板转换(例如，聚g序列)。在一些情况下，所述另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。291.尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码序列对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的。292.在使用图18的条形码寡核苷酸的细胞多核苷酸分析的示例性方法中，将细胞与带有带条形码寡核苷酸的珠粒和另外试剂(如逆转录酶、引物、寡核苷酸(例如，模板转换寡核苷酸)、dntp和还原剂)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。在分区内，可裂解细胞以产生多个模板多核苷酸(例如dna如基因组dna，rna如mrna等)。在一些情况下，使用与细胞共分配的裂解试剂裂解细胞。293.在珠粒为可降解或可破裂的珠粒的情况下，带条形码寡核苷酸可如前所述在施加刺激后从珠粒释放。在从珠粒释放后，带条形码寡核苷酸可以任何合适的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以适于产生足够产量的扩增产物的浓度存在于分区中以用于下游加工和分析，包括但不限于测序衔接子附接和测序分析。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸的浓度受带有条形码的珠粒的负载能力或可由珠粒递送的寡核苷酸的量限制。294.可与细胞共分配的模板转换寡核苷酸、带有带条形码寡核苷酸的珠粒等可以任何合适的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸以适合于扩增反应期间的有效模板转换的浓度存在于分区中。模板转换寡核苷酸的浓度可取决于用于微滴产生的试剂。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在多个模板转换寡核苷酸之中。295.在一些实施方案中，带条形码化寡核苷酸和模板转换寡核苷酸以相似的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸和模板转换寡核苷酸可以反映待使用每种寡核苷酸产生的扩增产物的量的比例存在。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸以比带条形码寡核苷酸更高的浓度存在于分区中。这种浓度差异可能是由于带有条形码的珠粒的容量的限制。在一些实施方案中，当带条形码寡核苷酸在分区中自由(例如，未附接至珠粒)时，反应体积中模板转换寡核苷酸的浓度是相同反应体积中带条形码寡核苷酸的浓度的至少2、5、10、20、50、100或200倍。296.如图19所示，可对包含来自细胞1920的模板多核苷酸和(i)具有与模板多核苷酸(例如，聚t)杂交的朝向3'端的序列的引物1924和(ii)包含朝向5'端的第一预定义序列1810的模板转换寡核苷酸1926的反应混合物进行扩增反应以产生第一扩增产物。在一些情况下，模板多核苷酸是具有聚a尾的mrna，并且与模板多核苷酸杂交的引物包含朝向3'端的聚t序列，其与聚a区段互补。第一预定义序列可包含衔接子序列、条形码序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合中的至少一种。在一些情况下，第一预定义序列1810是可为多个分区的所有分区共有的序列。例如，所述第一预定义序列可包含流动细胞附接序列、扩增引物结合位点或测序引物结合位点，并且第一扩增反应促进预定义序列与来自细胞的模板多核苷酸的附接。在一些实施方案中，第一预定义序列包含引物结合位点。在一些实施方案中，第一预定义序列包含测序引物结合位点。如操作1950中所示，引物1924的朝向3'端的序列(例如，聚t)与模板多核苷酸1920杂交。在第一扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如逆转录酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用细胞的核酸作为模板延伸引物1924序列以产生转录物(例如cdna)1922，其具有与引物退火的细胞核酸的链互补的片段。在一些情况下，逆转录酶具有末端转移酶活性，并且逆转录酶以不依赖于模板的方式向cdna添加另外的核苷酸，例如聚c。如操作1952中所示，模板转换寡核苷酸1926(例如包含聚g序列的模板转换寡核苷酸)可与cdna1922杂交并促进第一扩增反应中的模板转换。转录物因此可包含引物1924的序列，与来自细胞的模板多核苷酸互补的序列，和与模板转换寡核苷酸互补的序列。297.在多个分区中，每个分区含有一个或多个细胞或不含细胞，引物和模板转换寡核苷酸可以是所有分区通用的。在进行mrna的分析的情况下，例如，引物可包含能够杂交并引发来自mrna的聚a区段的延伸反应的至少一个聚t区段。在进行多种多核苷酸的分析的情况下，引物可包含能够杂交至各种多核苷酸模板并在各种多核苷酸模板上随机引发延伸反应的随机序列。由于使用具有末端转移酶活性的酶可发生模板转换，所以具有能够与所附加的碱基杂交的序列的模板转换寡核苷酸可以与待分析的多核苷酸模板的序列无关的方式用于模板转换。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸可包含朝向5'端的第一预定义序列，所述第一预定义序列不与模板特异性杂交。在一些实施方案中，进行特定基因的分析。在此类情况下，引物可包含能够与包含特定基因的模板杂交并引发来自包含特定基因的模板的延伸反应的基因特异性序列。在一些实施方案中，对多个基因进行分析并且引物在多种引物中。多种引物中的每一个可具有特定目标基因的序列。298.在第一扩增反应之后，可对第一扩增产物或转录物进行第二扩增反应以产生第二扩增产物。在一些情况下，将附接另外的序列(例如，诸如流动细胞附接序列、测序引物结合序列、条形码序列等的功能序列)。第一和第二扩增反应可在相同体积中，例如像在微滴中进行进行。在一些情况下，第一扩增产物在带条形码寡核苷酸存在下进行第二扩增反应，以产生具有条形码序列的第二扩增产物。条形码序列对于分区可以是唯一的，即每个分区具有唯一的条形码序列。带条形码寡核苷酸可包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列和至少第二预定义序列。带条形码寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段可促进带条形码寡核苷酸与转录物(例如cdna)的杂交，以促进第二扩增产物的产生。除条形码序列外，带条形码寡核苷酸可包含第二定义序列，如衔接子序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合中的至少一种。299.在一些实施方案中，第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板和带条形码寡核苷酸作为引物。如操作1954中所示，带条形码寡核苷酸1928上的模板转换寡核苷酸的区段可与cdna的部分或具有与模板转换寡核苷酸互补的序列或从模板转换寡核苷酸复制的序列的互补片段1922杂交。在第二扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用第一扩增产物作为模板延伸引物序列，如操作1956中所示。第二扩增产物可包含第二预定义序列(例如，1808、1812和1810)、模板多核苷酸(例如，mrna)区段的序列和与引物互补的序列(例如，1924)。300.在一些实施方案中，第二扩增产物使用带条形码寡核苷酸作为模板和第一扩增产物的至少一部分作为引物。如操作1954中所示，具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的第一扩增产物(例如cdna)的区段可与包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列的带条形码寡核苷酸的区段杂交。如操作1958中所示，在第二扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用带条形码寡核苷酸作为模板延伸引物序列(例如，第一扩增产物)。第二扩增产物可包含引物(例如，1924)的序列、与模板多核苷酸(例如，mrna)的序列互补的序列和与第二预定义序列互补的序列(例如，1808、1812和1810)。301.在一些实施方案中，第二扩增反应在间插纯化操作的存在下在第一扩增反应之后进行。可使用间插纯化操作，例如以从包括诸如模板转换寡核苷酸的过量引物在内的过量试剂纯化模板(例如，第一扩增产物)。在一些实施方案中，扩增反应在间插纯化操作不存在下进行。在某些实施方案中，不进行间插纯化操作，以使得所有样品制备在相同反应体积中进行。在间插纯化操作不存在下，模板转换寡核苷酸可在第二扩增反应中与带条形码寡核苷酸竞争，因为带条形码寡核苷酸包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段。在第二扩增反应中模板转换寡核苷酸与带条形码寡核苷酸之间的竞争以产生另外的扩增产物可产生缺乏条形码序列的第二扩增产物。在一些实施方案中，如果模板转换寡核苷酸在反应体积中以比带条形码寡核苷酸更高的浓度存在，则所述模板转换寡核苷酸可在第二扩增反应中胜过带条形码寡核苷酸。在带条形码寡核苷酸以比反应体积中的模板转换寡核苷酸更低的浓度存在的情况下，可利用各种方法来促进带条形码寡核苷酸在第二扩增反应中的使用，以产生具有条形码序列的扩增产物。302.在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应期间不可用于引物延伸。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应之前降解。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应期间降解。模板转换寡核苷酸可包含核糖核酸(rna)。包含rna的模板转换寡核苷酸可例如通过升高的温度或碱性条件降解。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％rna。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含100％rna。在一些实施方案中，使用带条形码寡核苷酸的第二扩增反应的第一反应速率大于使用模板转换寡核苷酸的第二扩增的第二反应速率。303.在一些实施方案中，与模板转换寡核苷酸相比，带条形码寡核苷酸可在更高的退火温度下与第一扩增产物杂交。例如，与第一扩增产物和模板转换寡核苷酸的解链温度相比，第一扩增产物和带条形码寡核苷酸可具有更高的解链温度。在此类情况下，第二扩增反应可在退火温度下进行，在所述退火温度下带条形码寡核苷酸能够与第一扩增产物杂交和起始引物延伸，并且在所述退火温度下模板转换寡核苷酸不能与第一扩增产物杂交和起始引物延伸。在一些实施方案中，第二扩增反应的引物退火温度是至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃或大于第一扩增反应的引物退火温度。解链温度的差异可由模板转换寡核苷酸中存在修饰的核苷酸引起。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的核苷酸。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含100％修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，解链温度的差异可以是带条形码寡核苷酸中存在修饰的核苷酸的结果。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的核苷酸。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸包含100％修饰的寡核苷酸。修饰的核苷酸包括但不限于2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2'‑脱氧肌苷、supert(5‑羟基丁炔基‑2'‑脱氧尿苷)、superg(8‑氮杂‑7‑脱氮杂鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc以及2'氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)。304.在各种实施方案中，使用包含聚合酶活性的酶促进第一扩增反应。例如，可通过dna依赖性聚合酶或逆转录酶(例如，rna依赖性)促进第一扩增反应。在一些实施方案中，第一扩增反应包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，第一扩增反应包括逆转录。在各种实施方案中，使用包含聚合酶活性的酶促进第二扩增反应。例如，可通过dna依赖性聚合酶促进第二扩增反应。在一些实施方案中，第二扩增反应包括聚合酶链式反应。305.在产生扩增产物后，后续操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、进一步加工(例如，剪切、连接功能序列和后续扩增(例如，经由pcr))。这些操作可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。可与带有条形码的珠粒一起共分配的另外试剂可包括用于阻断核糖体rna(rrna)的寡核苷酸和用于消化来自细胞的基因组dna的核酸酶。或者，可在另外的加工操作期间施加rrna去除剂。通过这种方法产生的构建体的构型可有助于最小化(或避免)在测序期间聚‑t序列的测序和/或对多核苷酸序列的5'端测序。可对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。306.尽管已经单独讨论了具有各种条形码设计的操作，但是单独珠粒可包括各种设计的条形码寡核苷酸以供同时使用。307.除了表征来自较大群体的单独细胞或细胞亚群之外，本文所述的过程和系统还可用于表征单独细胞，作为提供细胞或其它生物群体的总体概况的方式。各种应用需要评价细胞群体内的不同细胞或生物类型的存在和量化，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如在追踪污染等中。特别地，上述分析过程可用于单独表征、测序和/或鉴定群体内的大量单独细胞。然后可使用这种表征来组装起源群体的整体概况，其可提供重要的预后和诊断信息。308.例如，人类微生物组(包括例如肠、口腔、表皮微生物组等)的变化已经被鉴定为不同病状或一般健康状态的诊断和预后。使用本文所述的单细胞分析方法和系统，可再次表征、测序和鉴定总体群体中的单独细胞，并鉴定所述群体内可能指示诊断相关因子的变化。举例来说，细菌16s核糖体rna基因的测序已被用作细菌的分类学分类的高度准确的方法。使用上述靶向扩增和测序过程可提供细胞群体内单独细胞的鉴定。可进一步量化群体内不同细胞的数量，以鉴定当前状态或状态随时间的变化。参见例如，morgan等人,ploscomput.biol.,ch.12,2012年12月,8(12):e1002808和ram等人,syst.biol.reprod.med.,2011年6月,57(3):162‑170，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。同样，感染或潜在感染的鉴定和诊断也可受益于本文所述的单细胞分析，例如，以鉴定存在于其它细胞或其它生物材料、细胞和/或核酸的大混合物(包括上述环境以及任何其它诊断相关的环境，例如脑脊液、血液、粪便或肠样品等)中的微生物物种。309.前述分析也可通过不同抗性标志物/突变跨给定样品的细胞群体的分布的分析和剖析而特别适用于表征不同细胞或病原体(例如癌细胞、细菌病原体等)的潜在耐药性等。另外，随时间推移表征这些标志物/突变跨细胞群体的变化可提供对以此类抗药性问题为特征的各种疾病的进展、改变、预防和治疗的有价值的见解。310.尽管就细胞而言进行了描述，但应理解，本说明书中涵盖各种单独生物有机体或有机体组分中的任一种，包括例如细胞、病毒、细胞器、细胞内含物、囊泡等。另外，在提及细胞时，应当理解，这种参考包括任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其它动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其它细胞类型，无论是源自单细胞还是多细胞生物。311.同样，分析不同环境样品以剖析此类样品中存在的微生物、病毒或其它生物污染物可提供有关疾病流行病学的重要信息，并且可能有助于预测疾病爆发、时疫和流行病。312.如上所述，本文所述的方法、系统和组合物还可用于分析和表征个体细胞或细胞群体的其它方面。313.用于表征细胞的方法2000示于图20中。如操作2010中所示，方法2000可包括提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，所有这些都如本文所述。标记剂可能能够结合至细胞的细胞表面特征，并且可与包含允许鉴定所述标记剂的核酸条形码序列的报告寡核苷酸偶联。此外，所述分区可包含能够与报告寡核苷酸条形码相互作用的一种或多种锚寡核苷酸(本文中也称为寡核苷酸和带条形码寡核苷酸)，如本文详细描述的。接下来，在操作2020中，在分区内，可合成包含核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子，如本文所述。接下来，在操作2030中，可对核酸分子进行测序以鉴定标记剂或细胞。在一些情况下，标记剂和/或报告寡核苷酸可例如通过转染(例如，使用转染胺)、通过脂质(例如，1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(dopc))或通过转运蛋白递送至细胞中。314.如本文所述，标记剂可包括抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白质支架等以及其任何组合。如本文所述，细胞表面特征可包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接等以及其任何组合。315.在一些情况下，在操作2010之前，标记剂可经受适于使标记剂结合至细胞表面特征的条件。在一些情况下，在操作2010之前，当细胞和标记剂不含分区时(例如，在分配之前)，标记剂可经受适于使标记剂结合至细胞表面特征的条件。在一些情况下，在操作2010之前，报告寡核苷酸可与标记剂偶联。在一些情况下，在操作2010中，至少一种标记剂与细胞表面特征结合。316.在一些情况下，在操作2020中，可使与标记剂偶联的报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生核酸分子。在一些情况下，在操作2020中，锚寡核苷酸可偶联至也用细胞和一种或多种标记剂分配的珠粒，如本文所述，并且所述方法还包括在合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。317.如本文所述，珠粒可包含凝胶珠粒。此外，如本文所述，珠粒可包含多样性锚寡核苷酸文库。在一些情况下，珠粒可包含锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约1,000,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约5,000,000个拷贝或锚寡核苷酸的至少约10,000,000个拷贝。在一些情况下，珠粒可包含不同锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约1,00,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约5,000,000个拷贝或不同锚寡核苷酸的至少约10,000,000个拷贝。在一些情况下，并且如本文所述，从珠粒释放锚寡核苷酸可包括使珠粒经受使珠粒降解的刺激。在一些情况下，如本文所述，从珠粒释放锚寡核苷酸可包括使珠粒经受使珠粒降解的化学刺激。318.固体载体(例如珠粒)可包含不同类型的锚寡核苷酸以用于分析细胞的内在和外在信息。例如，固体载体可包含以下中的一种或多种：1)锚寡核苷酸，其包含结合至细胞中的一种或多种内源核酸的引物；2)锚寡核苷酸，其包含结合至细胞中的一种或多种外源核酸的引物，所述外源核酸例如来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的核酸、引入细胞中的核酸(例如，如质粒或源自其的核酸)、用于基因编辑的核酸(例如，crispr相关rna，如crrna、引导rna)；3)锚寡核苷酸，其包含结合至条形码(例如，核酸、蛋白质或细胞的条形码)的引物；4)锚寡核苷酸，其包含结合至蛋白质的序列(例如引物)，所述蛋白质例如在细胞中表达的外源蛋白质、来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的蛋白质或细胞的蛋白质的结合配偶体(例如，免疫细胞受体的抗原)。319.在一些情况下，所述方法可用于筛选携带突变(例如通过基因编辑如crispr技术产生的突变)的细胞。例如，珠粒包含第一锚寡核苷酸，所述第一锚寡核苷酸具有用于crisprrna(例如，crrna或引导rna)或其互补dna的引物；以及第二锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸具有细胞中的引物内源核酸，例如总mrna或特异性mrna。可将珠粒制成具有用crisprrna或表达crisprrna的质粒转染的细胞的分区。在一些情况下，表达的crisprrna或质粒可具有条形码(crispr条形码)或捕获序列。珠粒上的引物可用于扩增和测序crisprrna(例如，使用包含与crispr捕获序列互补的序列的带条形码衔接子寡核苷酸，参见图61a‑d)和内源性mrna(例如，使用包含寡核苷酸(dt)序列的带条形码衔接子寡核苷酸)，从而确定细胞中产生的突变(参见图61d)。在一些情况下，所述方法可用于进行单细胞rna测序，例如，如dixit等人,perturb‑seq:dissectingmolecularcircuitswithscalablesingle‑cellrnaprofilingofpooledgeneticscreens.cell；2016年12月15日；167(7):1853‑1866.e17中所描述，所述文献以引用的方式整体并入本文。320.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含主链。主链可包含以下元件中的一种或多种：测序仪引物、条形码和umi。除主链外，寡核苷酸还可包含如本文所述的引物，例如聚‑t引物、随机n‑聚体引物和/或靶特异性引物。包含各种主链和引物序列的寡核苷酸的实例在图27a‑27d中示出。321.本文方法的示例性工作流程可包括输入固定参考(例如，来自具有内在信息的细胞的已知转录物)、参考模板(例如，利用外在信息设计合成条形码(随机或靶特异性)和序列读数；并且输出源自内在或外在序列的序列读数的分类，每个分区的每个转录物/基因的检测的拷贝的计数，以及来自每个分区的外在序列的检测的条形码的列表和计数。在一些情况下，示例性工作流程可用软件实现。322.在一些情况下，在操作2030之前，方法2000可包括从分区释放核酸分子(例如，通过破坏分区)。在一些情况下，操作2030可包括鉴定标记剂(例如，结合至细胞表面特征的标记剂)。在一些情况下，操作2030可包括通过鉴定标记剂来鉴定细胞表面特征。在一些情况下，操作2030包括确定细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些情况下，操作2030包括鉴定细胞。在一些情况下，操作2030包括鉴定标记剂和细胞。323.在方法2000中，可与标记剂偶联的报告寡核苷酸可包含独特分子标识(umi)序列，如本文所述。umi序列可允许鉴定细胞、标记剂或两者。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定umi序列的序列并鉴定细胞。324.如本文所述，在方法2000中，锚寡核苷酸可包含独特分子标识(umi)序列。在这些情况下，锚寡核苷酸的umi序列可允许鉴定细胞。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定来自与标记剂结合的报告寡核苷酸的umi序列的序列，以及来自锚寡核苷酸的umi序列的序列，以鉴定细胞和细胞表面特征。325.在方法2000中，并且如本文所述，分区可包括乳液中的微滴。在一些情况下，分区仅包括一个细胞。在一些情况下，细胞结合至至少一种标记剂。在一些情况下，标记剂可包含至少两种相同的标记剂。在一些情况下，标记剂可包含至少两种不同的标记剂。在一些情况下，细胞可结合至至少约5种不同的标记剂、至少约10种不同的标记剂、至少约50种不同的标记剂、至少约100种不同的标记剂、至少约500种不同的标记剂、至少约1,000种不同的标记剂、至少约5,000种不同的标记剂、至少约10,000种不同的标记剂或至少约50,000种不同的标记剂。在一些情况下，细胞可结合至约2与5种之间的不同标记剂、约5与10种之间的不同标记剂、约10与100种之间的不同标记剂、约100与500种之间的不同标记剂、约500与1,000种之间的不同标记剂、约1,000与5,000种之间的不同标记剂、约5,000与10,000种之间的不同标记剂、约10,000与50,000种之间的不同标记剂或约2与50,000种之间的不同标记剂或其间的任何范围。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。326.在一种示例性方法中，提供样品，所述样品包含有待关于其细胞表面特征进行分析并且表征的细胞。细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接或其任何组合。还提供了能够结合至目标细胞表面特征的至少一种标记剂，如标记剂文库。标记剂可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架或其任何组合。标记剂可包括报告寡核苷酸，其指示结合基团所结合的细胞表面特征。特别地，对一种类型的细胞表面特征具有特异性的标记剂可具有与其偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞表面特征具有特异性的标记剂可具有与其偶联的不同报告寡核苷酸。在一些方面，这些报告寡核苷酸可包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸所偶联至的标记剂。选择寡核苷酸作为报告分子可提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还容易地可附接至大多数生物分子，例如抗体等，以及容易地例如使用测序或阵列技术检测。在一些实施方案中，标记剂可包括与它们附接的报告寡核苷酸。因此，第一标记剂(例如第一细胞表面特征的抗体)可具有与其缔合的具有第一核酸序列的报告寡核苷酸。不同的标记剂(例如对其它不同细胞表面特征具有结合亲和力的抗体)可具有与其缔合的包含不同核酸序列(例如具有部分或完全不同的核酸序列)的报告寡核苷酸。在一些情况下，对于每种类型的细胞表面特征标记剂，例如抗体或抗体片段，报告寡核苷酸序列可以是已知的并且容易地可鉴定为与已知的细胞表面特征标记剂相关。这些报告寡核苷酸可直接与标记剂偶联，或者它们可附接至珠粒、分子晶格(例如线性、球状、交联或其它聚合物)，或与标记剂附接或以其它方式缔合的其它框架，其允许将多个报告寡核苷酸附接至单一标记剂。327.在多个报告寡核苷酸与单一标记剂偶联的情况下，此类报告寡核苷酸可包含相同的序列，或特定的标记剂可包含一组已知的报告寡核苷酸序列。在例如对不同细胞表面特征具有特异性的不同的标记剂之间，报告寡核苷酸可以是不同的并且可归属于特定标记剂。328.报告寡核苷酸与标记剂的附接(偶联)可通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或附接中的任一种来实现。例如，在与基于抗体的标记剂缔合的寡核苷酸报告寡核苷酸的情况下，可使用化学缀合技术(例如，可从innovabiosciences获得的抗体标记试剂盒)以及其它非共价附接机制，例如使用生物素化的抗体和寡核苷酸(或与寡核苷酸偶联的包含一个或多个生物素化的接头的珠粒)与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白接头将此类寡核苷酸共价附接至抗体或抗体片段的一部分。可获得抗体和寡核苷酸生物素化技术。参见例如，fang等人,“fluoride‑cleavablebiotinylationphosphoramiditefor5′‑end‑labellingandaffinitypurificationofsyntheticoligonucleotides,”nucleicacidsres.2003年1月15日；31(2):708‑715，所述文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文。同样，已经开发出并且容易获得蛋白质和肽生物素化技术。参见例如，美国专利号6,265,552，所述美国专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。此外，点击反应化学如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯反应、tco‑peg4‑nhs酯反应等可用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在标记剂是第一抗体的情况下，报告寡核苷酸可通过第二抗体偶联相互作用与标记剂偶联。可商购的试剂盒(如来自thunderlink和abcam的试剂盒)以及本领域常用的技术可用于将报告寡核苷酸适当地偶联至标记剂。329.在一些情况下，报告寡核苷酸可经由抗体结合蛋白与抗体缔合(例如，通过结合相互作用共价连接如缀合或非共价连接)。例如，报告寡核苷酸和抗体结合蛋白可形成复合物。所述复合物可通过抗体结合蛋白结合至相应抗体。图28示出使用抗体结合蛋白用于在抗体上缔合核酸(例如dna)条形码的示例性工作流程。将抗体结合蛋白2810(例如蛋白a或蛋白g)和包含核酸(例如dna)条形码2820的寡核苷酸缀合至抗体的fc区，从而形成包含所述抗体、抗体结合蛋白质2810和dna条形码2820的复合物2830。将复合物2830与细胞一起孵育，并且洗去未结合的抗体。当复合物2830结合至细胞时，所述复合物和细胞被分配到微滴中用于进一步分析。330.抗体结合蛋白可具有快速吸附动力学、缓慢解吸动力学和/或低结合平衡常数。可使用向肽或蛋白质添加化学官能团的任何方法。一些方法可包括将报告寡核苷酸附接至抗体结合蛋白上的特定氨基酸或化学基团(例如，存在于多种类型的蛋白质中的化学基团)。抗体结合蛋白和寡核苷酸的缀合可使用用于形成本文所述的抗体‑核酸缀合的方法例如使用点击化学进行。可通过交联(例如，使用交联剂如甲醛)、蛋白质工程化或过量添加蛋白质结合蛋白来防止抗体结合蛋白/寡核苷酸复合物的解离。331.抗体结合蛋白的实例包括结合至抗体的恒定(fc)区的蛋白质，如蛋白a、蛋白g、蛋白l或其片段。其它结合蛋白(例如链霉抗生物素蛋白)可表达为与抗体结合蛋白的融合蛋白，并用于缔合寡核苷酸(例如，通过生物素化的寡核苷酸与链霉抗生物素蛋白‑蛋白a融合蛋白的结合)。其它抗体结合蛋白或结构域可为各种抗体类别提供额外的结合亲和力。在一些情况下，抗体结合蛋白可以是抗体，例如靶向样品的抗体的第二抗体。第二抗体可包含在此所述的寡核苷酸，例如具有条形码和聚‑a或聚t终止序列的寡核苷酸。332.可工程化抗体结合蛋白以引入另外的功能。可将抗体结合蛋白工程化为含有具有适合与寡核苷酸缀合的官能团的氨基酸。例如，抗体结合蛋白可天然地具有或被工程化为具有半胱氨酸残基，例如用于控制寡核苷酸的化学计量学和/或附接位置。可将抗体结合蛋白工程化为具有非天然氨基酸残基，例如用于结合蛋白和抗体的靶向交联。可将抗体结合蛋白工程化为具有标签，例如荧光标签(例如，通过与荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、黄色荧光蛋白(yfp))融合)和/或亲和标签以用于纯化和可视化。荧光标签和/或亲和标签可以是可裂解的。在一些情况下，可将抗原结合蛋白工程化为每个蛋白质具有一个或多个(例如，仅一个)条形码附接位点。333.本文还提供了包含例如在孔板中与报告寡核苷酸缀合的抗体结合蛋白的试剂盒。用于测定的抗体可以指定浓度与缀合有报告寡核苷酸的抗体结合蛋白一起孵育，而不干扰抗体的结合位点和/或不需要在客户手中进行任何化学反应来将报告寡核苷酸缀合至抗体。334.报告寡核苷酸可具有任何不同长度的任何长度，这取决于适合于给定分析的报告寡核苷酸的多样性、所采用的序列检测方案等。在一些情况下，这些报告寡核苷酸可以是长度大于或等于约5个核苷酸、长度大于或等于约10个核苷酸、长度大于或等于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200或250个核苷酸。在一些情况下，这些报告寡核苷酸的长度可小于或等于约250、200、180、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个核苷酸。在一些情况下，可选择报告寡核苷酸以提供已经设定大小的带条形码产物，并且另外配置为在测序系统上进行分析。例如，这些序列可以理想地为特定测序系统产生合适长度的可测序产物的长度提供。同样地，除了报告序列之外，这些报告寡核苷酸可包括另外的序列元件，如测序仪附接序列、测序引物序列、扩增引物序列或这些中的任一者的互补序列。335.在操作中，可将含有细胞的样品与标记剂及其相关的报告寡核苷酸一起孵育，以获得待分析的任何细胞表面特征。在孵育后，可洗涤细胞以除去未结合的标记剂。在洗涤后，细胞可与携带上述珠粒的条形码(也称为锚寡核苷酸)一起分配到单独的分区(例如微滴)中，其中每个分区包括有限数量的细胞，例如单细胞。在从珠粒释放条形码(或锚寡核苷酸)后，它们可引发与标记剂偶联的报告寡核苷酸的扩增和条形编码。报告寡核苷酸的带条形码重复可另外包括功能序列，如引物序列、附接序列等。336.然后可对带条形码的报告寡核苷酸进行序列分析以鉴定哪些报告寡核苷酸与分区内的细胞(即细胞表面特征)结合。此外，还通过对相关条形码序列进行测序，可鉴定给定细胞表面特征可能与其它不同细胞表面特征来自相同的细胞，其报告序列包含相同的条形码序列，即它们源自同一分区。337.在一些实施方案中，分区内的锚寡核苷酸可与结合至细胞表面特征的标记剂偶联的报告寡核苷酸相互作用并使得合成如本文所述的核酸分子，其中合成的核酸分子可包含含有报告寡核苷酸或锚寡核苷酸或两者的核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分。然后可对这些合成的核酸分子进行扩增和测序，如本文所述。338.在一些实施方案中，多于一种标记剂可结合至单一细胞表面特征，并且所述标记剂之间的接近性可允许与其偶联的报告寡核苷酸的3'端杂交(其中当在溶液中未结合时通过解链温度阻止这种杂交)。通过如本文所述的延伸反应，可合成、扩增核酸分子并进行测序，如本文所述。339.基于从基于条形码序列的存在从单独分区发出的报告寡核苷酸，然后可从细胞群体产生单独细胞的细胞表面特征概况。可将单独细胞或细胞群体的概况与来自其它细胞(例如，‘正常’细胞)的概况进行比较，以鉴定细胞表面特征的变化，其可提供诊断相关信息。特别地，这些概况可特别适用于诊断以细胞表面受体的变化为特征的各种病症，如癌症和其它病症。340.在一些实施方案中，可对通过本文描述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组学和细胞表面信息进行单独测序。在一些实施方案中，可汇集通过本文所述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组学和细胞表面信息并且一起测序。在一些实施方案中，可依次对通过本文所述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组和细胞表面信息进行测序(即，首先表征细胞表面信息，然后表征蛋白质组学和基因组信息)。341.本文还提供了用于筛选化学化合物文库的组合物和方法。所述方法可包括提供包含至少一种化学化合物的分区和所述分区的标识符。标识符可以是包含本技术中描述的核酸条形码序列的寡核苷酸。可扩增标识符寡核苷酸并进行测序。标识符寡核苷酸或其片段的序列读数可用于鉴定分区和所述分区中的至少一种化合物。所述方法可用于在小体积反应(例如按纳升的规模)中筛选化学化合物文库。可使用相同的底物和/或试剂在不同的分区中进行多个反应。可使反应多重化以减少在较大规模反应(例如按微升规模)中加工相同数量的化合物所需的努力和时间。所述方法和组合物可允许高通量筛选具有低噪声和/或假阳性结果的化学化合物文库。在一些情况下，用于筛选化学化合物文库的方法可包括以下操作中的一个或多个：(1)提供多个分区，其中所述多个分区的给定分区(i)具有或怀疑具有至少一种化学化合物，和(ii)包含标识符寡核苷酸，所述标识符寡核苷酸包含允许鉴定给定分区的核酸条形码序列；(2)在足以从所述多个分区的其余部分选择多个分区的子集的条件下对所述多个分区进行筛选，所述子集包括具有或疑似具有所述至少一种化学化合物的给定分区；(3)使所述多个分区的子集(包括给定分区)经受足以产生包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子的条件；(4)对所述核酸分子进行测序以产生序列读数，所述序列读数允许鉴定所述至少一种化学化合物。342.所述方法可包括在固体载体上构建组合化学和标识符寡核苷酸文库，例如单分散的聚合物珠粒。所述寡核苷酸条形码可固有地连接至对所述单分散的聚合物珠粒来说独特的化学合成路径。在分配这种聚合物珠粒时，化合物群体可从底物释放以与不受标识符寡核苷酸阻碍的靶分子相互作用。然后可基于正/负相互作用对分区进行分选，如传统的报告测定所指示。然后可将阳性分区均质化并汇集。可扩增阳性分区中的标识符寡核苷酸用于测序。所述方法可允许将大量单一化合物单独地包装到纳升分区中，并且用于可汇集并以多重形式加工的具有正相互作用的分区的随后去卷积。343.在一些情况下，所述方法包括在固体载体(例如珠粒)上合成受控数量的化学化合物，同时在固体载体上合成所述化合物特有的受控数量的标识符寡核苷酸。所述化学化合物和标识符寡核苷酸的组合文库可通过顺序添加化学化合物亚基来制备，所述化学化合物亚基与在固体基质上同时或随后顺序添加标识符寡核苷酸一致。所述方法可在单个器皿中多重化，以用于以大规模平行方式添加化学化合物和标识符寡核苷酸。待筛选的化学化合物的量可标准化。344.可通过调节附接点的数量来控制在固体载体上合成的化学化合物和/或标识符寡核苷酸的数量。附接点可以是固体载体上化学化合物或标识符寡核苷酸可附接至的位置。附接点可包括用于裂解化学化合物和/或标识符寡核苷酸的多种类型的化学。这允许以受控方式选择性释放化学化合物和/或标识符寡核苷酸。固体可具有单个或多个附接点。345.固体载体可充当化学化合物与标识符寡核苷酸之间的共价接头。单一类型的固体载体或多种类型的固体载体可用于筛选中。如果使用多种类型的固体载体，它们可共价连接以形成单一固体载体。在某些情况下，如果使用多种类型的固体载体，则它们可混杂(但不共价连接)并占据相同的物理空间。固体载体可具有两种或更多种混杂的基质。在这些情况下，化学化合物和标识符寡核苷酸可在固体载体的同一基质上或单独基质上。在后一种情况下，化学化合物和标识符寡核苷酸混杂(并且不共价连接)并占据相同的物理空间。在一些情况下，固体载体可以是可渗透的或不可渗透的。在某些情况下，固体载体可以是可溶解的或不可溶解的。346.化学化合物可以是蛋白质(例如，抗体或其片段或抗原或其片段)、核酸分子。在一些情况下，化学化合物可以是小分子化合物。小分子化合物可以是低分子量(例如，不大于1000道尔顿)的有机化合物，其可帮助调控生物过程。小化合物可具有约1nm的尺寸。例如，小分子化合物可以是小分子药物。347.可使用筛选用于药物发现的小分子的方法进行化学化合物文库的筛选。例如，可使用药物发现中的高通量筛选或高含量分析来进行筛选。高通量筛选可以是筛选，其鉴定调节特定生物分子途径的活性化合物、抗体或基因。高含量分析可以是筛选，其鉴定以某种方式改变细胞表型的物质，如小分子、肽或rnai。在一些情况下，筛选可以是免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(elisa)。348.本文还提供了用于递送一种或多种试剂的支架。在一些情况下，试剂不与固体支架共价结合。例如，试剂可在支架内并且阻止(例如，通过与支架的空间相互作用)扩散出所述支架。当支架溶解时，试剂可从支架释放。在一些情况下，支架可以是本文所述的微胶囊，如凝胶珠粒。349.支架可用于表征细胞的方法中。所述方法可包括提供包含细胞、支架和所述支架中的试剂的分区。为了表征分区中的细胞，可溶解支架以释放试剂。所述试剂然后与细胞接触以确定细胞的一种或多种特征。在一些情况下，所述分区可包含多种试剂。本公开中描述的任何试剂可用于这种方法中。350.支架可用于递送两种或更多种试剂。在一些情况下，第一试剂与支架非共价结合，并且第二试剂可与支架共价结合。在其它情况下，可使用多个支架来递送多种试剂。在这些情况下，第一试剂可与第一支架共价结合，并且第二试剂可与第二支架非共价结合。第一支架和第二支架可与细胞一起封装在同一分区中。351.当支架溶解时，可释放与支架非共价结合的试剂。当至少0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％体积的支架溶解在其周围的溶液中时，所述支架溶解。352.支架可包含一个或多个孔，并且与支架非共价结合的试剂可在一个或多个孔中。一个或多个孔的直径可达0.01nm、0.1nm、1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1μm或10μm。353.负载有非共价结合的试剂的支架可使用将剂并入固体物质中的任何方法来制备。在一些情况下，可使用以下操作中的一个或多个来制备负载有非共价结合的试剂的支架：1)将支架(例如，凝胶珠粒)和试剂置于引起所述支架膨胀并且由聚合物支架限定的孔扩大的条件下。这种条件可包括：在热力学上有利的溶剂中，在更高或更低的温度下(例如，对于温度响应性水凝胶材料)，在具有更高或更低离子浓度的溶剂中和/或对于电荷/场响应性水凝胶材料在存在或不存在电场的情况下；2)允许足够的时间用于试剂扩散到支架的内部中；3)将支架转移到引起孔收缩的条件。然后通过与聚合物支架的空间相互作用阻止支架内的试剂分子扩散出支架。操作3)中的转移可例如通过将支架从一种共流动溶剂流移动至另一种来微流体地实现。图29展示所述方法中的溶胀条件和消溶胀条件的实例。可通过改变聚合物组成来调节支架的溶胀性和孔径。354.在包含负载有非共价结合的试剂的支架的分区中，可通过包括一定体积的支架来调节分区的组成。例如，当分区具有固定体积时，通过包括较大体积的试剂负载的支架，可上调分区中试剂的浓度。在一些情况下，可在不改变分区中的组分的初始浓度的情况下进行调整。在某些情况下，可在不改变分区的总体积的情况下进行调整。此类方法可用于递送干扰分区产生的试剂，例如细胞裂解剂。355.可使用本公开中描述的方法产生具有支架的分区。在某些情况下，在分区产生期间，支架和紧紧围绕支架的液体两者均被封装在如图30所示的单个分区中。支架和周围液体的体积包括“单位细胞”。单位细胞可由支架在其中流动的微通道的几何形状和所施加的压力限定。例如，较高的压力可压缩可变形的支架，从而减小单位细胞的体积。356.分区的组成可由支架悬浮液的体积(z1)和包封在所述分区中的样品的体积(z2)来确定。组合物的特征可通过这两个体积的比率(z1/z2)来描述。单一支架封装可能的最大z1等于单位细胞的体积。因此，为了增加由支架递送在固定体积的分区中试剂的浓度而不增加支架悬浮液中试剂的浓度，可增加支架的尺寸。因此，封装的单位细胞可占据更大体积的分区(在较高的z1/z2比率下)。在用于制备所述分区的微通道中，取决于支架的机械性质，微通道的尺寸可以或可以不必增加以容纳更大的分区。当施加较高的压力时，支架可压缩，单位细胞的体积可减小，并且可实现较低的z1/z2比率。357.本文还提供了用于对来自细胞的dna(例如基因组dna)分子和rna(例如mrna)分子进行平行和/或同时测序的方法和组合物。在一些情况下，所述方法和组合物可用于对来自单细胞的基因组和转录组进行平行测序。所述方法可用于剖析遗传变异的功能后果。358.包埋一种或多种磁性颗粒的微胶囊(例如珠粒)可用于所述方法中。在微胶囊溶解之前，磁性颗粒可能不会扩散出微胶囊。微胶囊可包含含有dna引物的寡核苷酸。例如，dna引物可以是基因组dna引物。dna引物可结合至来自细胞的dna分子。dna引物可用于扩增和/或测序来自细胞的dna分子。dna引物可被包埋和/或结合至微胶囊并在微胶囊溶解时释放。359.包埋在微胶囊内的磁性颗粒可包含含有rna引物的寡核苷酸。所述rna引物可结合至来自细胞的rna分子。在一些情况下，rna引物是结合至来自细胞的mrna分子的mrna引物。例如，mrna引物可包含结合至来自细胞的mrna分子的聚‑a序列的聚‑t序列。图31示出包埋有带条形码磁性颗粒的微胶囊。360.磁性颗粒可由诸如氧化铁(例如，超顺磁性氧化铁)、铁磁性、亚铁磁性或顺磁性材料的材料制成。铁磁材料可能对磁场非常敏感，并且当磁场可被移除时能够保持磁性。铁磁材料包括但不限于铁、钴、镍、其合金以及其组合。其它铁磁稀土金属或其合金也可用于制造磁性颗粒。361.微胶囊和磁性颗粒两者上的寡核苷酸可包含相同的条形码序列。所述条形码序列可允许匹配来自相同细胞的dna和rna的信息(例如，序列读数)。362.在一些情况下，条形码序列可包含细胞的独特标识符。例如，独特标识符可将细胞与样品中的其它细胞区分开。因此，独特标识符可允许多个细胞例如至少10、50、100、200、300、400、500、600、800或1000个细胞中的dna分子和rna分子的并行分析。例如，独特标识符可允许多个细胞例如至少200或500个细胞中的dna分子和rna分子的并行分析。363.在一些情况下，微胶囊还可含有一种或多种用于分析细胞的试剂。例如，微胶囊可含有裂解剂。当微胶囊溶解时，可释放裂解剂并在与微胶囊同一分区中裂解细胞。364.在一些情况下，微胶囊可以是凝胶珠粒。用于制备具有一种或多种磁性颗粒的凝胶珠粒的示例性方法可包括以下操作中的一个或多个：1)将磁性颗粒添加至用于制备凝胶珠粒的材料的水相中，例如凝胶珠粒单体混合物；2)使用微流体方法制备凝胶珠粒，例如通过形成聚合以形成凝胶珠粒的微滴。当微滴聚合时，磁性颗粒被包埋在其中；3)将相同的条形码序列添加至凝胶珠粒，并且例如使用双连接策略将磁性颗粒包埋在其内。365.一旦产生分区以包括细胞、微胶囊和包埋在所述微胶囊中的磁性颗粒，可将分区与一种或多种试剂(例如，裂解剂)一起孵育以裂解细胞并溶解微胶囊。孵育可在微流体芯片装置上进行，例如使用如frenz等人,reliablemicrofluidicon‑chipincubationofdropletsindelay‑lines.labchip.2009may21；9(10):1344‑8中描述的延迟线装置，所述文献以引用的方式整体并入本文。在孵育后，可收集分区并置于容器，例如带管或板中。366.孵育可进行允许细胞有足够的时间溶解并且磁性颗粒从微胶囊中释放的一段时间。孵育时间还可允许磁性颗粒上的rna引物与来自细胞的rna分子的充分结合。在一些情况下，孵育时间可以是1分钟至100分钟、5分钟至50分钟、10分钟至30分钟或10分钟至20分钟。367.与磁性颗粒上的rna引物结合的一种或多种rna分子可与分区中的其它组分分离。可通过浓缩磁性颗粒来进行分离。磁性颗粒可通过磁场浓缩。分离可在微流体装置上进行，例如，如gao等人,wash‑freemagneticimmunoassayofthepsacancermarkerusingsersanddropletmicrofluidics,labchip,2016,16,1022‑1029；brouzes等人,rapidandcontinuousmagneticseparationindropletmicrofluidicdevices.labchip.2015年2月7日；15(3):908‑19；或lombardi等人,dropletmicrofluidicswithmagneticbeads:anewtooltoinvestigatedrug‑proteininteractions.analbioanalchem.2011jan；399(1):347‑52中描述的装置，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些情况下，一种或多种rna分子可与dna分子分离。可使用本文所述的方法(例如测序)分析来自单细胞的分离的rna分子和dna分子，以确定细胞的特征。368.图32示出对细胞中的dna(例如基因组dna)和rna(例如mrna)进行平行测序的方法。在操作3210中，通过将凝胶珠粒与磁性颗粒、细胞和反应试剂(例如裂解剂)混合来制备单细胞分区。从混合物产生微滴。单个微滴3220含有一个细胞、具有磁性颗粒的凝胶珠粒和反应试剂。凝胶珠粒具有基因组dna引物，并且磁性颗粒具有mrna引物。分区中的凝胶珠粒和磁性颗粒具有相同的条形码序列。在3230中，使凝胶珠粒溶解以释放磁性颗粒和基因组dna引物。还裂解细胞以释放基因组dna分子和mrna分子。通过与mrna引物结合，mrna分子被捕获在磁性颗粒上。在操作3240中，在微流体装置上，分区分成两个子微滴。具有捕获的mrna分子的磁性颗粒被收集在仅一个子微滴中，因此与其它组分例如另一个子微滴中的基因组dna分离。因此，来自单细胞的基因组dna分子和mrna分子被分离并可用于进一步分析。369.本文还提供了用于分析来自样品(例如，单细胞)的一种或多种蛋白质和一种或多种核酸的方法和组合物。例如，所述方法和组合物可用于分析单细胞中的蛋白质组、基因组和/或转录组。所述方法可包括产生含有样品、用于蛋白质的标记剂和用于核酸的标记剂的分区。在一些情况下，用于蛋白质的标记剂可与样品中的一种或多种蛋白质相互作用。例如，用于蛋白质的标记剂可包含抗体。在其它情况下，用于蛋白质的标记剂可与蛋白质探针偶联，所述蛋白质探针与样品中的一种或多种蛋白质相互作用。例如，用于蛋白质的标记剂可与抗体偶联。用于核酸的标记剂可与样品中的一种或多种核酸相互作用。用于核酸的标记剂可包含引物，例如结合至dna分子和/或rna分子的引物。用于蛋白质的标记剂和用于核酸的标记剂可包含相同的报告寡核苷酸。报告寡核苷酸可包含条形码和/或umi。条形码和/或umi可允许来自同一样品的蛋白质与核酸匹配。当与用于核酸的标记剂结合时，可对来自样品的核酸进行测序。报告寡核苷酸或其部分也可进行测序。在一些情况下，所述方法可包括以下操作中的一个或多个：a)提供分区，所述分区包含含有蛋白质和第一核酸分子的生物样品；(i)能够结合至所述蛋白质并且(ii)与报告寡核苷酸偶联的标记剂，所述报告寡核苷酸包含允许鉴定所述标记剂的核酸条形码序列；偶联至载体的第一锚寡核苷酸，所述第一锚寡核苷酸能够与所述报告寡核苷酸相互作用；以及偶联至所述载体的第二锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸能够与所述第一核酸分子相互作用；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子进行测序。当用于蛋白质的标记剂和蛋白质探针是分开的分子时，可在操作(a)中制备分区之前将所述蛋白质探针与样品一起孵育。370.两种锚定剂可用于本文所述的方法中。第一锚定剂可与来自样品的一种或多种核酸相互作用。另外或可替代地，第一锚定剂可与用于核酸的标记剂偶联。例如，第一锚定剂可包含结合至用于核酸的标记剂的寡核苷酸。第二锚定剂可与来自样品的一种或多种蛋白质相互作用。另外或可替代地，第二锚定剂可与用于蛋白质的标记剂偶联。例如，第二锚定剂可包含与用于蛋白质的标记剂相互作用的元件。在一些情况下，第二锚定剂可包含与偶联至用于蛋白质的标记剂的寡核苷酸序列相互作用的核酸序列。371.用于蛋白质的标记剂可包含一种或多种元件。所述标记剂可包含与锚定剂相互作用的元件(例如，寡核苷酸序列)。所述标记剂可包含报告寡核苷酸，例如包含条形码的寡核苷酸，所述条形码允许鉴定由标记剂靶向的蛋白质。例如，在用于蛋白质的标记剂包含抗体的情况下，所述报告寡核苷酸可允许鉴定抗体，从而鉴定由所述抗体结合的蛋白质。372.用于蛋白质的标记剂可包含允许所述标记剂与蛋白质探针(例如抗体)偶联的反应性部分。所述标记剂可通过本文描述的任何化学与蛋白质探针偶联，以用于将报告寡核苷酸附接至标记剂。在一些情况下，反应性部分可包括点击化学接头，如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯或tco‑peg4‑nhs酯。标记剂上的反应性部分还可包括用于靶向醛的胺、用于靶向马来酰亚胺(例如，游离硫醇)的胺、用于靶向点击化学化合物(例如，炔烃)的叠氮化物、用于靶向链霉抗生物素蛋白的生物素、用于靶向edc的磷酸酯，其进而靶向活性酯(例如，nh2)。蛋白质探针上的反应性部分可以是与标记剂上的反应性部分结合的化学化合物或基团。将蛋白质探针与标记剂缀合的示例性策略包括使用商业试剂盒(例如，solulink、thunderlink)、轻度还原铰链区和马来酰亚胺标记的缀合、标记的酰胺的染色促进的点击化学反应(例如，不含铜)以及糖链的高碘酸盐氧化和胺缀合的缀合。在蛋白质探针是抗体的情况下，可修饰所述抗体以缀合报告寡核苷酸。例如，抗体可用β‑1,4‑半乳糖基转移酶的底物允许突变体、galt(y289l)和带有叠氮化物的尿苷二磷酸‑n‑乙酰半乳糖胺类似物尿苷二磷酸‑galnaz进行糖基化。修饰的抗体可与具有二苯并环辛炔‑peg4‑nhs基团的报告寡核苷酸缀合。图33示出用于抗体‑报告寡核苷酸缀合的示例性策略。在一些情况下，可避免一些策略(例如，cooh活化(例如，edc)和同双功能交联剂)以防止蛋白质探针与它们自身缀合。373.两种锚定剂可与固体载体(例如微胶囊)偶联。例如，微胶囊可以是珠粒，例如凝胶珠粒。在一些情况下，两种锚定剂偶联至相同的固体载体。在其它情况下，两种锚定剂偶联至不同的固体载体。两种锚定剂可包含相同的报告寡核苷酸。374.图34示出所述方法中使用的示例性试剂。锚定剂3420偶联至珠粒3410。锚定剂包含条形码序列3422和umi3423。锚定剂还包含允许与标记剂3430结合的寡核苷酸序列3424。标记剂3430包含用于结合至锚定剂的寡核苷酸3431。标记剂3430还包含条形码3432，所述条形码允许鉴定其所偶联的抗体。标记剂3430还包含允许标记剂与抗体3440偶联的反应性部分3434。375.适用于分析带条形码标记剂的试剂和方案的另一个实例示于图52b的图i和图ii中。如图52b(图i)所示，标记剂(例如，抗体、mhc部分)5201直接与包含条形码序列5203的寡核苷酸5202偶联(例如，共价结合，经由蛋白质‑蛋白质相互作用结合，如与蛋白质g结合)，所述条形码序列鉴定标记剂5201。寡核苷酸5202还包括适用于下游反应的额外序列(包含模板转换寡核苷酸的反向互补序列的序列5204和包含pcr柄的序列5205)。图52b(图i)还示出适用于下游反应的另外的寡核苷酸5206(例如，其可能已经如本文其它地方所述从珠粒释放)，所述寡核苷酸包含条形码序列5208、umi序列5209和另外的序列(包含测序读取引物结合位点‘pr1’的序列5207和包含模板转换寡核苷酸的序列5210)。在分析期间，标记剂结合至其靶细胞表面特征，并且序列5210的rgrgrg序列与序列5204杂交，并且寡核苷酸5202和5206两者均经由聚合酶(例如，逆转录酶、聚合酶)的作用延伸，其中寡核苷酸5206然后在其3'端包含寡核苷酸5202的互补序列。然后可如本文其它地方所述任选地加工这些构建体并进行测序以例如鉴定靶细胞表面特征(经由从寡核苷酸5202产生的互补条形码序列)并将其与通过寡核苷酸5206的条形码序列鉴定的细胞相关联。376.在图52b(图ii)所示的另一个实例中，标记剂(例如，抗体)5221间接地(例如，经由杂交)偶联至寡核苷酸5222，所述寡核苷酸包含鉴定标记剂5221的条形码序列5223。标记剂5221直接(例如，共价结合，经由蛋白质‑蛋白质(如与蛋白质g)相互作用结合)偶联至与寡核苷酸5222的序列5231杂交的杂交寡核苷酸5232。寡核苷酸5232与寡核苷酸5231的杂交将标记剂5221偶联至寡核苷酸5222。寡核苷酸5222还包括适用于下游反应的额外序列(包含模板转换寡核苷酸的反向互补序列的序列5224和包含pcr柄的序列5225)。图52b(图ii)还示出适用于下游反应的另外的寡核苷酸5226(例如，其可能已经如本文其它地方所述从珠粒释放)，所述寡核苷酸包含条形码序列5228、umi序列5229和另外的序列(包含测序读取引物结合位点‘pr1’的序列5227和包含模板转换寡核苷酸的序列5220)。在分析期间，标记剂结合至其靶细胞表面特征，并且序列5220的rgrgrg序列与序列5224杂交，并且寡核苷酸5222和5226两者均经由聚合酶(例如，逆转录酶、聚合酶)的作用延伸，其中寡核苷酸5226然后在其3'端包含寡核苷酸5222的互补序列。然后可如本文其它地方所述任选地加工这些构建体并进行测序以例如鉴定靶细胞表面特征(经由从寡核苷酸5222产生的互补条形码序列)并将其与通过寡核苷酸5226的条形码序列鉴定的细胞相关联。377.用于分析来自单细胞的mrna分子和蛋白质的方法的实例示于图35a和图35b中。所述方法使用带条形码抗体3510，其含有与寡核苷酸3512缀合的抗体3511。寡核苷酸3512可结合至与珠粒偶联的第一锚寡核苷酸3520。将带条形码抗体3510与细胞一起孵育，以使得所述抗体结合至细胞上的抗原，并且形成抗体‑细胞复合物(图35a)。未结合的抗体被洗掉。将抗体‑细胞复合物制成乳液分区。每个分区含有抗体‑细胞复合物、第一锚寡核苷酸3520以及结合至来自细胞的mrna分子的第二锚寡核苷酸3530。裂解细胞并从所述细胞释放mrna分子。如图35b所示，将所述mrna分子逆转录为cdna并在第二锚寡核苷酸的帮助下扩增。扩增的cdna分子具有与第一锚寡核苷酸3520上的条形码和umi相同的条形码和umi。对第一锚寡核苷酸3520和寡核苷酸3512的复合物进行引物延伸，从而产生报告寡核苷酸3550，所述报告寡核苷酸包含与第二锚寡核苷酸上的条形码和umi相同的条形码和umi。报告寡核苷酸3550还包含抗体标识符(抗体条形码(abbc))，其鉴定抗体和由抗体结合的抗原。当对cdna分子进行测序时，使用条形码和umi将序列读数与相同细胞中的抗原相关联。图35c示出第一锚寡核苷酸和与抗体缀合的寡核苷酸3512的引物延伸。可将所得寡核苷酸与从来自细胞的mrna合成的cdna分离(例如，通过基于大小的选择)。第一锚寡核苷酸和第二锚寡核苷酸与寡核苷酸3512的复合物可单独或联合加工和/或测序。在一些情况下，锚定剂3520和3530可偶联至同一珠粒。378.本文还提供了用于如上所述分配细胞的微流体装置。此类微流体装置可包括用于进行分配过程(如图1和图2中所陈述的那些)的通道网络。简言之，这些微流体装置可包括用于将细胞分配至单独分区中并且将此类细胞与例如设置于珠粒上的寡核苷酸条形码库成员共分配的通道网络(如本文所描述的那些)。可将这些通道网络设置于固体本体(例如其中限定所述通道的玻璃、半导体或聚合物本体结构)内，其中那些通道在其末端与用于接收各种输入流体以及用于从通道网络的输出最终沉积所分配的细胞等的储库连通。举例来说，并且参考图2，流体联接至通道202的储库可提供有细胞214的水性悬浮液，同时联接至通道204的储库可提供有携带寡核苷酸的珠粒216的水性悬浮液。通道区段206和208可提供有非水性溶液(例如油)，在通道接点212处将水性流体以微滴形式分配至所述非水性溶液中。可将出口储库流体联接至通道210，可将所分配的细胞和珠粒递送至所述通道中以及从其中收获它们。如应了解，虽然以储库形式进行了描述，但应了解，可将通道区段联接至多种不同流体来源或接收部件(包括管道、歧管)或其它系统的流体部件中的任一种。379.还提供通过通道网络例如通过所施加的压力差、离心力、电动泵送、毛细管或重力流等来控制这些流体的流动的系统。380.本文还提供了用于分析单独细胞或细胞小群体的试剂盒。所述试剂盒可包括一种、两种、三种、四种、五种或更多种、直至所有分配流体，包括水性缓冲液和非水性分配流体或油；如本文所述的与珠粒可释放地缔合的核酸条形码库；如本文所述的标记剂；如本文所述的锚寡核苷酸；微流体装置；用于破坏细胞、扩增核酸以及在细胞核酸的片段或其重复上提供额外的功能序列的试剂；以及在本文描述的方法中使用前述中的任一者的说明书。381.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的组合物，所述组合物包含含有多个条形码分子和多种分析物的分区。多个条形码分子还可包括至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物(例如，dna和rna、dna和蛋白质、rna和蛋白质或dna、rna和蛋白质)。在一些情况下，所述组合物包含含有分区的多个分区。382.本公开的另一方面提供了一种用于分析物表征的方法。所述方法包括：(a)提供多个分区，其中所述多个分区中的给定分区包括多个条形码分子和多种分析物。所述多个条形码分子可包含至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列；其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述方法还包括(b)在所述给定分区中，(i)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(ii)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二分子。在一些情况下，所述方法还包括对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或所述第一核酸分子和/或第二核酸分子的衍生物进行测序以表征所述第一和/或所述第二分析物。383.表征所述第一分析物和/或第二分析物通常提供关于所述第一分析物和/或第二分析物的信息。此信息可用于为(a)‑(c)的一个或多个另外循环选择第一和/或第二分析物。因此，所述方法还可包括从所述测序基于基于所述第一分析物或第二分析物的表征重复(a)‑(c)。在一些情况下，所述方法还包括基于在重复(a)‑(c)时从测序或随后测序获得的第一分析物或第二分析物的表征来选择所述第一分析物和/或所述第二分析物。384.此外，在一些情况下，(b)还包括：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。例如，第一核酸分子和/或第二核酸分子可借助于一种或多种引物延伸反应合成，所述引物延伸反应利用与第一或第二分析物杂交的引物。这种引物可包含如本文其它地方所述的条形码序列和/或umi序列。在一些情况下，可借助于两个核酸分子之间的连接来合成第一核酸分子和/或第二核酸分子。385.在一些情况下，所述方法还包括在从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之后进行一个或多个反应。此类反应可包括经由另外的引物延伸反应、核酸扩增方案(例如pcr)或连接添加另外的核酸序列(例如，样品索引序列，在特定测序平台中起作用的序列)。在一些情况下，可在添加另外的核酸序列之前或之后除去第一和/或第二核酸分子的部分(例如，经由限制酶、经由剪切)。此外，这些反应可在本体中进行，以使得所述第一和第二核酸分子以及来自其它分区的第一和第二核酸分子的加工同时在本体中加工。这种加工可在单釜反应中完成。此类一种或多种其它反应的实例在美国专利公布号2015/0376609中提供，所述专利以引用的方式整体并入本文。386.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的系统。所述系统包括用于提供包含多个条形码分子和所述多种分析物的分区的分配单元，其中：(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子包含第一核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第一分析物；并且(ii)所述多个条形码分子的第二单个条形码分子包含第二核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第二分析物，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述系统还可包括耦接至分配单元的控制器，其中所述控制器被编程为：(i)指导所述分配单元提供所述分区；使所述分区经受足以以下的条件：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。第一核酸分子和第二核酸分子或其衍生物的测序可表征所述第一分析物或第二分析物。在一些情况下，所述分配单元可提供包括所述分区的多个分区。387.在一些情况下，所述分配单元包括多孔板。在一些情况下，所述分配单元包括多个通道，其可以是微流体通道。所述多个通道可聚集在一起以形成提供所述分区的至少一个通道接点。在一些情况下，分配单元可包括(i)第一通道，所述第一通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供第一流体；(ii)和第二通道，所述第二通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供与所述第一流体不混溶的第二流体。在一个实例中，然后第一通道可被配置为提供包含水相试剂的水相(例如，核酸，包括带条形码核酸、标记剂、珠粒、可降解珠粒的剂、扩增/引物延伸试剂、样品核酸、细胞、细胞裂解试剂等)，并且第二通道可被配置为提供油相，所述油相包含与水相不混溶的油(例如，包含含氟表面活性剂的油)。在水相与油相接触后，产生包含水相试剂的水相微滴。388.在各个方面，分区或给定分区可包含至少1,000个条形码分子、至少2,500个条形码分子、至少5,000个条形码分子、至少7,500个条形码分子、至少10,000个条形码分子、至少20,000个条形码分子、至少30,000个条形码分子、至少50,000个条形码分子、至少60,000个条形码分子、至少70,000个条形码分子、至少80,000个条形码分子、至少90,000个条形码分子、至少100,000个条形码分子、至少200,000个条形码分子、至少300,000个条形码分子、至少400,000个条形码分子、至少500,000个条形码分子、至少600,000个条形码分子、至少700,000个条形码分子、至少800,000个条形码分子、至少900,000个条形码分子、至少1,000,000个条形码分子、至少2,500,000个条形码分子、至少5,000,000个条形码分子、至少7,500,000个条形码分子、至少10,000,000个条形码分子、至少50,000,000个条形码分子、至少100,000,000个条形码分子或更多。389.在各个方面，第一单个条形码分子和第二单个条形码分子中的至少一个可偶联(例如，经由共价键、经由非共价相互作用、经由不稳定键等)至珠粒。在一些情况下，珠粒包含凝胶珠粒和/或如本文其它地方所述可降解。在本文所述的方法中，在提供一个或多个分区之后，可从珠粒释放第一或第二条形码分子。在一些情况下，条形码分子的释放可在其用于条形编码相应核酸分子之前、同时或之后发生。在释放于条形编码后发生的情况下，带条形码构建体最初与珠粒偶联。此外，分区可包含能够降解珠粒的剂。在一些情况下，这种试剂是可还原珠粒的二硫键和/或与珠粒偶联的物质与珠粒本身之间的任何二硫连键的还原剂。此外，在各个方面，分区或给定分区可以是任何合适的分区，如多个微滴中的微滴(例如，乳液中的微滴)或多个孔中的孔。此外，在各个方面，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是相同的。390.在各个方面，第一分析物或第二分析物可以是核酸分子，包括本文其它地方描述的任何类型的核酸分子。例如，核酸分子可以是基因组脱氧核糖核酸(gdna)。在另一个实例中，核酸分子是信使核糖核酸(mrna)。391.此外，在各个方面，第一分析物或第二分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。分区或给定分区可包含细胞或细胞的一种或多种组分(例如，如在细胞裂解后剩余的游离细胞表面特征)。在一些情况下，分区或给定分区包含单细胞。标记剂可以是任何标记剂，包括本文其它地方描述的类型的标记剂，包括抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。细胞表面特征的实例包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接等以及本文其它地方描述的任何其它细胞表面特征。392.在一些情况下，在分配细胞之前，将细胞与一种或多种标记试剂一起在本体中孵育。可选择一种或多种标记剂，以使得它们针对给定测定中的特定目标细胞表面特征。在将一种或多种标记剂结合至相应的细胞表面特征(在存在的情况下)后，然后可洗涤细胞以除去未结合的标记剂，并且然后将所得细胞进行分配。393.此外，在一些情况下，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子可能能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。所述第三核酸分子可偶联至标记剂并包含第三核酸条形码序列，所述第三核酸条形码序列鉴定偶联的标记剂(并且因此鉴定所述标记剂所结合的细胞表面特征)。在引物延伸反应中，可使所述第一单个条形码分子或第二单个条形码分子延伸，以使得所述第三条形码序列的互补序列被添加至所述第一或第二单个条形码分子。在测序期间，这些分子的第一或第二条形码序列可鉴定从其合成分子的分区，并且在分区包含单细胞的情况下，所述第三条形码序列可将特定细胞表面特征与所述单细胞相关联。394.在各个方面，所述第一分析物和第二分析物可以是不同类型的核酸分子。例如，所述第一分析物可以是脱氧核糖核酸分子(例如，gdna)，并且所述第二分析物可以是核糖核酸分子(例如mrna)，例如像转录物。在实现的情况下，可分析并表征细胞的基因组dna以及还有细胞的转录组。395.此外，在所述第一和第二分析物是核酸分子的情况下，所述第一单个条形码分子和/或第二单个条形码分子可包含能够分别与所述第一分析物和/或第二分析物杂交的引发序列。除了第一核酸条形码分子或第二核酸条形码分子外，还可包含umi序列，其可用于鉴定(和甚至定量)在给定分区内条形编码的特定分子，如本文其它地方所述。396.在图46a中示意性地描绘的一个实例中，分区(例如，微滴、孔或本文所述的任何其它类型的分区)包含珠粒4601，所述珠粒偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码的寡核苷酸4602和4603。珠粒4601以及带条形码寡核苷酸4602和4603在图46a中示意性地描绘。带条形码寡核苷酸4602包含第一核酸条形码序列和可与mrna转录物的聚‑a尾杂交的聚‑t引发序列4604。带条形码寡核苷酸4602还可包含可独特地鉴定给定转录物的umi序列。带条形码寡核苷酸4603包含第二核酸条形码序列和能够与gdna随机杂交的随机n‑聚体引发序列4605。在这种配置中，带条形码寡核苷酸4602和4603包含相同的核酸条形码序列，其允许下游测序读数与分区相关联。但是，在一些情况下，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是不同的。397.所述分区还包含细胞(未示出)和有助于从所述细胞释放核酸的裂解剂，并且还可包括可降解珠粒和/或破坏带条形码寡核苷酸4602和4603与珠粒4601之间的共价连键、从而将它们释放到分区中的剂(例如，还原剂)。释放的带条形码寡核苷酸4602可与从所述细胞释放的mrna杂交，并且释放的带条形码寡核苷酸4603可与从所述细胞释放的gdna杂交。然后可如本文其它地方所述，如经由聚合酶(和/或逆转录酶)和/或引物延伸的作用，针对所述mrna和带条形码寡核苷酸4623中的每个产生带条形码构建体a和b。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可从分区中释放/除去带条形码构建体，并且在一些情况下，进一步加工以添加任何另外序列。然后对所得构建体进行测序，对测序数据进行处理，并将结果用于表征来自细胞的mrna和gdna。可例如，如本文其它地方所述完成分析。从所述表征接收的信息然后可用于分区中的另一个细胞的后续分析。此外，带条形码寡核苷酸4602和4603可被设计为引发任何特定类型的核酸，包括不是源自细胞的核酸的那些。此外，图46a中所示的引发序列是出于示例性目的并且不意味着限制。398.在各个方面，第一分析物可以是核酸分子(例如，脱氧核糖核酸(例如，gdna)、核糖核酸(例如，mrna)、转录物)，并且第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在这种情况下，第一单个条形码分子可包含能够与核酸分子杂交的引发序列，并且还可包括umi序列。此外，第二单个条形码分子可包含能够与偶联至标记剂的第三核酸分子杂交的引发序列。如本文其它地方所述，此第三核酸分子可包含鉴定标记剂的条形码序列。它还可包括umi序列。标记剂可以是任何合适的标记剂，包括本文其它地方描述的一种类型的示例性标记剂，并且可靶向其可选择性地结合的任何合适的细胞表面特征。本文其它地方提供了此类细胞表面特征的非限制性实例。此外，在一些情况下，分区包含具有细胞表面特征的细胞，并且在一些情况下可包含仅一个细胞。399.在图46b中示意性地描绘的一个实例中，分区(例如，微滴、孔、微胶囊或本文所述的任何其它类型的分区)包含珠粒4611，所述珠粒偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码的寡核苷酸4612和4613。珠粒4611以及带条形码寡核苷酸4612和4613在图46b中示意性地描绘。带条形码寡核苷酸4612包含第一核酸条形码序列和可与mrna转录物的聚‑a尾杂交的聚‑t引发序列4614。带条形码寡核苷酸4612还可包含可独特地鉴定给定转录物的umi序列。带条形码寡核苷酸4613包含第二核酸条形码序列和靶向引发序列，所述靶向引发序列能够与带条形码寡核苷酸4623特异性地杂交(经由与结合至细胞4622的表面的抗体4621偶联的带条形码寡核苷酸4623的互补部分4624)。带条形码寡核苷酸4623包含条形码序列，所述条形码序列独特地鉴定抗体4621(并且因此鉴定其所结合的特定细胞表面特征)。在这种配置中，带条形码寡核苷酸4612和4613包含相同的核酸条形码序列，其允许带条形码核酸与分区的下游缔合。但是，在一些情况下，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是不同的。此外，带条形码标记剂(包括抗体)可通过任何合适的途径产生，包括经由本文其它地方描述的示例性偶联方案。400.如图46b所示，分区还包含细胞4622、有助于从细胞4622释放核酸的裂解剂，并且还可包括可降解珠粒和/或破坏带条形码寡核苷酸4612和4613与珠粒4611之间的共价连键、从而将它们释放到分区中的剂(例如，还原剂)。释放的带条形码寡核苷酸4612可与从细胞释放的mrna杂交，并且释放的带条形码寡核苷酸4613可与带条形码寡核苷酸4623杂交。然后可如本文其它地方所述，如经由聚合酶(和/或逆转录酶)和/或引物延伸的作用，针对所述mrna和带条形码寡核苷酸4623中的每个产生带条形码构建体a和b。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于与标记剂偶联的条形码序列的另外序列。然后可从分区中释放/除去带条形码构建体，并且在一些情况下，进一步加工以添加任何另外序列。然后对所得构建体进行测序，对测序数据进行处理，并将结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。例如，分析可如本文其它地方所述完成。从所述表征接收的信息然后可用于分区中的另一个细胞的后续分析。此外，图46b中所示的引发序列是出于示例性目的并且不意味着限制。另外，图46b中所示的方案也可用于基因组dna和细胞表面特征的同时分析。在一些情况下，分区包含仅一个细胞。401.此外，在各个方面，第一分析物可包含具有核酸序列(mrna，源自mrna的逆转录的互补dna)的核酸分子，所述核酸序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。因此，第一条形码分子可包含可引发这种核酸序列的引发序列，如本文其它地方所述。在一些情况下，具有编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分的核酸序列的核酸分子是使用含有聚‑t的引物首先从相应mrna的逆转录产生的cdna。然后可使用引物对产生的cdna进行条形编码，所述引物包含与产生的cdna的至少一部分杂交的条形码序列(和任选的umi序列)。在一些情况下，结合末端转移酶或具有末端转移酶活性的逆转录酶的模板转换寡核苷酸可用于在cdna上产生引发区，带条形码引物可在cdna产生期间与其杂交。末端转移酶活性可例如向cdna的3'端添加聚‑c尾，以使得模板转换寡核苷酸可经由聚‑g引发序列结合，并且cdna的3'端可进一步延伸。原始mrna模板和模板转换寡核苷酸然后可从cdna变性，并且包含与cdna上的产生的引发区的至少一部分互补的序列的带条形码引物然后可与cdna和包含条形码序列(和任何任选的umi序列)的带条形码构建体和产生的cdna的互补序列杂交。适用于条形编码由mrna转录物产生的cdna的另外方法和组合物(包括编码免疫细胞受体的v(d)j区的那些和/或条形编码方法和包含模板转换寡核苷酸的组合物)描述于美国临时专利申请序列号2016年10月19日提交的美国临时专利申请序列号62/410,326和2017年4月26日提交的美国临时专利申请序列号62/490,546中，所述申请两者以引用的方式整体并入本文。在一个实例中，在本文其它地方描述并且在图19中示意性地描绘的方案可用于v(d)j分析。402.v(d)j分析也可使用一种或多种标记剂完成，所述标记剂结合至免疫细胞的特定表面特征并且与如本文其它地方描述的条形码序列缔合。在一些情况下，一种或多种标记剂包含mhc。403.在一些情况下，不同类型的分析物不包括用于分离细胞的细胞表面特征的标记剂。404.此外，在各个方面，第一分析物可包含能够用作基因编辑反应的组分的核酸，例如像基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。因此，所述第一条形码分子可包含可引发这种核酸序列的引发序列，如本文其它地方所述。405.尽管参考图46a和图46b描述的实施例涉及两种不同类型的分析物的分析，但这些实施例不意味着限制。可评价任何合适数量的分析物。因此，在各个方面，它们可以是存在于可进行带条形码测序分析的分区中的至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约100种或更多种不同的分析物。通过包括能够产生带条形码构建体并且能够与特定分析物或与本身偶联至分区中的特定分析物的标记剂偶联的寡核苷酸特异性地杂交的引物物质(其中一个或多个可进行条形编码)并使所述分区经受适合条形编码的条件，可完成更高数量的多测定分析。406.用于多测定分析的示例性试剂示意性地描绘于图46c中。如图46c所示，分区可包括与带条形码引物偶联的珠粒4651，所述引物可各自参与不同分析物的测定。珠粒4651偶联(例如，可逆地偶联)至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4654的带条形码寡核苷酸4652，并且还偶联(例如，可逆地偶联)至包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4655的带条形码寡核苷酸4653。此外，珠粒4651还偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码寡核苷酸4656，所述带条形码寡核苷酸可经由其靶向引发序列4657特异性地结合与标记剂(例如抗体)偶联的寡核苷酸。珠粒4651还偶联至带条形码寡核苷酸4658，所述带条形码寡核苷酸可经由其靶向引发序列4659特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子。在此实例中，各种带条形码引物中的每一种包含相同的条形码序列。每种带条形码寡核苷酸可从分区内的珠粒4651释放，并且经受适于分析其相应分析物的条件。在一些情况下，所述分析物中的一种或多种与细胞相关或源自细胞，细胞本身可在分区中。在一些情况下，分区包含仅一个细胞。可如本文其它地方所述产生并分析带条形码构建体a、b、c和d。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于靶mrna的dna序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于基因组dna的序列。带条形码构建体c包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于与抗体标记剂相关的条形码序列的序列。条形码构建体d包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于crispr核酸的序列(在一些实施方案中，其还包含条形码序列)。可经由测序分析每种构建体，并将结果与各种分析物所来源的给定细胞相关联。虽然图46c中仅示出四种不同的带条形码构建体，但带条形码(或甚至不带条形码)构建体可被定制用于分析与核酸相关并且能够与这种构建体结合的任何给定分析物。407.例如，分区可包括与带条形码寡核苷酸偶联(例如，可逆地偶联)的珠粒(例如，凝胶珠粒)，所述带条形码寡核苷酸可参与至少两种不同分析物的测定。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4604的带条形码寡核苷酸4602和包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4605的带条形码寡核苷酸4603偶联的示例性珠粒，参见图46a。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4614的带条形码寡核苷酸4612和包含可经由其靶向引发序列4624特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4615的带条形码化寡核苷酸4613偶联的示例性珠粒，参见图46b。408.用于测量至少两种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列(例如，4604)的带条形码寡核苷酸(例如，4602)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列4659的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。用于测量至少两种不同分析物的其它示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列(例如，4615)的带条形码寡核苷酸(例如，4613)和包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4605)的带条形码寡核苷酸(例如，4603)。用于测量至少两种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列(例如，4615)的带条形码寡核苷酸(例如，4613)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4659)的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。用于测量至少两种不同分析物的其它示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4605)的带条形码寡核苷酸(例如，4603)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4659)的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。409.例如，分区可包括与带条形码寡核苷酸偶联(例如，可逆地偶联)的珠粒(例如，凝胶珠粒)，所述带条形码寡核苷酸可参与至少三种不同分析物的测定。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4662的带条形码寡核苷酸4661；包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4664的带条形码寡核苷酸4663；和包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4666的带条形码化寡核苷酸4665偶联的示例性珠粒4660，参见图46d。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4662的带条形码寡核苷酸4661；包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4666的带条形码寡核苷酸4665；和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列4673的带条形码寡核苷酸4672偶联的示例性珠粒4667，参见图46e(参见例如，图61a‑d)。410.用于测量至少三种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列(例如，4662)的带条形码寡核苷酸(例如，4661)；包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4664)的带条形码寡核苷酸(例如，4663)；和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4673)的带条形码寡核苷酸(例如，4672)(参见例如，图61a‑d)。411.本公开提供了被编程为实现本公开的方法，即本公开的方案的计算机控制系统。例如，本公开提供了被编程为实现本公开的方法2000的计算机控制系统。图17示出被编程或以其它方式配置以实现本公开的方法的计算机系统1701，所述方法包括核酸测序方法、细胞表面特征鉴定方法、核酸测序数据的解释和细胞核酸如rna(例如，mrna)的分析、核酸测序数据的解释和源自细胞表面特征的表征的核酸的分析以及来自测序数据的细胞的表征。计算机系统1701可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。412.计算机系统1701包括中央处理单元(cpu，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1705，其可为单一核心或多核心处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1701还包括存储器或存储单元1710(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1715(例如，硬盘)、与一个或多个其它系统通信的通信接口1720(例如，网络适配器)以及外围装置1725，如高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1710、存储单元1715、接口1720和外围装置1725经由通信总线(实线)诸如母板与cpu1705通信。存储单元1715可为用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1701可借助于通信接口1720来可操作地耦接至计算机网络(“网络”)1730。网络1730可为互联网、互联网和/或外联网或与互联网通信的内部网和/或外联网。网络1730在一些情况下为电信和/或数据网络。网络1730可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，诸如云计算。网络1730在一些情况下借助于计算机系统1701，可实施对等网络，其可使得耦接至计算机系统1701的装置能够作为客户端或服务器来运作。413.cpu1705可执行序列机器可读指令，所述指令可在程序或软件中具体实现。指令可存储于存储单元，诸如存储器1710中。指令可被引导至cpu1705，其可随后编程或以其它方式配置cpu1705来实施本公开的方法。由cpu1705执行的操作的实例可包括撷取、解码、执行和写回。414.cpu1705可以是电路的一部分，如集成电路。系统1701的一个或多个其它部件可包含于电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(asic)。415.存储单元1715可存储文件，诸如驱动程序、文库和保存程序。存储单元1715可存储使用者数据，例如，使用者偏好和使用者程序。计算机系统1701在一些情况下可包括一个或多个额外数据存储单元，所述单元在计算机系统1701外部，诸如位于经由内部网或互联网与计算机系统1701通信的远程服务器上。416.计算机系统1701可经由网络1730与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1701可与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式pc)、平板(slate)或平板(tablet)pc(例如，ipad、galaxytab)、电话、智能手机(例如iphone、支持android的装置、)或个人数字助理。用户可经由网络1730访问计算机系统1701。417.如本文描述的方法可经由机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施，所述代码存储于计算机系统1701的电子存储单元上，例如像，存储器1710或电子存储单元1715。机器可执行或机器可读代码可以软件形式提供。在使用期间，代码可由处理器1705执行。在一些情况下，代码可从存储单元1715检索并且存储在存储器1710上准备由处理器1705访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1715，并且机器可执行指令存储于存储器1710上。418.代码可预先编译并且被配置来供具有适于执行代码的处理器的机器来使用，或可在执行时间期间加以编译。代码可以程序语言来提供，可选择所述程序语言以使得代码能够以预先编译或原样编译方式来执行。419.本文提供的系统和方法，诸如计算机系统1701的各个方面可在程序编制中具体实现。技术的各个方面可被认为是通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据形式的“产品”或“制品”，所述数据承载或具体实现于一定类型的机器可读介质中。机器可执行代码可存储于电子存储单元，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时候提供非暂时性存储用于软件编程。软件的全部或一部分可有时经由互联网或各种其它电信网络来传送。这类通信，例如，可使得将软件从一个计算机或处理器加载至另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机计算机加载至应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，诸如跨越本地装置之间的物理接口、经由有线和光学陆地线网络和各种空中链路所使用的光、电和电磁波。携带这些波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等也可被认为是承载软件的介质。如本文使用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，术语诸如计算机或机器“可读介质”是指参与提供指令至处理器供执行的任何介质。420.因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储器介质包括，例如，光盘或磁盘，诸如任何计算机等中的任何存储装置，诸如在附图中示出的可用于实施数据库等的存储装置。易失性存储器介质包括动态存储器，诸如这类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光导纤维，包括构成计算机系统中的总线的导线。载波传输介质可采用电或电磁信号，或声或光波的形式诸如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间产生的信号。常见形式的计算机可读介质因此包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁介质、cd‑rom、dvd或dvd‑rom、任何其它光学介质、冲孔卡纸带、具有孔图案的任何其它物理存储器介质、ram、rom、prom和eprom、快闪eprom、任何其它存储器芯片或盒、运输数据或指令的载波、运输这类载波的电缆或链路，或计算机可读取编程代码和/或数据的任何其它介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及运送一个或多个指令的一个或多个序列至处理器供执行。421.计算机系统1701可包括电子显示屏1735或与所述电子显示屏通信，所述电子显示屏包括用于提供例如核酸测序的结果、核酸测序数据的分析、核酸测序样品的表征、细胞表征等的用户界面(ui)1740。ui的实例包括但不限于图形用户接口(gui)和基于网路的用户接口。系统1701可包括电子显示屏1735，所述电子显示屏包括用户界面1740，所述用户界面显示用户可访问的图形元素以根据本文描述的方法执行方案(例如，表征细胞)；以及计算机处理器，所述计算机处理器耦接至所述电子显示屏并被编程为在所述用户选择图形元素时执行所述方案。422.本公开的方法和系统可经由一个或多个算法来实施。算法可在由中央处理单元1705执行时经由软件来实施。所述算法可例如起始核酸测序、处理核酸测序数据、解释核酸测序结果、表征核酸样品、表征细胞等。423.如本文其它地方所述的带条形码寡核苷酸可以任何合适的方式产生，并且除条形码序列外还包含一个或多个序列。如本文其它地方所述，一种这样的序列可以是引发序列，所述引发序列可帮助条形编码分析物。此外，带条形码寡核苷酸还可包含一个或多个另外的功能序列，所述功能序列可例如有助于使带条形码寡核苷酸与给定测序平台相容(例如，功能序列可以是流动细胞衔接子固定序列(例如像来自illumina平台的p7和p5)；测序引物结合位点序列(例如像来自illumina平台的r1)和用于下游扩增的其它引发位点(例如像nextera功能序列或truseq功能序列)。424.在一些情况下，带条形码寡核苷酸与珠粒偶联，并且珠粒可包含在给定位置具有第一类型的功能序列的寡核苷酸和在给定位置具有第二不同类型的功能序列的寡核苷酸。图50a中描绘了一个实例。如图50a所示，珠粒可偶联至包含truseq功能序列的寡核苷酸，并且还偶联至包含nextera功能序列的寡核苷酸。在这些序列中的每一个上，可添加另外的序列以产生完整寡核苷酸，所述寡核苷酸还包含核酸条形码序列、任选的umi序列和引发序列。这些序列的附接可经由连接(包括经由如美国专利公布号20140378345中描述的夹板连接，所述专利以引用的方式整体并入本文)或任何其它合适的途径。包含truseq官能团的示例性带条形码寡核苷酸的序列示于图50b中，并且包含nextera官能团的示例性带条形码寡核苷酸的序列示于图50c中。图50b和图50b中所示的示例性带条形码寡核苷酸(每种构建体的顶部序列)显示与夹板序列(每种构建体的底部序列)杂交，所述夹板序列可有助于构建完整的带条形码寡核苷酸。425.在一些方面，本文提供的方法还可用于以能够获得细胞特异性信息的方式制备细胞内包含的多核苷酸。所述方法能够检测来自非常小的样品，如来自包含约10‑100个细胞的样品的遗传变异(例如，snp、突变、插入缺失、拷贝数变化、颠换、易位、倒位等)。在一些情况下，可在本文描述的方法中使用约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在一些情况下，可在本文描述的方法中使用至少约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在其它情况下，可在本文描述的方法中使用至多约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。426.在一个实例中，方法包括分配细胞样品(或粗细胞提取物)，以使得每个分区存在至多一个细胞(或一个细胞的提取物)，使所述细胞裂解、通过本文所述的任何方法使所述细胞内包含的多核苷酸片段化，将所述片段化的多核苷酸附接至条形码、汇集并测序。427.条形码和其它试剂可包含在微胶囊内。可在负载细胞之前、之后或同时将这些微胶囊负载到分区(例如，微孔、微滴)中，以使得每个细胞与不同的微胶囊接触。这种技术可用于将独特条形码附接至从每个细胞获得的多核苷酸。然后可汇集所得标记的多核苷酸并测序，并且条形码可用于追踪多核苷酸的来源。例如，可确定具有相同条形码的多核苷酸源自相同细胞，同时可确定具有不同条形码的多核苷酸源自不同细胞。428.本文描述的方法可用于检测跨癌性肿瘤细胞群体的致癌突变的分布。例如，一些肿瘤细胞可在两个等位基因(纯合子)中具有致癌基因(例如her2，braf，egfr，kras)的突变或扩增，其它肿瘤细胞可在一个等位基因(杂合子)中具有突变，并且仍然其它肿瘤细胞可能没有突变(野生型)。本文描述的方法可用于检测这些差异，并且还用于量化纯合子、杂合子和野生型细胞的相对数量。这种信息可用于例如分期特定癌症和/或监测癌症及其治疗随时间推移的进展。429.在一些实例中，本公开提供了鉴定两种不同致癌基因(例如，kras和egfr)中的突变的方法。如果相同的细胞包含具有两种突变的基因，则这可指示更具攻击性形式的癌症。相比之下，如果突变位于两种不同的细胞中，这可指示癌症更良性或更早期。430.实施例431.实施例i：使用乳液的细胞rna分析432.在一个实施例中，在乳液微滴中进行使用模板转换的逆转录和cdna扩增(经由pcr)，其操作如图9a所示。经分配用于逆转录和cdna扩增(经由pcr)的反应混合物包含1,000个细胞或10,000个细胞或10ng的rna、带有带条形码寡核苷酸的珠粒/0.2％tx‑100/5xkapa缓冲液、2xkapahshifi预混液、4μm转换寡核苷酸和smartscribe。在存在细胞的情况下，将混合物分配，以使得大部分或全部微滴包含单细胞和单个珠粒。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸，并且如在操作950中，所述带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与从所述细胞释放的mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段在如操作952中的逆转录反应中延伸，并且cdna如操作954中扩增。热循环条件是42℃持续130分钟；98℃持续2分钟；以及遵循98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续6分钟，35个循环。在热循环后，使乳液破乳并且如操作956中用dynabead和0.6xspri纯化转录物。433.在图13a中对于1,000个细胞且在图13c中对于10,000个细胞并在图13b(smartscribe线)中对于10ng的rna示出来自乳液中的模板转换逆转录和pcr的产率。将来自用于10ngrna的乳液中进行的rt和pcr的cdna进行剪切并连接至功能序列，用0.8xspri净化，并且如操作958中通过pcr进一步扩增。用0.8xspri清除扩增产物。来自这种加工的产率如图13b(ssii线)所示。434.实施例ii：使用乳液的细胞rna分析435.在另一个实施例中，在乳液微滴中进行使用模板转换的逆转录和cdna扩增(经由pcr)，其操作如图9a所示。经分配用于逆转录和cdna扩增(经由pcr)的反应混合物包含jurkat细胞、带有带条形码寡核苷酸的珠粒/0.2％tritonx‑100/5xkapa缓冲液、2xkapahshifi预混液、4μm转换寡核苷酸和smartscribe。将混合物分配，以使得大部分或全部微滴包含单细胞和单个珠粒。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸，并且如在操作950中，所述带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与从所述细胞释放的mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段在如操作952中的逆转录反应中延伸，并且cdna如操作954中扩增。热循环条件是42℃持续130分钟；98℃持续2分钟；以及遵循98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续6分钟，35个循环。在热循环后，使乳液破乳并且如操作956中用dynabead和0.6xspri净化转录物。来自使用各种细胞数(625个细胞、1,250个细胞、2,500个细胞、5,000个细胞和10,000个细胞)的反应的产率在图14a中示出。用图14b中所示的gadphqpcr测定结果证实这些产率。436.实施例iii：使用乳液的rna分析437.在另一个实例中，在乳液微滴中进行逆转录，并且以类似于图9c中所示的方式在本体中进行cdna扩增。经分配用于逆转录的反应混合物包含带有带条形码寡核苷酸的珠粒、10ngjurkatrna(例如jurkatmrna)、5x第一链缓冲液和smartscribe。带条形码寡核苷酸从珠粒释放，并且如操作961中带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与rna的聚‑a尾杂交。如操作963中，聚‑t区段在逆转录反应中延伸。逆转录的热循环条件是在42℃下持续2小时的一个循环和在70℃下持续10分钟的一个循环。在热循环之后，使乳液破乳并且如操作962中使rna和cdna变性。然后如操作964中，通过用具有生物素标签的引物进行引物延伸来合成第二链。这种引物延伸的反应条件包括作为第一链的cdna和浓度在0.5‑3.0μm范围内的生物素化的延伸引物。热循环条件是在98℃下持续3分钟的一个循环和98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。在引物延伸后，用dynabeadmyone链霉抗生物素蛋白c1和t1下拉(pulldown)第二链，并用agilentsureselectxt缓冲液净化。第二链如操作965中经由pcr用以下循环条件进行预扩增：在98℃下持续3分钟的一个循环以及98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。各种浓度的生物素化引物(0.5μm、1.0μm、2.0μm和3.0μm)的产率在图15中示出。438.实施例iv：使用乳液的rna分析439.在另一个实例中，如图10所示，将使用t7聚合酶的体外转录用于产生rna转录物。经分配用于逆转录的混合物包含带有带条形码寡核苷酸的珠粒(其还包含t7rna聚合酶启动子序列)、10ng人rna(例如人mrna)、5x第一链缓冲液和smartscribe。将混合物分配，以使得大部分或全部液滴包含单个珠粒。带条形码寡核苷酸从珠粒释放，并且如操作1050中带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与rna的聚‑a尾杂交。如操作1052中，聚‑t区段在逆转录反应中延伸。热循环条件是在42℃下持续2小时的一个循环和在70℃下持续10分钟的一个循环。在热循环之后，使乳液破乳并且剩余操作在本体中进行。然后如操作1054中，通过引物延伸合成第二链。用于这种引物延伸的反应条件包括作为模板的cdna和延伸引物。热循环条件是在98℃下持续3分钟的一个循环和98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。在这种引物延伸后，用0.6xspri纯化第二链。如在操作1056中，然后进行体外转录以产生rna转录物。过夜进行体外转录，并用0.6xspri纯化转录物。来自体外转录的rna产率在图16中示出。440.实施例v：使用凝胶珠粒将裂解剂递送至分区441.经由凝胶珠粒悬浮液(gbs)将裂解剂引入分区(gem)中。裂解剂是当其在gbs中的浓度超过阈值时引起润湿失效(不受控制的微滴形成)的表面活性剂。442.可使用较大的凝胶珠粒来增加裂解剂的分区中浓度，而不增加gbs中浓度(以避免润湿失效)并且不降低分区的总体积(在不降低测定的灵敏度的情况下所述分区的总体积可能不降低)(图36a)。或者，可使用较大的凝胶珠粒来增加分区的体积(其增加测定的灵敏度)并保留现有分区内裂解剂浓度而不增加gbs中浓度。443.凝胶珠粒的大小也可影响细胞分配的方式。通过用凝胶珠粒悬浮液体积(z1)代替一部分样品体积(z2)，较大的凝胶珠粒降低细胞的分区内浓度，根据泊松统计，这导致每个分区多于一个细胞的不利包封的可能性较低(图36b)。444.实施例vi：产生与短ssdna分子缀合的cd3蛋白445.首先活化cd3蛋白和ssdna分子以进行点击化学反应。用5‑(甲基丙烯酰胺基)四唑(mtet)活化cd3蛋白，并且用反式环辛烯(tco)活化ssdna分子。ssdna分子包含生物素基团。通过点击化学反应将活化的cd3蛋白和ssdna分子混合用于缀合。ssdna分子浓度比cd3蛋白浓度高5倍，以避免在同一蛋白质分子上缀合多个条形码拷贝。在一些情况下，ssdna浓度比cd3蛋白高10倍，以最大化条形码附接。生物素基团也可并入活化的cd3‑ssdna缀合物中以用于纯化。如图37所示，纯化并测试cd3蛋白和ssdna缀合物。446.实施例vii：用人cd3和小鼠cd3标记jurkat细胞447.测试了dna缀合对jurkat细胞上cd3结合的影响。将人cd3(hcd3、mca463)和小鼠cd3(mcd3、mca500)与af488‑nhs一起孵育，其中af499‑nhs的浓度比cd3蛋白高1倍、2倍、5倍和10倍，以产生标记的cd3，其中af999与cd3的胺偶联。将缀合的hcd3和mcd3与jurkat细胞一起孵育。洗去未结合的cd3蛋白。确定来自标记的细胞的荧光信号(图38)。通过与商业jurkat细胞对照比较来标准化荧光信号。数据显示相对于mcd3，jurkat细胞特异性地结合至hcd3，从而表明染料/dna的缀合不影响cd3蛋白与jurkat细胞的结合。可添加封闭试剂(例如，fbs、5％bsa)以改善特异性。448.实施例viii：将dna条形码与抗体的igg缀合449.将抗体与甲基四嗪‑peg5‑nhs酯在室温下孵育1小时并脱盐。将约65nt长的dna条形码与tco‑peg4‑nhs酯在室温下孵育1小时并脱盐。将所得抗体和dna条形码在室温下孵育2小时以进行缀合。图39a示出缀合策略。将缀合的抗体‑dna复合物进行蛋白质凝胶分析。如图39b所示，约20kda的蛋白质凝胶移位表明dna条形码与抗体的igg成功缀合。验证用于第一抗体条形编码的多种可行化学(例如，mtet、二苯并环辛炔(dbco)、siteclick)。将缀合的抗体‑dna复合物与细胞一起孵育以用于标记。450.实施例ix：使用抗体结合蛋白将寡核苷酸缀合至抗体451.抗体结合蛋白质蛋白质x(蛋白质a或蛋白质g)用二苯并环辛炔‑n‑羟基琥珀酰亚胺酯(dbco‑nhs)官能化。荧光素亚酰胺(fam)标记的oligox22‑叠氮化物(3eq)用作与抗体结合蛋白缀合的寡核苷酸。官能化的抗体结合蛋白和寡核苷酸如图40所示缀合。二苯并环辛炔(dbco)与蛋白g之间的缀合程度可基于gong等人,simplemethodtoprepareoligonucleotide‑conjugatedantibodiesanditsapplicationinmultiplexproteindetectioninsinglecells.bioconjugatechem.,2016进行控制，所述文献以引用的方式整体并入本文。如图41所示，可通过调节输入dbco‑nhs浓度来控制dbco并入的程度。452.此外，如图42所示，可通过寡核苷酸等价性来控制缀合程度。通过凝胶电泳(sds‑page)分析粗蛋白‑寡核苷酸缀合反应，以确定缀合效率和缀合的寡核苷酸的数量。如图42所示，相对于蛋白质，寡核苷酸等价性的增加导致更高程度的缀合。因为寡核苷酸含有荧光分子，所以可用凝胶内荧光成像(图42中的黑色图)容易地可视化未使用的寡核苷酸。453.将寡核苷酸‑蛋白质x缀合物与cd47抗体一起孵育以形成标记的抗体。将标记的抗体与jurkat细胞一起孵育并洗涤两次以制备标记的细胞。使用流式细胞术通过荧光信号测量细胞的标记(图43)。454.实施例x：产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒455.此实施例示出用于产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒的方法。工作流程在图44中示出。条形码序列4421与偶联至珠粒的序列引物r14411连接。r1引物4411和条形码序列4421形成珠粒上寡核苷酸的主链4420。多个主链寡核苷酸4420偶联至同一珠粒。然后将不同的引物序列连接至主链寡核苷酸4420。引物包括靶向mrna分子的聚‑a的聚‑t引物4431。引物还包括靶特异性引物，例如与抗体上的条形码结合的抗体靶引物。在第二连接后，珠粒包含具有聚‑t引物的寡核苷酸(4430)和具有抗体靶引物的寡核苷酸(4440)。来自所述方法的所得产物是与多个寡核苷酸偶联的珠粒(图45a)。所有寡核苷酸包含相同的主链。一些寡核苷酸包含聚‑t引物，并且一些包含抗体靶引物。通过凝胶电泳分析具有0％、5％、15％和25％的含有抗体靶引物的偶联寡核苷酸的珠粒(图45b)456.实施例xi：条形码抗体标记剂和细胞表面特征分析457.在第一组实验中，使用点击化学反应方案将包含叠氮化物官能团和fam染料的带条形码寡核苷酸缀合至蛋白g标记剂。所述带条形码寡核苷酸包括可用于鉴定蛋白g的条形码序列以及可用作引发位点的序列。将蛋白质g与越来越高摩尔当量的dbco‑nhs(0x、1x、2x、4x和6x)混合在一系列混合物中。dbco‑nhs用于活化胺基团以变得对叠氮化物具有反应性。所述混合物中还包括不同当量的叠氮化物寡核苷酸与dbco(0x、1x、1.5x和2x)。然后使反应进行4小时，并在4％‑12％bis‑tris凝胶上用凝胶电泳评价反应混合物。分析的结果图示于图47a‑图47b中。观察到连接有至多6个寡核苷酸的蛋白g。458.然后将各种标记的蛋白g部分与cd47抗体混合以将标记的蛋白g部分结合至cd47抗体。然后将所得蛋白g‑cd47复合物与293t细胞一起孵育，以使得所述复合物可结合细胞表面上的cd47。洗涤细胞以除去未结合的复合物，且然后进行流式细胞术以经由寡核苷酸结合的fam染料观察抗体的结合。流式细胞术的结果图示于图48中。459.接下来，将标记的细胞与偶联至寡核苷酸的珠粒混合，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列、umi和能够结合细胞中的mrna转录物的聚‑a序列的聚‑t序列。还包括具有引发序列的条形码引物，所述引发序列能够经由带条形码寡核苷酸的引发位点特异性地杂交与cd47抗体偶联的带条形码寡核苷酸。然后将混合物分配成乳液中的微滴。然后使乳液经受适于引发序列的条件以与它们各自的靶标(mrna或带条形码抗体寡核苷酸)杂交，并经由聚合酶或逆转录酶的作用延伸引物。延伸产生带条形码构建体。在反应后，使乳液破乳。通过除去珠粒去除仍附接至珠粒的带条形码转录物构建体，并将上清液进行2xspri分离以回收约110bp抗体条形码。然后分析回收的产物，结果示于图49a和图49b中。460.实施例xii：条形码的偶联461.在大量实验中，图51a中所示的两种寡核苷酸5101和5102经由延伸反应连接在一起。寡核苷酸5101代表包含条形码序列的寡核苷酸，所述条形码序列可用于鉴定包含寡核苷酸5101的分区，并且寡核苷酸5102代表包含条形码序列的寡核苷酸，所述条形码序列可用于鉴定标记剂，如与寡核苷酸5102偶联的抗体。寡核苷酸5102还包含fam染料和包括在寡核苷酸5101上的模板转换寡核苷酸间隔区‑rgrgrg区的3'反向互补序列。在所述实验中，将50nmabbc寡核苷酸5102与寡核苷酸5101以两种单独的混合物混合。混合物中包括用于进行引物延伸反应的试剂，包括能够促进引物延伸反应的两种逆转录酶中的一种和dntp。然后经由毛细管电泳分析延伸产物。462.实验结果图示于图51b中。如所示，检测到具有对应于寡核苷酸5101的条形码序列(或所述条形码序列的互补序列)的序列和对应于寡核苷酸5102的条形码序列(或所述条形码序列的互补序列)的序列两者的预期延伸产物。这些结果证实，所测试的逆转录酶可用于产生具有对应于寡核苷酸5101和5102的条形码序列两者的序列的延伸产物。463.实施例xiii：单细胞条形码行为464.获得抗cd47和抗cd99抗体，并且两种类型都与包含条形码序列的寡核苷酸偶联，所述条形码序列适于鉴定其各自的抗体并且还包含独特分子标识(umi)序列和模板转换寡核苷酸反向互补序列(例如，ccc)。通过将寡核苷酸与蛋白g连接且然后将蛋白g‑寡核苷酸构建体与抗体结合来产生抗体‑寡核苷酸构建体。通过用单个半胱氨酸残基修饰蛋白g并经由半胱氨酸残基将其与寡核苷酸连接来将寡核苷酸连接至蛋白g。蛋白g还包含hisx6标签，其可用于将未缀合的寡核苷酸与偶联至蛋白g的那些寡核苷酸分开。来自产生的构建体的凝胶电泳分析的样品数据示于图52a中。图52a中的泳道示出含有半胱氨酸的蛋白g抗体结合蛋白的表达。培养物泳道描绘均质化的细胞培养物，流通泳道描绘的是所有不与镍‑nta柱结合的蛋白质，并且两个洗脱泳道是洗脱的纯化的蛋白g。465.然后将jurkat细胞与抗体‑寡核苷酸构建体一起孵育，以经由它们各自的细胞表面特征靶标将抗体结合至细胞表面。然后将细胞连同与寡核苷酸连接的珠粒一起分配到乳液中的水性微滴中，所述寡核苷酸包含条形码序列、umi序列、能够与抗体结合的寡核苷酸杂交的引发序列(例如，引物序列包含模板转换序列，如rgrgrg)。在分区中还包括能够破坏珠粒的二硫连键和珠粒与其寡核苷酸之间的连键的还原剂。还原剂释放珠粒的寡核苷酸，且然后使微滴经受适于经由两种寡核苷酸的序列的相互作用(包括经由rgrgrg/ccc相互作用)使先前珠粒结合的寡核苷酸与细胞结合的抗体寡核苷酸杂交的条件。虽然示出特定序列，但可经由两种寡核苷酸末端的任何恒定序列实现杂交。466.然后使两种杂交的寡核苷酸在引物延伸反应中延伸以产生包含对应于珠粒寡核苷酸和抗体条形码序列两者的序列的构建体，类似于图52b(图i)中所示的示例性方案。然后使乳液破乳，进一步加工延伸的产物且然后进行测序。jurkat cd47和jurkat cd47/cd99运行的测序结果分别在图53a的图i和图ii中图示描绘和图53b中制表。图53a和图53b中所示的数据表明如例如通过对应于细胞的源自珠粒的条形码构建体中的抗体‑寡核苷酸umi的大约2‑log富集所证明，包含条形码序列的抗体‑寡核苷酸结构能够显示单细胞行为。467.实施例xiv：抗体条形码染色参数468.与本文所述方法相关的各种参数在其对抗体‑条形码构建体结合的影响的背景下进行评价，所述参数包括逆转录失活过程和分区中还原剂的浓度(例如，如本文其它地方所述的用于降解带条形码珠粒的还原剂)。469.通过将逆转录反应混合物的温度升高至相对高的温度(“热杀灭”)，可使逆转录失活。然而，此类高温可导致抗体条形码构建体从反应混合物中沉淀出来，从而导致不能与细胞结合。针对细胞测试各种抗cd3条形码构建体样品，其中一些样品经受热杀灭，而另一些样品未经受热杀灭。用于实验的测序数据列于图54中。如图54所示，当不使用热杀灭时，许多测序度量得到改善，包括可靠地映射的读数和复杂性。470.此外，高浓度的还原剂还可降解用于标记细胞表面特征的抗体。因此，测试了将还原剂(例如，dtt)浓度降低10倍对分区中逆转录的总体效率的影响。如图55所示，对于所有测试的样品(22mmdtt对比2.2mmdtt)迹线是相似的，从而表明如本文其它地方所述，逆转录可在显著降低的dtt浓度下有效地进行。在另一个实验中，也显示0.15mmdtt是有效的。471.实施例xv：使用带条形码mhc‑抗原多聚体将t细胞受体序列与抗原结合表型连接472.许多tcr可结合特定抗原(具有不同的亲和力)并且鉴定对特定抗原具有特异性的个别克隆型是困难的。虽然流式细胞术和基于珠粒的富集方案允许对抗原结合细胞的物理分选，但当细胞稀少或样品有限时，与传统方法相关的细胞损失可能是不可接受的。此外，基于荧光检测的传统方法在多重化(在单个实验中同时测定多种独立抗原/配体的结合性质的能力)方面具有重要限制，因为可有效地组合使用的光谱可区分荧光标记的数量较少。此外，多种抗原结合克隆型可存在于异质样品中，这使得鉴定特异性抗原结合tcr复合物变得困难，即使当对表达抗原结合克隆型的细胞进行物理分选时。473.本文所述的组合物、方法和系统允许用寡核苷酸(dna或rna)官能化mhc‑肽多聚体，所述寡核苷酸包含对mhc‑肽身份具有特异性的独特肽条形码序列(例如，与肽egaliywpn相关的条形码1，与肽ahmrdsqq相关的条形码2等)。可将单一肽‑mhc复合物或肽‑mhc文库暴露于细胞(例如，t细胞)群体以产生用带条形码mhc多聚体“标记”的细胞。然后可如本文所述对这些细胞进行分配和加工以组装tcr序列并定量与每个细胞缔合的mhc‑肽条形码的数量。具有低水平的mhc‑肽来源的umi的克隆型对mhc‑肽具有低亲和力，而具有高水平的mhc‑肽umi的克隆型对抗原具有高亲和力。474.与链霉抗生物素蛋白核心结合的带条形码的肽结合的mhc四聚体通常如图54a所描绘并如下所述产生。尽管在以下系列实验中使用i类mhc‑四聚体，但是存在可与本文公开的组合物、方法和系统(例如mhc五聚体)(经由卷曲螺旋结构域组装的mhc，例如mhci类五聚体、(proimmune,ltd.)、mhc修饰的葡聚糖分子(例如，mhc(immudex))等一起使用的i类和/或ii类mhc‑抗原多聚体的许多可能的构型。475.如图57a所描绘，使用一般赖氨酸化学(经由具有nhs‑dbco的赖氨酸残基修饰的链霉抗生物素蛋白；随后经由dbco官能团附接叠氮化物修饰的寡核苷酸)将链霉抗生物素蛋白分子(5701)缀合至杂交寡核苷酸(5702)以产生链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。然后在tbe‑尿素变性琼脂糖凝胶上分析链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。如图58a所示，0.6μm、1.2μm、1.8μm、2.4μm和3μm未修饰的寡核苷酸全部观察到具有相似大小的条带，而链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸表现出明显的分子量偏移，从而表明成功的链霉抗生物素蛋白缀合。在链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸泳道中观察到的多个条带对应于附接有增加数量的寡核苷酸(例如，1个寡核苷酸、2个寡核苷酸、3个寡核苷酸等)的缀合的链霉抗生物素蛋白分子。如图58a所示，用最少过量的非缀合的寡核苷酸产生链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸。476.还在sds‑page蛋白质凝胶上分析了链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。如图58b所示，0.25μg、0.5μg和1.0μg未修饰的链霉抗生物素蛋白表现出相似的分子量，而链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸表现出分子量偏移，指示链霉抗生物素蛋白与0、1、2、3、4个(或更多个)寡核苷酸缀合。可通过比较缀合的寡核苷酸条带的密度与0.25μg、0.5μg和1.0μg未修饰的链霉抗生物素蛋白条带的密度来估计缀合的寡核苷酸的定量。从这种比较，缀合的总体程度是每个链霉抗生物素蛋白亚基大约1个寡核苷酸(产生每个mhc四聚体大约4个寡核苷酸)。477.在定量缀合程度后，条形码寡核苷酸(5708)以条形码寡核苷酸(5708)与链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)的0.25:1至1:1之间的化学计量经由杂交寡核苷酸序列(5702)的反向互补序列(5704)与链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)杂交。在此，条形码寡核苷酸(5708)包含为杂交寡核苷酸序列(5702)的反向互补序列(5704)的序列、truseqr2测序引物序列(5705)、独特分子标识(umi)(任何“n”核苷酸系列)和条形码序列(5706)，以及与凝胶珠粒上的序列互补的衔接子序列(5707)。或者，条形码寡核苷酸可直接与链霉抗生物素蛋白缀合。478.在杂交后，将带条形码链霉抗生物素蛋白(5709)添加至展示埃‑巴二氏病毒(ebv)肽抗原(glctlvaml)的生物素化的hla‑a‑02:01mhc单体池(参见例如5606)以产生带条形码mhc四聚体(参见，例如，5608)。添加带条形码链霉抗生物素蛋白(5709)，直至达到生物素化的ebvmhc单体与生物素结合位点的1:1比率(4个生物素化的mhc单体/链霉抗生物素蛋白复合物)。479.然后将带条形码mhc四聚体(0.4μg或4.0μg)与约200,000(100μl)ebv抗原扩增的t细胞(astartebiologics)和/或约200,000(100μl)初始t细胞一起孵育30分钟。用pbs/1％fbs洗涤细胞三次以除去未结合的多聚体。然后将细胞重悬于pbs 0.04％bsa中，并分配成包含带条形码mhc结合的t细胞和带条形码凝胶珠粒的微滴(参见例如图11)。然后通常如本文所述加工带条形码mhc四聚体(参见例如图56c和随附文本)。然后裂解t细胞并且释放的mrna分子通常如本文所述进行加工(参见例如图11和随附文本)。然后使微滴乳液破乳并用大量pcr扩增来富集来自tcrcdna的带条形码的全长v(d)j区段。制备第二文库以量化与每个细胞缔合的mhc‑ebv肽umi的数量。然后使用illumina测序仪对完全构建的测序文库进行测序。生物信息学地组装t细胞受体克隆型，并且定量每个细胞和每种克隆型的来自带条形码mhc四聚体的umi计数的数量。480.图59示出来自带条形码mhc四聚体的umi计数对比通过条形码数量测量的克隆型频率。对于检测到的每种克隆型，针对对应于所述克隆型的所有细胞相关的细胞条形码计算每个细胞条形码的mhc多聚体来源的umi计数的平均数量，并且在y轴上绘制一加其每个细胞的平均umi计数值的log10。在x轴上绘制用每种克隆型检测的细胞相关细胞条形码的数量。出于可视化目的，将随机量的高斯噪声添加至每个点的x和y坐标值以避免过度绘制。特征5901显示将与4μgmhc多聚体一起孵育的ebv扩增的t细胞(“1kebc 4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；特征5902显示将来自与0.4μgmhc多聚体一起孵育的ebv扩增的t细胞(“1kebc 0.4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；特征5903显示将来自与4μgmhc多聚体一起孵育的初始t细胞(“1kt 4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；并且特征5904显示将来自与0.4μgmhc多聚体一起孵育的初始t细胞(“1kt 0.4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值。如图59所示，与针对初始t细胞群体(特征5903和5904)获得的值相比，ebv扩增的细胞类型具有与四聚体相关的最多umi计数(特征5901和5902)。此外，来自在ebv扩增的细胞群体内以高频率出现的ebv扩增细胞的克隆型(有界圆，特征5905)表现出更高的mhc‑四聚体umi值，从而表明它们在ebv扩增的群体中的富集频率与优先mhc‑四聚体结合相关。相反，预期初始t细胞不会优先结合抗原，并且所有都具有低背景水平的四聚体相关umi。481.在另一个实验中，在与上述带条形码mhc四聚体孵育之前，将ebv扩增的t细胞掺入初始t细胞背景中。然后如前所述将细胞进行加工、测序和分析。图60示出来自带条形码mhc四聚体的umi计数的数量对比来自混合t细胞群体的克隆型频率(遵循图59中使用的轴和绘图惯例)。特征6001显示将来自含有克隆型的细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值，所述克隆型先前观察到在独立加工的ebv扩增的细胞的至少一个样品中发生(“ebv(n＝1)”)；特征6002显示将来自含有克隆型的细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值，所述克隆型先前观察到在独立加工的ebv扩增的细胞的多于一个样品中发生(“ebv(n>1)”)；而特征6003显示将来自在实验(“其它”)中检测到的所有细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值。如图60所示，虽然来自ebv加标的精确细胞数量未知(由于洗涤过程中初始t细胞与ebv扩增的细胞之间的细胞恢回收的差异)，但在这种混合样品中检测到代表总计四个细胞的两种克隆型(有界圆，特征6004)，所述样品表现出非常高的四聚体相关umi计数(比背景高约1000倍)。确定这四个细胞对应于ebv扩增的样品中最频繁检测到的细胞的克隆型，并且对应于ebv加标细胞。因此，可将目标特定克隆型与含有复杂克隆型分布的混合细胞群体区分开。482.尽管本文已示出和描述了本发明的一些实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。并不意图本发明受本说明书内所提供的具体实施例限制。尽管参照前面提及的说明书描述了本发明，但是本文实施方案的描述和说明并非从限制意义上进行解释。在不背离本发明的情况下本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代。此外，应该理解本发明的所有方面并非限制于在此阐述的取决于各种条件和变量的具体描绘、配置或相对比例。应当理解的是，可在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，应该想到的是，本发明还应该覆盖任何此类替代方案、修改、变化或等效物。以下权利要求书意图限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。当前第1页12当前第1页12
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：：4.在分析和表征生物和生物化学材料和系统方面的重大进展已经带来在了解生命、健康、疾病和治疗的机制方面的前所未有的进展。在这些进展中，以生物系统的基因组组成为目标和特征的技术已经产生了一些最具开创性的结果，包括使用和利用基因扩增技术以及核酸测序技术的进展。5.核酸测序可用于获得包括诊断学、预后、生物技术和法医生物学在内的各种生物医学背景中的信息。测序可涉及基本方法，包括maxam‑gilbert测序和链终止方法，或从头测序方法(包括鸟枪测序和桥式pcr)，或下一代方法(包括聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、illumina测序、solid测序、iontorrent半导体测序、heliscope单分子测序、测序等)。核酸测序技术(包括下一代dna测序)已经用于细胞群体的基因组和蛋白质组学分析。技术实现要素：6.本文认识到对用于分析来自单独细胞或细胞小群体的基因组和蛋白质组学信息的方法、组合物和系统的需要。此类细胞包括但不限于癌细胞、胎儿细胞和参与免疫应答的免疫细胞。本文提供了用于分析单独细胞或细胞小群体的方法、组合物和系统，包括来自这些单独细胞或细胞群体的核酸和蛋白质的分析以及核酸和蛋白质归属于这些单独细胞或细胞群体。7.在一个方面，本公开提供了一种表征细胞的方法。所述方法包括(a)提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，其中所述至少一种标记剂(i)能够结合至所述细胞的细胞表面特征并且(ii)偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定所述至少一种标记剂，其中所述分区包含能够与所述报告寡核苷酸条形码相互作用的锚寡核苷酸；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子；以及(c)对所述核酸分子进行测序以鉴定所述标记剂或所述细胞。8.在一些实施方案中，在(a)中，所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征。在一些实施方案中，在(a)之前，使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，当所述细胞和所述至少一种标记剂不含所述分区时，进行使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，在(a)之前，将所述至少一种标记剂偶联至所述报告寡核苷酸。9.在一些实施方案中，在(b)中，使所述报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生所述核酸分子。在一些实施方案中，所述引物延伸反应包括使所述报告寡核苷酸经受适于使所述锚寡核苷酸与所述报告寡核苷酸杂交并使用所述报告寡核苷酸作为模板延伸所述锚寡核苷酸的条件。10.在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒。在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒，并且所述方法还包括在所述合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。在一些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述释放包括使所述珠粒经受使所述珠粒降解的刺激。在一些实施方案中，所述刺激是化学刺激。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝。11.在一些实施方案中，在(c)之前，所述核酸分子从所述分区释放。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述至少一种标记剂。在一些实施方案中，(c)包括从鉴定所述至少一种标记剂鉴定所述细胞表面特征。在一些实施方案中，(c)包括确定所述细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述细胞。在一些实施方案中，(c)包括鉴定所述至少一种标记剂和所述细胞。12.在一些实施方案中，所述报告寡核苷酸包含独特分子标识(umi)序列。在一些实施方案中，所述umi序列允许鉴定所述细胞。在一些实施方案中，(c)包括确定所述umi序列的序列并鉴定所述细胞。13.在一些实施方案中，所述分区是乳液中的微滴。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂选自由以下组成的组：抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。在一些实施方案中，所述分区仅包含一个细胞。14.在一些实施方案中，所述细胞结合至所述至少一种标记剂中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种相同的标记剂。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约5种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约10种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约50种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约100种不同的标记剂。在一些实施方案中，(c)包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。15.在一些实施方案中，所述方法还包括(i)从所述细胞释放核酸和(ii)对所述核酸或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，所述核酸从所述细胞释放到所述分区中。16.在一个方面，本公开提供了一种用于表征细胞的系统。所述系统包括电子显示屏，所述电子显示屏包括用户界面，所述用户界面显示用户可访问的图形元素以执行用于表征所述细胞的方案；以及计算机处理器，所述计算机处理器耦接至所述电子显示屏并被编程为在所述用户选择图形元素时执行所述方案，所述方案包括：(a)提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，其中所述至少一种标记剂(i)能够结合至所述细胞的细胞表面特征并且(ii)偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定所述至少一种标记剂，其中所述分区包含能够与所述报告寡核苷酸条形码相互作用的锚寡核苷酸；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子；以及(c)对所述核酸分子进行测序以鉴定所述标记剂或所述细胞。17.在一些实施方案中，在方案(a)中，所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征。在一些实施方案中，在方案(a)之前，使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，当所述细胞和所述至少一种标记剂不含所述分区时，进行使所述至少一种标记剂经受适于使所述至少一种标记剂结合至所述细胞表面特征的条件。在一些实施方案中，在方案(a)之前，将所述至少一种标记剂偶联至所述报告寡核苷酸。18.在一些实施方案中，在方案(b)中，使所述报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生所述核酸分子。在一些实施方案中，所述引物延伸反应包括使所述报告寡核苷酸经受适于使所述锚寡核苷酸与所述报告寡核苷酸杂交并使用所述报告寡核苷酸作为模板延伸所述锚寡核苷酸的条件。19.在一些实施方案中，在方案(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒。在一些实施方案中，在(b)中，所述锚寡核苷酸偶联至珠粒，并且所述方法还包括在所述合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。在一些实施方案中，所述珠粒是凝胶珠粒。在一些实施方案中，所述释放包括使所述珠粒经受使所述珠粒降解的刺激。在一些实施方案中，所述刺激是化学刺激。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝。在一些实施方案中，所述珠粒包含所述锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝。20.在一些实施方案中，在方案(c)之前，所述核酸分子从所述分区释放。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述至少一种标记剂。在一些实施方案中，方案(c)包括从鉴定所述至少一种标记剂鉴定所述细胞表面特征。在一些实施方案中，方案(c)包括确定所述细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述细胞。在一些实施方案中，方案(c)包括鉴定所述至少一种标记剂和所述细胞。21.在一些实施方案中，所述报告寡核苷酸包含独特分子标识(umi)序列。在一些实施方案中，所述umi序列允许鉴定所述细胞。在一些实施方案中，方案(c)包括确定所述umi序列的序列并鉴定所述细胞。22.在一些实施方案中，所述分区是乳液中的微滴。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂选自由以下组成的组：抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。在一些实施方案中，所述分区仅包含一个细胞。23.在一些实施方案中，所述细胞结合至所述至少一种标记剂中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种相同的标记剂。在一些实施方案中，所述至少一种标记剂中的至少一种包含至少两种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约5种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约10种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约50种不同的标记剂。在一些实施方案中，所述细胞结合至至少约100种不同的标记剂。在一些实施方案中，方案(c)包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。24.在一些实施方案中，方案还包括(i)从所述细胞释放核酸和(ii)对所述核酸或其衍生物进行测序。在一些实施方案中，所述核酸从所述细胞释放到所述分区中。25.本公开的另一方面提供了一种用于分析物表征的方法。所述方法包括：(a)提供多个分区，其中所述多个分区中的给定分区包括多个条形码分子和多种分析物。在一些情况下，所述多个条形码分子包括至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列，并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述方法还包括(b)在所述给定分区中，(i)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(ii)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子。26.在一些实施方案中，所述方法还包括对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子的衍生物进行测序以表征所述第一分析物和/或所述第二分析物。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述测序基于所述第一分析物或所述第二分析物的表征重复(a)‑(c)。在一些实施方案中，所述方法还包括基于在重复(a)‑(c)时从测序或随后测序获得的第一分析物或第二分析物的表征来选择所述第一分析物或所述第二分析物。27.在一些实施方案中，(b)还包括：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。28.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或信使rna(mrna)。29.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体、抗体片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述给定分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述给定分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。30.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。31.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是信使核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述标记剂杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征选自由以下组成的组：受体、抗原或蛋白质。32.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸分子是信使核糖核酸。在一些实施方案中，所述核酸分子是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。33.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。34.在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)之后，从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码。在一些实施方案中，所述给定分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。35.在一些实施方案中，所选择的给定分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述第一核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。在一些实施方案中，所述方法还包括在从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之后进行一个或多个反应。36.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的组合物。所述组合物包含分区，所述分区包含多个条形码分子和多种分析物。所述多个条形码分子可包含至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。37.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或是信使rna(mrna)。38.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。39.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。40.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与偶联至所述标记剂的第三核酸分子杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。41.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸序列是核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含核酸序列，所述核酸序列是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。42.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述给定分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。在一些实施方案中，所述给定分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述第一核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。43.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的系统。所述系统包括用于提供包含多个条形码分子和所述多种分析物的分区的分配单元，其中：(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子包含第一核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第一分析物；并且(ii)所述多个条形码分子的第二单个条形码分子包含第二核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第二分析物，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述系统还包括耦接至所述分配单元的控制器，其中所述控制器被编程为(i)指导所述分配单元提供所述分区；(ii)使所述分区经受足以以下的条件：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子；以及(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或其衍生物的测序表征所述第一分析物或所述第二分析物。44.在一些实施方案中，所述分配单元包括多个通道。在一些实施方案中，所述分配单元还包括至少一个通道接点，其中所述至少一个通道接点被配置为提供所述分区。在一些实施方案中，所述系统还包括(i)第一通道，所述第一通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供第一流体；(ii)和第二通道，所述第二通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供与所述第一流体不混溶的第二流体。45.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，如基因组脱氧核糖核酸(gdna)或信使rna(mrna)。46.在一些实施方案中，所述第一分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述分区包含所述细胞或所述细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述分区包含单细胞。在一些实施方案中，所述第一核酸分子或所述第二核分子包含第三条形码序列。在一些实施方案中，所述第三条形码序列源自第三核酸分子。在一些实施方案中，所述第三核酸分子偶联至能够结合至细胞的细胞表面特征的标记剂。47.在一些实施方案中，所述第一分析物和第二分析物是不同类型的核酸分子。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子，并且所述第二分析物是脱氧核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与所述第二分析物杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述第一条形码分子或所述第二条形码分子包含独特分子标识(umi)序列。48.在一些实施方案中，所述第一分析物是核酸分子，并且所述第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在一些实施方案中，所述第一分析物是核糖核酸分子。在一些实施方案中，(i)所述第一单个条形码分子包含能够与所述第一分析物杂交的第一引发序列；或(ii)所述第二单个条形码分子包含能够与偶联至所述标记剂的第三核酸分子杂交的第二引发序列。在一些实施方案中，所述标记剂是抗体或其表位结合片段或主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方案中，所述细胞表面特征是受体、抗原或蛋白质。49.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列或其互补序列的核酸分子，所述核酸序列或其互补序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸序列是信使核糖核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子是源自编码所述v(d)j序列的至少一部分的mrna的逆转录的互补dna(cdna)。50.在一些实施方案中，所述第一分析物包含具有核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够用作基因编辑反应的组分。在一些实施方案中，所述基因编辑反应包括基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。51.在一些实施方案中，所述第一单个条形码分子和所述第二单个条形码分子中的至少一个偶联至珠粒，如凝胶珠粒。所述珠粒可以是可降解的。在一些实施方案中，所述分区还包含能够从所述珠粒释放所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码的剂。在一些实施方案中，所述分区是多个微滴中的微滴或多个孔中的孔。在一些实施方案中，所述核酸条形码序列和所述第二核条形码序列是相同的。在一些实施方案中，所述分区包含至少1,000个条形码分子。52.本公开的额外方面和优点从以下详细说明变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的说明性实施方案。应当认识到，本公开能够具有其它以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种不同方面做出修改，所有均不脱离公开内容。因此，附图和说明书本质上被认为是说明性的而不是限制性的。53.通过引用结合54.本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请在此通过引用结合，达到如同每一个单独的公开、专利或专利申请被专门地并且单独地指示通过引用结合的相同的程度。附图说明55.本发明的新颖特征在附属权利要求中具体阐述。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也为“图(figure)”和“图(fig.)”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，其中：56.图1示意性地示出用于分配单独细胞或细胞小群组的微流体通道结构；57.图2示意性地示出用于共分配细胞和包含另外试剂的微胶囊(例如珠粒)的微流体通道结构；58.图3a‑图3f示意性地示出用于扩增和条形编码(barcoding)细胞的核酸的示例性过程；59.图4提供在将序列数据归属于单独细胞或细胞群组以用于其表征中使用细胞核酸的条形编码的示意图；60.图5提供与标记的细胞结合配体缔合的细胞的示意图；61.图6提供使用本文所述的方法用于进行rna分析的示例性工作流程的示意图；62.图7提供使用本文所述的方法用于分析核糖核酸(rna)的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；63.图8提供与单独携带条形码的珠粒一起共分配的单独细胞的图像；64.图9a‑图9e提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和用于进行rna分析的示例性操作；65.图10提供用于rna的示例性分析的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和使用序列用于体外转录；66.图11提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图和用于进行rna分析的示例性操作；67.图12a‑图12b提供用于分析rna的示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；68.图13a‑图13c提供分区中来自模板转换逆转录和pcr的示例性产率的说明；69.图14a‑图14b提供具有不同细胞数量的分区中来自逆转录和cdna扩增的示例性产率的说明；70.图15提供在不同输入细胞浓度下来自cdna合成和实时定量pcr的示例性产率的说明，以及在固定细胞输入浓度下改变引物浓度对产率的影响；71.图16提供来自体外转录的示例性产率的说明；72.图17示出被编程或以其它方式配置来实现本文提供的方法的示例性计算机控制系统；73.图18提供示例性带条形码寡核苷酸结构的示意图；74.图19示出用于进行rna分析的示例性操作；75.图20示出根据实施方案的用于表征细胞的方法；76.图21示出具有可防止被聚合酶延伸的修饰的寡核苷酸；77.图22示出包含u切除元件的寡核苷酸；78.图23a示出与包含靶特异性引物的寡核苷酸和具有聚‑t引物的寡核苷酸偶联的珠粒；图23b示出与多种寡核苷酸偶联的珠粒，所述寡核苷酸各自包含靶特异性引物；图23c示出与多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含聚‑t引物)偶联的珠粒；79.图24示出与多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含用于总rna的随机n‑聚体引物)偶联的珠粒；80.图25a‑图25c示出包含衔接子和测定引物的示例性寡核苷酸；81.图26示出具有包含转换寡核苷酸的衔接子的寡核苷酸；82.图27a示出具有包含p7和r2序列的主链和聚‑t引物的寡核苷酸；图27b示出具有包含r1序列的主链和聚‑t引物的y寡核苷酸；图27c示出具有p5、r1和r2序列和聚‑t引物的寡核苷酸；图27d示出具有r1序列和随机n‑聚体引物的寡核苷酸；83.图28示出使用抗体结合蛋白用于在抗体上缀合dna条形码的工作流程；84.图29示出在制备具有磁性颗粒的凝胶珠粒的过程中的溶胀条件和消溶胀条件；85.图30示出包含支架和紧紧围绕支架的液体的单位细胞；86.图31示出包埋有带条形码磁性颗粒的微胶囊；87.图32示出用于对细胞中的dna分子和rna分子进行平行测序的方法；88.图33示出用于制备抗体‑报告寡核苷酸缀合物的各种方法；89.图34示出抗体‑报告寡核苷酸缀合；90.图35a‑图35c示出用于分析来自单细胞的mrna分子和蛋白质的方法；91.图36a示出凝胶珠粒的直径与所述凝胶珠粒内部的试剂之间的关系；图36b示出凝胶珠粒的直径与具有多于一个细胞的微滴数量之间的关系；92.图37示出cd3蛋白质‑单链dna(ssdna)缀合物的分析结果；93.图38示出来自被标记的抗体结合的细胞的荧光信号；94.图39a示出用于使寡核苷酸与抗体缀合的方法；图39b示出带条形码抗体的分析结果；95.图40示出官能化抗体结合蛋白和官能化寡核苷酸的缀合物；96.图41示出二苯并环辛炔(dbco)并入的程度与输入二苯并环辛炔‑n‑羟基琥珀酰亚胺酯(dbco‑nhs)浓度之间的关系；97.图42示出缀合程度与寡核苷酸等价性之间的示例性关系；98.图43示出通过流式细胞术测量的标记的细胞的荧光信号；99.图44示出用于产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒的方法；100.图45a示出与多种寡核苷酸偶联的珠粒。图45b示出来自珠粒的凝胶电泳分析的结果。在珠粒上，0％、5％、15％或25％的偶联寡核苷酸含有抗体靶引物；101.图46a‑图46e示意性地描绘本文描述的示例性多测定方案的组分；102.图47a‑图47b描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；103.图48描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；104.图49a和图49b描绘从实施例xi中描述的示例性实验获得的数据；105.图50a示意性地描绘包含具有两个不同功能性序列的寡核苷酸的示例性珠粒；106.图50b和图50c示意性地描绘可偶联至珠粒的示例性序列；107.图51a描绘在实施例xii中描述的示例性实验中使用的序列；图51b图解地描绘来自实施例xii中描述的示例性实验的数据；108.图52a描绘从实施例xiii中描述的示例性实验获得的数据；109.图52b示意性地描绘用于连接条形码的示例性延伸方案；110.图53a和图53b提供从实施例xiii中描述的示例性实验获得的数据；111.图54和图55提供从实施例xiv中描述的示例性实验获得的数据；并且112.图56a‑图56c示意性地描绘包括主要组织相容性复合物的示例性条形编码方案。113.图57a‑图57b图解地描绘示例性带条形码链霉抗生物素蛋白复合物。114.图58a‑图58b示出带条形码链霉抗生物素蛋白复合物的示例性分析。图58a示出代表性变性琼脂糖凝胶，而图58b示出代表性sds‑page凝胶。115.图59示出从如实施例xv中描述的示例性带条形码mhc四聚体t细胞实验获得的数据的结果。116.图60示出从如实施例xv中描述的示例性ebv扩增的t细胞加标实验获得的数据的结果。117.图61a‑图61d示意性地描绘crispr引导rna的示例性条形编码方案。具体实施方式118.尽管本文已示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。在不背离本发明的情况下本领域的技术人员可想到众多变体、变化、以及替代。应了解可使用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。119.在将值描述为范围的情况下，应理解，这种公开内容包括在此类范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入此类范围内的特定数值，而不管特定数值或特定子范围是否明确说明。120.如本文所用，术语“条形码”通常是指可以是分析物的一部分以传达关于所述分析物的信息的标记或标识符。除了分析物的内源性特征(例如，分析物的大小或末端序列)之外，条形码可以是附接至分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是唯一的。条形码可具有各种不同的格式，例如，条形码可包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以可逆或不可逆的方式附接至分析物。在样品测序之前、期间和/或之后，可将条形码添加至例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)样品的片段。条形码可允许实时鉴定和/或定量单独测序读数。121.如本文所用，术语“受试者”通常是指动物，如哺乳动物物种(例如人)或禽类(例如鸟)物种，或其它生物体，如植物。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、小鼠、灵长类动物、猿猴或人。动物可包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康个体、患有或疑似患有疾病或所述疾病倾向的个体或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。122.如本文所用，术语“基因组”通常是指受试者的遗传信息的整体。基因组可以在dna或rna中编码。基因组可包含编码蛋白质的编码区以及非编码区。基因组可包含生物体中所有染色体一起的序列。例如，人基因组具有总计46个染色体。所有这些的序列一起可构成人基因组。123.术语“衔接子(adaptor)”、“衔接子(adapter)”和“标签”可同义使用。衔接子或标签可偶联至多核苷酸序列以通过任何方法(包括连接、杂交或其它方法)“标记”。124.如本文所用，术语“测序”通常是指用于确定一种或多种多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna)。测序可通过目前可用的各种系统进行，如但不限于illumina、pacificbiosciences、oxfordnanopore或lifetechnologies(iontorrent)的测序系统。此类装置可提供对应于受试者(例如人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如通过所述装置从受试者提供的样品产生的。在一些情况下，本文提供的系统和方法可与蛋白质组学信息一起使用。125.如本文所用，术语“变体”通常是指遗传变体，如包含多态性的核酸分子。变体可以是结构变体或拷贝数变体，其可以是大于单核苷酸变体或短插入缺失的基因组变体。变体可以是受试者的核酸样品或基因组中的改变或多态性。单核苷酸多态性(snp)是多态性的一种形式。多态性可包括单核苷酸变异(snv)、插入、缺失、重复、小插入、小缺失、小重复、结构变体连接、可变长度串联重复和/或侧翼序列。拷贝数变体(cnv)、颠换和其它重排也是遗传变异的形式。基因组改变可以是碱基变化、插入、缺失、重复、拷贝数变异或颠换。126.如本文所用，术语“珠粒”通常是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶。珠粒可以由聚合物材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。127.如本文所用，术语“样品”通常是指受试者的生物样品。样品可以是组织样品，如活组织检查、芯活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是流体样品，如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是面颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是无细胞(或无细胞)样品。无细胞样品可包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可从身体样品分离，所述身体样品可选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰液、粪便和泪液。128.如本文所用的术语“核酸”通常是指任何长度的核苷酸的单体或聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物或变体。核酸分子可包含一种或多种未修饰的或修饰的核苷酸。核酸可具有任何三维结构，并且可执行任何功能。以下是核酸的非限制性实例：核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运核糖核酸(rna)、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核酶、互补脱氧核糖核酸(cdna)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的dna、具有任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，如肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)、苏糖核酸(tna)、2'‑氟、2'‑ome和硫代磷酸化dna。核酸可包含选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的一个或多个亚单位。在一些实例中，核酸是dna或rna或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以是环状的。129.如本文所用的术语“核苷酸”通常是指核酸亚单位，其可包括a、c、g、t或u，或其变体或类似物。核苷酸可包含可并入增长核酸链中的任何亚单位。这种亚单位可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u具有特异性、或与嘌呤(即，a或g或其变体或类似物)或嘧啶(即，c、t或u或其变体或类似物)互补的任何其它亚单位。亚单位可使得单独核酸碱基或碱基群组(例如，aa、ta、at、gc、cg、ct、tc、gt、tg、ac、ca或其尿嘧啶对应物)能够得以拆分。130.如本文所用，术语“分析物”通常是指用于鉴定、如检测(例如，经由测序检测)的物质或其一种或多种成分。分析物的实例包括但不限于dna、rna、标记剂、抗体和蛋白质。分析物可以是细胞或细胞的一种或多种成分。131.分析物可具有不同类型。在一些实例中，在多种分析物中，给定分析物具有与多种其它分析物不同的结构或功能类别。不同类型的分析物的实例包括dna和rna；核酸分子和标记剂；转录物和基因组核酸；多个核酸分子，其中每个核酸分子具有不同的功能，如不同的细胞功能。样品可具有多种不同类型的分析物，如dna和rna分子的混合物，或核酸分子和标记剂的混合物。在一些情况下，不同类型的分析物不包括用于分离细胞的细胞表面特征的标记剂。132.如本文所用的术语“表位结合片段”通常是指能够与完整抗体结合相同表位的完整抗体的一部分，尽管不一定达到相同程度。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但表位结合片段通常包含(例如，通过二硫键)保持在一起的至少一对重链和轻链可变区(分别vh和vl)以保留抗原结合位点，并且不包含fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可通过任何合适的技术(例如，重组dna技术或完整抗体的酶或化学裂解)从给定抗体获得，并且通常可以筛选完整抗体相同的方式筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包含f(ab’)2片段、fab'片段、fab片段、fd片段或fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体来源的多肽，如单链可变片段(scfv)、双抗体或其它多聚体scfv、重链抗体、单结构域抗体或包含抗体的足够部分(例如，一个或多个互补决定区(cdr))的其它多肽以赋予多肽特异性抗原结合能力。133.核酸测序技术在测序生物材料方面取得了实质性结果，包括提供关于个体生物体以及相对纯的生物样品的实质性序列信息。然而，这些系统传统上不能有效地鉴定和表征单细胞水平的细胞。134.核酸测序技术可衍生出它们从自组织或其它样品(如生物流体(例如血液、血浆等))获得的细胞集合测序的核酸。可加工细胞(例如，在整体方法中全部一起)以提取代表细胞群体的平均值的遗传材料，然后可将其加工成被配置用于给定测序技术的测序简易dna文库。尽管经常就dna或核酸而言论述，但是源自细胞的核酸可包括可进行加工以产生用于测序的cdna的dna或rna，包括例如mrna、总rna等。135.除了不能将特征归属于细胞或单独细胞的特定子集外，此类整体样品制备方法可从一开始就倾向于主要鉴定和表征细胞样品中的大多数成分，并且可能不被设计成挑选少数成分，例如，样品中由一个细胞、一些细胞或一小部分总细胞贡献的遗传或蛋白质组学材料。同样地，在分析例如mrna或细胞表面蛋白的表达水平时，整体方法可倾向于从就表达水平而言不均匀的细胞群体呈现潜在不准确的数据。在一些情况下，在所分析的群体中的少数细胞中表达高并且在所述群体的大多数细胞中不存在时，整体方法可指示整个群体的低水平表达。136.通过用于从这些样品产生测序文库的加工操作，可进一步放大这些不准确性。一些下一代测序技术(例如，大规模平行测序)可依赖于核酸片段的几何扩增(如经由聚合酶链式反应)，以产生用于测序文库的足够dna。然而，这种扩增可偏向于扩增样品中的大多数成分，并且可能无法保持此类少数成分和多数成分的起始比例。虽然这些困难中的一些可通过利用不同的测序系统(如不需要扩增的单分子系统)来解决，但单分子系统以及其它下一代测序(ngs)系统的整体测序方法也可具有大的输入dna要求。例如，一些单分子测序系统可具有500纳克(ng)至高于10微克(μg)的样品输入dna要求，这可能不能从单独细胞或细胞小亚群获得。同样地，可优化其它ngs系统以使样品中样品dna的起始量为大约50纳克(ng)至约1微克(μg)。dna的起始量可以是至少约1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg或100μg。137.本文公开了用于表征细胞小群体的表面特征、蛋白质和核酸，并且在一些情况下用于表征单独细胞的表面特征、蛋白质和核酸的方法和系统。本文描述的方法可划分单独细胞或细胞小群体(包括例如单独细胞或细胞小群组的细胞表面特征、蛋白质和核酸)的分析，并且然后允许所述分析归属回至所述细胞表面特征、蛋白质和核酸所来源于的单独细胞或细胞小群组。无论细胞群体是代表细胞类型的50/50混合物、细胞类型的90/10混合物还是几乎任何细胞类型比例以及不同细胞类型的完全异质混合物或者这些之间的任何混合物，都可实现这一点。不同的细胞类型可包括来自个体的不同组织类型或来自不同个体的相同组织类型或生物有机体如来自不同属、种、菌株、变体或任何或所有前述的任何组合的微生物的细胞。例如，不同的细胞类型可包括来自个体的正常和肿瘤组织、从人受试者获得的各种细胞类型如各种免疫细胞(例如，b细胞、t细胞等)、来自环境、法医、微生物组或其它样品的多种不同的细菌物种、菌株和/或变体或细胞类型的任何各种其它混合物。138.在一个方面，本文描述的方法和系统提供将来自含有细胞的样品材料的单独细胞的核酸内容物划分、沉积或分配到离散的区室或分区(在本文中可互换地称为分区)，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。在另一个方面，本文描述的方法和系统提供将单独细胞从含有细胞的样品材料划分、沉积或分配到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。在另一个方面，本文所述的方法和系统提供在已经将至少一种标记剂结合至细胞的细胞表面特征之后，将来自含有细胞的样品材料的单独细胞划分、沉积或分配到离散的分区中，其中每个分区保持其自身的内容物与其它分区的内容物的分离。可在先前、随后或同时将独特标识符(例如条形码)递送至保持划分的或分配的细胞的分区，以便允许稍后将单独细胞的特征归属于特定区室。此外，独特标识符(例如，条形码)可偶联至标记剂并且在先前、随后或同时递送至保持划分的或分配的细胞的分区，以便允许稍后将单独细胞的特征归属于特定区室。条形码可经由任何合适的机制例如在寡核苷酸上递送至分区。139.在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸经由微胶囊递送至分区。在一些情况下，带条形码寡核苷酸最初与微胶囊缔合，并且然后在施加刺激时从所述微胶囊释放，所述刺激允许所述寡核苷酸解离或从所述微胶囊释放。在一些实施方案中，锚寡核苷酸经由微胶囊递送至分区。在一些情况下，锚寡核苷酸最初与微胶囊缔合，并且然后在施加刺激时从所述微胶囊释放，所述刺激允许所述锚寡核苷酸解离或从所述微胶囊释放。140.微胶囊可以是或可包括固体载体或固体颗粒，如珠粒。固体载体或固体颗粒可以是珠粒。微胶囊可以是微滴。在一些实施方案中，微胶囊可以是或可包含珠粒。在一些实施方案中，珠粒可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的或流体的。在一些实施方案中，珠粒可以是可溶解的、可破裂的或可降解的。在一些情况下，珠粒可能不可降解。在一些实施方案中，珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可由分子前体，如聚合物或单体物质形成。半固体珠粒可以是脂质体珠粒。固体珠粒可包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠粒可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，珠粒可以是刚性的。在一些情况下，珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。141.在一些实施方案中，珠粒可含有分子前体(例如，单体或聚合物)，其可经由所述前体的聚合形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经由例如化学交联进行进一步聚合的已经聚合的物质。在一些情况下，前体包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，珠粒可包含预聚物，所述预聚物是能够进一步聚合的低聚物。例如，可使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些情况下，珠粒可含有可进一步聚合在一起的单独聚合物。在一些情况下，可经由不同前体的聚合产生珠粒，以使得它们包含混合聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。142.珠粒可包含天然和/或合成材料。例如，聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。在一些情况下，珠粒可包含天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、刺梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)以及其组合(例如共聚物)。珠粒也可由除聚合物以外的材料，包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其它无机材料等形成。143.在一些情况下，化学交联剂可以是用于在单体聚合期间交联单体的前体和/或可用于将寡核苷酸(例如，带条形码寡核苷酸)附接至珠粒。在一些情况下，聚合物可进一步与交联剂物质或其它类型的单体聚合以产生另外的聚合物网络。化学交联剂(本文中也称为“交联剂(crosslinker)”或“交联剂(crosslinkeragent)”)的非限制性实例包括胱胺、戊二醛、辛二亚氨酸二甲酯、n‑羟基琥珀酰亚胺交联剂bs3、甲醛、碳二亚胺(edc)、smcc、磺基‑smcc、乙烯基硅烷、n,n’二烯丙基酒石酸二酰胺(datd)、n,n’‑双(丙烯酰基)胱胺(bac)或其同系物。在一些情况下，本公开中使用的交联剂含有胱胺。144.交联可以是永久性的或可逆的，这取决于所用的特定交联剂。可逆交联可允许聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可允许结合至珠粒表面的材料的可逆附接。在一些情况下，交联剂可形成二硫连键。在一些情况下，形成二硫连键的化学交联剂可以是胱胺或改性的胱胺。145.在一些实施方案中，二硫连键可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或并入珠粒中的前体与寡核苷酸之间形成。胱胺(包括改性的胱胺)例如是包含二硫键的有机剂，其可用作珠粒的单独单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包含胱胺(例如，改性的胱胺)的物质存在下聚合，以产生包含二硫连键的聚丙烯酰胺凝胶珠粒(例如，包含可化学还原的交联剂的可化学降解的珠粒)。所述二硫连键可允许珠粒在所述珠粒暴露于还原剂时降解(或溶解)。146.在一些实施方案中，壳聚糖(线性多糖聚合物)可经由亲水链与戊二醛交联以形成珠粒。壳聚糖聚合物的交联可通过化学反应来实现，所述化学反应通过热、压力、ph的变化和/或辐射引发。147.在一些实施方案中，珠粒可包含聚合物前体(例如，单体、低聚物、线性聚合物)、寡核苷酸、引物和其它实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键包含碳‑碳键或硫醚键。148.在一些情况下，珠粒可包含acrydite部分，其在某些方面可用于将一种或多种寡核苷酸(例如条形码序列、带条形码寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)附接至珠粒。在一些情况下，acrydite部分可指由acrydite与一种或多种物质的反应，如acrydite与其它单体和交联剂在聚合反应期间的反应产生的acrydite类似物。acrydite部分可被修饰为与待附接的物质如寡核苷酸(例如条形码序列、带条形码寡核苷酸、引物或其它寡核苷酸)形成化学键。acrydite部分可用能够形成二硫键的硫醇基团修饰，或者可用已经包含二硫键的基团修饰。硫醇或二硫化物(经由二硫化物交换)可用作待附接的物质的锚定点，或者acrydite部分的另一部分可用于附接。在一些情况下，附接是可逆的，以使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂存在下)，附接的物质从珠粒释放。在其它情况下，acrydite部分包含可用于附接的反应性羟基。149.用于附接寡核苷酸的珠粒的官能化可通过多种不同的方法实现，所述方法包括活化聚合物内的化学基团、在聚合物结构中并入活性或可活化的官能团或者在珠粒生产中的预聚物或单体阶段附接。150.例如，聚合以形成珠粒的前体(例如单体、交联剂)可包含acrydite部分，以使得当产生珠粒时，所述珠粒也包含acrydite部分。所述acrydite部分可附接至寡核苷酸如引物(例如，用于扩增靶核酸的引物、带条形码寡核苷酸等)以并入珠粒中。在一些情况下，所述引物包含用于附接至用于illumina测序的测序流动池的p5序列。在一些情况下，所述引物包含用于附接至用于illumina测序的测序流动池的p7序列。在一些情况下，所述引物包含条形码序列。在一些情况下，所述引物还包含独特分子标识符(umi)。在一些情况下，所述引物包含用于illumina测序的r1引物序列。在一些情况下，所述引物包含用于illumina测序的r2引物序列。151.在一些情况下，包含反应性或能够被活化以使其变得反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以产生包含活化的或可活化官能团的凝胶珠粒。然后可使用官能团来将另外的物质(例如，二硫化物接头、引物、其它寡核苷酸等)附接至凝胶珠粒。例如，包含羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包含cooh官能团的凝胶珠粒。在一些情况下，丙烯酸(包含游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可共聚合在一起以产生包含游离cooh基团的凝胶珠粒。可活化凝胶珠粒的cooh基团(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或氯化4‑(4,6‑二甲氧基‑1,3,5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉鎓(dmtmm))，以使得它们是反应性的(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团然后可与适当的物质(例如，包含胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应，所述物质包含待连接至珠粒的部分。152.在其聚合物网络中包含二硫连键的珠粒可经由将一些二硫连键还原成游离硫醇而用另外的物质官能化。二硫连键可经由例如还原剂(例如dtt、tcep等)的作用来还原以产生游离硫醇基团而不溶解珠粒。珠粒的游离硫醇然后可与物质或包含另一个二硫键的物质的游离硫醇(例如，经由硫醇‑二硫化物交换)反应，以使得所述物质可连接至珠粒(例如，经由产生的二硫键)。在一些情况下，珠粒的游离硫醇可与任何其它合适的基团反应。例如，珠粒的游离硫醇可与包含acrydite部分的物质反应。珠粒的游离硫醇基团可经由迈克尔加成化学与丙烯酸酯反应，以使得包含acrydite的物质连接至珠粒。在一些情况下，可通过包含硫醇封端剂如n‑乙基马来酰胺或碘乙酸酯来防止不受控制的反应。153.可控制珠粒内二硫连键的活化，以使得仅活化少量二硫连键。可例如通过控制用于产生游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠粒聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些情况下，低浓度(例如，小于或等于约10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000、10000000000或100000000000的还原剂:凝胶珠粒比率的分子)的还原剂可用于还原。控制被还原为游离硫醇的二硫连键的数量可用于确保官能化期间的珠粒结构完整性。在一些情况下，光学活性剂(如荧光染料)可经由珠粒的游离硫醇基团与珠粒偶联，并用于量化珠粒中存在的游离硫醇的数量和/或追踪珠粒。154.在一些情况下，在凝胶珠粒形成后向凝胶珠粒添加部分可以是有利的。例如，在凝胶珠粒形成后添加寡核苷酸(例如，带条形码寡核苷酸)可避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质的损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接的部分的单体或交联剂)可用于聚合，并且由于粘性效应可最小程度地阻止生长链端。在一些情况下，在凝胶珠粒合成后的官能化可使物质(例如，寡核苷酸)的暴露最小化，以负载潜在的破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境。在一些情况下，所产生的凝胶可具有上临界溶解温度(ucst)，其可允许温度驱动的溶胀和珠粒的塌陷。在随后用寡核苷酸官能化珠粒期间，这种功能可帮助寡核苷酸(例如，引物)渗入珠粒中。生产后官能化也可用于控制珠粒中物质的负载比例，以使得例如负载比例的可变性最小化。物质负载也可在分批过程中进行，以使得多个珠粒可在单个批次中用所述物质官能化。155.在一些情况下，连接至前体的acrydite部分、连接至前体的另一种物质或前体本身包含不稳定键，如化学、热或光敏感键，例如二硫键、uv敏感键等。一旦acrydite部分或包含不稳定键的其它部分并入到珠粒中，所述珠粒也可包含不稳定键。不稳定键可例如用于将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价连接)至珠粒。在一些情况下，热不稳定键可包括基于核酸杂交的附接，例如，其中寡核苷酸与附接至珠粒的互补序列杂交，以使得杂合体的热解链从所述珠粒或微胶囊释放寡核苷酸，例如含条形码的序列。156.向凝胶珠粒添加多种类型的不稳定键可导致产生能够响应于不同刺激的珠粒。每种类型的不稳定键可对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度等)敏感，以使得可通过施加适当的刺激来控制经由每个不稳定键附接至珠粒的物质的释放。这种功能可用于从凝胶珠粒中控制释放物质。在一些情况下，包含不稳定键的另一种物质可在凝胶珠粒形成后经由例如如上所述的凝胶珠粒的活化的官能团连接至凝胶珠粒。如将理解的，可释放地、可裂解地或可逆地附接至本文所述的珠粒的条形码包括通过裂解条形码分子与珠粒之间的连键而释放或可释放或通过下面的珠珠粒本身的降解释放的条形码，从而允许条形码通过其它试剂访问或可访问，或两者。157.附接至固体支载体(例如珠粒)的物质(例如，包含条形码的寡核苷酸)可包含允许所述物质从珠粒释放的u‑切除元件。在一些情况下，所述u切除元件可包含含有至少一个尿嘧啶的单链dna(ssdna)序列。所述物质可经由ssdna序列附接至固体载体。所述物质可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(例如，以除去尿嘧啶)和核酸内切酶(例如，以诱导ssdna断裂)的组合释放。如果核酸内切酶从裂解产生5'磷酸基团，则可在下游加工中包括额外的酶处理以例如在连接额外的测序柄元件(例如，illumina完整p5序列、部分p5序列、完整r1序列和/或部分r1序列)之前消除磷酸基团。158.如本文所述可释放的条形码有时可被称为可活化的，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可通过从珠粒(或本文所述的其它合适类型的分区)释放条形码来活化可活化的条形码。在所描述的方法和系统的背景下还设想了其它可活化配置。159.除了热可裂解的键、二硫键和uv敏感键以外，可偶联至前体或珠粒的不稳定键的其它非限制性实例包括酯连键(例如，可用酸、碱或羟胺裂解)、邻位二醇连键(例如，可经由高碘酸钠裂解)、狄尔斯‑阿尔德(diels‑alder)连键(例如，可经由热裂解)、砜连键(例如，可经由碱裂解)、甲硅烷基醚连键(例如，可经由酸裂解)、糖苷连键(例如，可经由淀粉酶裂解)、肽连键(例如，可经由蛋白酶裂解)或磷酸二酯连键(例如，可经由核酸酶(例如，dna酶)裂解))。160.不参与聚合的物质也可在珠粒产生期间(例如，在前体聚合期间)包封在珠粒中。此类物质可进入聚合反应混合物中，以使得产生的珠粒在珠粒形成时包含所述物质。在一些情况下，可在形成后将此类物质添加至凝胶珠粒。此类物质可包括，例如，寡核苷酸(例如带条形码寡核苷酸和/或锚寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dntp、辅因子(例如，离子辅因子))(包括本文所述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物)或用于核酸修饰反应如聚合、连接或消化的试剂。捕获此类物质可通过在前体聚合期间产生的聚合物网络密度、控制凝胶珠粒内的离子电荷(例如，经由连接至聚合物质的离子物质)或通过释放其它物质来进行控制。在珠粒降解时和/或通过施加能够从珠粒释放物质的刺激，可从珠粒释放包封的物质。161.珠粒可具有均匀的尺寸或不均匀的尺寸。在一些情况下，珠粒的直径可以是约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm。在一些情况下，珠粒可具有至少约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大的直径。在一些情况下，珠粒可具有小于或等于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm或1mm的直径。在一些情况下，珠粒可具有在约40‑75μm、30‑75μm、20‑75μm、40‑85μm、40‑95μm、20‑100μm、10‑100μm、1‑100μm、20‑250μm或20‑500μm的范围内。162.在某些方面，珠粒被提供为一群或多个具有相对单分散尺寸分布的珠粒。这种单分散性可在分区内提供相对一致量的试剂并维持相对一致的珠粒特性。特别地，本文所述的珠粒可具有尺寸分布，所述尺寸分布具有小于或等于约50％、小于或等于约40％、小于或等于约30％、小于或等于约20％、小于或等于约15％、小于或等于约10％或小于或等于约5％的其横截面尺寸的变异系数。163.珠粒可具有任何合适的形状。珠粒形状的实例包括但不限于球形、非球形、卵形、椭圆形、无定形、圆形、圆柱形以及其变化。164.除了珠粒与相关分子(例如，以上所述的含有条形码的寡核苷酸)之间的可裂解连键之外或作为其替代，珠粒可自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、ph变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)时可降解、可破坏或可溶解。在一些情况下，珠粒可以是可溶解的，以使得珠粒的材料组分在暴露于特定化学物质或环境变化(如变化温度或ph变化)时溶解。在一些情况下，凝胶珠粒在升高的温度和/或在碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，珠粒可以是可热降解的，以使得当珠粒暴露于适当的温度变化(例如，热)时，所述珠粒降解。结合至物质(例如，寡核苷酸，例如带条形码寡核苷酸)的珠粒的降解或溶解可导致所述物质从所述珠粒释放。165.可降解珠粒可包含一种或多种具有不稳定键的物质，以使得当所述珠粒/物质暴露于适当的刺激时，键被破坏并且珠粒降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些情况下，用于产生珠粒的交联剂可包含不稳定键。在暴露于适当的条件下，可破坏不稳定的键并且珠粒降解。例如，在将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠粒暴露于还原剂时，可破坏胱胺的二硫键并且珠粒降解。166.与不降解的珠粒相比，当将适当的刺激施加至珠粒时，可降解的珠粒可用于更快地从珠粒释放附接的物质(例如，寡核苷酸、条形码序列、引物等)。例如，对于与多孔珠粒的内表面结合的物质或在包封的物质的情况下，所述物质在珠粒降解后可具有更大的迁移率和对溶液中其它物质的可接近性。在一些情况下，物质也可经由可降解的接头(例如，二硫化物接头)附接至可降解的珠粒。可降解的接头可与可降解珠粒响应于相同的刺激，或者两种可降解物质可响应于不同的刺激。例如，条形码序列可经由二硫键附接至包含胱胺的聚丙烯酰胺珠粒。在带条形码珠粒暴露于还原剂后，所述珠粒降解并且条形码序列在条形码序列与珠粒之间的二硫连键以及珠粒中胱胺的二硫连键两者断裂时释放。167.可将可降解珠粒引入分区，如乳液或孔的微滴，以使得所述珠粒在分区内降解，并且当施加适当的刺激时，任何缔合的物质(例如，寡核苷酸)在所述微滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸)可与分区中包含的其它试剂相互作用。例如，包含胱胺并经由二硫键连接至条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒可与油包水乳液的微滴内的还原剂组合。在微滴内，还原剂可使各种二硫键断裂，从而导致珠粒降解并将条形码序列释放到微滴的水性内部环境中。在另一个实例中，在碱性溶液中加热包含珠粒结合的条形码序列的微滴也可导致珠粒降解并将附接的条形码序列释放到微滴的水性内部环境中。168.如将从以上公开内容理解，虽然称为珠粒的降解，但降解可指结合或夹带的物质从珠粒解离，有或没有结构上降解物理珠粒本身。例如，由于例如改变化学环境，可通过渗透压差从珠粒释放夹带的物质。举例来说，由于渗透压差所致的珠粒孔径的改变通常可在没有珠粒本身的结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠粒的渗透膨胀所致的孔径增加可允许珠粒内的夹带物质的释放。在其它情况下，由于孔径收缩，珠粒的渗透收缩可使得珠粒更好地保留夹带的物质。169.在提供可降解珠粒的情况下，避免使此类珠粒暴露于在给定时间之前引起这种降解的一种或多种刺激是有用的，以避免过早珠粒降解和由这种降解引起的问题，包括例如较差流动特性和聚集。举例来说，其中珠粒包含可还原的交联基团如二硫化物基团，避免使此类珠粒与还原剂例如dtt或其它二硫化物裂解试剂接触可能是有用的。在此类情况下，对本文所述珠粒的处理在一些情况下将在不含还原剂如dtt的情况下提供。因为通常在商业酶制剂中提供还原剂，所以可提供不含还原剂(或不含dtt)的酶制剂来处理本文所述的珠粒。此类酶的实例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及可用于处理本文所述珠粒的许多其它酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含dtt”制剂可指具有小于或等于约1/10、小于或等于约1/50或小于或等于约1/100的用于降解珠粒的此类材料的较低范围。例如，对于dtt，不含还原剂的制剂通常将具有小于或等于约0.01mm、0.005mm、0.001mmdtt、0.0005mmdtt或0.0001mmdtt。在一些情况下，dtt的量将不可检测到。170.在一些情况下，可使用刺激来触发珠粒的降解，其可导致内容物从珠粒释放。通常，刺激可引起珠粒结构的降解，如共价键或其它类型的物理相互作用的降解。这些刺激可用于诱导珠粒降解和/或释放其内容物。如下文更全面描述的，可使用的刺激的实例包括化学刺激、热刺激、光刺激(例如光)以及其任何组合。171.可使用许多化学触发剂来触发珠粒的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠粒内组分的完整性的变化、珠粒的组分经由交联键裂解的降解和珠粒的组分的解聚。172.在一些实施方案中，珠粒可由包含可降解化学交联剂如bac或胱胺的材料形成。此类可降解交联剂的降解可通过许多机制完成。在一些实例中，珠粒可与化学降解剂接触，所述化学降解剂可诱导氧化、还原或其它化学变化。例如，化学降解剂可以是还原剂，如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的另外实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1,4‑二巯基丁烷(二硫代丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解在形成珠粒的凝胶前体之间形成的二硫键，并且因此降解珠粒。在其它情况下，溶液的ph变化(如ph的增加)可触发珠粒的降解。在其它情况下，暴露于水溶液(如水)可触发水解降解，并且因此触发珠粒的降解。173.在施加热刺激时，还可诱导珠粒释放其内容物。温度的变化可引起珠粒的各种变化。例如，热可引起固体珠粒液化。热的变化可引起珠粒熔融，以使得珠粒的一部分降解。在其它情况下，热可增加珠粒组分的内部压力，以使得珠粒破裂或爆炸。热还可作用于用作构建珠粒的材料的热敏聚合物。174.本公开的方法、组合物、装置和试剂盒可与任何合适的剂一起使用以降解珠粒。在一些实施方案中，温度或ph的变化可用于降解珠粒内的热敏性或ph敏感性键。在一些实施方案中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其它化学变化降解珠粒内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，如dtt，其中dtt可降解在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠粒。在一些实施方案中，可添加还原剂以降解珠粒，其可以或可以不引起珠粒释放其内容物。还原剂的实例可包括二硫苏糖醇(dtt)、β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1,4‑二巯基丁烷(二硫代丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可以约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm或10mm的浓度存在。还原剂可以至少约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm、10mm或更高的浓度存在。还原剂可以至多约0.1mm、0.5mm、1mm、5mm或10mm的浓度存在。175.任何合适数量的核酸分子(例如，引物、带条形码寡核苷酸、锚寡核苷酸)可与珠粒缔合，以使得在从珠粒释放时，所述核酸分子(例如，引物、带条形码寡核苷酸、锚寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择这种预定浓度以促进用于在分区内产生测序文库(例如扩增)的某些反应。在一些情况下，预定浓度的引物受到产生带有寡核苷酸的珠粒的方法的限制。176.在一些方面，分区是指容器或器皿(如孔、微孔、管、小瓶、纳米阵列基底(例如biotrove纳米阵列)中的贯通端口或其它容器)。在一些方面，区室或分区包括可在流体流内流动的分区。这些分区可包括例如具有包围内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡，或在一些情况下它们可包括能够夹带和/或保留其基质内的材料的多孔基质。在一些方面，分区包括非水性连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。不同器皿的实例描述于美国专利申请公布号2014/0155295中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。用于在非水性或油连续相中产生稳定微滴的乳液体系的实例详细描述于美国专利申请公布号2010/0105112中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。177.在乳液中的微滴的情况下，将单独细胞分派至离散分区通常可通过以下方式来实现：将细胞于水性流体中的流动流引入非水性流体的流动流中，以使得在两种流的接点处产生微滴。通过在一定浓度的细胞中提供水性细胞的流，可控制所得分区的占用率(例如，每个分区的细胞数)。在实现单细胞分区的情况下，可选择流体的相对流速，以使得所述分区平均每个分区含有少于一个细胞，以便确保那些被占用的分区主要是单一占用的。在一些实施方案中，可选择流体的相对流速，以使得大多数分区被占用，例如从而允许仅一小部分未占用的分区。在一些方面，控制流量和通道结构以确保一定数目的单一占用分区、低于某一水平的未占用分区以及低于某一水平的多重占用分区。178.可操作本文描述的系统和方法，以使得大多数被占用的分区包括每个被占用的分区不超过一个细胞。在一些情况下，进行分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有多于一个细胞，并且在一些情况下，少于20％的被占用的分区具有多于一个细胞。在一些情况下，少于10％或少于5％的被占用的分区包括每个分区多于一个细胞。179.在一些情况下，避免创建过量的空分区可能是有用的。例如，从成本角度和/或效率角度来看，最小化空分区的数量可能是有帮助的。虽然这可通过将足够数量的靶细胞提供至分配区中来实现，但泊松分布(poissoniandistribution)预期可增加可包括多个细胞的分区的数量。因此，根据本文所描述的方面，进行被定向至分配区中的一个或多个细胞或其它流体的流量，以使得在一些情况下，不超过50％的所产生的分区、不超过25％的所产生的分区或不超过10％的所产生的分区未被占用。此外，在一些方面，控制这些流以便呈现单个占用分区的非泊松分布，同时提供较低水平的未占用分区。可实现未占用分区的上述范围，同时仍然提供上述任何单一占用率。例如，使用本文描述的系统和方法产生具有小于或等于约25％、20％、15％、10％或5％的多重占用率、同时具有小于或等于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的未占用分区的所得分区。180.如将理解，上述占用率也适用于包含细胞和另外的试剂和剂的分区，包括但不限于携带带条形码寡核苷酸的微胶囊、携带锚定寡核苷酸的微胶囊、标记剂、包含报告寡核苷酸的标记剂、包含含有核条形码序列的报告寡核苷酸的标记剂和具有与一种或多种细胞表面特征结合的一种或多种标记剂的细胞。在一些方面，相当大百分比的全部被占用的分区可包括包含条形码或锚定寡核苷酸的微胶囊(例如珠粒)和有或无结合的标记剂的细胞。181.虽然在上文中就提供大体上单一占用的分区进行了描述，但在某些情况下，提供例如在单一分区内含有包含带条形码寡核苷酸或锚寡核苷酸的两个、三个、四个或更多个细胞和/或微胶囊(例如，珠粒)的多重占用分区可能是有用的。因此，可控制含有细胞和/或珠粒的流体和分配流体的流动特征以提供此类多重占用分区。特别地，可控制流动参数以提供分区的大于或等于约50％、大于或等于约75％或大于或等于约80％、90％、95％或更高的占用率。182.在一些情况下，使用另外的微胶囊来将另外的试剂递送至分区。在此类情况下，可能有利的是从不同珠粒来源(即含有不同的所缔合的试剂)通过进入共同的通道或微滴产生接点的不同通道入口将不同珠粒引入这种共同的通道或微滴产生接点中。在此类情况下，可控制不同珠粒进入通道或接点的流量和频率以从各来源提供合适比率的微胶囊，同时确保配对或组合的此类珠粒进入具有所需数量的细胞的分区。183.本文描述的分区可包括小体积，例如，小于或等于10□l、5□l、1□l、900皮升(pl)、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl、1pl、500纳升(nl)、100nl、50nl或更低。184.例如，在基于微滴的分区的情况下，所述微滴可具有小于或等于1000pl、900pl、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl或1pl的总体积。在与微胶囊共同分配的情况下，应当理解，分区内的样品流体体积(例如包括共分配的细胞)可小于或等于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或小于上述体积。185.如本文其它地方所述，分配物质可产生群体或多个分区。在此类情况下，可产生任何合适数量的分区以产生多个分区。例如，在本文所描述的方法中，可产生包含至少约1,000个分区、至少约5,000个分区、至少约10,000个分区、至少约50,000个分区、至少约100,000个分区、至少约500,000个分区、至少约1,000,000个分区、至少约5,000,000个分区、至少约10,000,000个分区、至少约50,000,000个分区、至少约100,000,000个分区、至少约500,000,000个分区或至少约1,000,000,000个分区的多个分区。此外，多个分区可包含未占用的分区(例如空分区)与被占用的分区两者。186.微流体通道网络可用于产生如本文所述的分区。在分配单独细胞时还可采用替代机制，所述替代机制包括多孔膜，细胞的水性混合物穿过所述多孔膜被挤压至非水性流体中。187.用于分配单独细胞的简化微流体通道结构的实例在图1中示出。如本文所述，细胞可在有或无与细胞表面特征结合的标记剂的情况下进行分配。如本文所述，在一些情况下，大多数被占用的分区包括每个被占用的分区不超过一个小细胞，并且在一些情况下，所产生的分区中的一些未被占用。但是，在一些情况下，所述被占用的分区中的一些可包括多于一个细胞。在一些情况下，可控制分配过程，以使得少于25％的被占用的分区含有超过一个细胞，并且在一些情况下，少于20％的被占用的分区具有超过一个细胞，而在一些情况下，少于10％或少于5％的被占用的分区每个分区包括超过一个细胞。如所示，所述通道结构可包括在通道接点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中，包括悬浮细胞114的第一水性流体112可沿着通道区段102输送到接点110中，而与水性流体112不混溶的第二流体116从通道区段104和106递送到接点110以产生包括单独细胞114的水性流体的离散微滴118，从而流入通道区段108中。188.在一些方面，此第二流体116包含油，如氟化油，其包括用于稳定所得微滴、例如抑制所得微滴的随后聚结的含氟表面活性剂。分配流体和含氟表面活性剂的实例描述于美国专利申请公布号2010/0105112中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。189.在其它方面，除了基于微滴的分配之外或作为其替代，细胞(如本文所述，有或无与细胞表面特征结合的标记剂)可包封在包含外壳或层或多孔基质的微胶囊内，在所述微胶囊内夹带一个或多个单独细胞或细胞小群组，并且可包括其它试剂。细胞的包封可通过各种方法进行。此类方法将含有待分析的细胞的水性流体与聚合物前体材料组合，所述聚合物前体材料在对聚合物前体施加特定刺激时能够形成凝胶或其它固体或半固体基质。此类刺激包括例如热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过前体的交联、聚合引发(例如，通过添加的引发剂)等。190.包含细胞的微胶囊的制备可通过各种方法进行。例如，气刀微滴或气溶胶发生器可用于将前体流体的微滴分配到胶凝溶液中，以形成包括单独细胞或细胞小群组的微胶囊。同样地，基于膜的包封系统可用于产生包含如本文所述的包封细胞的微胶囊。在一些方面，微流体系统如图1中所示的微流体系统可容易地用于包封如本文所述的细胞。特别地并且参考图1，包含细胞和聚合物前体材料的水性流体流入通道接点110中，其中其通过非水性流体116的流动分配呈包含单独细胞114的微滴118。在包封方法的情况下，非水性流体116还可包括引发剂，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，以形成包括夹带的细胞的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例描述于美国专利申请公布号2014/0378345中，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。191.例如，在聚合物前体材料包含线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、peg或其它线性聚合物材料)的情况下，活化剂可包含交联剂或活化所形成的微滴内的交联剂的化学品。同样，对于包含可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包含聚合引发剂。例如，在某些情况下，当聚合物前体包含丙烯酰胺单体与n,n’‑双‑(丙烯酰基)胱胺(bac)共聚单体的混合物时，可在通道区段104和106中的第二流体流内提供诸如四乙基亚甲基二胺(temed)的剂，所述剂引发丙烯酰胺和bac共聚成交联聚合物网络或水凝胶。192.在第二流体流116与第一流体流112在接点110处接触形成微滴后，temed可从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的水性第一流体112中，其将活化所述微滴内的聚丙烯酰胺的交联，从而导致形成呈夹带细胞114的固体或半固体珠粒或颗粒形式的凝胶(例如水凝胶)、微胶囊118。尽管就聚丙烯酰胺包封而言进行了描述，但是其它‘可活化的’包封组合物也可用于本文所述的方法和组合物的背景中。例如，形成藻酸盐微滴、然后暴露于二价金属离子(例如ca2 )可用作使用所述方法的包封过程。同样地，琼脂糖微滴也可通过基于温度的胶凝(例如在冷却后等)转化成胶囊。在一些情况下，例如通过时间推移或者在施加特定刺激后，包封的细胞可选择性地从微胶囊释放，使所述微胶囊充分降解以允许细胞或其内容物从所述微胶囊例如释放到分区(如微滴)中。例如，在上述聚丙烯酰胺聚合物的情况下，微胶囊的降解可通过引入适当的还原剂如dtt等来完成，以裂解使聚合物基质交联的二硫键。参见例如美国专利申请公布号2014/0378345，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。193.包封的细胞或细胞群体提供可储存并且比基于微滴的分配细胞更便携的某些潜在优点。此外，在一些情况下，可将待分析的细胞孵育选择的一段时间，以便在存在或不存在不同刺激的情况下表征此类细胞随时间推移的变化。在此类情况下，单独细胞的包封可允许比在乳液微滴中分配更长的孵育，尽管在一些情况下，微滴分配的细胞也可孵育不同的时间段，例如，至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。细胞的包封可构成细胞的分配，其它试剂共分配到所述细胞中。或者，如上所述，包封的细胞可容易地沉积到其它分区(例如液滴)中。194.根据某些方面，细胞可与裂解试剂一起分配，以释放分区内细胞的内容物。在此类情况下，可在将细胞引入分配接点/微滴产生区中(例如通过通道接点110上游的另外一个或多个通道)同时或之前不久使裂解剂与细胞悬浮液接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，如溶菌酶、无色肽酶、溶葡球菌素、labiase、kitalase、溶细胞酶和可从例如sigma‑aldrich,inc.(stlouis,mo)获得的各种其它裂解酶以及其它可商购的裂解酶。其它裂解剂可另外或可替代地与细胞共分配以引起细胞的内容物释放到分区中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞。在一些情况下，裂解溶液可包括非离子型表面活性剂，例如像tritonx‑100和tween20。在一些情况下，裂解溶液可包括离子型表面活性剂，例如像肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。在某些情况下也可使用电穿孔、热、声学或机械细胞破裂，例如基于非乳液的分配，如可除了微滴分配之外或代替微滴分配的细胞的包封，其中包封物的任何孔径足够小以在细胞破裂后保留合适大小的核酸片段。195.除了与上述细胞共分配的裂解剂之外，其它试剂也可与细胞共分配，所述其它试剂包括例如dna酶和rna酶灭活剂或抑制剂，如蛋白酶k、螯合剂(如edta)和用于除去或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸的随后加工的负面活性或影响的其它试剂。另外，在包封的细胞的情况下，可使细胞暴露于适当的刺激以从共分配的微胶囊释放细胞或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可与包封的细胞共分配，以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物释放到更大的分区中。在一些情况下，这种刺激可与本文其它地方描述的用于从其各自的微胶囊(例如珠粒)释放寡核苷酸的刺激相同。在替代方面，这可以是不同的和非重叠的刺激，以允许包封的细胞在与寡核苷酸释放到同一分区中的不同时间释放到分区中。196.另外的试剂也可与细胞共分配，如用于使细胞的dna片段化的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增细胞的核酸片段并将条形码寡核苷酸附接至扩增的片段的dntp。另外的试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸(switcholigos)”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可用于增加cdna的长度。在一些情况下，模板转换可用于将预定义的核酸序列附加至cdna。在模板转换的一个实例中，cdna可从模板(例如细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以模板独立方式向cdna添加额外的核苷酸，例如聚c。转换寡核苷酸可包括与另外的核苷酸(例如聚g)互补的序列。cdna上的另外核苷酸(例如聚c)可与转换寡核苷酸上的另外核苷酸(例如聚g)杂交，由此所述转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。模板转换寡核苷酸可包含杂交区和模板区。杂交区可包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如前所述，杂交区包含一系列g碱基以补充cdna分子的3'端的突出c碱基。所述系列g碱基可包含1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或多于5个g碱基。模板序列可包含待并入cdna中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2、3、4、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2'‑脱氧肌苷、supert(5‑羟基丁炔基‑2'‑脱氧尿苷)、superg(8‑氮杂‑7‑脱氮杂鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2'氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)或任何组合。197.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250个核苷酸或更长。198.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。199.在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。200.另外的剂也可与细胞共分配，如能够结合至细胞的一种或多种细胞表面特征的一种或多种标记剂。细胞表面特征可包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。标记剂可包括抗体、抗体片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架。所述标记剂可通过如本文所述的偶联方法偶联至包含核酸条形码序列的报告寡核苷酸，所述核酸条形码序列允许鉴定标记剂，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，与标记剂偶联的核酸条形码序列可包含独特分子标识符(umi)序列区段。201.标记剂可包含抗原呈递颗粒。在一些情况下，抗原呈递颗粒可在其表面上或附近包含抗原。抗原呈递颗粒例如通过抗原呈递颗粒上的抗原可结合至样品中的细胞表面上的一个或多个分子。在一些情况下，抗原呈递颗粒可用作免疫细胞(例如t细胞或b细胞)的标记剂。这种抗原呈递颗粒可结合至t细胞受体和/或b细胞受体。在一些情况下，抗原呈递颗粒包含被免疫细胞识别(例如，结合)的抗原。抗原呈递颗粒可以是细胞，例如癌细胞或其它抗原呈递细胞。抗原呈递颗粒可以是病原体，例如细菌、真菌、微生物或病毒。在某些情况下，抗原呈递颗粒(例如，细胞或病毒)可包含在颗粒的表面上表达抗原的抗原表达载体。抗原表达载体可包含用于鉴定抗原的核酸或氨基酸序列的条形码。202.使用抗原呈递颗粒来分析细胞的示例性方法可包括以下操作中的一个或多个。将包含免疫细胞(例如，血液或其部分)的样品与抗原呈递颗粒群体混合，并孵育以允许免疫细胞和抗原呈递颗粒相互作用。使用选择性地结合至免疫细胞的抗体纯化与免疫细胞结合的免疫细胞和抗原呈递颗粒。将结合的免疫细胞和抗原呈递颗粒分配到具有珠粒(例如凝胶珠粒)的微滴中。所述珠粒各自包含锚寡核苷酸，所述锚寡核苷酸包含mrna分子的引物、条形码和umi。所述微滴中的至少一个含有免疫细胞、抗原呈递颗粒和凝胶珠粒。裂解微滴中的免疫细胞和抗原呈递颗粒。释放来自免疫细胞和抗原呈递颗粒的mrna分子。用mrna分子和来自珠粒的锚寡核苷酸进行逆转录。因此，用来自锚寡核苷酸的条形码和umi标记所得cdna。然后在测序仪(例如，illumina测序仪)上对所得cdna进行测序，例如至每个细胞的高深度。利用序列读数，组装免疫细胞的v(d)j区，并且还确定抗原呈递颗粒的特征。当抗原呈递颗粒是癌细胞时，可用序列读数确定突变和/或单核苷酸多态性(snp)以鉴定由具有相应v(d)j序列的免疫细胞靶向的肿瘤细胞的亚群。当抗原呈递颗粒是病毒时，可组装病毒基因组以鉴定由具有相应v(d)j序列的免疫细胞靶向的病毒的亚克隆。所述方法可产生成对的v(d)j序列和抗原鉴定序列(例如，肿瘤细胞的mrna或病毒的基因组)，其可用于开发针对特定病毒株的个性化免疫疗法或疫苗。203.由标记剂(例如，由条形码标记的抗体)标记的蛋白质可用作结合测定中的探针。蛋白质可以是抗体或细胞表面蛋白，例如细胞受体，如t细胞受体和b细胞受体。标记剂可包含条形码和/或umi。在一些情况下，包含相同条形码和/或umi的另一种标记剂可用于分析与所述蛋白质来自相同细胞的核酸。来自相同细胞的核酸和蛋白质可通过条形码和/或umi鉴定。在一些情况下，可使用用于分析核酸的标记剂来确定细胞表面蛋白的核酸序列，以使得也可确定细胞表面蛋白的氨基酸序列。来自细胞的标记的蛋白质然后可用作针对靶分子(例如蛋白质)的结合测定中的探针。例如，在结合测定中，可确定标记的细胞表面蛋白是否能够结合至靶蛋白。可例如通过变性将细胞表面蛋白的标记与细胞表面蛋白分离。然后可对标签上的条形码和/或umi进行测序。条形码和/或umi的序列可用于将结合测定结果与细胞表面蛋白的序列相关联。因此，蛋白质与靶分子的相互作用可与蛋白质的序列相关联。在一些情况下，可使用umi量化蛋白质与靶分子之间的相互作用。204.一旦细胞的内容物释放到它们各自的分区中，其中包含的核酸可在所述分区内进一步加工。根据本文所述的方法和系统，可为单独细胞的核酸内容物提供独特的标识符，以使得在表征那些核酸时，它们可归属为源自一种或多种相同的细胞。通过将独特标识符具体地分配至单独细胞或细胞群组来提供将特征归属于单独细胞或细胞群组的能力。可将例如呈核酸条形码形式的独特标识符指定或与单独细胞或细胞群体相关联，以便用所述独特标识符标记(tag)或标记(label)细胞的组分(并且因此标记其特征)。然后，可使用这些独特标识符将细胞的组分和特征归属于单独细胞或细胞群组。在一些方面，这通过将单独细胞或细胞群组与独特标识符共分配来实现。在一些方面，独特标识符以寡核苷酸(在本文中也称为锚寡核苷酸)的形式提供，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可附接至单独细胞的核酸内容物或以其它方式与单独细胞的核酸内容物相关联，或附接至细胞的其它组分，并且特别是那些核酸的片段。可分配寡核苷酸，以使得在给定分区中的寡核苷酸之间，其中包含的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分区之间，所述寡核苷酸可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表大量在给定分析中跨越所有分区的不同条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可与给定分区相关联，尽管在一些情况下，可存在两个或更多个不同的条形码序列。205.核酸条形码序列可包含在寡核苷酸的序列内的6至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在单个相邻核苷酸区段中，或者它们可分成两个或多个分开的子序列，所述子序列被1个或多个核苷酸分开。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以是约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。206.共分配的寡核苷酸还可包含可用于加工来自共分配的细胞的核酸的其它功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，所述序列用于扩增来自分区内的单独细胞的基因组dna、同时附接相关联的条形码序列、对引物或引物识别位点进行测序、杂交或探测序列，例如用于鉴定序列的存在或用于提取带条形码的核酸；或任何许多其它潜在的功能序列。也可使用共分配寡核苷酸的其它机制，包括例如两个或更多个微滴的聚结，其中一个微滴含有寡核苷酸，或寡核苷酸微分配到分区，例如微流体系统内的微滴中。可进行寡核苷酸和相关条形码以及其它功能序列或标记以及如本文所述的样品材料的共分配，例如，如美国专利申请公布号2014/0227684中所描述，所述专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。207.简言之，在一个实例中，提供微胶囊如珠粒，其各自包含可释放地附接至珠粒的大量上述带条形码寡核苷酸(本文中也称为锚寡核苷酸)，其中附接至特定珠粒的所有寡核苷酸将包含相同的核酸条形码序列，但是其中大量不同的条形码序列在所使用的珠粒群体中表示。在一些实施方案中，水凝胶珠粒(例如，包含聚丙烯酰胺聚合物基质)用作寡核苷酸进入分区的固体载体和递送媒介物，因为它们能够携带大量寡核苷酸分子，并且可被配置为在暴露于特定刺激时释放那些寡核苷酸，如本文其它地方所描述。在一些情况下，珠粒群体将提供多样的条形码序列文库，所述条形码序列文库包括至少1,000个不同的条形码序列、至少5,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少50,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少5,000,000个不同的条形码序列或至少10,000,000个不同的条形码序列。另外，每个珠粒可提供有大量附接的寡核苷酸分子。特别地，单独珠粒上的包含条形码序列的寡核苷酸分子的数量可以是至少1,000个寡核苷酸分子、至少5,000个寡核苷酸分子、至少10,000个寡核苷酸分子、至少50,000个寡核苷酸分子、至少100,000个寡核苷酸分子、至少500,000个寡核苷酸、至少1,000,000个寡核苷酸分子、至少5,000,000个寡核苷酸分子、至少10,000,000个寡核苷酸分子、至少50,000,000个寡核苷酸分子、至少100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少10亿个寡核苷酸分子。208.此外，当分配珠粒群体时，所得到的分区群体还可包括多样的条形码文库，所述条形码文库包括至少1,000个不同的条形码序列、至少5,000个不同的条形码序列、至少10,000个不同的条形码序列、至少50,000个不同的条形码序列、至少100,000个不同的条形码序列、至少1,000,000个不同的条形码序列、至少5,000,000个不同的条形码序列或至少10,000,000个不同的条形码序列。另外，所述群体的每个分区可包括至少1,000个寡核苷酸分子、至少5,000个寡核苷酸分子、至少10,000个寡核苷酸分子、至少50,000个寡核苷酸分子、至少100,000个寡核苷酸分子、至少500,000个寡核苷酸、至少1,000,000个寡核苷酸分子、至少5,000,000个寡核苷酸分子、至少10,000,000个寡核苷酸分子、至少50,000,000个寡核苷酸分子、至少100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少10亿个寡核苷酸分子。209.在一些情况下，可将多个不同的条形码并入在给定分区内，或者附接至所述分区内的单个或多个珠粒。例如，在一些情况下，混合的但已知的条形码序列集可在后续加工中提供更大的鉴定保证，例如通过向给定分区提供更强的条形码地址或属性，作为来自给定分区的输出的重复或独立的确认。210.在向珠粒施加特定刺激时，寡核苷酸可从所述珠粒释放。在一些情况下，所述刺激可以是光刺激，例如通过释放寡核苷酸的光不稳定性连键的裂解。在其它情况下，可使用热刺激，其中珠粒环境的温度升高将导致连键的裂解或寡核苷酸从珠粒的其它释放。在仍然其它情况下，使用化学刺激，所述化学刺激裂解寡核苷酸与珠粒的连键，或以其它方式使得寡核苷酸从珠粒释放。在一种情况下，此类组合物包含上述用于包封细胞的聚丙烯酰胺基质，并且可通过暴露于还原剂如dtt而降解以释放附接的寡核苷酸。其它系统和方法的实例描述于美国专利申请公布号2014/0155295和美国专利申请公布号2014/0378345中，所述专利申请各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。211.根据本文所述的方法和系统，包含附接的寡核苷酸的珠粒可与单独细胞共分配，以使得单个珠粒和单细胞包含在单独分区内。当单细胞/单个珠粒占用是一种可能的状态时，应了解，可能经常存在多重占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)，或未占用分区(就细胞、珠粒或两者来说)。图2中示意性地示出用于共分配细胞和包含条形码寡核苷酸的珠粒的微流体通道结构的实例。如本文其它地方所描述，在一些方面，相当大百分比的全部被占用的分区可包括珠粒和细胞两者，并且在一些情况下，所产生的分区中的一些可未被占用。在一些情况下，所述分区中的一些可具有未1:1分配的珠粒和细胞。在一些情况下，可提供多重占用分区，例如，在单一分区内含有两个、三个、四个或更多个细胞和/或珠粒。如所示，通道区段202、204、206、208和210在通道接点212处流体连通地设置。使包含单独细胞214的水性流通过通道区段202流向通道接点212。如上所述，这些细胞可在分配过程之前悬浮在水性流体中，或者可能已经预先包封。212.同时，包含携带条形码的珠粒216的水性流通过通道区段204流向通道接点212。非水性分配流体216从每个侧通道206和208引入通道接点212中，并且合并的流流动到出口通道210中。在通道接点212内，将来自通道区段202和204的两种组合水性流合并在一起，并且分配至微滴218中，所述微滴包括共分配的细胞214和珠粒216。通过控制在通道接点212处合并的流体中的每一者的流动特征以及控制通道接点的几何结构，可优化分配以在所产生的分区218内实现合适的珠粒、细胞或两者的占用水平。213.在一些情况下，可将裂解剂(例如细胞裂解酶)与珠粒流一起引入分区中，例如流动通过通道区段204，以使得细胞可在分配时或分配之后裂解。在一些情况下，如本文后面所述，细胞膜保持完整，如以允许表征细胞表面标志物。另外的试剂也可添加至呈这种构型的分区，如用于使细胞的dna片段化的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增细胞的核酸片段并将条形码寡核苷酸附接至扩增的片段的dntp。可使用化学刺激(如dtt)来使条形码从它们各自的珠粒释放到分区中。在此类情况下，化学刺激可与通道区段202中的含细胞的流一起提供，以使得条形码的释放仅在两个流已经组合例如在分区218内之后发生。然而，在细胞被包封的情况下，引入常见的化学刺激，例如使寡核苷酸从其珠粒释放并且使细胞从其微胶囊释放的化学刺激通常可从通道接点212上游或连接至所述通道接点的单独的额外侧通道(未示出)提供。214.许多其它试剂可与细胞、珠粒、裂解剂和化学刺激共同分配，包括例如保护试剂如蛋白酶k、螯合剂、核酸延伸、复制、转录或扩增试剂如聚合酶、逆转录酶、可用于基于转座子的方法(如nextera)的转座酶、核苷三磷酸或ntp类似物、引物序列和另外的辅因子(如此类反应中使用的二价金属离子)、连接反应试剂(如连接酶和连接序列)、染料、标记或其它标记试剂。215.例如如本文所描述的通道网络可流体联接至适当的流体部件。例如，入口通道区段(例如通道区段202、204、206以及208)流体联接至它们要递送至通道接点212的适当的材料来源。例如，通道区段202可流体联接至待分析的细胞214的水性悬浮液的来源，而通道区段204可流体联接至珠粒216的水性悬浮液的来源。然后，通道区段206和208可流体连接至非水性流体的一个或多个来源。这些来源可包括从微流体装置的本体结构中所限定或与微流体装置的本体结构连接的简单储库到递送来自装置外来源、歧管的流体的流体导管等多种不同流体部件中的任一种。同样地，出口通道区段210可流体联接至所分配的细胞的接收容器或导管。再次，这可以是微流体装置的本体中所限定的储库，或其可以是用于将所分配的细胞递送至后续工艺操作、仪器或部件的流体导管。216.图8示出与含条形码寡核苷酸的珠粒一起共分配于油乳液中的水性微滴中的单独jurkat细胞的图像。如所示，单独细胞可容易地与单独珠粒共分配。如将理解的，可通过多种方法(包括通过将细胞群体的稀释液提供到微流体系统中)进行单独细胞负载的优化，以实现如本文其它地方所述的每个分区的合适的细胞负载。217.在操作中，一旦裂解，单独细胞的核酸内容物然后可用于在分区内进一步加工，包括例如片段化、扩增和条形编码以及其它功能序列的附接。片段化可通过剪切酶(如核酸内切酶)的共分配来完成，以便将核酸片段化成更小的片段。这些核酸内切酶可包括限制性核酸内切酶，包括ii型和ii型限制性核酸内切酶以及其它核酸裂解酶，如切口核酸内切酶等。在一些情况下，可不实施片段化，并且全长核酸可保留在分区内，或者在包封的细胞或细胞内容物的情况下，可在分配之前例如通过酶方法(例如本文所述的那些)，或通过机械方法(例如机械、声学或其它剪切)进行片段化。218.一旦共分配并且细胞裂解以释放其核酸，置于珠粒上的寡核苷酸就可用于条形编码和扩增那些核酸的片段。简言之，在一个方面，存在于与细胞共分配的珠粒上的寡核苷酸从其珠粒释放到具有细胞的核酸的分区中。寡核苷酸可连同条形码序列包括在其5'端的引物序列。此引物序列可以是意图随机引发细胞的核酸上的许多不同区域的随机寡核苷酸序列，或者它可以是靶向引发细胞的基因组的特定靶向区域的上游的特异性引物序列。219.一旦释放，寡核苷酸的引物部分可与细胞的核酸的互补区退火。也可与细胞和珠粒共分配的延伸反应试剂(例如dna聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 ))然后使用细胞的核酸作为模板延伸引物序列，以产生与引物退火的细胞核酸的链的互补片段，所述互补片段包含寡核苷酸及其相关的条形码序列。将多个引物退火和延伸至细胞核酸的不同部分将产生大量核酸的重叠互补片段，所述片段各自具有指示其所产生的分区的其自身的条形码序列。在一些情况下，这些互补片段本身可用作由分区中存在的寡核苷酸引发的模板，以产生补体的互补序列，其再次包含条形码序列。在一些情况下，配置这种复制过程，以使得当第一互补序列被复制时，它在其末端或其末端附近产生两个互补序列，以允许形成可降低分子为产生进一步迭代拷贝的基础的能力的发夹结构或部分发夹结构。如本文所述，细胞的核酸可包括细胞内的任何核酸，包括例如细胞的dna(例如基因组dna)、rna(例如信使rna)等。例如，在一些情况下，本文描述的方法和系统用于表征表达的mrna，包括例如这种mrna的存在和定量，并且可包括rna测序过程作为表征过程。或者或另外，与细胞一起分配的试剂可包括用于将mrna转化为cdna的试剂(例如逆转录酶和试剂)，以促进使用dna测序的测序过程。在一些情况下，其中待表征的核酸包含rna(例如mrna)，这一点的一个实例的示意图在图3中示出。220.如所示，包含条形码序列的寡核苷酸与样品核酸304一起共分配在例如乳液中的微滴302中。寡核苷酸308可提供在与样品核酸304共分配的珠粒306上，所述寡核苷酸可从珠粒306释放，如图a所示。除了一个或多个功能序列(例如序列310、314和316)外，寡核苷酸308还可包含条形码序列312。例如，寡核苷酸308被示出为包含条形码序列312，以及可用作给定测序系统的附接或固定序列的序列310，例如用于附接于illumina或系统的流动池中的p5序列。如所示，寡核苷酸还包含引物序列316，其可包含用于引发样品核酸304的部分的复制的随机或靶向n‑聚体。寡核苷酸308内还包含序列314，其可提供用于通过测序系统中的合成反应引发聚合酶介导的模板指导的测序的测序引发区，如“读段1”或r1引发区。如将理解的，可选择功能序列以与各种不同的测序系统，例如454测序、iontorrentproton或pgm、illuminax10等以及其要求兼容。在一些情况下，条形码序列312、固定序列310和r1序列314可为附接至给定珠粒的所有寡核苷酸共有。引物序列316对于随机n‑聚体引物可变化，或者对于某些靶向应用可为给定珠粒上的寡核苷酸共有。此外，在一些情况下，可如美国专利公布号20160257984中所描述产生带条形码寡核苷酸，所述专利以引用的方式整体并入本文。221.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含使其不能被聚合酶延伸的修饰。当结合至样品中的核酸用于引物延伸反应时，寡核苷酸可充当模板，而不是引物。当寡核苷酸还包含条形码(例如，寡核苷酸是报告寡核苷酸)时，这种设计可通过增加寡核苷酸与未条形编码的样品核酸之间的亲和力来增加分子条形编码的效率，并消除衔接子伪影的潜在形成。在一些情况下，寡核苷酸可包含随机n‑聚体序列，其用使其不能被聚合酶延伸的修饰加帽。在一些情况下，可设计随机n‑聚体序列的组成以最大化与游离未条形编码的ssdna分子的结合效率。所述设计可包括具有较高gc含量的随机序列组成、在特定位置具有固定g或c的部分随机序列、鸟苷的使用、锁核酸的使用或其任何组合。222.用于通过聚合酶阻断引物延伸的修饰可以是不同长度的碳间隔基团或双脱氧核苷酸。在一些情况下，所述修饰可以是具有脱嘌呤或脱嘧啶结构的无碱基位点、碱基类似物或磷酸主链的类似物，如通过酰胺键连接的n‑(2‑氨基乙基)‑甘氨酸的主链、四氢呋喃或1’,2’‑双脱氧核糖。所述修饰还可以是尿嘧啶碱基、2'ome修饰的rna、c3‑18间隔区(例如，具有3‑18个连续碳原子的结构，如c3间隔区)、乙二醇多聚体间隔区(例如，间隔区18(六乙二醇间隔区)、生物素、二脱氧核苷酸三磷酸、乙二醇、胺或磷酸酯。223.图21示出具有这种修饰的寡核苷酸。双链寡核苷酸2110包含在其3'端具有随机n‑聚体序列的单链dna(ssdna)退火区。来自样品的未条形编码的ssdna2120结合至寡核苷酸2110。寡核苷酸2110的随机n‑聚体序列在3'端上具有修饰(显示为“x”)。当寡核苷酸2110和未条形编码的ssdna2120在引物延伸反应中彼此结合时，可使用寡核苷酸3310作为模板延伸仅未条形编码的ssdna2120。224.在一些情况下，具有随机n‑聚体序列的寡核苷酸可经由u‑切除元件(例如具有尿嘧啶的ssdna序列)与固体载体(例如珠粒)偶联。图22示出这种寡核苷酸的实例。双链寡核苷酸2210包含ssdna退火区，所述ssdna退火区在其3'端含有随机n‑聚体序列。寡核苷酸2210经由具有尿嘧啶的ssdna2211偶联至珠粒。寡核苷酸2210还包含防止通过聚合酶延伸的修饰。寡核苷酸2210可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(以除去尿嘧啶)和核酸内切酶(以诱导ssdna断裂)从珠粒释放，从而产生释放的寡核苷酸2230。寡核苷酸2220包含ssdna引发区，其具有与寡核苷酸2210类似的设计。在一些情况下，ssdna退火区与ssdna引发区之间的差异分别是存在或不存在封闭基团(例如，“x”)。未封闭的ssdna可延伸并充当引物，而封闭的ssdna可充当被动退火序列。225.如将理解的，在一些情况下，功能序列可包括可用于rna‑seq应用的引物序列。例如，在一些情况下，所述寡核苷酸可包含用于引发rna‑seq的rna逆转录的聚‑t引物。在其它情况下，除了常见的条形码序列之外，给定分区中的寡核苷酸(例如包含在单独珠粒上)可包含多种类型的引物序列，如dna测序和rna测序引物，例如包含在与珠粒偶联的寡核苷酸内的聚‑t引物序列。在此类情况下，单个分配的细胞可进行dna和rna测序过程两者。226.标记剂或锚定剂上的引物(例如，用于rna‑seq应用的引物)可以是靶特异性引物。靶特异性引物可结合至rna分子或dna分子(例如来自rna的互补dna(cdna)或来自细胞的内源性dna)中的特定序列。例如，所述特定序列可以是不在rna分子的聚‑a尾或其cdna中的序列。在一些情况下，靶特异性引物可结合至rna分子，如mrna分子或非编码rna分子，例如rrna、trna、mrna或mirna分子。在一些情况下，靶特异性引物可结合至引入细胞的rna分子。在一些情况下，引入细胞的rna分子可以是用于基因编辑方法中的rna分子(例如，成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)rna(crrna)或用于crispr基因编辑的引导rna)。例如，靶特异性引物可结合至crrna以用于鉴定引入细胞的crrna和/或确定crrna对细胞的转录组的影响。在一些情况下，靶特异性引物可用于确定疾病(例如癌症)相关基因的拷贝数，同时分析转录组的其余部分。在其它情况下，靶特异性引物可用于分析来自感染细胞的病原体的rna分子，例如用于区分病原体感染的细胞和非病原体感染的细胞和/或确定病原体如何改变细胞转录组。在一些情况下，靶特异性引物可结合至dna分子，例如来自细胞的内源性dna分子，或合成dna分子。例如，靶特异性引物可结合至条形码，例如细胞的条形码(例如，细胞内或细胞表面上)、蛋白质的条形码(例如，抗体条形码)或核酸的条形码(例如，crispr条形码)。227.靶特异性引物可与一种或多种条形码、一种或多种umi、mrna的一种或多种聚‑t引物和/或用于相同不同寡核苷酸中的总rna的一种或多种随机n‑聚体引物(随机物)组合。在一些情况下，例如，如图23a所示，本文公开的珠粒可包含具有靶特异性引物的寡核苷酸和具有聚‑t引物的一种或多种寡核苷酸。在一些情况下，例如，如图23b所示，珠粒可具有多种寡核苷酸，所述寡核苷酸各自包含靶特异性引物。在一些情况下，例如，如图23c所示，珠粒可具有多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含聚‑t引物)。在一些情况下，例如，如图24所示，珠粒可具有多种寡核苷酸(其各自包含靶特异性引物)和多种寡核苷酸(其各自包含用于总rna的随机n‑聚体引物)。228.在珠粒上，可调整具有靶特异性引物的寡核苷酸与具有非特异性(聚‑t或随机n‑聚体)引物的寡核苷酸的比例以匹配特定应用的需要。在一些情况下，珠粒上的至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的寡核苷酸可包含靶特异性引物。在一些情况下，珠粒上的至少0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的寡核苷酸可包含非特异性(聚‑t或随机n‑聚体)引物。寡核苷酸可通过在珠粒上附接(例如，通过连接)一个或多个寡核苷酸主链且然后将一个或多个引物序列附接(例如，通过连接)至主链来制备。229.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可以是夹板寡核苷酸。夹板寡核苷酸可包含两种或更多种不同的引物。所述引物可具有不同的功能。例如，夹板寡核苷酸可包含以下中的两种或更多种：聚‑t引物、随机n‑聚体引物和靶特异性引物。230.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含能够结合或连接至测定引物的衔接子。衔接子可允许锚定剂或标记剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定中。测定引物可包含引发区和能够结合或连接至衔接子的序列。在一些情况下，所述衔接子可以是非特异性引物(例如，5'突出端)，并且测定引物可包含可连接至5'突出端的3'突出端。测定引物上的引发区可以是本文所述的任何引物，例如聚‑t引物、随机n‑聚体引物、靶特异性引物或标记剂捕获序列。图25a示出示例性衔接子和测定引物。寡核苷酸2510包含衔接子2511，其是包含10个核苷酸的5'突出端。衔接子2511可连接至测定引物，所述测定引物各自包含与衔接子2511的5'突出端互补的包含10个核苷酸的3'突出端。锚寡核苷酸可通过附接至为所述测定设计的测定引物而用于任何测定中。图26b示出示例性衔接子和测定引物，所述衔接子和测定引物允许锚定剂或标记剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定中。带条形码的衔接子寡核苷酸2561附接至珠子2560如凝胶珠粒，并且包含聚(dt)序列2562。图26c示出示例性夹板寡核苷酸，其包含促进与带条形码的衔接子寡核苷酸2561偶联的聚‑a序列和促进与测定引物偶联的第二序列(显示为“xxx”、“yyy”和“zzz”)。测定引物包含与夹板寡核苷酸第二序列互补的序列(显示为“x'x'x'”、“y'y'y'”和“z'z'z'”)和确定测定引物功能性的测定特异性序列(例如，如本文所述的聚‑t引物、随机n‑聚体引物、靶特异性引物或标记剂捕获序列)。231.在一些情况下，带条形码的衔接子包含例如具有3'端3rg的转换寡核苷酸。图26示出珠粒(如凝胶珠粒)，其包含能够进行模板转换(例如，逆转录酶模板转换)、但对任何特定测定不具有特异性的用3rg序列官能化的带条形码衔接子寡核苷酸。添加至反应的测定引物通过结合质靶向分子确定特定测定，并通过逆转录酶/聚合酶延伸，随后模板转换到带条形码的衔接子寡核苷酸上以并入条形码和其它功能序列。引发区确定所述测定，并且在一些实施方案中，包含用于mrna分析的聚‑t序列、用于gdna分析的随机引物或可结合与标记剂(例如，抗体)偶联的核酸分子或可经由靶向引发序列在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列。232.基于引物序列316的存在，寡核苷酸可引发样品核酸，如图b所示，其允许使用也与珠粒306和样品核酸304共分配的聚合酶和其它延伸试剂延伸寡核苷酸308和308a。如图c所示，对于随机n‑聚体引物在可与样品核酸304的多个不同区域退火的寡核苷酸延伸之后；产生核酸的多个重叠互补序列或片段，例如片段318和320。尽管包含与样品核酸的部分互补的序列部分，例如序列322和324，但这些构建体在本文中通常称为包含样品核酸304的片段，其具有附接的条形码序列。233.如图d所示，然后可例如通过序列分析对带条形码的核酸片段进行表征，或者可在所述过程中进一步扩增它们。例如，也从珠粒306释放的另外的寡核苷酸(例如寡核苷酸308b)可引发片段318和320。这对于片段318示出。特别地，再次，基于寡核苷酸308b中的随机n‑聚体引物316b(其在一些情况下可与给定分区中的其它随机n‑聚体，例如引物序列316不同)的存在，寡核苷酸与片段318退火并且延伸以产生片段318的至少一部分的互补序列326，所述片段318包含序列328，其包含样品核酸序列的一部分的重复。继续延伸寡核苷酸308b，直至其通过片段318的寡核苷酸部分308复制。如图d所示，寡核苷酸可被配置成例如在通过片段318内包含的寡核苷酸308的序列316和314复制之后在给定点通过聚合酶促使复制的终止。如本文所述，这可通过包括例如并入不能被所用聚合酶加工的不同核苷酸和/或核苷酸类似物在内的不同的方法实现。例如，这可包括在序列区312内包含含尿嘧啶的核苷酸，以防止非尿嘧啶耐受性聚合酶停止所述区域的复制。结果，产生片段326，其在一端包含全长寡核苷酸308b，包括条形码序列312、附接序列310、r1引物区314和随机n‑聚体序列316b。在所述序列的另一端可包括第一寡核苷酸308的随机n‑聚体的互补序列316'，以及r1序列的全部或一部分的互补序列，如序列314'所示。r1序列314及其互补序列314'然后能够一起杂交以形成部分发夹结构328。如将理解的，因为随机n‑聚体在不同寡核苷酸之间不同，这些序列及其互补序列可能不预期参与发夹形成，例如序列316'(其是随机n‑聚体316的互补序列)可能不预期与随机n‑聚体序列316b互补。对于其它应用，例如靶向引物，情况可能并非如此，其中n‑聚体可能在给定分区内的寡核苷酸中是共有的。234.通过形成这些部分发夹结构，它允许从进一步复制中除去样品序列的第一级重复，例如防止拷贝的迭代复制。部分发夹结构还为随后加工所产生的片段(例如片段326)提供有用的结构。235.通常，进行细胞核酸的扩增，直到分区内的带条形码的重叠片段构成细胞基因组的特定部分或全部至少1x覆盖，所述基因组或其相关目标部分的至少2x、至少3x、至少4x、至少5x、至少10x、至少20x、至少40x或更多覆盖。一旦产生带条形码片段，它们就可在适当的测序系统(例如illumina或x10系统)上直接测序，或者它们可进行另外的加工，如进一步扩增、附接用于反向读数的其它功能序列(例如第二测序引物)、样品索引序列等。236.然后可汇集来自多个不同分区的所有片段以在如本文所述的高通量测序仪上进行测序，其中汇集的片段包含源自不同细胞或细胞小群体的核酸的大量片段，但其中来自给定细胞的核酸将共享相同的条形码序列。特别地，因为每个片段关于其原始分区编码，并且因此编码其单细胞或细胞小群体，所以所述片段的序列可基于条形码的存在归属回至所述细胞或那些细胞，其还将有助于将来自多个分区的各种序列片段应用于不同细胞的单独基因组的组装。这在图4中示意性地示出。如一个实例中所示，来自第一细胞400的第一核酸404和来自第二细胞402的第二核酸406各自与它们自身的多组条形码寡核苷酸一起分配，如上所述。核酸可包含染色体、整个基因组或来自细胞的其它大核酸。237.在每个分区内，然后加工每个细胞的核酸404和406以分别提供一个或多个第一片段的第二片段的重叠集，例如第二片段集408和410。这种加工还为第二片段提供条形码序列，所述条形码序列对于源自特定第一片段的每个第二片段是相同的。如所示，第二片段集408的条形码序列由“1”表示，而片段集410的条形码序列由“2”表示。可使用条形码的多样文库来差异地条形编码化大量不同的片段集。然而，不必将来自不同第一片段的每个第二片段集用不同的条形码序列进行条形编码。在一些情况下，可同时加工多个不同的第一片段以包含相同的条形码序列。本文其它地方详细描述了不同的条形码文库。238.然后可汇集例如来自片段集408和410的带条形码片段以用于使用例如可通过从illumina或thermo‑fisher,inc的iontorrent分部获得的合成技术的序列进行测序。一旦测序，序列读数412可归属于它们各自的片段集，例如，如聚集的读数414和416所示，至少部分地基于所包含的条形码，并且在一些情况下，部分地基于片段本身的序列。然后组装每个片段集的归属序列读数以提供每个细胞核酸的组装序列，例如序列418和420，其进而可归属于单独细胞，例如细胞400和402。239.虽然在分析细胞内存在的遗传物质方面进行了描述，但本文所述的方法和系统可具有更广泛的适用性，包括通过允许将试剂和/或剂分配至单独细胞并响应于那些试剂和/或剂提供那些细胞的归因分析或表征来表征单独细胞或细胞群体的其它方面的能力。这些方法和系统在能够表征细胞以例如用于研究、诊断或病原体鉴定方面可能是有价值的。举例来说，广泛范围的不同细胞表面特征(例如细胞表面蛋白如分化簇或cd蛋白质)在如癌症的疾病的表征中具有显著诊断相关性。240.在一个特别有用的应用中，本文描述的方法和系统可用于表征细胞特征，如细胞表面特征。细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘附连接。特别地，本文所述的方法可用于将一种或多种标记剂附接至这些细胞特征，所述细胞特征当如上所述分配时可例如使用dna测序技术进行条形编码并分析，以确定单独细胞或细胞群体的此类细胞特征的存在并且在一些情况下相对丰度或量。241.在特定实例中，可提供与第一组核酸报告分子相关的潜在细胞表面特征标记剂的文库，例如，其中不同的报告寡核苷酸序列与特定标记剂相关，并且因此能够结合至特定细胞表面特征。细胞表面特征标记剂可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架。在一些方面，所述文库的不同成员可通过不同的寡核苷酸序列标记的存在来表征，例如，针对第一类型的细胞表面蛋白或受体的抗体可具有与其缔合的第一已知的报告寡核苷酸序列，而针对第二受体蛋白的抗体可具有与其缔合的不同的已知报告寡核苷酸序列。在共分配之前，可将细胞与标记剂文库一起孵育，所述标记剂文库可代表针对广泛的不同细胞表面特征(例如受体，蛋白质等)的抗体，并且包含它们相关的报告寡核苷酸。可从细胞洗去未结合的标记剂，并且然后可将细胞与上述条形码寡核苷酸一起共分配。结果，分区可包含一种或多种细胞，以及结合的标记剂和它们已知的相关报告寡核苷酸。242.不需要裂解分区内的细胞，然后可使报告寡核苷酸进行上述用于细胞核酸的条形编码操作，以产生带条形码的报告寡核苷酸，其中报告寡核苷酸的存在可指示特定细胞表面特征的存在，并且条形码序列将允许基于与给定单独细胞或细胞群体共分配的条形码序列将不同细胞表面特征的范围归属于所述细胞或细胞群体。结果，可在更广泛的细胞群体内产生细胞表面特征的逐细胞概况。下文更详细地描述本文所述述的方法和系统的这个方面。243.此实例在图5中示意性地示出。如所示，将由细胞502和504代表的细胞群体与细胞表面相关标记剂(例如抗体、抗体片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架等)文库，其中每种不同类型的结合基团包含与其缔合的相关核酸报告分子，显示为标记剂和相关的报告寡核苷酸506、508、510和512(其中报告寡核苷酸由不同阴影的圆圈表示)。当细胞表达由标记剂文库结合的表面特征时，标记剂及其相关的报告寡核苷酸可变得与细胞表面特征缔合或偶联。然后可如本文所述将单独细胞与它们的相关标记剂/报告寡核苷酸一起分别分配到单独的分区，例如，微滴514和516，以及如本文其它地方所述含有单独条形码寡核苷酸(例如，锚寡核苷酸)的珠粒(例如珠粒518和520)中。与本文所述的其它实例一样，带条形码寡核苷酸可从珠粒释放并用于将条形码序列与具有条形码的每个分区内存在的报告寡核苷酸附接，所述条形码是给定分区共有的，但在不同的分区之间广泛变化。例如，如图5所示，与分区514中的细胞502缔合的报告寡核苷酸用条形码序列522条形编码，而与分区516中的细胞504缔合的报告寡核苷酸用条形码序列524条形编码。结果，一者提供有反映细胞的表面特征的寡核苷酸文库，如报告分子所反映的，但由于共同的条形码序列基本上可归属于单独细胞，从而允许细胞的表面特征的单细胞水平剖析。如将理解的，这种方法不限于细胞表面受体，而是可用于鉴定多种特定细胞结构、化学或其它特征的存在。244.本文描述的单细胞加工和分析方法以及系统可用于多种应用，包括特定单独细胞的分析、不同细胞类型的群体内的不同细胞类型的分析、用于环境、人类健康、流行病学法医学或任何多种不同应用的大细胞群体的分析和表征。245.本文所述的单细胞分析方法的特别有价值的应用是在患病细胞的测序和表征中。患病细胞可具有改变的代谢性质、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的实例包括炎性病症、代谢病症、神经系统病症和癌症。246.特别感兴趣的是癌细胞。特别地，传统的分析技术(包括上文提到的整体测序方法)在挑选癌细胞的基因组构成的小变异方面不是很擅长，特别是其中那些存在于大量正常组织细胞中。此外，即使在肿瘤细胞之间，也可存在广泛变异并且可通过测序的整体方法掩蔽(参见，例如，patel等人,single‑cellrna‑seqhighlightsintratumoralheterogeneityinprimaryglioblastoma,sciencedoi:10.1126/science.1254257(2014年6月12日在线公开)。癌细胞可源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或作为循环肿瘤细胞获得，并进行上述分配过程。通过分析，可将单独细胞序列鉴定为源自单细胞或细胞小群组，并区分那些与正常组织细胞序列。247.癌细胞的非限制性实例包括诸如以下的癌症的细胞：棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性成髓细胞白血病伴成熟、急性髓系树突状细胞白血病、急性髓系白血病、急性前髓细胞性白血病、成釉细胞瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺样瘤、肾上腺皮质癌、成人t细胞性白血病、侵袭性nk细胞白血病、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、间变性甲状腺癌、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、b细胞白血病、b细胞淋巴瘤、bellini导管癌、胆道癌、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发部位不明的癌症、类癌瘤、瘤、原位癌、阴茎癌、原发部位不明癌、癌肉瘤、卡斯特莱曼病、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、慢性中性粒细胞性白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、德戈斯病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促纤维增生性小圆细胞瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、胚胎性癌、内胚层窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、内膜样瘤、与肠病相关的t细胞淋巴瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤文氏家族肿瘤、尤文氏家族肉瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节神经胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤、胚组织瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠性滋养层细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、大脑神经胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺胚细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞性白血病、毛细胞性白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、成血管细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾t细胞淋巴瘤、遗传性乳腺‑卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒‑单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、肝门胆管癌、库肯勃瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇及口腔癌、脂肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴系白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性横纹肌样瘤、恶性蝾螈瘤、malt淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵膈生殖细胞瘤、纵膈肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、麦克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、转移性膀胱上皮癌、苗勒氏混合瘤、单核细胞白血病、口腔癌、粘液性瘤、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓系白血病、髓系肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、赘生瘤、神经细胞瘤、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、乳房佩吉特病、肺上沟瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、神经节细胞瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周围上皮样细胞瘤、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前驱t‑淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假性粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上的nut基因的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、里希特转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、雪旺氏细胞瘤、皮脂腺癌、继发性瘤、精原细胞瘤、浆液瘤、塞‑莱二氏细胞瘤、性索‑间质肿瘤、塞泽里综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、蓝色小圆形细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表扩展性黑素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮‑间质瘤、滑膜肉瘤、t细胞急性成淋巴细胞性白血病、t细胞大颗粒淋巴细胞白血病、t细胞白血病、t细胞淋巴瘤、t细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、末期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、凡‑莫二氏综合征、疣状癌、视路胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、沃辛瘤、维尔姆斯肿瘤以及其组合。248.在待分析癌细胞的情况下，可用于附接条形码序列和/或扩增反应的任何各种操作中的引物序列可包含靶向与癌症相关或疑似与癌症相关的基因或基因区域的基因特异性序列。例如，这可包括基因或基因区域，其中与癌性病状相关的突变(例如，插入、缺失、多态性、拷贝数变化和基因融合)的存在疑似存在于细胞群体中。249.与癌细胞分析一样，通过分析胎儿细胞来分析和诊断胎儿健康或异常是使用常规技术的困难任务。特别地，在不存在相对侵入性程序的情况下，如获得胎儿细胞样品的羊膜穿刺术可采用从母体循环收获那些细胞。如将理解的，此类循环胎儿细胞构成所述循环的总体细胞群体的极小部分。结果，进行复杂分析以表征所获得的数据可能来源于胎儿细胞而不是母体细胞。然而，通过采用本文所述的单细胞表征方法和系统，可将遗传构成归属于单独细胞，并基于它们各自的遗传构成将那些细胞分类为母体或胎儿。此外，胎儿细胞的遗传序列可用于鉴定许多遗传病症中的任一种，包括例如非整倍性如唐氏综合症、爱德华兹综合征和帕陶综合征(patausyndrome)。此外，胎儿细胞的细胞表面特征可用于鉴定许多病症或疾病中的任一种。250.同样感兴趣的是免疫细胞。本文公开的方法、组合物和系统可用于免疫组库的序列分析，包括基因组学、蛋白质组学和细胞表面特征。对免疫组库的潜在信息的分析可在理解免疫系统的状态和功能方面提供显著改进。251.可使用本文描述的方法分析的免疫细胞的非限制性实例包括b细胞、t细胞(例如，细胞毒性t细胞、天然杀伤t细胞、调控性t细胞和t辅助细胞)、天然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞；骨髓细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突细胞。在一些实施方案中，使用本文公开的方法分析单独t细胞。在一些实施方案中，使用本文公开的方法分析单独b细胞。252.免疫细胞表达与免疫功能相关的各种适应性免疫受体，如t细胞受体和b细胞受体。t细胞受体和b细胞受体通过特异性地识别和结合至抗原并帮助其破坏而在免疫应答中起作用。253.t细胞受体或tcr是在t细胞表面上发现的分子，其通常负责识别作为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽的抗原片段。tcr通常是两条链的异二聚体，所述链各自是免疫球蛋白超家族的成员，具有n‑末端可变(v)结构域和c末端恒定结构域。在人中，在95％的t细胞中，tcr由α(α)和β(β)链组成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链组成。此比例可在个体发生和患病状态以及不同物种中变化。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)接合时，通过信号转导活化t淋巴细胞。254.tcr的两条链各自含有基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段、多样性‘d’基因区段和连接‘j’基因区段。tcrα链通过v和j区段的重组产生，而β链通过v、d和j区段的重组产生。类似地，tcrγ链的产生涉及v和j基因区段的重组，而tcrδ链的产生通过v、d和j基因区段的重组发生。这些特定区域(对于α或γ链为v和j，或对于β或δ链为v、d和j)的交叉对应于对抗原‑mhc识别重要的cdr3区。互补决定区(例如，cdr1、cdr2和cdr3)或高变区是抗原受体(例如，t细胞受体和免疫球蛋白)的可变结构域中可补充抗原的序列。在cdr3中发现大多数多样性cdr，其中多样性由t淋巴细胞发育期间的体细胞重组事件产生。在基因排列过程中出现的独特核苷酸序列可称为克隆型。255.b细胞受体或bcr是在b细胞表面上发现的分子。bcr的抗原结合部分由膜结合抗体组成，所述膜结合抗体与大多数抗体(例如免疫球蛋白)一样具有独特且随机确定的抗原结合位点。bcr的抗原结合部分包括一种同种型的膜结合的免疫球蛋白分子(例如，igd、igm、iga、igg或ige)。当b细胞通过其与同源抗原首次相遇活化时，所述细胞增殖并分化以产生分泌抗体的血浆b细胞和记忆b细胞群体。各种免疫球蛋白同种型的生物学特征、结构、靶特异性和分布不同。存在多种分子机制以产生初始多样性，包括多个位点处的遗传重组。256.bcr由编码抗体重链和轻链的两种基因igh和igk(或igl)组成。免疫球蛋白通过基因区段之间的重组、这些区段的接点处的序列多样化以及整个基因的点突变形成。每个重链基因含有三个不同基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段、多样性‘d’基因区段和连接‘j’基因区段。每个轻链基因含有蛋白质的可变区的两个不同基因区段的多个拷贝‑可变‘v’基因区段和连接‘j’基因区段。重组可产生具有v、d和j区段中的每一个之一的分子。此外，可缺失若干碱基，并且在两个接点中的每一个处添加其它碱基(称为n和p核苷酸)，从而产生进一步多样性。在b细胞活化后，发生通过体细胞超突变的亲和力成熟过程。在此过程中，活化的b细胞的子代细胞在整个基因中累积不同的体细胞突变，在cdr区中具有更高的突变浓度，从而导致产生对抗原具有更高亲和力的抗体。除了体细胞超突变之外，活化的b细胞经历同种型转换过程。具有相同可变区段的抗体可具有不同的形式(同种型)，这取决于恒定区段。尽管所有初始b细胞表达igm(或igd)，但活化的b细胞主要表达igg，但也表达igm、iga和ige。从igm(和/或igd)转换为igg、iga或ige的这种表达通过重组事件发生，从而引起一个细胞专门产生特定同种型。在基因排列过程中出现的独特核苷酸序列可类似地称为克隆型。257.在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析来自免疫细胞的各种tcr和bcr序列，例如各种克隆型。在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析tcrα链、tcrβ链、tcrδ链、tcrγ链或其任何片段(例如，包括vdj或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合以及其片段的组合)的序列。在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物和系统用于分析b细胞受体重链、b细胞受体轻链或其任何片段(例如，包括vdj或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合以及其片段的组合)的序列。258.在待分析免疫细胞的情况下，可用于附接条形码序列和/或扩增反应的任何各种操作中的引物序列可包含靶向免疫细胞蛋白(例如免疫受体)的基因或基因区域的基因特异性序列。此类基因序列包括但不限于以下各项的序列：各种t细胞受体α可变基因(trav基因)、t细胞受体α连接基因(traj基因)、t细胞受体α恒定基因(trac基因)、t细胞受体β可变基因(trbv基因)、t细胞受体β多样性基因(trbd基因)、t细胞受体β连接基因(trbj基因)、t细胞受体β恒定基因(trbc基因)、t细胞受体γ可变基因(trgv基因)、t细胞受体γ连接基因(trgj基因)、t细胞受体γ恒定基因(trgc基因)、t细胞受体δ可变基因(trdv基因)、t细胞受体δ多样性基因(trdd基因)、t细胞受体δ连接基因(trdj基因)以及t细胞受体δ恒定基因(trdc基因)。259.mhc(包括全部或部分mhc‑肽)可用作与寡核苷酸偶联的标记剂，所述寡核苷酸包含鉴定其相关mhc(并且因此例如mhc的tcr结合配偶体)的条形码序列。在一些情况下，mhc用于分析t细胞(如tcr)的一种或多种细胞表面特征。在一些情况下，多个mhc在较大的复合物中缔合在一起，以经由多种配体结合协同作用改善mhc与tcr的结合亲和力。260.例如，如图56a中所示，mhc肽可单独与生物素缔合并结合至链霉抗生物素蛋白部分，以使得链霉抗生物素蛋白部分包含多个mhc部分。这些部分中的每一个都可结合至tcr，以使得链霉抗生物素蛋白经由多重mch/tcr结合相互作用结合至靶t细胞。这些多重相互作用协同作用并且能够显著提高结合亲和力。这种改善的亲和力可改善t细胞的标记并且还降低标记将从t细胞表面解离的可能性。261.如图56b所示并且继续此实施例，带条形码寡核苷酸5601可用链霉抗生物素蛋白5602修饰并与多个生物素化的mhc5606分子接触，以使得生物素化的mhc5606分子与链霉抗生物素蛋白缀合的带条形码寡核苷酸5601偶联。结果是带条形码mhc多聚体复合物5608。如图56b所示，寡核苷酸5601条形码序列5602可将mhc5604鉴定为其相关的标记，并且还包括用于与其它寡核苷酸杂交的序列(例如，包含‘间隔区ccc’的序列5603和包含‘间隔区pcr柄’的序列5605)。一种这样的其它寡核苷酸是寡核苷酸5611，其包含互补序列5615(例如，对应于ccc的rgrgrg)、条形码序列5613以及例如像如图56c中所示的umi5614。在一些情况下，寡核苷酸5611可首先与珠粒缔合并从珠粒释放。然而，在任何情况下，寡核苷酸5611可与mhc‑寡核苷酸复合物5608的寡核苷酸5601杂交。然后可在引物延伸反应中延伸杂交的寡核苷酸5611和5601，以使得产生包含对应于两个条形码序列5613和5604中的每一个的序列的构建体。在一些情况下，这些相应序列中的一个或两个可以是寡核苷酸5611或5601中的原始序列的互补序列。可任选地进一步加工所得构建体中的一种或两种(例如，以添加任何另外的序列和/或用于清除)并进行测序。如本文其它地方所述，源自条形码序列5613的这种构建体中的序列可用于鉴定分区或分区内的细胞，并且源自条形码序列5604的序列可用于鉴定细胞表面上的特定tcr，从而允许多测定分析。262.此外，尽管图56b和图56c中所示的实例显示链霉抗生物素蛋白直接与其寡核苷酸偶联，所述链霉抗生物素蛋白也可与杂交寡核苷酸偶联，所述杂交寡核苷酸然后与鉴定的带条形码寡核苷酸杂交，类似于图52b(图ii)中所示的示例性方案和本文其它地方描述的。263.从较大的不同细胞群体表征单独细胞的能力在环境测试以及法医学分析中也具有重要价值，其中样品可就其本质而言相对于正针对其测试样品的细胞由不同的细胞群体和其它“污染”样品的物质组成，例如在性侵犯和其它暴力犯罪等的法医学分析中用于例如环境和食品安全测试、受害者和/或犯罪者细胞的环境指示生物、有毒生物等。264.上述单细胞测序和表征方法的其它有用应用是在神经科学研究和诊断领域。特别地，神经细胞可包含长散布核元件(line)或可在基因组周围移动的‘跳跃’基因，其引起每个神经元与其相邻细胞不同。研究已经表明，人脑中line的数量超过其它组织(例如心脏和肝脏组织)，具有80与300个之间的独特插入(参见，例如，参见例如，coufal,n.g.等人nature460,1127–1131(2009))。这些差异被认为与个人对神经系统病症的易感性有关(参见例如，muotri,a.r.等人nature468,443–446(2010))，或者为大脑提供响应于挑战的多样性。因此，本文所述的方法可用于单独神经细胞的测序和表征。265.本文所述的单细胞分析方法也可用于分析基因表达，就rna转录物的鉴定和它们的定量而言。特别地，使用本文所述的单细胞水平分析方法，可分离和分析单独细胞、细胞群体或细胞群体子集中存在的rna转录物。特别地，在一些情况下，条形码寡核苷酸可被配置为引发、复制并因此从单独细胞产生rna的带条形码片段。例如，在一些情况下，条形码寡核苷酸可包含mrna特异性引发序列，例如允许在逆转录反应中引发和复制mrna的聚‑t引物区段或其它靶向引发序列。或者或另外，可使用条形码寡核苷酸的随机n‑聚体引物区段进行随机rna引发。266.图6提供使用本文所述的方法在单独细胞中用于rna表达分析的一种示例性方法的示意图。如所示，在操作602，针对活细胞分选含细胞的样品，将所述或细胞定量并稀释用于随后的分配。在操作604，单独细胞分别与带有如本文所述的条形编码寡核苷酸的凝胶珠粒共分配。在操作606，细胞被裂解并且带条形码寡核苷酸释放到分区中，其中它们在操作608例如借助于与mrna的聚‑a尾互补的聚‑t引物序列与mrna相互作用并与mrna杂交。使用聚‑t条形码寡核苷酸作为引发序列，在操作610进行逆转录反应以合成包含条形码序列的mrna的cdna。带条形码的cdna然后在操作612进行另外的扩增(例如使用pcr方法)，在操作614纯化，然后将它们置于核酸测序系统上以确定cdna序列及其相关的条形码序列。在一些情况下，如所示，操作602至608可在试剂保留在其原始微滴或分区中时发生，而操作612至616可在本体中发生(例如，在分区外)。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作612至616。在一些情况下，在乳液破乳后，可用核酸外切酶消化条形码寡核苷酸。在引物消化后，可通过乙二胺四乙酸(edta)抑制核酸外切酶活性。在一些情况下，操作610可基于逆转录混合物(例如逆转录酶和相关试剂)的共分配在分区内进行，或者它可在本体中进行。267.除寡核苷酸条形码序列外，条形码寡核苷酸的结构可包含许多序列元件。如上所述用于rna分析的条形码寡核苷酸的一个实例示于图7中。如所示，整个寡核苷酸702通过可释放的连键706(如二硫化物接头)与珠粒704偶联。寡核苷酸可包括用于后续加工的功能序列，如功能序列708，其可包括以下中的一种或多种：测序仪特异性流动细胞附接序列，例如用于illumina测序系统的p5序，以及测序引物序列，例如用于illumina测序系统的r1引物。条形码序列710包含在用于条形编码样品rna的结构内。mrna特异性引发序列，如聚‑t序列712也包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段714以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。此锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，这将确保聚‑t区段更可能在mrna的聚‑a尾的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段716。在一些情况下，这一另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，例如，作为跨与单个珠粒偶联的单独寡核苷酸变化的随机序列(例如，如随机n‑聚体序列)，而条形码序列710在栓系至单独珠粒的寡核苷酸中可以是恒定的。此独特序列用于提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以允许定量原始表达的rna的数量。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。这种独特分子标识符(umi)序列区段可包含寡核苷酸序列内的5至约8个或更多个核苷酸。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更长。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更长。在一些情况下，独特分子标识符(umi)序列区段的长度可以是至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸或更短。在一些情况下，寡核苷酸可包含靶特异性引物。靶特异性引物可结合至rna分子或源自其的dna分子中的特定序列。例如，特定序列可以是不在聚‑a尾中的序列。268.在操作中，并且参考图6和图7，细胞与带有条形码的珠粒共分配并裂解，同时带条形码寡核苷酸从所述珠粒释放。释放的条形码寡核苷酸的聚‑t部分然后与mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段然后引发mrna的逆转录以产生mrna的cdna，但其包含条形码寡核苷酸的序列区段708‑716中的每个。再次，因为寡核苷酸702包含锚定序列714，它将更可能与mrna的聚‑a尾的序列端杂交并在所述序列端处引发逆转录。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段710。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。转录物然后可扩增、净化并测序以鉴定mrna的cdna序列，以及对条形码区段和独特序列区段进行测序。269.虽然描述了聚‑t引物序列，但其它靶向或随机引发序列也可用于引发逆转录反应。同样地，尽管描述为将带条形码寡核苷酸与裂解的细胞的内容物一起释放到分区中，但是应当理解，在一些情况下，凝胶珠粒结合的寡核苷酸可用于杂交并捕获凝胶珠粒的固相上的mrna，以促进rna与其它细胞内容物的分离。270.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图9a中示出。如所示，整个寡核苷酸902可通过可释放的连键906(如二硫化物接头)与珠粒904偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列908，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如用于illumina测序系统的p5序列；以及功能序列910，其可包括测序引物序列，例如用于illumina测序系统的r1引物结合位点。条形码序列912包含在用于条形编码样品rna的结构内。rna特异性(例如，mrna特异性)引发序列，如聚‑t序列914也包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段(未示出)以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段916。这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，例如，作为跨与单个珠粒偶联的单独寡核苷酸变化的随机n‑聚体序列，而条形码序列912在栓系至单独珠粒的寡核苷酸中可以是恒定的。如本文其它地方所述，此独特序列可用于提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以允许定量原始表达的rna的数量，例如mrna计数。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。271.在细胞rna(例如，mrna)分析的示例性方法中并且参考图9a，将细胞与带有条形码的珠粒、转换寡核苷酸924和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作950中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，经由还原剂的作用)，并且释放的条形码寡核苷酸的聚‑t片段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作952中，使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。然后，转换寡核苷酸924可与添加至cdna的额外碱基杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段912。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列916，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。如本文其它地方所述，这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。在操作952之后，然后在操作954中用引物926(例如，pcr引物)扩增cdna922。接下来，然后在操作956中纯化扩增的产物(例如，经由固相可逆固定化(spri))。在操作958，然后剪切扩增的产物，将其连接至另外的功能序列并进一步扩增(例如，经由pcr)。功能序列可包括测序仪特异性流动细胞附接序列930，例如用于illumina测序系统的p7序列；以及功能序列928，其可包括测序引物结合位点，例如用于illumina测序系统的r2引物；以及功能序列932，其可包括样品索引，例如用于illumina测序系统的i7样品索引序列。在一些情况下，操作950和952可在分区中发生，而操作954、956和958可在本体溶液中(例如，在分区外的汇集混合物中)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作954、956和958。在一些情况下，可在分区中完成操作954。在一些情况下，在乳液破乳后，可用核酸外切酶消化条形码寡核苷酸。在引物消化后，可通过乙二胺四乙酸(edta)抑制核酸外切酶活性。尽管根据用于某些测序系统(例如illumina系统)的特定序列参考进行了描述，但应理解，对这些序列的提及仅出于说明目的，并且本文描述的方法可被配置用于与其它测序系统一起使用，所述其它测序系统并入在那些系统中使用的特异性引发、附接、索引和其它操作序列，例如可从iontorrent、oxfordnanopore、genia、pacificbiosciences、completegenomics等获得的系统。272.在如图9a所示用于rna(例如，细胞rna)分析的条形码寡核苷酸的替代实例中，功能序列908可以是p7序列，并且功能序列910可以是r2引物结合位点。此外，功能序列930可以是p5序列，功能序列928可以是r1引物结合位点，并且功能序列932可以是用于illumina测序系统的i5样品索引序列。由这种条形码寡核苷酸产生的构建体的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。273.图9b中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。转换寡核苷酸924可用另外的标签934(例如生物素)标记。在操作951中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。在操作953中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。接下来，可使用分离操作960来使cdna922与分区中的试剂和寡核苷酸分离。另外的标签934(例如生物素)可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。在操作960，可在操作955中扩增(例如，经由pcr)之前用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)分离cdna，然后在操作957中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作959中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，如所示，操作951和953可在分区中发生，而操作960、955、957和959可在本体溶液中(例如，在分区外的汇集混合物中)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作960。然后可在汇集转录物以用于加工后，在操作960之后执行操作955、957和959。274.图9c中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作961中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作963中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在操作961和操作963之后，在操作962中使mrna920和cdna922变性。在操作964，使第二链从具有另外的标签942(例如生物素)的引物940延伸，并与cdna922杂交。同样在操作964中，生物素标记的第二链可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。可在操作965中扩增(例如，经由聚合酶链式反应(pcr))之前用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)分离cdna，然后在操作967中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作969中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，操作961和963可在分区中发生，而操作962、964、965、967和969可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作962、964、965、967和969。275.图9d中示出用于rna分析(包括细胞mrna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将转换寡核苷酸924与单独细胞和带条形码珠粒以及诸如逆转录酶、还原剂和dntp的试剂一起共分配。在操作971中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸902(例如，如图9a中所示)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段914然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来，在操作973中，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段914，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸924然后可与cdna杂交并促进模板转换。然后可使用转换寡聚物924作为模板，经由cdna922的延伸将与转换寡核苷酸序列互补的序列并入到cdna922中。在操作966中，可使mrna920、cdna922和转换寡核苷酸924变性，并且cdna922可与用另外的标签946(例如生物素)标记的捕获寡核苷酸944杂交。在此操作中，与cdna杂交的生物素标记的捕获寡核苷酸944可与相互作用标签936(例如链霉抗生物素蛋白)(其可附接至磁珠938)接触。在使用下拉操作(例如，经由磁分离、离心)与其它物质(例如，过量带条形码寡核苷酸)分离后，可在操作975用引物926扩增(例如，经由pcr)cdna，然后在操作977中纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))，并且在操作979中进一步加工(剪切、序列928、932和930的连接以及随后扩增(例如，经由pcr))。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的其它情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，操作971和973可在分区中发生，而操作966、975、977(纯化)和979可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作966、975、977和979。276.图9e中示出用于rna分析(包括细胞rna分析)的另一种示例性方法。在这种方法中，将单独细胞与带有条形码的珠粒、转换寡核苷酸990和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作981中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，如图9a中所示的902)(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列908是p7序列，并且序列910是r2引物结合位点。在其它情况下，序列908是p5序列，并且序列910是r1引物结合位点。接下来，释放的条形码寡核苷酸的聚‑t区段然后与从细胞释放的mrna920的聚‑a尾杂交。接下来在操作983，然后在逆转录反应中延伸聚‑t区段，以产生与所述mrna互补的cdna922，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段908、912、910、916和914中的每一个。逆转录酶的末端转移酶活性可向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。转换寡核苷酸990然后可与cdna杂交并促进模板转换。与转换寡核苷酸序列互补并包含t7启动子序列的序列可并入cdna922中。在操作968，合成第二链，并且在操作970，t7启动子序列可由t7聚合酶用于在体外转录中产生rna转录物。在操作985，rna转录物可纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、逆转录以形成dna转录物，并且可针对每种dna转录物合成第二链。在一些情况下，在纯化之前，可使rna转录物与dna酶(例如，dna酶i)接触以分解残余dna。在操作987，然后将dna转录物片段化并连接至另外的功能序列，如序列928、932和930，并且在一些情况下进一步扩增(例如，经由pcr)。在序列908是p7序列且序列910是r2引物结合位点的一些情况下，序列930是p5序列且序列928是r1引物结合位点，并且序列932是i5样品索引序列。在序列908是p5序列且序列910是r1引物结合位点的一些情况下，序列930是p7序列且序列928是r2引物结合位点，并且序列932是i7样品索引序列。在一些情况下，在除去dna转录物的一部分之前，可使所述dna转录物与rna酶接触以分解残余rna。在一些情况下，操作981和983可在分区中发生，而操作968、970、985和987可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作968、970、985和987。277.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图10中示出。如所示，整个寡核苷酸1002通过可释放的连键1006(如二硫化物接头)与珠粒1004偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1008，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p7序列；以及功能序列1010，其可包括测序引物序列，例如r2引物结合位点。条形码序列1012包含在用于条形编码样品rna的结构内。rna特异性(例如，mrna特异性)引发序列，如聚‑t序列1014可包含在寡核苷酸结构中。可包含锚定序列区段(未示出)以确保聚‑t序列在mrna的序列端杂交。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1016。这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。可包括另外的功能序列1020以用于体外转录，例如t7rna聚合酶启动子序列。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。278.在细胞rna分析的示例性方法中并且参考图10，将细胞与带有条形码的珠粒和其它试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。在操作1050中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸1002(例如，经由还原剂的作用)，并且释放的条形码寡核苷酸的聚‑t片段1014然后与mrna1020的聚‑a尾杂交。接下来在操作1052，然后使用mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚‑t区段，以产生所述mrna的cdna1022，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段1020、1008、1012、1010、1016和1014中的每一个。在任何给定分区内，单独mrna分子的所有cdna将包含共同的条形码序列区段1012。然而，通过包含独特的随机n‑聚体序列，在给定分区内由不同mrna分子制备的转录物将在此独特序列处变化。如本文其它地方所述，这提供即使在给定分区的内容物的任何后续扩增之后也可鉴定的定量特征，例如，与共同条形码相关的独特区段的数量可指示源自单个分区并且因此单细胞的mrna的量。在操作1054，合成第二链，并且在操作1056，t7启动子序列可由t7聚合酶用于在体外转录中产生rna转录物。在操作1058，将转录物片段化(例如，剪切)，连接至另外的功能序列并逆转录。功能序列可包括测序仪特异性流动细胞附接序列1030，例如p5序列；以及功能序列1028，其可包括测序引物，例如r1引物结合序列；以及功能序列1032，其可包括样品索引，例如i5样本品索引序列。在操作1060，可将rna转录物逆转录为dna，扩增所述dna(例如，经由pcr)，并测序以鉴定mrna的cdna的序列，以及对条形码区段和独特序列区段进行测序。在一些情况下，操作1050和1052可在分区中发生，而操作1054、1056、1058和1060可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物以完成操作1054、1056、1058和1060。279.在如图10所示用于rna(例如，细胞rna)分析的条形码寡核苷酸的替代实例中，功能序列1008可以是p5序列，并且功能序列1010可以是r1引物结合位点。此外，功能序列1030可以是p7序列，功能序列1028可以是r2引物结合位点，并且功能序列1032可以是i7样品索引序列。280.用于rna分析(包括信使rna(mrna，包括从细胞获得的mrna)分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图11中示出。如所示，整个寡核苷酸1102通过可释放的连键1106(如二硫化物接头)与珠粒1104偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1108，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1110，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1108是p7序列，并且序列1110是r2引物结合位点。条形码序列1112包含在用于条形编码样品rna的结构内。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1116。在一些情况下，这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。可包括另外的序列1114以有助于模板转换，例如聚g。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。281.在细胞mrna分析的示例性方法中并参考图11，将细胞与微胶囊(例如，带有带条形码寡核苷酸的珠粒)、聚t序列和其它试剂(如dna聚合酶、逆转录酶、寡核苷酸引物、dntp和还原剂)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。所述分区可用作反应体积。如本文其它地方所述，用作反应体积的分区可包括容器或器皿，如孔、微孔、小瓶、管、纳米阵列基底中的贯通端口或具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微囊泡、乳液或微滴。在一些方面，这些分区可包括非水性连续相(例如油相)内的水性流体的微滴。在分区内，可裂解细胞，并且可从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂或其它刺激的作用)。细胞裂解和带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放可在分区(例如，乳液中的微滴)或反应体积中同时发生。在一些实施方案中，细胞裂解先于带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸从微胶囊的释放先于细胞裂解。282.在细胞裂解和带条形码寡核苷酸从微胶囊释放之后，可对反应体积进行扩增反应以产生扩增产物。在示例性扩增反应中，如操作1150所示，聚t序列与从细胞释放的mrna1120的聚a尾杂交。接下来，在操作1152中，然后使用所述mrna作为模板在逆转录反应中延伸聚t序列，以产生与所述mrna互补的cdna1122。逆转录酶的末端转移酶活性可以模板无关的方式向cdna添加额外的碱基(例如聚c)。然后，添加至cdna的额外碱基(例如聚c)可与带条形码寡核苷酸1114杂交。这可促进模板转换，并且可将与带条形码寡核苷酸互补的序列并入所述cdna中。在各种实施方案中，带条形码寡核苷酸不与模板多核苷酸杂交。283.带条形码寡核苷酸在从微胶囊释放后可以任何合适的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm或500μm的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以至少约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm、500μm或更高的浓度存在于反应体积中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以至多约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm或500μm的浓度存在于反应体积中。284.可进一步加工转录物(例如，扩增、除去部分、添加额外的序列等)，并如本文其它地方所述进行表征。在一些实施方案中，直接对转录物进行测序。在一些实施方案中，将转录物进一步加工(例如，除去部分、添加额外的序列等)且然后进行测序。在一些实施方案中，对反应体积进行第二扩增反应以产生另外的扩增产物。转录物或第一扩增产物可用作第二扩增反应的模板。在一些实施方案中，用于第二扩增反应的引物包含带条形码寡核苷酸和聚t序列。在一些实施方案中，用于第二扩增反应的引物包含与细胞共分配的另外的引物。在一些实施方案中，直接对这些另外的扩增产物进行测序。在一些实施方案中，将这些另外的扩增产物进一步加工(例如，除去部分、添加额外的序列等)且然后进行测序。通过这种方法产生的扩增产物(例如，第一扩增产物和第二扩增产物)的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。285.用于rna分析(包括细胞rna分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图12a中示出。如所示，整个寡核苷酸1202通过可释放的连键1206(如二硫化物接头)与珠粒1204偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1208，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1210，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1208是p7序列，并且序列1210是r2引物结合位点。条形码序列1212包含在用于条形编码样品rna的结构内。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1216。在一些情况下，这一另外序列可提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。在使用这种条形码的细胞rna分析的示例性方法中，将细胞与带有条形码的珠粒和其它试剂(如rna连接酶和还原剂)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)。然后可通过rna连接酶将带条形码寡核苷酸连接至mrna转录物的5'端，同时在分区中。随后的操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))和进一步加工(剪切、功能序列的连接和随后扩增(例如，经由pcr))，并且这些操作可在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。286.用于rna分析(包括细胞rna分析)的条形码寡核苷酸的另一个实例在图12b中示出。如所示，整个寡核苷酸1222通过可释放的连键1226(如二硫化物接头)与珠粒1224偶联。所述寡核苷酸可包含用于后续加工的功能序列，如功能序列1228，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1230，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。条形码序列1232包含在用于条形编码样品rna的结构内。引发序列1234(例如，随机引发序列)也可包含在寡核苷酸结构，例如随机六聚体中。可在寡核苷酸序列内提供另外的序列区段1236。在一些情况下，这一另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。如将理解的，尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码区段对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的，但是其中可变或独特序列区段将跨单独珠粒变化。在使用图12b的条形码寡核苷酸的细胞mrna分析的示例性方法中，将细胞与带有条形码的珠粒和另外试剂(如逆转录酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如乳液中的微滴)中。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。在其它情况下，序列1228是p5序列，并且序列1230是r1引物结合位点。随机六聚体的引发序列1234可随机杂交细胞mrna。然后可使用来自细胞的mrna作为模板在逆转录反应中延伸随机六聚体序列以产生与mrna互补的cdna，并且还包括条形码寡核苷酸的序列区段1228、1232、1230、1236和1234中的每一个。随后的操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、进一步加工(剪切、功能序列的连接和随后扩增(例如，经由pcr))，并且这些操作可在本体中(例如，在分区外部)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。可与带有条形码的珠粒一起共分配的另外试剂可包括用于阻断核糖体rna(rrna)的寡核苷酸和用于消化来自细胞的基因组dna和cdna的核酸酶。或者，可在另外的加工操作期间施加rrna去除剂。通过这种方法产生的构建体的构型可有助于在测序期间最小化(或避免)聚‑t序列的测序。287.本文描述的单细胞分析方法也可用于分析全转录组。返回参考图12b的条形码，引发序列1234可以是随机n‑聚体。在一些情况下，序列1228是p7序列，并且序列1230是r2引物结合位点。在其它情况下，序列1228是p5序列，并且序列1230是r1引物结合位点。在使用这种条形码进行全转录组分析的示例性方法中，将单独细胞与带有条形码的珠粒、聚‑t序列和其它试剂(如逆转录酶、聚合酶、还原剂和dntp)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。在这种方法的操作中，裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸(例如，经由还原剂的作用)，并且聚‑t序列与细胞mrna的聚‑a尾杂交。在使用mrna作为模板的逆转录反应中，可产生细胞mrna的cdna。然后可用rna酶降解rna。带条形码寡核苷酸中的引发序列1234然后可随机地与所述cdna杂交。寡核苷酸可使用聚合酶以及与类似于图3所示的珠粒和细胞共分配的其它延伸试剂延伸以产生扩增产物(例如，带条形码片段)，类似于图3(图f)中所示的示例性扩增产物。带条形码核酸片段可在一些情况下例如通过序列分析表征进行进一步加工(例如，扩增、添加额外序列、净化过程等，如本文其它地方所述)。在这种操作中，测序信号可来自全长rna。288.在示例性方法中，条形码序列可附加至模板多核苷酸序列(例如，mrna)的3'端。例如，如果待分析模板多核苷酸的3'端的序列，则这种构型可能是有用的。在一些实施方案中，条形码序列可附加至模板多核苷酸序列(例如mrna)的5'端。例如，如果待分析模板多核苷酸的5'端的序列，则这种构型可能是有用的。289.在另一方面，分区包含与具有与模板多核苷酸杂交的朝向3'端的序列的引物、具有朝向5'端的第一预定义序列的模板转换寡核苷酸和具有可释放地与其偶联的带条形码寡核苷酸的微胶囊(如珠粒)共分配的细胞。在一些实施方案中，与珠粒偶联的寡核苷酸包含相同的条形码序列(例如，所有寡核苷酸共有相同的条形码序列)。在一些方面，与珠粒偶联的寡核苷酸另外包含独特分子标识符(umi)序列区段(例如，具有不同独特分子标识符序列的所有寡核苷酸)。290.图18示出与珠粒偶联的带条形码寡核苷酸。如所示，整个寡核苷酸1802通过可释放的连键1806(如二硫化物接头)与珠粒1804偶联。所述寡核苷酸可包含适用于后续加工的功能序列，如功能序列1808，其可包括测序仪特异性流动细胞附接序列，例如p5序列；以及功能序列1810，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些情况下，序列1808是p7序列，并且序列1810是r2引物结合位点。条形码序列1812可包含在用于条形编码模板多核苷酸的结构内。可选择功能序列以与各种不同的测序系统，例如454测序、iontorrentproton或pgm、illuminax10等以及其要求兼容。在一些情况下，条形码序列1812、功能序列1808(例如，流动细胞附接序列)和1810(例如，测序引物序列)可为附接至给定珠粒的所有寡核苷酸共有。带条形码寡核苷酸还可包含序列1816以促进模板转换(例如，聚g序列)。在一些情况下，所述另外序列提供独特分子标识符(umi)序列区段，如本文其它地方所述。291.尽管显示为栓系至珠粒表面的单个寡核苷酸，但单独珠粒可包括数十至数十万或数百万个单独寡核苷酸分子(例如，至少约10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000或10,000,000个寡核苷酸分子)，其中条形码序列对于给定珠粒可以是恒定的或相对恒定的。292.在使用图18的条形码寡核苷酸的细胞多核苷酸分析的示例性方法中，将细胞与带有带条形码寡核苷酸的珠粒和另外试剂(如逆转录酶、引物、寡核苷酸(例如，模板转换寡核苷酸)、dntp和还原剂)一起共分配到分区(例如，乳液中的微滴)中。在分区内，可裂解细胞以产生多个模板多核苷酸(例如dna如基因组dna，rna如mrna等)。在一些情况下，使用与细胞共分配的裂解试剂裂解细胞。293.在珠粒为可降解或可破裂的珠粒的情况下，带条形码寡核苷酸可如前所述在施加刺激后从珠粒释放。在从珠粒释放后，带条形码寡核苷酸可以任何合适的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸以适于产生足够产量的扩增产物的浓度存在于分区中以用于下游加工和分析，包括但不限于测序衔接子附接和测序分析。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸的浓度受带有条形码的珠粒的负载能力或可由珠粒递送的寡核苷酸的量限制。294.可与细胞共分配的模板转换寡核苷酸、带有带条形码寡核苷酸的珠粒等可以任何合适的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸以适合于扩增反应期间的有效模板转换的浓度存在于分区中。模板转换寡核苷酸的浓度可取决于用于微滴产生的试剂。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在多个模板转换寡核苷酸之中。295.在一些实施方案中，带条形码化寡核苷酸和模板转换寡核苷酸以相似的浓度存在于分区中。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸和模板转换寡核苷酸可以反映待使用每种寡核苷酸产生的扩增产物的量的比例存在。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸以比带条形码寡核苷酸更高的浓度存在于分区中。这种浓度差异可能是由于带有条形码的珠粒的容量的限制。在一些实施方案中，当带条形码寡核苷酸在分区中自由(例如，未附接至珠粒)时，反应体积中模板转换寡核苷酸的浓度是相同反应体积中带条形码寡核苷酸的浓度的至少2、5、10、20、50、100或200倍。296.如图19所示，可对包含来自细胞1920的模板多核苷酸和(i)具有与模板多核苷酸(例如，聚t)杂交的朝向3'端的序列的引物1924和(ii)包含朝向5'端的第一预定义序列1810的模板转换寡核苷酸1926的反应混合物进行扩增反应以产生第一扩增产物。在一些情况下，模板多核苷酸是具有聚a尾的mrna，并且与模板多核苷酸杂交的引物包含朝向3'端的聚t序列，其与聚a区段互补。第一预定义序列可包含衔接子序列、条形码序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合中的至少一种。在一些情况下，第一预定义序列1810是可为多个分区的所有分区共有的序列。例如，所述第一预定义序列可包含流动细胞附接序列、扩增引物结合位点或测序引物结合位点，并且第一扩增反应促进预定义序列与来自细胞的模板多核苷酸的附接。在一些实施方案中，第一预定义序列包含引物结合位点。在一些实施方案中，第一预定义序列包含测序引物结合位点。如操作1950中所示，引物1924的朝向3'端的序列(例如，聚t)与模板多核苷酸1920杂交。在第一扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如逆转录酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用细胞的核酸作为模板延伸引物1924序列以产生转录物(例如cdna)1922，其具有与引物退火的细胞核酸的链互补的片段。在一些情况下，逆转录酶具有末端转移酶活性，并且逆转录酶以不依赖于模板的方式向cdna添加另外的核苷酸，例如聚c。如操作1952中所示，模板转换寡核苷酸1926(例如包含聚g序列的模板转换寡核苷酸)可与cdna1922杂交并促进第一扩增反应中的模板转换。转录物因此可包含引物1924的序列，与来自细胞的模板多核苷酸互补的序列，和与模板转换寡核苷酸互补的序列。297.在多个分区中，每个分区含有一个或多个细胞或不含细胞，引物和模板转换寡核苷酸可以是所有分区通用的。在进行mrna的分析的情况下，例如，引物可包含能够杂交并引发来自mrna的聚a区段的延伸反应的至少一个聚t区段。在进行多种多核苷酸的分析的情况下，引物可包含能够杂交至各种多核苷酸模板并在各种多核苷酸模板上随机引发延伸反应的随机序列。由于使用具有末端转移酶活性的酶可发生模板转换，所以具有能够与所附加的碱基杂交的序列的模板转换寡核苷酸可以与待分析的多核苷酸模板的序列无关的方式用于模板转换。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸可包含朝向5'端的第一预定义序列，所述第一预定义序列不与模板特异性杂交。在一些实施方案中，进行特定基因的分析。在此类情况下，引物可包含能够与包含特定基因的模板杂交并引发来自包含特定基因的模板的延伸反应的基因特异性序列。在一些实施方案中，对多个基因进行分析并且引物在多种引物中。多种引物中的每一个可具有特定目标基因的序列。298.在第一扩增反应之后，可对第一扩增产物或转录物进行第二扩增反应以产生第二扩增产物。在一些情况下，将附接另外的序列(例如，诸如流动细胞附接序列、测序引物结合序列、条形码序列等的功能序列)。第一和第二扩增反应可在相同体积中，例如像在微滴中进行进行。在一些情况下，第一扩增产物在带条形码寡核苷酸存在下进行第二扩增反应，以产生具有条形码序列的第二扩增产物。条形码序列对于分区可以是唯一的，即每个分区具有唯一的条形码序列。带条形码寡核苷酸可包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列和至少第二预定义序列。带条形码寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段可促进带条形码寡核苷酸与转录物(例如cdna)的杂交，以促进第二扩增产物的产生。除条形码序列外，带条形码寡核苷酸可包含第二定义序列，如衔接子序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合中的至少一种。299.在一些实施方案中，第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板和带条形码寡核苷酸作为引物。如操作1954中所示，带条形码寡核苷酸1928上的模板转换寡核苷酸的区段可与cdna的部分或具有与模板转换寡核苷酸互补的序列或从模板转换寡核苷酸复制的序列的互补片段1922杂交。在第二扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用第一扩增产物作为模板延伸引物序列，如操作1956中所示。第二扩增产物可包含第二预定义序列(例如，1808、1812和1810)、模板多核苷酸(例如，mrna)区段的序列和与引物互补的序列(例如，1924)。300.在一些实施方案中，第二扩增产物使用带条形码寡核苷酸作为模板和第一扩增产物的至少一部分作为引物。如操作1954中所示，具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的第一扩增产物(例如cdna)的区段可与包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列的带条形码寡核苷酸的区段杂交。如操作1958中所示，在第二扩增反应中，也共分配的延伸反应试剂例如聚合酶、核苷三磷酸、辅因子(例如，mg2 或mn2 )可使用带条形码寡核苷酸作为模板延伸引物序列(例如，第一扩增产物)。第二扩增产物可包含引物(例如，1924)的序列、与模板多核苷酸(例如，mrna)的序列互补的序列和与第二预定义序列互补的序列(例如，1808、1812和1810)。301.在一些实施方案中，第二扩增反应在间插纯化操作的存在下在第一扩增反应之后进行。可使用间插纯化操作，例如以从包括诸如模板转换寡核苷酸的过量引物在内的过量试剂纯化模板(例如，第一扩增产物)。在一些实施方案中，扩增反应在间插纯化操作不存在下进行。在某些实施方案中，不进行间插纯化操作，以使得所有样品制备在相同反应体积中进行。在间插纯化操作不存在下，模板转换寡核苷酸可在第二扩增反应中与带条形码寡核苷酸竞争，因为带条形码寡核苷酸包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段。在第二扩增反应中模板转换寡核苷酸与带条形码寡核苷酸之间的竞争以产生另外的扩增产物可产生缺乏条形码序列的第二扩增产物。在一些实施方案中，如果模板转换寡核苷酸在反应体积中以比带条形码寡核苷酸更高的浓度存在，则所述模板转换寡核苷酸可在第二扩增反应中胜过带条形码寡核苷酸。在带条形码寡核苷酸以比反应体积中的模板转换寡核苷酸更低的浓度存在的情况下，可利用各种方法来促进带条形码寡核苷酸在第二扩增反应中的使用，以产生具有条形码序列的扩增产物。302.在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应期间不可用于引物延伸。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应之前降解。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸在第二扩增反应期间降解。模板转换寡核苷酸可包含核糖核酸(rna)。包含rna的模板转换寡核苷酸可例如通过升高的温度或碱性条件降解。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％rna。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含100％rna。在一些实施方案中，使用带条形码寡核苷酸的第二扩增反应的第一反应速率大于使用模板转换寡核苷酸的第二扩增的第二反应速率。303.在一些实施方案中，与模板转换寡核苷酸相比，带条形码寡核苷酸可在更高的退火温度下与第一扩增产物杂交。例如，与第一扩增产物和模板转换寡核苷酸的解链温度相比，第一扩增产物和带条形码寡核苷酸可具有更高的解链温度。在此类情况下，第二扩增反应可在退火温度下进行，在所述退火温度下带条形码寡核苷酸能够与第一扩增产物杂交和起始引物延伸，并且在所述退火温度下模板转换寡核苷酸不能与第一扩增产物杂交和起始引物延伸。在一些实施方案中，第二扩增反应的引物退火温度是至少约0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃或大于第一扩增反应的引物退火温度。解链温度的差异可由模板转换寡核苷酸中存在修饰的核苷酸引起。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的核苷酸。在一些实施方案中，模板转换寡核苷酸包含100％修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，解链温度的差异可以是带条形码寡核苷酸中存在修饰的核苷酸的结果。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的核苷酸。在一些实施方案中，带条形码寡核苷酸包含100％修饰的寡核苷酸。修饰的核苷酸包括但不限于2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2'‑脱氧肌苷、supert(5‑羟基丁炔基‑2'‑脱氧尿苷)、superg(8‑氮杂‑7‑脱氮杂鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc以及2'氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)。304.在各种实施方案中，使用包含聚合酶活性的酶促进第一扩增反应。例如，可通过dna依赖性聚合酶或逆转录酶(例如，rna依赖性)促进第一扩增反应。在一些实施方案中，第一扩增反应包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，第一扩增反应包括逆转录。在各种实施方案中，使用包含聚合酶活性的酶促进第二扩增反应。例如，可通过dna依赖性聚合酶促进第二扩增反应。在一些实施方案中，第二扩增反应包括聚合酶链式反应。305.在产生扩增产物后，后续操作可包括纯化(例如，经由固相可逆固定化(spri))、进一步加工(例如，剪切、连接功能序列和后续扩增(例如，经由pcr))。这些操作可在本体中(例如，在分区外)发生。在分区是乳液中的微滴的情况下，可使乳液破乳并汇集微滴的内容物用于另外的操作。可与带有条形码的珠粒一起共分配的另外试剂可包括用于阻断核糖体rna(rrna)的寡核苷酸和用于消化来自细胞的基因组dna的核酸酶。或者，可在另外的加工操作期间施加rrna去除剂。通过这种方法产生的构建体的构型可有助于最小化(或避免)在测序期间聚‑t序列的测序和/或对多核苷酸序列的5'端测序。可对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。306.尽管已经单独讨论了具有各种条形码设计的操作，但是单独珠粒可包括各种设计的条形码寡核苷酸以供同时使用。307.除了表征来自较大群体的单独细胞或细胞亚群之外，本文所述的过程和系统还可用于表征单独细胞，作为提供细胞或其它生物群体的总体概况的方式。各种应用需要评价细胞群体内的不同细胞或生物类型的存在和量化，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如在追踪污染等中。特别地，上述分析过程可用于单独表征、测序和/或鉴定群体内的大量单独细胞。然后可使用这种表征来组装起源群体的整体概况，其可提供重要的预后和诊断信息。308.例如，人类微生物组(包括例如肠、口腔、表皮微生物组等)的变化已经被鉴定为不同病状或一般健康状态的诊断和预后。使用本文所述的单细胞分析方法和系统，可再次表征、测序和鉴定总体群体中的单独细胞，并鉴定所述群体内可能指示诊断相关因子的变化。举例来说，细菌16s核糖体rna基因的测序已被用作细菌的分类学分类的高度准确的方法。使用上述靶向扩增和测序过程可提供细胞群体内单独细胞的鉴定。可进一步量化群体内不同细胞的数量，以鉴定当前状态或状态随时间的变化。参见例如，morgan等人,ploscomput.biol.,ch.12,2012年12月,8(12):e1002808和ram等人,syst.biol.reprod.med.,2011年6月,57(3):162‑170，所述文献各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。同样，感染或潜在感染的鉴定和诊断也可受益于本文所述的单细胞分析，例如，以鉴定存在于其它细胞或其它生物材料、细胞和/或核酸的大混合物(包括上述环境以及任何其它诊断相关的环境，例如脑脊液、血液、粪便或肠样品等)中的微生物物种。309.前述分析也可通过不同抗性标志物/突变跨给定样品的细胞群体的分布的分析和剖析而特别适用于表征不同细胞或病原体(例如癌细胞、细菌病原体等)的潜在耐药性等。另外，随时间推移表征这些标志物/突变跨细胞群体的变化可提供对以此类抗药性问题为特征的各种疾病的进展、改变、预防和治疗的有价值的见解。310.尽管就细胞而言进行了描述，但应理解，本说明书中涵盖各种单独生物有机体或有机体组分中的任一种，包括例如细胞、病毒、细胞器、细胞内含物、囊泡等。另外，在提及细胞时，应当理解，这种参考包括任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其它动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其它细胞类型，无论是源自单细胞还是多细胞生物。311.同样，分析不同环境样品以剖析此类样品中存在的微生物、病毒或其它生物污染物可提供有关疾病流行病学的重要信息，并且可能有助于预测疾病爆发、时疫和流行病。312.如上所述，本文所述的方法、系统和组合物还可用于分析和表征个体细胞或细胞群体的其它方面。313.用于表征细胞的方法2000示于图20中。如操作2010中所示，方法2000可包括提供包含细胞和至少一种标记剂的分区，所有这些都如本文所述。标记剂可能能够结合至细胞的细胞表面特征，并且可与包含允许鉴定所述标记剂的核酸条形码序列的报告寡核苷酸偶联。此外，所述分区可包含能够与报告寡核苷酸条形码相互作用的一种或多种锚寡核苷酸(本文中也称为寡核苷酸和带条形码寡核苷酸)，如本文详细描述的。接下来，在操作2020中，在分区内，可合成包含核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子，如本文所述。接下来，在操作2030中，可对核酸分子进行测序以鉴定标记剂或细胞。在一些情况下，标记剂和/或报告寡核苷酸可例如通过转染(例如，使用转染胺)、通过脂质(例如，1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(dopc))或通过转运蛋白递送至细胞中。314.如本文所述，标记剂可包括抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白质支架等以及其任何组合。如本文所述，细胞表面特征可包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接等以及其任何组合。315.在一些情况下，在操作2010之前，标记剂可经受适于使标记剂结合至细胞表面特征的条件。在一些情况下，在操作2010之前，当细胞和标记剂不含分区时(例如，在分配之前)，标记剂可经受适于使标记剂结合至细胞表面特征的条件。在一些情况下，在操作2010之前，报告寡核苷酸可与标记剂偶联。在一些情况下，在操作2010中，至少一种标记剂与细胞表面特征结合。316.在一些情况下，在操作2020中，可使与标记剂偶联的报告寡核苷酸经受引物延伸反应，所述引物延伸反应产生核酸分子。在一些情况下，在操作2020中，锚寡核苷酸可偶联至也用细胞和一种或多种标记剂分配的珠粒，如本文所述，并且所述方法还包括在合成之前从所述珠粒释放所述锚寡核苷酸。317.如本文所述，珠粒可包含凝胶珠粒。此外，如本文所述，珠粒可包含多样性锚寡核苷酸文库。在一些情况下，珠粒可包含锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约1,000,000个拷贝、锚寡核苷酸的至少约5,000,000个拷贝或锚寡核苷酸的至少约10,000,000个拷贝。在一些情况下，珠粒可包含不同锚寡核苷酸的至少约1,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约10,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约100,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约1,00,000个拷贝、不同锚寡核苷酸的至少约5,000,000个拷贝或不同锚寡核苷酸的至少约10,000,000个拷贝。在一些情况下，并且如本文所述，从珠粒释放锚寡核苷酸可包括使珠粒经受使珠粒降解的刺激。在一些情况下，如本文所述，从珠粒释放锚寡核苷酸可包括使珠粒经受使珠粒降解的化学刺激。318.固体载体(例如珠粒)可包含不同类型的锚寡核苷酸以用于分析细胞的内在和外在信息。例如，固体载体可包含以下中的一种或多种：1)锚寡核苷酸，其包含结合至细胞中的一种或多种内源核酸的引物；2)锚寡核苷酸，其包含结合至细胞中的一种或多种外源核酸的引物，所述外源核酸例如来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的核酸、引入细胞中的核酸(例如，如质粒或源自其的核酸)、用于基因编辑的核酸(例如，crispr相关rna，如crrna、引导rna)；3)锚寡核苷酸，其包含结合至条形码(例如，核酸、蛋白质或细胞的条形码)的引物；4)锚寡核苷酸，其包含结合至蛋白质的序列(例如引物)，所述蛋白质例如在细胞中表达的外源蛋白质、来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的蛋白质或细胞的蛋白质的结合配偶体(例如，免疫细胞受体的抗原)。319.在一些情况下，所述方法可用于筛选携带突变(例如通过基因编辑如crispr技术产生的突变)的细胞。例如，珠粒包含第一锚寡核苷酸，所述第一锚寡核苷酸具有用于crisprrna(例如，crrna或引导rna)或其互补dna的引物；以及第二锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸具有细胞中的引物内源核酸，例如总mrna或特异性mrna。可将珠粒制成具有用crisprrna或表达crisprrna的质粒转染的细胞的分区。在一些情况下，表达的crisprrna或质粒可具有条形码(crispr条形码)或捕获序列。珠粒上的引物可用于扩增和测序crisprrna(例如，使用包含与crispr捕获序列互补的序列的带条形码衔接子寡核苷酸，参见图61a‑d)和内源性mrna(例如，使用包含寡核苷酸(dt)序列的带条形码衔接子寡核苷酸)，从而确定细胞中产生的突变(参见图61d)。在一些情况下，所述方法可用于进行单细胞rna测序，例如，如dixit等人,perturb‑seq:dissectingmolecularcircuitswithscalablesingle‑cellrnaprofilingofpooledgeneticscreens.cell；2016年12月15日；167(7):1853‑1866.e17中所描述，所述文献以引用的方式整体并入本文。320.锚定剂或标记剂的寡核苷酸可包含主链。主链可包含以下元件中的一种或多种：测序仪引物、条形码和umi。除主链外，寡核苷酸还可包含如本文所述的引物，例如聚‑t引物、随机n‑聚体引物和/或靶特异性引物。包含各种主链和引物序列的寡核苷酸的实例在图27a‑27d中示出。321.本文方法的示例性工作流程可包括输入固定参考(例如，来自具有内在信息的细胞的已知转录物)、参考模板(例如，利用外在信息设计合成条形码(随机或靶特异性)和序列读数；并且输出源自内在或外在序列的序列读数的分类，每个分区的每个转录物/基因的检测的拷贝的计数，以及来自每个分区的外在序列的检测的条形码的列表和计数。在一些情况下，示例性工作流程可用软件实现。322.在一些情况下，在操作2030之前，方法2000可包括从分区释放核酸分子(例如，通过破坏分区)。在一些情况下，操作2030可包括鉴定标记剂(例如，结合至细胞表面特征的标记剂)。在一些情况下，操作2030可包括通过鉴定标记剂来鉴定细胞表面特征。在一些情况下，操作2030包括确定细胞上给定细胞表面特征的丰度。在一些情况下，操作2030包括鉴定细胞。在一些情况下，操作2030包括鉴定标记剂和细胞。323.在方法2000中，可与标记剂偶联的报告寡核苷酸可包含独特分子标识(umi)序列，如本文所述。umi序列可允许鉴定细胞、标记剂或两者。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定umi序列的序列并鉴定细胞。324.如本文所述，在方法2000中，锚寡核苷酸可包含独特分子标识(umi)序列。在这些情况下，锚寡核苷酸的umi序列可允许鉴定细胞。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定来自与标记剂结合的报告寡核苷酸的umi序列的序列，以及来自锚寡核苷酸的umi序列的序列，以鉴定细胞和细胞表面特征。325.在方法2000中，并且如本文所述，分区可包括乳液中的微滴。在一些情况下，分区仅包括一个细胞。在一些情况下，细胞结合至至少一种标记剂。在一些情况下，标记剂可包含至少两种相同的标记剂。在一些情况下，标记剂可包含至少两种不同的标记剂。在一些情况下，细胞可结合至至少约5种不同的标记剂、至少约10种不同的标记剂、至少约50种不同的标记剂、至少约100种不同的标记剂、至少约500种不同的标记剂、至少约1,000种不同的标记剂、至少约5,000种不同的标记剂、至少约10,000种不同的标记剂或至少约50,000种不同的标记剂。在一些情况下，细胞可结合至约2与5种之间的不同标记剂、约5与10种之间的不同标记剂、约10与100种之间的不同标记剂、约100与500种之间的不同标记剂、约500与1,000种之间的不同标记剂、约1,000与5,000种之间的不同标记剂、约5,000与10,000种之间的不同标记剂、约10,000与50,000种之间的不同标记剂或约2与50,000种之间的不同标记剂或其间的任何范围。在一些情况下，方法2000的操作2030可包括确定不同标记剂的至少一个子集的身份。326.在一种示例性方法中，提供样品，所述样品包含有待关于其细胞表面特征进行分析并且表征的细胞。细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接或其任何组合。还提供了能够结合至目标细胞表面特征的至少一种标记剂，如标记剂文库。标记剂可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin以及蛋白支架或其任何组合。标记剂可包括报告寡核苷酸，其指示结合基团所结合的细胞表面特征。特别地，对一种类型的细胞表面特征具有特异性的标记剂可具有与其偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞表面特征具有特异性的标记剂可具有与其偶联的不同报告寡核苷酸。在一些方面，这些报告寡核苷酸可包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸所偶联至的标记剂。选择寡核苷酸作为报告分子可提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还容易地可附接至大多数生物分子，例如抗体等，以及容易地例如使用测序或阵列技术检测。在一些实施方案中，标记剂可包括与它们附接的报告寡核苷酸。因此，第一标记剂(例如第一细胞表面特征的抗体)可具有与其缔合的具有第一核酸序列的报告寡核苷酸。不同的标记剂(例如对其它不同细胞表面特征具有结合亲和力的抗体)可具有与其缔合的包含不同核酸序列(例如具有部分或完全不同的核酸序列)的报告寡核苷酸。在一些情况下，对于每种类型的细胞表面特征标记剂，例如抗体或抗体片段，报告寡核苷酸序列可以是已知的并且容易地可鉴定为与已知的细胞表面特征标记剂相关。这些报告寡核苷酸可直接与标记剂偶联，或者它们可附接至珠粒、分子晶格(例如线性、球状、交联或其它聚合物)，或与标记剂附接或以其它方式缔合的其它框架，其允许将多个报告寡核苷酸附接至单一标记剂。327.在多个报告寡核苷酸与单一标记剂偶联的情况下，此类报告寡核苷酸可包含相同的序列，或特定的标记剂可包含一组已知的报告寡核苷酸序列。在例如对不同细胞表面特征具有特异性的不同的标记剂之间，报告寡核苷酸可以是不同的并且可归属于特定标记剂。328.报告寡核苷酸与标记剂的附接(偶联)可通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或附接中的任一种来实现。例如，在与基于抗体的标记剂缔合的寡核苷酸报告寡核苷酸的情况下，可使用化学缀合技术(例如，可从innovabiosciences获得的抗体标记试剂盒)以及其它非共价附接机制，例如使用生物素化的抗体和寡核苷酸(或与寡核苷酸偶联的包含一个或多个生物素化的接头的珠粒)与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白接头将此类寡核苷酸共价附接至抗体或抗体片段的一部分。可获得抗体和寡核苷酸生物素化技术。参见例如，fang等人,“fluoride‑cleavablebiotinylationphosphoramiditefor5′‑end‑labellingandaffinitypurificationofsyntheticoligonucleotides,”nucleicacidsres.2003年1月15日；31(2):708‑715，所述文献出于所有目的以引用的方式整体并入本文。同样，已经开发出并且容易获得蛋白质和肽生物素化技术。参见例如，美国专利号6,265,552，所述美国专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。此外，点击反应化学如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯反应、tco‑peg4‑nhs酯反应等可用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在标记剂是第一抗体的情况下，报告寡核苷酸可通过第二抗体偶联相互作用与标记剂偶联。可商购的试剂盒(如来自thunderlink和abcam的试剂盒)以及本领域常用的技术可用于将报告寡核苷酸适当地偶联至标记剂。329.在一些情况下，报告寡核苷酸可经由抗体结合蛋白与抗体缔合(例如，通过结合相互作用共价连接如缀合或非共价连接)。例如，报告寡核苷酸和抗体结合蛋白可形成复合物。所述复合物可通过抗体结合蛋白结合至相应抗体。图28示出使用抗体结合蛋白用于在抗体上缔合核酸(例如dna)条形码的示例性工作流程。将抗体结合蛋白2810(例如蛋白a或蛋白g)和包含核酸(例如dna)条形码2820的寡核苷酸缀合至抗体的fc区，从而形成包含所述抗体、抗体结合蛋白质2810和dna条形码2820的复合物2830。将复合物2830与细胞一起孵育，并且洗去未结合的抗体。当复合物2830结合至细胞时，所述复合物和细胞被分配到微滴中用于进一步分析。330.抗体结合蛋白可具有快速吸附动力学、缓慢解吸动力学和/或低结合平衡常数。可使用向肽或蛋白质添加化学官能团的任何方法。一些方法可包括将报告寡核苷酸附接至抗体结合蛋白上的特定氨基酸或化学基团(例如，存在于多种类型的蛋白质中的化学基团)。抗体结合蛋白和寡核苷酸的缀合可使用用于形成本文所述的抗体‑核酸缀合的方法例如使用点击化学进行。可通过交联(例如，使用交联剂如甲醛)、蛋白质工程化或过量添加蛋白质结合蛋白来防止抗体结合蛋白/寡核苷酸复合物的解离。331.抗体结合蛋白的实例包括结合至抗体的恒定(fc)区的蛋白质，如蛋白a、蛋白g、蛋白l或其片段。其它结合蛋白(例如链霉抗生物素蛋白)可表达为与抗体结合蛋白的融合蛋白，并用于缔合寡核苷酸(例如，通过生物素化的寡核苷酸与链霉抗生物素蛋白‑蛋白a融合蛋白的结合)。其它抗体结合蛋白或结构域可为各种抗体类别提供额外的结合亲和力。在一些情况下，抗体结合蛋白可以是抗体，例如靶向样品的抗体的第二抗体。第二抗体可包含在此所述的寡核苷酸，例如具有条形码和聚‑a或聚t终止序列的寡核苷酸。332.可工程化抗体结合蛋白以引入另外的功能。可将抗体结合蛋白工程化为含有具有适合与寡核苷酸缀合的官能团的氨基酸。例如，抗体结合蛋白可天然地具有或被工程化为具有半胱氨酸残基，例如用于控制寡核苷酸的化学计量学和/或附接位置。可将抗体结合蛋白工程化为具有非天然氨基酸残基，例如用于结合蛋白和抗体的靶向交联。可将抗体结合蛋白工程化为具有标签，例如荧光标签(例如，通过与荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、黄色荧光蛋白(yfp))融合)和/或亲和标签以用于纯化和可视化。荧光标签和/或亲和标签可以是可裂解的。在一些情况下，可将抗原结合蛋白工程化为每个蛋白质具有一个或多个(例如，仅一个)条形码附接位点。333.本文还提供了包含例如在孔板中与报告寡核苷酸缀合的抗体结合蛋白的试剂盒。用于测定的抗体可以指定浓度与缀合有报告寡核苷酸的抗体结合蛋白一起孵育，而不干扰抗体的结合位点和/或不需要在客户手中进行任何化学反应来将报告寡核苷酸缀合至抗体。334.报告寡核苷酸可具有任何不同长度的任何长度，这取决于适合于给定分析的报告寡核苷酸的多样性、所采用的序列检测方案等。在一些情况下，这些报告寡核苷酸可以是长度大于或等于约5个核苷酸、长度大于或等于约10个核苷酸、长度大于或等于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200或250个核苷酸。在一些情况下，这些报告寡核苷酸的长度可小于或等于约250、200、180、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个核苷酸。在一些情况下，可选择报告寡核苷酸以提供已经设定大小的带条形码产物，并且另外配置为在测序系统上进行分析。例如，这些序列可以理想地为特定测序系统产生合适长度的可测序产物的长度提供。同样地，除了报告序列之外，这些报告寡核苷酸可包括另外的序列元件，如测序仪附接序列、测序引物序列、扩增引物序列或这些中的任一者的互补序列。335.在操作中，可将含有细胞的样品与标记剂及其相关的报告寡核苷酸一起孵育，以获得待分析的任何细胞表面特征。在孵育后，可洗涤细胞以除去未结合的标记剂。在洗涤后，细胞可与携带上述珠粒的条形码(也称为锚寡核苷酸)一起分配到单独的分区(例如微滴)中，其中每个分区包括有限数量的细胞，例如单细胞。在从珠粒释放条形码(或锚寡核苷酸)后，它们可引发与标记剂偶联的报告寡核苷酸的扩增和条形编码。报告寡核苷酸的带条形码重复可另外包括功能序列，如引物序列、附接序列等。336.然后可对带条形码的报告寡核苷酸进行序列分析以鉴定哪些报告寡核苷酸与分区内的细胞(即细胞表面特征)结合。此外，还通过对相关条形码序列进行测序，可鉴定给定细胞表面特征可能与其它不同细胞表面特征来自相同的细胞，其报告序列包含相同的条形码序列，即它们源自同一分区。337.在一些实施方案中，分区内的锚寡核苷酸可与结合至细胞表面特征的标记剂偶联的报告寡核苷酸相互作用并使得合成如本文所述的核酸分子，其中合成的核酸分子可包含含有报告寡核苷酸或锚寡核苷酸或两者的核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分。然后可对这些合成的核酸分子进行扩增和测序，如本文所述。338.在一些实施方案中，多于一种标记剂可结合至单一细胞表面特征，并且所述标记剂之间的接近性可允许与其偶联的报告寡核苷酸的3'端杂交(其中当在溶液中未结合时通过解链温度阻止这种杂交)。通过如本文所述的延伸反应，可合成、扩增核酸分子并进行测序，如本文所述。339.基于从基于条形码序列的存在从单独分区发出的报告寡核苷酸，然后可从细胞群体产生单独细胞的细胞表面特征概况。可将单独细胞或细胞群体的概况与来自其它细胞(例如，‘正常’细胞)的概况进行比较，以鉴定细胞表面特征的变化，其可提供诊断相关信息。特别地，这些概况可特别适用于诊断以细胞表面受体的变化为特征的各种病症，如癌症和其它病症。340.在一些实施方案中，可对通过本文描述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组学和细胞表面信息进行单独测序。在一些实施方案中，可汇集通过本文所述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组学和细胞表面信息并且一起测序。在一些实施方案中，可依次对通过本文所述的方法和系统表征的细胞的基因组、蛋白质组和细胞表面信息进行测序(即，首先表征细胞表面信息，然后表征蛋白质组学和基因组信息)。341.本文还提供了用于筛选化学化合物文库的组合物和方法。所述方法可包括提供包含至少一种化学化合物的分区和所述分区的标识符。标识符可以是包含本技术中描述的核酸条形码序列的寡核苷酸。可扩增标识符寡核苷酸并进行测序。标识符寡核苷酸或其片段的序列读数可用于鉴定分区和所述分区中的至少一种化合物。所述方法可用于在小体积反应(例如按纳升的规模)中筛选化学化合物文库。可使用相同的底物和/或试剂在不同的分区中进行多个反应。可使反应多重化以减少在较大规模反应(例如按微升规模)中加工相同数量的化合物所需的努力和时间。所述方法和组合物可允许高通量筛选具有低噪声和/或假阳性结果的化学化合物文库。在一些情况下，用于筛选化学化合物文库的方法可包括以下操作中的一个或多个：(1)提供多个分区，其中所述多个分区的给定分区(i)具有或怀疑具有至少一种化学化合物，和(ii)包含标识符寡核苷酸，所述标识符寡核苷酸包含允许鉴定给定分区的核酸条形码序列；(2)在足以从所述多个分区的其余部分选择多个分区的子集的条件下对所述多个分区进行筛选，所述子集包括具有或疑似具有所述至少一种化学化合物的给定分区；(3)使所述多个分区的子集(包括给定分区)经受足以产生包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的核酸分子的条件；(4)对所述核酸分子进行测序以产生序列读数，所述序列读数允许鉴定所述至少一种化学化合物。342.所述方法可包括在固体载体上构建组合化学和标识符寡核苷酸文库，例如单分散的聚合物珠粒。所述寡核苷酸条形码可固有地连接至对所述单分散的聚合物珠粒来说独特的化学合成路径。在分配这种聚合物珠粒时，化合物群体可从底物释放以与不受标识符寡核苷酸阻碍的靶分子相互作用。然后可基于正/负相互作用对分区进行分选，如传统的报告测定所指示。然后可将阳性分区均质化并汇集。可扩增阳性分区中的标识符寡核苷酸用于测序。所述方法可允许将大量单一化合物单独地包装到纳升分区中，并且用于可汇集并以多重形式加工的具有正相互作用的分区的随后去卷积。343.在一些情况下，所述方法包括在固体载体(例如珠粒)上合成受控数量的化学化合物，同时在固体载体上合成所述化合物特有的受控数量的标识符寡核苷酸。所述化学化合物和标识符寡核苷酸的组合文库可通过顺序添加化学化合物亚基来制备，所述化学化合物亚基与在固体基质上同时或随后顺序添加标识符寡核苷酸一致。所述方法可在单个器皿中多重化，以用于以大规模平行方式添加化学化合物和标识符寡核苷酸。待筛选的化学化合物的量可标准化。344.可通过调节附接点的数量来控制在固体载体上合成的化学化合物和/或标识符寡核苷酸的数量。附接点可以是固体载体上化学化合物或标识符寡核苷酸可附接至的位置。附接点可包括用于裂解化学化合物和/或标识符寡核苷酸的多种类型的化学。这允许以受控方式选择性释放化学化合物和/或标识符寡核苷酸。固体可具有单个或多个附接点。345.固体载体可充当化学化合物与标识符寡核苷酸之间的共价接头。单一类型的固体载体或多种类型的固体载体可用于筛选中。如果使用多种类型的固体载体，它们可共价连接以形成单一固体载体。在某些情况下，如果使用多种类型的固体载体，则它们可混杂(但不共价连接)并占据相同的物理空间。固体载体可具有两种或更多种混杂的基质。在这些情况下，化学化合物和标识符寡核苷酸可在固体载体的同一基质上或单独基质上。在后一种情况下，化学化合物和标识符寡核苷酸混杂(并且不共价连接)并占据相同的物理空间。在一些情况下，固体载体可以是可渗透的或不可渗透的。在某些情况下，固体载体可以是可溶解的或不可溶解的。346.化学化合物可以是蛋白质(例如，抗体或其片段或抗原或其片段)、核酸分子。在一些情况下，化学化合物可以是小分子化合物。小分子化合物可以是低分子量(例如，不大于1000道尔顿)的有机化合物，其可帮助调控生物过程。小化合物可具有约1nm的尺寸。例如，小分子化合物可以是小分子药物。347.可使用筛选用于药物发现的小分子的方法进行化学化合物文库的筛选。例如，可使用药物发现中的高通量筛选或高含量分析来进行筛选。高通量筛选可以是筛选，其鉴定调节特定生物分子途径的活性化合物、抗体或基因。高含量分析可以是筛选，其鉴定以某种方式改变细胞表型的物质，如小分子、肽或rnai。在一些情况下，筛选可以是免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(elisa)。348.本文还提供了用于递送一种或多种试剂的支架。在一些情况下，试剂不与固体支架共价结合。例如，试剂可在支架内并且阻止(例如，通过与支架的空间相互作用)扩散出所述支架。当支架溶解时，试剂可从支架释放。在一些情况下，支架可以是本文所述的微胶囊，如凝胶珠粒。349.支架可用于表征细胞的方法中。所述方法可包括提供包含细胞、支架和所述支架中的试剂的分区。为了表征分区中的细胞，可溶解支架以释放试剂。所述试剂然后与细胞接触以确定细胞的一种或多种特征。在一些情况下，所述分区可包含多种试剂。本公开中描述的任何试剂可用于这种方法中。350.支架可用于递送两种或更多种试剂。在一些情况下，第一试剂与支架非共价结合，并且第二试剂可与支架共价结合。在其它情况下，可使用多个支架来递送多种试剂。在这些情况下，第一试剂可与第一支架共价结合，并且第二试剂可与第二支架非共价结合。第一支架和第二支架可与细胞一起封装在同一分区中。351.当支架溶解时，可释放与支架非共价结合的试剂。当至少0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％体积的支架溶解在其周围的溶液中时，所述支架溶解。352.支架可包含一个或多个孔，并且与支架非共价结合的试剂可在一个或多个孔中。一个或多个孔的直径可达0.01nm、0.1nm、1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1μm或10μm。353.负载有非共价结合的试剂的支架可使用将剂并入固体物质中的任何方法来制备。在一些情况下，可使用以下操作中的一个或多个来制备负载有非共价结合的试剂的支架：1)将支架(例如，凝胶珠粒)和试剂置于引起所述支架膨胀并且由聚合物支架限定的孔扩大的条件下。这种条件可包括：在热力学上有利的溶剂中，在更高或更低的温度下(例如，对于温度响应性水凝胶材料)，在具有更高或更低离子浓度的溶剂中和/或对于电荷/场响应性水凝胶材料在存在或不存在电场的情况下；2)允许足够的时间用于试剂扩散到支架的内部中；3)将支架转移到引起孔收缩的条件。然后通过与聚合物支架的空间相互作用阻止支架内的试剂分子扩散出支架。操作3)中的转移可例如通过将支架从一种共流动溶剂流移动至另一种来微流体地实现。图29展示所述方法中的溶胀条件和消溶胀条件的实例。可通过改变聚合物组成来调节支架的溶胀性和孔径。354.在包含负载有非共价结合的试剂的支架的分区中，可通过包括一定体积的支架来调节分区的组成。例如，当分区具有固定体积时，通过包括较大体积的试剂负载的支架，可上调分区中试剂的浓度。在一些情况下，可在不改变分区中的组分的初始浓度的情况下进行调整。在某些情况下，可在不改变分区的总体积的情况下进行调整。此类方法可用于递送干扰分区产生的试剂，例如细胞裂解剂。355.可使用本公开中描述的方法产生具有支架的分区。在某些情况下，在分区产生期间，支架和紧紧围绕支架的液体两者均被封装在如图30所示的单个分区中。支架和周围液体的体积包括“单位细胞”。单位细胞可由支架在其中流动的微通道的几何形状和所施加的压力限定。例如，较高的压力可压缩可变形的支架，从而减小单位细胞的体积。356.分区的组成可由支架悬浮液的体积(z1)和包封在所述分区中的样品的体积(z2)来确定。组合物的特征可通过这两个体积的比率(z1/z2)来描述。单一支架封装可能的最大z1等于单位细胞的体积。因此，为了增加由支架递送在固定体积的分区中试剂的浓度而不增加支架悬浮液中试剂的浓度，可增加支架的尺寸。因此，封装的单位细胞可占据更大体积的分区(在较高的z1/z2比率下)。在用于制备所述分区的微通道中，取决于支架的机械性质，微通道的尺寸可以或可以不必增加以容纳更大的分区。当施加较高的压力时，支架可压缩，单位细胞的体积可减小，并且可实现较低的z1/z2比率。357.本文还提供了用于对来自细胞的dna(例如基因组dna)分子和rna(例如mrna)分子进行平行和/或同时测序的方法和组合物。在一些情况下，所述方法和组合物可用于对来自单细胞的基因组和转录组进行平行测序。所述方法可用于剖析遗传变异的功能后果。358.包埋一种或多种磁性颗粒的微胶囊(例如珠粒)可用于所述方法中。在微胶囊溶解之前，磁性颗粒可能不会扩散出微胶囊。微胶囊可包含含有dna引物的寡核苷酸。例如，dna引物可以是基因组dna引物。dna引物可结合至来自细胞的dna分子。dna引物可用于扩增和/或测序来自细胞的dna分子。dna引物可被包埋和/或结合至微胶囊并在微胶囊溶解时释放。359.包埋在微胶囊内的磁性颗粒可包含含有rna引物的寡核苷酸。所述rna引物可结合至来自细胞的rna分子。在一些情况下，rna引物是结合至来自细胞的mrna分子的mrna引物。例如，mrna引物可包含结合至来自细胞的mrna分子的聚‑a序列的聚‑t序列。图31示出包埋有带条形码磁性颗粒的微胶囊。360.磁性颗粒可由诸如氧化铁(例如，超顺磁性氧化铁)、铁磁性、亚铁磁性或顺磁性材料的材料制成。铁磁材料可能对磁场非常敏感，并且当磁场可被移除时能够保持磁性。铁磁材料包括但不限于铁、钴、镍、其合金以及其组合。其它铁磁稀土金属或其合金也可用于制造磁性颗粒。361.微胶囊和磁性颗粒两者上的寡核苷酸可包含相同的条形码序列。所述条形码序列可允许匹配来自相同细胞的dna和rna的信息(例如，序列读数)。362.在一些情况下，条形码序列可包含细胞的独特标识符。例如，独特标识符可将细胞与样品中的其它细胞区分开。因此，独特标识符可允许多个细胞例如至少10、50、100、200、300、400、500、600、800或1000个细胞中的dna分子和rna分子的并行分析。例如，独特标识符可允许多个细胞例如至少200或500个细胞中的dna分子和rna分子的并行分析。363.在一些情况下，微胶囊还可含有一种或多种用于分析细胞的试剂。例如，微胶囊可含有裂解剂。当微胶囊溶解时，可释放裂解剂并在与微胶囊同一分区中裂解细胞。364.在一些情况下，微胶囊可以是凝胶珠粒。用于制备具有一种或多种磁性颗粒的凝胶珠粒的示例性方法可包括以下操作中的一个或多个：1)将磁性颗粒添加至用于制备凝胶珠粒的材料的水相中，例如凝胶珠粒单体混合物；2)使用微流体方法制备凝胶珠粒，例如通过形成聚合以形成凝胶珠粒的微滴。当微滴聚合时，磁性颗粒被包埋在其中；3)将相同的条形码序列添加至凝胶珠粒，并且例如使用双连接策略将磁性颗粒包埋在其内。365.一旦产生分区以包括细胞、微胶囊和包埋在所述微胶囊中的磁性颗粒，可将分区与一种或多种试剂(例如，裂解剂)一起孵育以裂解细胞并溶解微胶囊。孵育可在微流体芯片装置上进行，例如使用如frenz等人,reliablemicrofluidicon‑chipincubationofdropletsindelay‑lines.labchip.2009may21；9(10):1344‑8中描述的延迟线装置，所述文献以引用的方式整体并入本文。在孵育后，可收集分区并置于容器，例如带管或板中。366.孵育可进行允许细胞有足够的时间溶解并且磁性颗粒从微胶囊中释放的一段时间。孵育时间还可允许磁性颗粒上的rna引物与来自细胞的rna分子的充分结合。在一些情况下，孵育时间可以是1分钟至100分钟、5分钟至50分钟、10分钟至30分钟或10分钟至20分钟。367.与磁性颗粒上的rna引物结合的一种或多种rna分子可与分区中的其它组分分离。可通过浓缩磁性颗粒来进行分离。磁性颗粒可通过磁场浓缩。分离可在微流体装置上进行，例如，如gao等人,wash‑freemagneticimmunoassayofthepsacancermarkerusingsersanddropletmicrofluidics,labchip,2016,16,1022‑1029；brouzes等人,rapidandcontinuousmagneticseparationindropletmicrofluidicdevices.labchip.2015年2月7日；15(3):908‑19；或lombardi等人,dropletmicrofluidicswithmagneticbeads:anewtooltoinvestigatedrug‑proteininteractions.analbioanalchem.2011jan；399(1):347‑52中描述的装置，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些情况下，一种或多种rna分子可与dna分子分离。可使用本文所述的方法(例如测序)分析来自单细胞的分离的rna分子和dna分子，以确定细胞的特征。368.图32示出对细胞中的dna(例如基因组dna)和rna(例如mrna)进行平行测序的方法。在操作3210中，通过将凝胶珠粒与磁性颗粒、细胞和反应试剂(例如裂解剂)混合来制备单细胞分区。从混合物产生微滴。单个微滴3220含有一个细胞、具有磁性颗粒的凝胶珠粒和反应试剂。凝胶珠粒具有基因组dna引物，并且磁性颗粒具有mrna引物。分区中的凝胶珠粒和磁性颗粒具有相同的条形码序列。在3230中，使凝胶珠粒溶解以释放磁性颗粒和基因组dna引物。还裂解细胞以释放基因组dna分子和mrna分子。通过与mrna引物结合，mrna分子被捕获在磁性颗粒上。在操作3240中，在微流体装置上，分区分成两个子微滴。具有捕获的mrna分子的磁性颗粒被收集在仅一个子微滴中，因此与其它组分例如另一个子微滴中的基因组dna分离。因此，来自单细胞的基因组dna分子和mrna分子被分离并可用于进一步分析。369.本文还提供了用于分析来自样品(例如，单细胞)的一种或多种蛋白质和一种或多种核酸的方法和组合物。例如，所述方法和组合物可用于分析单细胞中的蛋白质组、基因组和/或转录组。所述方法可包括产生含有样品、用于蛋白质的标记剂和用于核酸的标记剂的分区。在一些情况下，用于蛋白质的标记剂可与样品中的一种或多种蛋白质相互作用。例如，用于蛋白质的标记剂可包含抗体。在其它情况下，用于蛋白质的标记剂可与蛋白质探针偶联，所述蛋白质探针与样品中的一种或多种蛋白质相互作用。例如，用于蛋白质的标记剂可与抗体偶联。用于核酸的标记剂可与样品中的一种或多种核酸相互作用。用于核酸的标记剂可包含引物，例如结合至dna分子和/或rna分子的引物。用于蛋白质的标记剂和用于核酸的标记剂可包含相同的报告寡核苷酸。报告寡核苷酸可包含条形码和/或umi。条形码和/或umi可允许来自同一样品的蛋白质与核酸匹配。当与用于核酸的标记剂结合时，可对来自样品的核酸进行测序。报告寡核苷酸或其部分也可进行测序。在一些情况下，所述方法可包括以下操作中的一个或多个：a)提供分区，所述分区包含含有蛋白质和第一核酸分子的生物样品；(i)能够结合至所述蛋白质并且(ii)与报告寡核苷酸偶联的标记剂，所述报告寡核苷酸包含允许鉴定所述标记剂的核酸条形码序列；偶联至载体的第一锚寡核苷酸，所述第一锚寡核苷酸能够与所述报告寡核苷酸相互作用；以及偶联至所述载体的第二锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸能够与所述第一核酸分子相互作用；(b)在所述分区中，合成包含所述核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子进行测序。当用于蛋白质的标记剂和蛋白质探针是分开的分子时，可在操作(a)中制备分区之前将所述蛋白质探针与样品一起孵育。370.两种锚定剂可用于本文所述的方法中。第一锚定剂可与来自样品的一种或多种核酸相互作用。另外或可替代地，第一锚定剂可与用于核酸的标记剂偶联。例如，第一锚定剂可包含结合至用于核酸的标记剂的寡核苷酸。第二锚定剂可与来自样品的一种或多种蛋白质相互作用。另外或可替代地，第二锚定剂可与用于蛋白质的标记剂偶联。例如，第二锚定剂可包含与用于蛋白质的标记剂相互作用的元件。在一些情况下，第二锚定剂可包含与偶联至用于蛋白质的标记剂的寡核苷酸序列相互作用的核酸序列。371.用于蛋白质的标记剂可包含一种或多种元件。所述标记剂可包含与锚定剂相互作用的元件(例如，寡核苷酸序列)。所述标记剂可包含报告寡核苷酸，例如包含条形码的寡核苷酸，所述条形码允许鉴定由标记剂靶向的蛋白质。例如，在用于蛋白质的标记剂包含抗体的情况下，所述报告寡核苷酸可允许鉴定抗体，从而鉴定由所述抗体结合的蛋白质。372.用于蛋白质的标记剂可包含允许所述标记剂与蛋白质探针(例如抗体)偶联的反应性部分。所述标记剂可通过本文描述的任何化学与蛋白质探针偶联，以用于将报告寡核苷酸附接至标记剂。在一些情况下，反应性部分可包括点击化学接头，如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯或tco‑peg4‑nhs酯。标记剂上的反应性部分还可包括用于靶向醛的胺、用于靶向马来酰亚胺(例如，游离硫醇)的胺、用于靶向点击化学化合物(例如，炔烃)的叠氮化物、用于靶向链霉抗生物素蛋白的生物素、用于靶向edc的磷酸酯，其进而靶向活性酯(例如，nh2)。蛋白质探针上的反应性部分可以是与标记剂上的反应性部分结合的化学化合物或基团。将蛋白质探针与标记剂缀合的示例性策略包括使用商业试剂盒(例如，solulink、thunderlink)、轻度还原铰链区和马来酰亚胺标记的缀合、标记的酰胺的染色促进的点击化学反应(例如，不含铜)以及糖链的高碘酸盐氧化和胺缀合的缀合。在蛋白质探针是抗体的情况下，可修饰所述抗体以缀合报告寡核苷酸。例如，抗体可用β‑1,4‑半乳糖基转移酶的底物允许突变体、galt(y289l)和带有叠氮化物的尿苷二磷酸‑n‑乙酰半乳糖胺类似物尿苷二磷酸‑galnaz进行糖基化。修饰的抗体可与具有二苯并环辛炔‑peg4‑nhs基团的报告寡核苷酸缀合。图33示出用于抗体‑报告寡核苷酸缀合的示例性策略。在一些情况下，可避免一些策略(例如，cooh活化(例如，edc)和同双功能交联剂)以防止蛋白质探针与它们自身缀合。373.两种锚定剂可与固体载体(例如微胶囊)偶联。例如，微胶囊可以是珠粒，例如凝胶珠粒。在一些情况下，两种锚定剂偶联至相同的固体载体。在其它情况下，两种锚定剂偶联至不同的固体载体。两种锚定剂可包含相同的报告寡核苷酸。374.图34示出所述方法中使用的示例性试剂。锚定剂3420偶联至珠粒3410。锚定剂包含条形码序列3422和umi3423。锚定剂还包含允许与标记剂3430结合的寡核苷酸序列3424。标记剂3430包含用于结合至锚定剂的寡核苷酸3431。标记剂3430还包含条形码3432，所述条形码允许鉴定其所偶联的抗体。标记剂3430还包含允许标记剂与抗体3440偶联的反应性部分3434。375.适用于分析带条形码标记剂的试剂和方案的另一个实例示于图52b的图i和图ii中。如图52b(图i)所示，标记剂(例如，抗体、mhc部分)5201直接与包含条形码序列5203的寡核苷酸5202偶联(例如，共价结合，经由蛋白质‑蛋白质相互作用结合，如与蛋白质g结合)，所述条形码序列鉴定标记剂5201。寡核苷酸5202还包括适用于下游反应的额外序列(包含模板转换寡核苷酸的反向互补序列的序列5204和包含pcr柄的序列5205)。图52b(图i)还示出适用于下游反应的另外的寡核苷酸5206(例如，其可能已经如本文其它地方所述从珠粒释放)，所述寡核苷酸包含条形码序列5208、umi序列5209和另外的序列(包含测序读取引物结合位点‘pr1’的序列5207和包含模板转换寡核苷酸的序列5210)。在分析期间，标记剂结合至其靶细胞表面特征，并且序列5210的rgrgrg序列与序列5204杂交，并且寡核苷酸5202和5206两者均经由聚合酶(例如，逆转录酶、聚合酶)的作用延伸，其中寡核苷酸5206然后在其3'端包含寡核苷酸5202的互补序列。然后可如本文其它地方所述任选地加工这些构建体并进行测序以例如鉴定靶细胞表面特征(经由从寡核苷酸5202产生的互补条形码序列)并将其与通过寡核苷酸5206的条形码序列鉴定的细胞相关联。376.在图52b(图ii)所示的另一个实例中，标记剂(例如，抗体)5221间接地(例如，经由杂交)偶联至寡核苷酸5222，所述寡核苷酸包含鉴定标记剂5221的条形码序列5223。标记剂5221直接(例如，共价结合，经由蛋白质‑蛋白质(如与蛋白质g)相互作用结合)偶联至与寡核苷酸5222的序列5231杂交的杂交寡核苷酸5232。寡核苷酸5232与寡核苷酸5231的杂交将标记剂5221偶联至寡核苷酸5222。寡核苷酸5222还包括适用于下游反应的额外序列(包含模板转换寡核苷酸的反向互补序列的序列5224和包含pcr柄的序列5225)。图52b(图ii)还示出适用于下游反应的另外的寡核苷酸5226(例如，其可能已经如本文其它地方所述从珠粒释放)，所述寡核苷酸包含条形码序列5228、umi序列5229和另外的序列(包含测序读取引物结合位点‘pr1’的序列5227和包含模板转换寡核苷酸的序列5220)。在分析期间，标记剂结合至其靶细胞表面特征，并且序列5220的rgrgrg序列与序列5224杂交，并且寡核苷酸5222和5226两者均经由聚合酶(例如，逆转录酶、聚合酶)的作用延伸，其中寡核苷酸5226然后在其3'端包含寡核苷酸5222的互补序列。然后可如本文其它地方所述任选地加工这些构建体并进行测序以例如鉴定靶细胞表面特征(经由从寡核苷酸5222产生的互补条形码序列)并将其与通过寡核苷酸5226的条形码序列鉴定的细胞相关联。377.用于分析来自单细胞的mrna分子和蛋白质的方法的实例示于图35a和图35b中。所述方法使用带条形码抗体3510，其含有与寡核苷酸3512缀合的抗体3511。寡核苷酸3512可结合至与珠粒偶联的第一锚寡核苷酸3520。将带条形码抗体3510与细胞一起孵育，以使得所述抗体结合至细胞上的抗原，并且形成抗体‑细胞复合物(图35a)。未结合的抗体被洗掉。将抗体‑细胞复合物制成乳液分区。每个分区含有抗体‑细胞复合物、第一锚寡核苷酸3520以及结合至来自细胞的mrna分子的第二锚寡核苷酸3530。裂解细胞并从所述细胞释放mrna分子。如图35b所示，将所述mrna分子逆转录为cdna并在第二锚寡核苷酸的帮助下扩增。扩增的cdna分子具有与第一锚寡核苷酸3520上的条形码和umi相同的条形码和umi。对第一锚寡核苷酸3520和寡核苷酸3512的复合物进行引物延伸，从而产生报告寡核苷酸3550，所述报告寡核苷酸包含与第二锚寡核苷酸上的条形码和umi相同的条形码和umi。报告寡核苷酸3550还包含抗体标识符(抗体条形码(abbc))，其鉴定抗体和由抗体结合的抗原。当对cdna分子进行测序时，使用条形码和umi将序列读数与相同细胞中的抗原相关联。图35c示出第一锚寡核苷酸和与抗体缀合的寡核苷酸3512的引物延伸。可将所得寡核苷酸与从来自细胞的mrna合成的cdna分离(例如，通过基于大小的选择)。第一锚寡核苷酸和第二锚寡核苷酸与寡核苷酸3512的复合物可单独或联合加工和/或测序。在一些情况下，锚定剂3520和3530可偶联至同一珠粒。378.本文还提供了用于如上所述分配细胞的微流体装置。此类微流体装置可包括用于进行分配过程(如图1和图2中所陈述的那些)的通道网络。简言之，这些微流体装置可包括用于将细胞分配至单独分区中并且将此类细胞与例如设置于珠粒上的寡核苷酸条形码库成员共分配的通道网络(如本文所描述的那些)。可将这些通道网络设置于固体本体(例如其中限定所述通道的玻璃、半导体或聚合物本体结构)内，其中那些通道在其末端与用于接收各种输入流体以及用于从通道网络的输出最终沉积所分配的细胞等的储库连通。举例来说，并且参考图2，流体联接至通道202的储库可提供有细胞214的水性悬浮液，同时联接至通道204的储库可提供有携带寡核苷酸的珠粒216的水性悬浮液。通道区段206和208可提供有非水性溶液(例如油)，在通道接点212处将水性流体以微滴形式分配至所述非水性溶液中。可将出口储库流体联接至通道210，可将所分配的细胞和珠粒递送至所述通道中以及从其中收获它们。如应了解，虽然以储库形式进行了描述，但应了解，可将通道区段联接至多种不同流体来源或接收部件(包括管道、歧管)或其它系统的流体部件中的任一种。379.还提供通过通道网络例如通过所施加的压力差、离心力、电动泵送、毛细管或重力流等来控制这些流体的流动的系统。380.本文还提供了用于分析单独细胞或细胞小群体的试剂盒。所述试剂盒可包括一种、两种、三种、四种、五种或更多种、直至所有分配流体，包括水性缓冲液和非水性分配流体或油；如本文所述的与珠粒可释放地缔合的核酸条形码库；如本文所述的标记剂；如本文所述的锚寡核苷酸；微流体装置；用于破坏细胞、扩增核酸以及在细胞核酸的片段或其重复上提供额外的功能序列的试剂；以及在本文描述的方法中使用前述中的任一者的说明书。381.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的组合物，所述组合物包含含有多个条形码分子和多种分析物的分区。多个条形码分子还可包括至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物(例如，dna和rna、dna和蛋白质、rna和蛋白质或dna、rna和蛋白质)。在一些情况下，所述组合物包含含有分区的多个分区。382.本公开的另一方面提供了一种用于分析物表征的方法。所述方法包括：(a)提供多个分区，其中所述多个分区中的给定分区包括多个条形码分子和多种分析物。所述多个条形码分子可包含至少1,000个条形码分子。此外，(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第一分析物的第一核酸条形码序列；并且(ii)所述多个带条形码分子的第二单个条形码分子可包含能够偶联至所述多种分析物的第二分析物的第二核酸条形码序列；其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述方法还包括(b)在所述给定分区中，(i)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(ii)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子；以及(c)从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二分子。在一些情况下，所述方法还包括对所述第一核酸分子和所述第二核酸分子或所述第一核酸分子和/或第二核酸分子的衍生物进行测序以表征所述第一和/或所述第二分析物。383.表征所述第一分析物和/或第二分析物通常提供关于所述第一分析物和/或第二分析物的信息。此信息可用于为(a)‑(c)的一个或多个另外循环选择第一和/或第二分析物。因此，所述方法还可包括从所述测序基于基于所述第一分析物或第二分析物的表征重复(a)‑(c)。在一些情况下，所述方法还包括基于在重复(a)‑(c)时从测序或随后测序获得的第一分析物或第二分析物的表征来选择所述第一分析物和/或所述第二分析物。384.此外，在一些情况下，(b)还包括：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。例如，第一核酸分子和/或第二核酸分子可借助于一种或多种引物延伸反应合成，所述引物延伸反应利用与第一或第二分析物杂交的引物。这种引物可包含如本文其它地方所述的条形码序列和/或umi序列。在一些情况下，可借助于两个核酸分子之间的连接来合成第一核酸分子和/或第二核酸分子。385.在一些情况下，所述方法还包括在从所述给定分区除去所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之后进行一个或多个反应。此类反应可包括经由另外的引物延伸反应、核酸扩增方案(例如pcr)或连接添加另外的核酸序列(例如，样品索引序列，在特定测序平台中起作用的序列)。在一些情况下，可在添加另外的核酸序列之前或之后除去第一和/或第二核酸分子的部分(例如，经由限制酶、经由剪切)。此外，这些反应可在本体中进行，以使得所述第一和第二核酸分子以及来自其它分区的第一和第二核酸分子的加工同时在本体中加工。这种加工可在单釜反应中完成。此类一种或多种其它反应的实例在美国专利公布号2015/0376609中提供，所述专利以引用的方式整体并入本文。386.本公开的另一方面提供了一种用于表征多种分析物的系统。所述系统包括用于提供包含多个条形码分子和所述多种分析物的分区的分配单元，其中：(i)所述多个条形码分子的第一单个条形码分子包含第一核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第一分析物；并且(ii)所述多个条形码分子的第二单个条形码分子包含第二核酸条形码序列并且能够偶联至所述多种分析物的第二分析物，其中所述第一分析物和所述第二分析物是不同类型的分析物。所述系统还可包括耦接至分配单元的控制器，其中所述控制器被编程为：(i)指导所述分配单元提供所述分区；使所述分区经受足以以下的条件：(1)合成包含所述第一核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第一核酸分子，和(2)合成包含所述第二核酸条形码序列或其互补序列的至少一部分的第二核酸分子。第一核酸分子和第二核酸分子或其衍生物的测序可表征所述第一分析物或第二分析物。在一些情况下，所述分配单元可提供包括所述分区的多个分区。387.在一些情况下，所述分配单元包括多孔板。在一些情况下，所述分配单元包括多个通道，其可以是微流体通道。所述多个通道可聚集在一起以形成提供所述分区的至少一个通道接点。在一些情况下，分配单元可包括(i)第一通道，所述第一通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供第一流体；(ii)和第二通道，所述第二通道流体连接至所述至少一个通道接点并且被配置为向所述至少一个通道接点提供与所述第一流体不混溶的第二流体。在一个实例中，然后第一通道可被配置为提供包含水相试剂的水相(例如，核酸，包括带条形码核酸、标记剂、珠粒、可降解珠粒的剂、扩增/引物延伸试剂、样品核酸、细胞、细胞裂解试剂等)，并且第二通道可被配置为提供油相，所述油相包含与水相不混溶的油(例如，包含含氟表面活性剂的油)。在水相与油相接触后，产生包含水相试剂的水相微滴。388.在各个方面，分区或给定分区可包含至少1,000个条形码分子、至少2,500个条形码分子、至少5,000个条形码分子、至少7,500个条形码分子、至少10,000个条形码分子、至少20,000个条形码分子、至少30,000个条形码分子、至少50,000个条形码分子、至少60,000个条形码分子、至少70,000个条形码分子、至少80,000个条形码分子、至少90,000个条形码分子、至少100,000个条形码分子、至少200,000个条形码分子、至少300,000个条形码分子、至少400,000个条形码分子、至少500,000个条形码分子、至少600,000个条形码分子、至少700,000个条形码分子、至少800,000个条形码分子、至少900,000个条形码分子、至少1,000,000个条形码分子、至少2,500,000个条形码分子、至少5,000,000个条形码分子、至少7,500,000个条形码分子、至少10,000,000个条形码分子、至少50,000,000个条形码分子、至少100,000,000个条形码分子或更多。389.在各个方面，第一单个条形码分子和第二单个条形码分子中的至少一个可偶联(例如，经由共价键、经由非共价相互作用、经由不稳定键等)至珠粒。在一些情况下，珠粒包含凝胶珠粒和/或如本文其它地方所述可降解。在本文所述的方法中，在提供一个或多个分区之后，可从珠粒释放第一或第二条形码分子。在一些情况下，条形码分子的释放可在其用于条形编码相应核酸分子之前、同时或之后发生。在释放于条形编码后发生的情况下，带条形码构建体最初与珠粒偶联。此外，分区可包含能够降解珠粒的剂。在一些情况下，这种试剂是可还原珠粒的二硫键和/或与珠粒偶联的物质与珠粒本身之间的任何二硫连键的还原剂。此外，在各个方面，分区或给定分区可以是任何合适的分区，如多个微滴中的微滴(例如，乳液中的微滴)或多个孔中的孔。此外，在各个方面，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是相同的。390.在各个方面，第一分析物或第二分析物可以是核酸分子，包括本文其它地方描述的任何类型的核酸分子。例如，核酸分子可以是基因组脱氧核糖核酸(gdna)。在另一个实例中，核酸分子是信使核糖核酸(mrna)。391.此外，在各个方面，第一分析物或第二分析物是能够偶联至细胞的细胞表面特征的标记剂。分区或给定分区可包含细胞或细胞的一种或多种组分(例如，如在细胞裂解后剩余的游离细胞表面特征)。在一些情况下，分区或给定分区包含单细胞。标记剂可以是任何标记剂，包括本文其它地方描述的类型的标记剂，包括抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性t细胞衔接器、t细胞受体衔接器、b细胞受体衔接器、前抗体(pro‑body)、适体、单域抗体、affimer、darpin、蛋白支架、抗原、抗原呈递颗粒和主要组织相容性复合物(mhc)。细胞表面特征的实例包括受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘附连接等以及本文其它地方描述的任何其它细胞表面特征。392.在一些情况下，在分配细胞之前，将细胞与一种或多种标记试剂一起在本体中孵育。可选择一种或多种标记剂，以使得它们针对给定测定中的特定目标细胞表面特征。在将一种或多种标记剂结合至相应的细胞表面特征(在存在的情况下)后，然后可洗涤细胞以除去未结合的标记剂，并且然后将所得细胞进行分配。393.此外，在一些情况下，所述第一单个条形码分子或所述第二单个条形码分子可能能够经由偶联至标记剂的第三核酸分子偶联至所述标记剂。所述第三核酸分子可偶联至标记剂并包含第三核酸条形码序列，所述第三核酸条形码序列鉴定偶联的标记剂(并且因此鉴定所述标记剂所结合的细胞表面特征)。在引物延伸反应中，可使所述第一单个条形码分子或第二单个条形码分子延伸，以使得所述第三条形码序列的互补序列被添加至所述第一或第二单个条形码分子。在测序期间，这些分子的第一或第二条形码序列可鉴定从其合成分子的分区，并且在分区包含单细胞的情况下，所述第三条形码序列可将特定细胞表面特征与所述单细胞相关联。394.在各个方面，所述第一分析物和第二分析物可以是不同类型的核酸分子。例如，所述第一分析物可以是脱氧核糖核酸分子(例如，gdna)，并且所述第二分析物可以是核糖核酸分子(例如mrna)，例如像转录物。在实现的情况下，可分析并表征细胞的基因组dna以及还有细胞的转录组。395.此外，在所述第一和第二分析物是核酸分子的情况下，所述第一单个条形码分子和/或第二单个条形码分子可包含能够分别与所述第一分析物和/或第二分析物杂交的引发序列。除了第一核酸条形码分子或第二核酸条形码分子外，还可包含umi序列，其可用于鉴定(和甚至定量)在给定分区内条形编码的特定分子，如本文其它地方所述。396.在图46a中示意性地描绘的一个实例中，分区(例如，微滴、孔或本文所述的任何其它类型的分区)包含珠粒4601，所述珠粒偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码的寡核苷酸4602和4603。珠粒4601以及带条形码寡核苷酸4602和4603在图46a中示意性地描绘。带条形码寡核苷酸4602包含第一核酸条形码序列和可与mrna转录物的聚‑a尾杂交的聚‑t引发序列4604。带条形码寡核苷酸4602还可包含可独特地鉴定给定转录物的umi序列。带条形码寡核苷酸4603包含第二核酸条形码序列和能够与gdna随机杂交的随机n‑聚体引发序列4605。在这种配置中，带条形码寡核苷酸4602和4603包含相同的核酸条形码序列，其允许下游测序读数与分区相关联。但是，在一些情况下，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是不同的。397.所述分区还包含细胞(未示出)和有助于从所述细胞释放核酸的裂解剂，并且还可包括可降解珠粒和/或破坏带条形码寡核苷酸4602和4603与珠粒4601之间的共价连键、从而将它们释放到分区中的剂(例如，还原剂)。释放的带条形码寡核苷酸4602可与从所述细胞释放的mrna杂交，并且释放的带条形码寡核苷酸4603可与从所述细胞释放的gdna杂交。然后可如本文其它地方所述，如经由聚合酶(和/或逆转录酶)和/或引物延伸的作用，针对所述mrna和带条形码寡核苷酸4623中的每个产生带条形码构建体a和b。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可从分区中释放/除去带条形码构建体，并且在一些情况下，进一步加工以添加任何另外序列。然后对所得构建体进行测序，对测序数据进行处理，并将结果用于表征来自细胞的mrna和gdna。可例如，如本文其它地方所述完成分析。从所述表征接收的信息然后可用于分区中的另一个细胞的后续分析。此外，带条形码寡核苷酸4602和4603可被设计为引发任何特定类型的核酸，包括不是源自细胞的核酸的那些。此外，图46a中所示的引发序列是出于示例性目的并且不意味着限制。398.在各个方面，第一分析物可以是核酸分子(例如，脱氧核糖核酸(例如，gdna)、核糖核酸(例如，mrna)、转录物)，并且第二分析物是能够偶联至细胞表面特征的标记剂。在这种情况下，第一单个条形码分子可包含能够与核酸分子杂交的引发序列，并且还可包括umi序列。此外，第二单个条形码分子可包含能够与偶联至标记剂的第三核酸分子杂交的引发序列。如本文其它地方所述，此第三核酸分子可包含鉴定标记剂的条形码序列。它还可包括umi序列。标记剂可以是任何合适的标记剂，包括本文其它地方描述的一种类型的示例性标记剂，并且可靶向其可选择性地结合的任何合适的细胞表面特征。本文其它地方提供了此类细胞表面特征的非限制性实例。此外，在一些情况下，分区包含具有细胞表面特征的细胞，并且在一些情况下可包含仅一个细胞。399.在图46b中示意性地描绘的一个实例中，分区(例如，微滴、孔、微胶囊或本文所述的任何其它类型的分区)包含珠粒4611，所述珠粒偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码的寡核苷酸4612和4613。珠粒4611以及带条形码寡核苷酸4612和4613在图46b中示意性地描绘。带条形码寡核苷酸4612包含第一核酸条形码序列和可与mrna转录物的聚‑a尾杂交的聚‑t引发序列4614。带条形码寡核苷酸4612还可包含可独特地鉴定给定转录物的umi序列。带条形码寡核苷酸4613包含第二核酸条形码序列和靶向引发序列，所述靶向引发序列能够与带条形码寡核苷酸4623特异性地杂交(经由与结合至细胞4622的表面的抗体4621偶联的带条形码寡核苷酸4623的互补部分4624)。带条形码寡核苷酸4623包含条形码序列，所述条形码序列独特地鉴定抗体4621(并且因此鉴定其所结合的特定细胞表面特征)。在这种配置中，带条形码寡核苷酸4612和4613包含相同的核酸条形码序列，其允许带条形码核酸与分区的下游缔合。但是，在一些情况下，第一核酸条形码序列和第二核酸条形码序列是不同的。此外，带条形码标记剂(包括抗体)可通过任何合适的途径产生，包括经由本文其它地方描述的示例性偶联方案。400.如图46b所示，分区还包含细胞4622、有助于从细胞4622释放核酸的裂解剂，并且还可包括可降解珠粒和/或破坏带条形码寡核苷酸4612和4613与珠粒4611之间的共价连键、从而将它们释放到分区中的剂(例如，还原剂)。释放的带条形码寡核苷酸4612可与从细胞释放的mrna杂交，并且释放的带条形码寡核苷酸4613可与带条形码寡核苷酸4623杂交。然后可如本文其它地方所述，如经由聚合酶(和/或逆转录酶)和/或引物延伸的作用，针对所述mrna和带条形码寡核苷酸4623中的每个产生带条形码构建体a和b。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的原始条形码序列的序列和对应于与标记剂偶联的条形码序列的另外序列。然后可从分区中释放/除去带条形码构建体，并且在一些情况下，进一步加工以添加任何另外序列。然后对所得构建体进行测序，对测序数据进行处理，并将结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。例如，分析可如本文其它地方所述完成。从所述表征接收的信息然后可用于分区中的另一个细胞的后续分析。此外，图46b中所示的引发序列是出于示例性目的并且不意味着限制。另外，图46b中所示的方案也可用于基因组dna和细胞表面特征的同时分析。在一些情况下，分区包含仅一个细胞。401.此外，在各个方面，第一分析物可包含具有核酸序列(mrna，源自mrna的逆转录的互补dna)的核酸分子，所述核酸序列编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分。因此，第一条形码分子可包含可引发这种核酸序列的引发序列，如本文其它地方所述。在一些情况下，具有编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少一部分的核酸序列的核酸分子是使用含有聚‑t的引物首先从相应mrna的逆转录产生的cdna。然后可使用引物对产生的cdna进行条形编码，所述引物包含与产生的cdna的至少一部分杂交的条形码序列(和任选的umi序列)。在一些情况下，结合末端转移酶或具有末端转移酶活性的逆转录酶的模板转换寡核苷酸可用于在cdna上产生引发区，带条形码引物可在cdna产生期间与其杂交。末端转移酶活性可例如向cdna的3'端添加聚‑c尾，以使得模板转换寡核苷酸可经由聚‑g引发序列结合，并且cdna的3'端可进一步延伸。原始mrna模板和模板转换寡核苷酸然后可从cdna变性，并且包含与cdna上的产生的引发区的至少一部分互补的序列的带条形码引物然后可与cdna和包含条形码序列(和任何任选的umi序列)的带条形码构建体和产生的cdna的互补序列杂交。适用于条形编码由mrna转录物产生的cdna的另外方法和组合物(包括编码免疫细胞受体的v(d)j区的那些和/或条形编码方法和包含模板转换寡核苷酸的组合物)描述于美国临时专利申请序列号2016年10月19日提交的美国临时专利申请序列号62/410,326和2017年4月26日提交的美国临时专利申请序列号62/490,546中，所述申请两者以引用的方式整体并入本文。在一个实例中，在本文其它地方描述并且在图19中示意性地描绘的方案可用于v(d)j分析。402.v(d)j分析也可使用一种或多种标记剂完成，所述标记剂结合至免疫细胞的特定表面特征并且与如本文其它地方描述的条形码序列缔合。在一些情况下，一种或多种标记剂包含mhc。403.在一些情况下，不同类型的分析物不包括用于分离细胞的细胞表面特征的标记剂。404.此外，在各个方面，第一分析物可包含能够用作基因编辑反应的组分的核酸，例如像基于成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)的基因编辑。因此，所述第一条形码分子可包含可引发这种核酸序列的引发序列，如本文其它地方所述。405.尽管参考图46a和图46b描述的实施例涉及两种不同类型的分析物的分析，但这些实施例不意味着限制。可评价任何合适数量的分析物。因此，在各个方面，它们可以是存在于可进行带条形码测序分析的分区中的至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约100种或更多种不同的分析物。通过包括能够产生带条形码构建体并且能够与特定分析物或与本身偶联至分区中的特定分析物的标记剂偶联的寡核苷酸特异性地杂交的引物物质(其中一个或多个可进行条形编码)并使所述分区经受适合条形编码的条件，可完成更高数量的多测定分析。406.用于多测定分析的示例性试剂示意性地描绘于图46c中。如图46c所示，分区可包括与带条形码引物偶联的珠粒4651，所述引物可各自参与不同分析物的测定。珠粒4651偶联(例如，可逆地偶联)至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4654的带条形码寡核苷酸4652，并且还偶联(例如，可逆地偶联)至包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4655的带条形码寡核苷酸4653。此外，珠粒4651还偶联(例如，可逆地偶联)至带条形码寡核苷酸4656，所述带条形码寡核苷酸可经由其靶向引发序列4657特异性地结合与标记剂(例如抗体)偶联的寡核苷酸。珠粒4651还偶联至带条形码寡核苷酸4658，所述带条形码寡核苷酸可经由其靶向引发序列4659特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子。在此实例中，各种带条形码引物中的每一种包含相同的条形码序列。每种带条形码寡核苷酸可从分区内的珠粒4651释放，并且经受适于分析其相应分析物的条件。在一些情况下，所述分析物中的一种或多种与细胞相关或源自细胞，细胞本身可在分区中。在一些情况下，分区包含仅一个细胞。可如本文其它地方所述产生并分析带条形码构建体a、b、c和d。带条形码构建体a可包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于靶mrna的dna序列。带条形码构建体b可包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于基因组dna的序列。带条形码构建体c包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于与抗体标记剂相关的条形码序列的序列。条形码构建体d包含对应于来自珠粒的条形码序列的序列和对应于crispr核酸的序列(在一些实施方案中，其还包含条形码序列)。可经由测序分析每种构建体，并将结果与各种分析物所来源的给定细胞相关联。虽然图46c中仅示出四种不同的带条形码构建体，但带条形码(或甚至不带条形码)构建体可被定制用于分析与核酸相关并且能够与这种构建体结合的任何给定分析物。407.例如，分区可包括与带条形码寡核苷酸偶联(例如，可逆地偶联)的珠粒(例如，凝胶珠粒)，所述带条形码寡核苷酸可参与至少两种不同分析物的测定。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4604的带条形码寡核苷酸4602和包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4605的带条形码寡核苷酸4603偶联的示例性珠粒，参见图46a。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4614的带条形码寡核苷酸4612和包含可经由其靶向引发序列4624特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4615的带条形码化寡核苷酸4613偶联的示例性珠粒，参见图46b。408.用于测量至少两种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列(例如，4604)的带条形码寡核苷酸(例如，4602)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列4659的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。用于测量至少两种不同分析物的其它示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列(例如，4615)的带条形码寡核苷酸(例如，4613)和包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4605)的带条形码寡核苷酸(例如，4603)。用于测量至少两种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列(例如，4615)的带条形码寡核苷酸(例如，4613)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4659)的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。用于测量至少两种不同分析物的其它示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4605)的带条形码寡核苷酸(例如，4603)和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4659)的带条形码寡核苷酸(例如，4658)(参见例如，图61a‑d)。409.例如，分区可包括与带条形码寡核苷酸偶联(例如，可逆地偶联)的珠粒(例如，凝胶珠粒)，所述带条形码寡核苷酸可参与至少三种不同分析物的测定。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4662的带条形码寡核苷酸4661；包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列4664的带条形码寡核苷酸4663；和包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4666的带条形码化寡核苷酸4665偶联的示例性珠粒4660，参见图46d。关于与包含用于mrna分析的聚‑t引发序列4662的带条形码寡核苷酸4661；包含可经由其靶向引发序列(例如，4624)特异性地结合与标记剂(例如，抗体)偶联的寡核苷酸的捕获序列4666的带条形码寡核苷酸4665；和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列4673的带条形码寡核苷酸4672偶联的示例性珠粒4667，参见图46e(参见例如，图61a‑d)。410.用于测量至少三种不同分析物的另外的示例性测定包括珠粒，所述珠粒偶联至包含用于mrna分析的聚‑t引发序列(例如，4662)的带条形码寡核苷酸(例如，4661)；包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列(例如，4664)的带条形码寡核苷酸(例如，4663)；和包含可经由其靶向引发序列特异性地结合可在crispr测定(例如，crispr/cas9)中起作用的核酸分子的捕获序列(例如，4673)的带条形码寡核苷酸(例如，4672)(参见例如，图61a‑d)。411.本公开提供了被编程为实现本公开的方法，即本公开的方案的计算机控制系统。例如，本公开提供了被编程为实现本公开的方法2000的计算机控制系统。图17示出被编程或以其它方式配置以实现本公开的方法的计算机系统1701，所述方法包括核酸测序方法、细胞表面特征鉴定方法、核酸测序数据的解释和细胞核酸如rna(例如，mrna)的分析、核酸测序数据的解释和源自细胞表面特征的表征的核酸的分析以及来自测序数据的细胞的表征。计算机系统1701可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。412.计算机系统1701包括中央处理单元(cpu，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1705，其可为单一核心或多核心处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1701还包括存储器或存储单元1710(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1715(例如，硬盘)、与一个或多个其它系统通信的通信接口1720(例如，网络适配器)以及外围装置1725，如高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1710、存储单元1715、接口1720和外围装置1725经由通信总线(实线)诸如母板与cpu1705通信。存储单元1715可为用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1701可借助于通信接口1720来可操作地耦接至计算机网络(“网络”)1730。网络1730可为互联网、互联网和/或外联网或与互联网通信的内部网和/或外联网。网络1730在一些情况下为电信和/或数据网络。网络1730可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，诸如云计算。网络1730在一些情况下借助于计算机系统1701，可实施对等网络，其可使得耦接至计算机系统1701的装置能够作为客户端或服务器来运作。413.cpu1705可执行序列机器可读指令，所述指令可在程序或软件中具体实现。指令可存储于存储单元，诸如存储器1710中。指令可被引导至cpu1705，其可随后编程或以其它方式配置cpu1705来实施本公开的方法。由cpu1705执行的操作的实例可包括撷取、解码、执行和写回。414.cpu1705可以是电路的一部分，如集成电路。系统1701的一个或多个其它部件可包含于电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(asic)。415.存储单元1715可存储文件，诸如驱动程序、文库和保存程序。存储单元1715可存储使用者数据，例如，使用者偏好和使用者程序。计算机系统1701在一些情况下可包括一个或多个额外数据存储单元，所述单元在计算机系统1701外部，诸如位于经由内部网或互联网与计算机系统1701通信的远程服务器上。416.计算机系统1701可经由网络1730与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1701可与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式pc)、平板(slate)或平板(tablet)pc(例如，ipad、galaxytab)、电话、智能手机(例如iphone、支持android的装置、)或个人数字助理。用户可经由网络1730访问计算机系统1701。417.如本文描述的方法可经由机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施，所述代码存储于计算机系统1701的电子存储单元上，例如像，存储器1710或电子存储单元1715。机器可执行或机器可读代码可以软件形式提供。在使用期间，代码可由处理器1705执行。在一些情况下，代码可从存储单元1715检索并且存储在存储器1710上准备由处理器1705访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1715，并且机器可执行指令存储于存储器1710上。418.代码可预先编译并且被配置来供具有适于执行代码的处理器的机器来使用，或可在执行时间期间加以编译。代码可以程序语言来提供，可选择所述程序语言以使得代码能够以预先编译或原样编译方式来执行。419.本文提供的系统和方法，诸如计算机系统1701的各个方面可在程序编制中具体实现。技术的各个方面可被认为是通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据形式的“产品”或“制品”，所述数据承载或具体实现于一定类型的机器可读介质中。机器可执行代码可存储于电子存储单元，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时候提供非暂时性存储用于软件编程。软件的全部或一部分可有时经由互联网或各种其它电信网络来传送。这类通信，例如，可使得将软件从一个计算机或处理器加载至另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机计算机加载至应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，诸如跨越本地装置之间的物理接口、经由有线和光学陆地线网络和各种空中链路所使用的光、电和电磁波。携带这些波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等也可被认为是承载软件的介质。如本文使用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，术语诸如计算机或机器“可读介质”是指参与提供指令至处理器供执行的任何介质。420.因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储器介质包括，例如，光盘或磁盘，诸如任何计算机等中的任何存储装置，诸如在附图中示出的可用于实施数据库等的存储装置。易失性存储器介质包括动态存储器，诸如这类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光导纤维，包括构成计算机系统中的总线的导线。载波传输介质可采用电或电磁信号，或声或光波的形式诸如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间产生的信号。常见形式的计算机可读介质因此包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁介质、cd‑rom、dvd或dvd‑rom、任何其它光学介质、冲孔卡纸带、具有孔图案的任何其它物理存储器介质、ram、rom、prom和eprom、快闪eprom、任何其它存储器芯片或盒、运输数据或指令的载波、运输这类载波的电缆或链路，或计算机可读取编程代码和/或数据的任何其它介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及运送一个或多个指令的一个或多个序列至处理器供执行。421.计算机系统1701可包括电子显示屏1735或与所述电子显示屏通信，所述电子显示屏包括用于提供例如核酸测序的结果、核酸测序数据的分析、核酸测序样品的表征、细胞表征等的用户界面(ui)1740。ui的实例包括但不限于图形用户接口(gui)和基于网路的用户接口。系统1701可包括电子显示屏1735，所述电子显示屏包括用户界面1740，所述用户界面显示用户可访问的图形元素以根据本文描述的方法执行方案(例如，表征细胞)；以及计算机处理器，所述计算机处理器耦接至所述电子显示屏并被编程为在所述用户选择图形元素时执行所述方案。422.本公开的方法和系统可经由一个或多个算法来实施。算法可在由中央处理单元1705执行时经由软件来实施。所述算法可例如起始核酸测序、处理核酸测序数据、解释核酸测序结果、表征核酸样品、表征细胞等。423.如本文其它地方所述的带条形码寡核苷酸可以任何合适的方式产生，并且除条形码序列外还包含一个或多个序列。如本文其它地方所述，一种这样的序列可以是引发序列，所述引发序列可帮助条形编码分析物。此外，带条形码寡核苷酸还可包含一个或多个另外的功能序列，所述功能序列可例如有助于使带条形码寡核苷酸与给定测序平台相容(例如，功能序列可以是流动细胞衔接子固定序列(例如像来自illumina平台的p7和p5)；测序引物结合位点序列(例如像来自illumina平台的r1)和用于下游扩增的其它引发位点(例如像nextera功能序列或truseq功能序列)。424.在一些情况下，带条形码寡核苷酸与珠粒偶联，并且珠粒可包含在给定位置具有第一类型的功能序列的寡核苷酸和在给定位置具有第二不同类型的功能序列的寡核苷酸。图50a中描绘了一个实例。如图50a所示，珠粒可偶联至包含truseq功能序列的寡核苷酸，并且还偶联至包含nextera功能序列的寡核苷酸。在这些序列中的每一个上，可添加另外的序列以产生完整寡核苷酸，所述寡核苷酸还包含核酸条形码序列、任选的umi序列和引发序列。这些序列的附接可经由连接(包括经由如美国专利公布号20140378345中描述的夹板连接，所述专利以引用的方式整体并入本文)或任何其它合适的途径。包含truseq官能团的示例性带条形码寡核苷酸的序列示于图50b中，并且包含nextera官能团的示例性带条形码寡核苷酸的序列示于图50c中。图50b和图50b中所示的示例性带条形码寡核苷酸(每种构建体的顶部序列)显示与夹板序列(每种构建体的底部序列)杂交，所述夹板序列可有助于构建完整的带条形码寡核苷酸。425.在一些方面，本文提供的方法还可用于以能够获得细胞特异性信息的方式制备细胞内包含的多核苷酸。所述方法能够检测来自非常小的样品，如来自包含约10‑100个细胞的样品的遗传变异(例如，snp、突变、插入缺失、拷贝数变化、颠换、易位、倒位等)。在一些情况下，可在本文描述的方法中使用约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在一些情况下，可在本文描述的方法中使用至少约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。在其它情况下，可在本文描述的方法中使用至多约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞。426.在一个实例中，方法包括分配细胞样品(或粗细胞提取物)，以使得每个分区存在至多一个细胞(或一个细胞的提取物)，使所述细胞裂解、通过本文所述的任何方法使所述细胞内包含的多核苷酸片段化，将所述片段化的多核苷酸附接至条形码、汇集并测序。427.条形码和其它试剂可包含在微胶囊内。可在负载细胞之前、之后或同时将这些微胶囊负载到分区(例如，微孔、微滴)中，以使得每个细胞与不同的微胶囊接触。这种技术可用于将独特条形码附接至从每个细胞获得的多核苷酸。然后可汇集所得标记的多核苷酸并测序，并且条形码可用于追踪多核苷酸的来源。例如，可确定具有相同条形码的多核苷酸源自相同细胞，同时可确定具有不同条形码的多核苷酸源自不同细胞。428.本文描述的方法可用于检测跨癌性肿瘤细胞群体的致癌突变的分布。例如，一些肿瘤细胞可在两个等位基因(纯合子)中具有致癌基因(例如her2，braf，egfr，kras)的突变或扩增，其它肿瘤细胞可在一个等位基因(杂合子)中具有突变，并且仍然其它肿瘤细胞可能没有突变(野生型)。本文描述的方法可用于检测这些差异，并且还用于量化纯合子、杂合子和野生型细胞的相对数量。这种信息可用于例如分期特定癌症和/或监测癌症及其治疗随时间推移的进展。429.在一些实例中，本公开提供了鉴定两种不同致癌基因(例如，kras和egfr)中的突变的方法。如果相同的细胞包含具有两种突变的基因，则这可指示更具攻击性形式的癌症。相比之下，如果突变位于两种不同的细胞中，这可指示癌症更良性或更早期。430.实施例431.实施例i：使用乳液的细胞rna分析432.在一个实施例中，在乳液微滴中进行使用模板转换的逆转录和cdna扩增(经由pcr)，其操作如图9a所示。经分配用于逆转录和cdna扩增(经由pcr)的反应混合物包含1,000个细胞或10,000个细胞或10ng的rna、带有带条形码寡核苷酸的珠粒/0.2％tx‑100/5xkapa缓冲液、2xkapahshifi预混液、4μm转换寡核苷酸和smartscribe。在存在细胞的情况下，将混合物分配，以使得大部分或全部微滴包含单细胞和单个珠粒。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸，并且如在操作950中，所述带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与从所述细胞释放的mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段在如操作952中的逆转录反应中延伸，并且cdna如操作954中扩增。热循环条件是42℃持续130分钟；98℃持续2分钟；以及遵循98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续6分钟，35个循环。在热循环后，使乳液破乳并且如操作956中用dynabead和0.6xspri纯化转录物。433.在图13a中对于1,000个细胞且在图13c中对于10,000个细胞并在图13b(smartscribe线)中对于10ng的rna示出来自乳液中的模板转换逆转录和pcr的产率。将来自用于10ngrna的乳液中进行的rt和pcr的cdna进行剪切并连接至功能序列，用0.8xspri净化，并且如操作958中通过pcr进一步扩增。用0.8xspri清除扩增产物。来自这种加工的产率如图13b(ssii线)所示。434.实施例ii：使用乳液的细胞rna分析435.在另一个实施例中，在乳液微滴中进行使用模板转换的逆转录和cdna扩增(经由pcr)，其操作如图9a所示。经分配用于逆转录和cdna扩增(经由pcr)的反应混合物包含jurkat细胞、带有带条形码寡核苷酸的珠粒/0.2％tritonx‑100/5xkapa缓冲液、2xkapahshifi预混液、4μm转换寡核苷酸和smartscribe。将混合物分配，以使得大部分或全部微滴包含单细胞和单个珠粒。裂解细胞，同时从珠粒释放带条形码寡核苷酸，并且如在操作950中，所述带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与从所述细胞释放的mrna的聚‑a尾杂交。聚‑t区段在如操作952中的逆转录反应中延伸，并且cdna如操作954中扩增。热循环条件是42℃持续130分钟；98℃持续2分钟；以及遵循98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续6分钟，35个循环。在热循环后，使乳液破乳并且如操作956中用dynabead和0.6xspri净化转录物。来自使用各种细胞数(625个细胞、1,250个细胞、2,500个细胞、5,000个细胞和10,000个细胞)的反应的产率在图14a中示出。用图14b中所示的gadphqpcr测定结果证实这些产率。436.实施例iii：使用乳液的rna分析437.在另一个实例中，在乳液微滴中进行逆转录，并且以类似于图9c中所示的方式在本体中进行cdna扩增。经分配用于逆转录的反应混合物包含带有带条形码寡核苷酸的珠粒、10ngjurkatrna(例如jurkatmrna)、5x第一链缓冲液和smartscribe。带条形码寡核苷酸从珠粒释放，并且如操作961中带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与rna的聚‑a尾杂交。如操作963中，聚‑t区段在逆转录反应中延伸。逆转录的热循环条件是在42℃下持续2小时的一个循环和在70℃下持续10分钟的一个循环。在热循环之后，使乳液破乳并且如操作962中使rna和cdna变性。然后如操作964中，通过用具有生物素标签的引物进行引物延伸来合成第二链。这种引物延伸的反应条件包括作为第一链的cdna和浓度在0.5‑3.0μm范围内的生物素化的延伸引物。热循环条件是在98℃下持续3分钟的一个循环和98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。在引物延伸后，用dynabeadmyone链霉抗生物素蛋白c1和t1下拉(pulldown)第二链，并用agilentsureselectxt缓冲液净化。第二链如操作965中经由pcr用以下循环条件进行预扩增：在98℃下持续3分钟的一个循环以及98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。各种浓度的生物素化引物(0.5μm、1.0μm、2.0μm和3.0μm)的产率在图15中示出。438.实施例iv：使用乳液的rna分析439.在另一个实例中，如图10所示，将使用t7聚合酶的体外转录用于产生rna转录物。经分配用于逆转录的混合物包含带有带条形码寡核苷酸的珠粒(其还包含t7rna聚合酶启动子序列)、10ng人rna(例如人mrna)、5x第一链缓冲液和smartscribe。将混合物分配，以使得大部分或全部液滴包含单个珠粒。带条形码寡核苷酸从珠粒释放，并且如操作1050中带条形码寡核苷酸的聚‑t片段与rna的聚‑a尾杂交。如操作1052中，聚‑t区段在逆转录反应中延伸。热循环条件是在42℃下持续2小时的一个循环和在70℃下持续10分钟的一个循环。在热循环之后，使乳液破乳并且剩余操作在本体中进行。然后如操作1054中，通过引物延伸合成第二链。用于这种引物延伸的反应条件包括作为模板的cdna和延伸引物。热循环条件是在98℃下持续3分钟的一个循环和98℃持续15秒、60℃持续20秒和72℃持续30分钟的一个循环。在这种引物延伸后，用0.6xspri纯化第二链。如在操作1056中，然后进行体外转录以产生rna转录物。过夜进行体外转录，并用0.6xspri纯化转录物。来自体外转录的rna产率在图16中示出。440.实施例v：使用凝胶珠粒将裂解剂递送至分区441.经由凝胶珠粒悬浮液(gbs)将裂解剂引入分区(gem)中。裂解剂是当其在gbs中的浓度超过阈值时引起润湿失效(不受控制的微滴形成)的表面活性剂。442.可使用较大的凝胶珠粒来增加裂解剂的分区中浓度，而不增加gbs中浓度(以避免润湿失效)并且不降低分区的总体积(在不降低测定的灵敏度的情况下所述分区的总体积可能不降低)(图36a)。或者，可使用较大的凝胶珠粒来增加分区的体积(其增加测定的灵敏度)并保留现有分区内裂解剂浓度而不增加gbs中浓度。443.凝胶珠粒的大小也可影响细胞分配的方式。通过用凝胶珠粒悬浮液体积(z1)代替一部分样品体积(z2)，较大的凝胶珠粒降低细胞的分区内浓度，根据泊松统计，这导致每个分区多于一个细胞的不利包封的可能性较低(图36b)。444.实施例vi：产生与短ssdna分子缀合的cd3蛋白445.首先活化cd3蛋白和ssdna分子以进行点击化学反应。用5‑(甲基丙烯酰胺基)四唑(mtet)活化cd3蛋白，并且用反式环辛烯(tco)活化ssdna分子。ssdna分子包含生物素基团。通过点击化学反应将活化的cd3蛋白和ssdna分子混合用于缀合。ssdna分子浓度比cd3蛋白浓度高5倍，以避免在同一蛋白质分子上缀合多个条形码拷贝。在一些情况下，ssdna浓度比cd3蛋白高10倍，以最大化条形码附接。生物素基团也可并入活化的cd3‑ssdna缀合物中以用于纯化。如图37所示，纯化并测试cd3蛋白和ssdna缀合物。446.实施例vii：用人cd3和小鼠cd3标记jurkat细胞447.测试了dna缀合对jurkat细胞上cd3结合的影响。将人cd3(hcd3、mca463)和小鼠cd3(mcd3、mca500)与af488‑nhs一起孵育，其中af499‑nhs的浓度比cd3蛋白高1倍、2倍、5倍和10倍，以产生标记的cd3，其中af999与cd3的胺偶联。将缀合的hcd3和mcd3与jurkat细胞一起孵育。洗去未结合的cd3蛋白。确定来自标记的细胞的荧光信号(图38)。通过与商业jurkat细胞对照比较来标准化荧光信号。数据显示相对于mcd3，jurkat细胞特异性地结合至hcd3，从而表明染料/dna的缀合不影响cd3蛋白与jurkat细胞的结合。可添加封闭试剂(例如，fbs、5％bsa)以改善特异性。448.实施例viii：将dna条形码与抗体的igg缀合449.将抗体与甲基四嗪‑peg5‑nhs酯在室温下孵育1小时并脱盐。将约65nt长的dna条形码与tco‑peg4‑nhs酯在室温下孵育1小时并脱盐。将所得抗体和dna条形码在室温下孵育2小时以进行缀合。图39a示出缀合策略。将缀合的抗体‑dna复合物进行蛋白质凝胶分析。如图39b所示，约20kda的蛋白质凝胶移位表明dna条形码与抗体的igg成功缀合。验证用于第一抗体条形编码的多种可行化学(例如，mtet、二苯并环辛炔(dbco)、siteclick)。将缀合的抗体‑dna复合物与细胞一起孵育以用于标记。450.实施例ix：使用抗体结合蛋白将寡核苷酸缀合至抗体451.抗体结合蛋白质蛋白质x(蛋白质a或蛋白质g)用二苯并环辛炔‑n‑羟基琥珀酰亚胺酯(dbco‑nhs)官能化。荧光素亚酰胺(fam)标记的oligox22‑叠氮化物(3eq)用作与抗体结合蛋白缀合的寡核苷酸。官能化的抗体结合蛋白和寡核苷酸如图40所示缀合。二苯并环辛炔(dbco)与蛋白g之间的缀合程度可基于gong等人,simplemethodtoprepareoligonucleotide‑conjugatedantibodiesanditsapplicationinmultiplexproteindetectioninsinglecells.bioconjugatechem.,2016进行控制，所述文献以引用的方式整体并入本文。如图41所示，可通过调节输入dbco‑nhs浓度来控制dbco并入的程度。452.此外，如图42所示，可通过寡核苷酸等价性来控制缀合程度。通过凝胶电泳(sds‑page)分析粗蛋白‑寡核苷酸缀合反应，以确定缀合效率和缀合的寡核苷酸的数量。如图42所示，相对于蛋白质，寡核苷酸等价性的增加导致更高程度的缀合。因为寡核苷酸含有荧光分子，所以可用凝胶内荧光成像(图42中的黑色图)容易地可视化未使用的寡核苷酸。453.将寡核苷酸‑蛋白质x缀合物与cd47抗体一起孵育以形成标记的抗体。将标记的抗体与jurkat细胞一起孵育并洗涤两次以制备标记的细胞。使用流式细胞术通过荧光信号测量细胞的标记(图43)。454.实施例x：产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒455.此实施例示出用于产生与具有不同引物序列的寡核苷酸偶联的珠粒的方法。工作流程在图44中示出。条形码序列4421与偶联至珠粒的序列引物r14411连接。r1引物4411和条形码序列4421形成珠粒上寡核苷酸的主链4420。多个主链寡核苷酸4420偶联至同一珠粒。然后将不同的引物序列连接至主链寡核苷酸4420。引物包括靶向mrna分子的聚‑a的聚‑t引物4431。引物还包括靶特异性引物，例如与抗体上的条形码结合的抗体靶引物。在第二连接后，珠粒包含具有聚‑t引物的寡核苷酸(4430)和具有抗体靶引物的寡核苷酸(4440)。来自所述方法的所得产物是与多个寡核苷酸偶联的珠粒(图45a)。所有寡核苷酸包含相同的主链。一些寡核苷酸包含聚‑t引物，并且一些包含抗体靶引物。通过凝胶电泳分析具有0％、5％、15％和25％的含有抗体靶引物的偶联寡核苷酸的珠粒(图45b)456.实施例xi：条形码抗体标记剂和细胞表面特征分析457.在第一组实验中，使用点击化学反应方案将包含叠氮化物官能团和fam染料的带条形码寡核苷酸缀合至蛋白g标记剂。所述带条形码寡核苷酸包括可用于鉴定蛋白g的条形码序列以及可用作引发位点的序列。将蛋白质g与越来越高摩尔当量的dbco‑nhs(0x、1x、2x、4x和6x)混合在一系列混合物中。dbco‑nhs用于活化胺基团以变得对叠氮化物具有反应性。所述混合物中还包括不同当量的叠氮化物寡核苷酸与dbco(0x、1x、1.5x和2x)。然后使反应进行4小时，并在4％‑12％bis‑tris凝胶上用凝胶电泳评价反应混合物。分析的结果图示于图47a‑图47b中。观察到连接有至多6个寡核苷酸的蛋白g。458.然后将各种标记的蛋白g部分与cd47抗体混合以将标记的蛋白g部分结合至cd47抗体。然后将所得蛋白g‑cd47复合物与293t细胞一起孵育，以使得所述复合物可结合细胞表面上的cd47。洗涤细胞以除去未结合的复合物，且然后进行流式细胞术以经由寡核苷酸结合的fam染料观察抗体的结合。流式细胞术的结果图示于图48中。459.接下来，将标记的细胞与偶联至寡核苷酸的珠粒混合，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列、umi和能够结合细胞中的mrna转录物的聚‑a序列的聚‑t序列。还包括具有引发序列的条形码引物，所述引发序列能够经由带条形码寡核苷酸的引发位点特异性地杂交与cd47抗体偶联的带条形码寡核苷酸。然后将混合物分配成乳液中的微滴。然后使乳液经受适于引发序列的条件以与它们各自的靶标(mrna或带条形码抗体寡核苷酸)杂交，并经由聚合酶或逆转录酶的作用延伸引物。延伸产生带条形码构建体。在反应后，使乳液破乳。通过除去珠粒去除仍附接至珠粒的带条形码转录物构建体，并将上清液进行2xspri分离以回收约110bp抗体条形码。然后分析回收的产物，结果示于图49a和图49b中。460.实施例xii：条形码的偶联461.在大量实验中，图51a中所示的两种寡核苷酸5101和5102经由延伸反应连接在一起。寡核苷酸5101代表包含条形码序列的寡核苷酸，所述条形码序列可用于鉴定包含寡核苷酸5101的分区，并且寡核苷酸5102代表包含条形码序列的寡核苷酸，所述条形码序列可用于鉴定标记剂，如与寡核苷酸5102偶联的抗体。寡核苷酸5102还包含fam染料和包括在寡核苷酸5101上的模板转换寡核苷酸间隔区‑rgrgrg区的3'反向互补序列。在所述实验中，将50nmabbc寡核苷酸5102与寡核苷酸5101以两种单独的混合物混合。混合物中包括用于进行引物延伸反应的试剂，包括能够促进引物延伸反应的两种逆转录酶中的一种和dntp。然后经由毛细管电泳分析延伸产物。462.实验结果图示于图51b中。如所示，检测到具有对应于寡核苷酸5101的条形码序列(或所述条形码序列的互补序列)的序列和对应于寡核苷酸5102的条形码序列(或所述条形码序列的互补序列)的序列两者的预期延伸产物。这些结果证实，所测试的逆转录酶可用于产生具有对应于寡核苷酸5101和5102的条形码序列两者的序列的延伸产物。463.实施例xiii：单细胞条形码行为464.获得抗cd47和抗cd99抗体，并且两种类型都与包含条形码序列的寡核苷酸偶联，所述条形码序列适于鉴定其各自的抗体并且还包含独特分子标识(umi)序列和模板转换寡核苷酸反向互补序列(例如，ccc)。通过将寡核苷酸与蛋白g连接且然后将蛋白g‑寡核苷酸构建体与抗体结合来产生抗体‑寡核苷酸构建体。通过用单个半胱氨酸残基修饰蛋白g并经由半胱氨酸残基将其与寡核苷酸连接来将寡核苷酸连接至蛋白g。蛋白g还包含hisx6标签，其可用于将未缀合的寡核苷酸与偶联至蛋白g的那些寡核苷酸分开。来自产生的构建体的凝胶电泳分析的样品数据示于图52a中。图52a中的泳道示出含有半胱氨酸的蛋白g抗体结合蛋白的表达。培养物泳道描绘均质化的细胞培养物，流通泳道描绘的是所有不与镍‑nta柱结合的蛋白质，并且两个洗脱泳道是洗脱的纯化的蛋白g。465.然后将jurkat细胞与抗体‑寡核苷酸构建体一起孵育，以经由它们各自的细胞表面特征靶标将抗体结合至细胞表面。然后将细胞连同与寡核苷酸连接的珠粒一起分配到乳液中的水性微滴中，所述寡核苷酸包含条形码序列、umi序列、能够与抗体结合的寡核苷酸杂交的引发序列(例如，引物序列包含模板转换序列，如rgrgrg)。在分区中还包括能够破坏珠粒的二硫连键和珠粒与其寡核苷酸之间的连键的还原剂。还原剂释放珠粒的寡核苷酸，且然后使微滴经受适于经由两种寡核苷酸的序列的相互作用(包括经由rgrgrg/ccc相互作用)使先前珠粒结合的寡核苷酸与细胞结合的抗体寡核苷酸杂交的条件。虽然示出特定序列，但可经由两种寡核苷酸末端的任何恒定序列实现杂交。466.然后使两种杂交的寡核苷酸在引物延伸反应中延伸以产生包含对应于珠粒寡核苷酸和抗体条形码序列两者的序列的构建体，类似于图52b(图i)中所示的示例性方案。然后使乳液破乳，进一步加工延伸的产物且然后进行测序。jurkat cd47和jurkat cd47/cd99运行的测序结果分别在图53a的图i和图ii中图示描绘和图53b中制表。图53a和图53b中所示的数据表明如例如通过对应于细胞的源自珠粒的条形码构建体中的抗体‑寡核苷酸umi的大约2‑log富集所证明，包含条形码序列的抗体‑寡核苷酸结构能够显示单细胞行为。467.实施例xiv：抗体条形码染色参数468.与本文所述方法相关的各种参数在其对抗体‑条形码构建体结合的影响的背景下进行评价，所述参数包括逆转录失活过程和分区中还原剂的浓度(例如，如本文其它地方所述的用于降解带条形码珠粒的还原剂)。469.通过将逆转录反应混合物的温度升高至相对高的温度(“热杀灭”)，可使逆转录失活。然而，此类高温可导致抗体条形码构建体从反应混合物中沉淀出来，从而导致不能与细胞结合。针对细胞测试各种抗cd3条形码构建体样品，其中一些样品经受热杀灭，而另一些样品未经受热杀灭。用于实验的测序数据列于图54中。如图54所示，当不使用热杀灭时，许多测序度量得到改善，包括可靠地映射的读数和复杂性。470.此外，高浓度的还原剂还可降解用于标记细胞表面特征的抗体。因此，测试了将还原剂(例如，dtt)浓度降低10倍对分区中逆转录的总体效率的影响。如图55所示，对于所有测试的样品(22mmdtt对比2.2mmdtt)迹线是相似的，从而表明如本文其它地方所述，逆转录可在显著降低的dtt浓度下有效地进行。在另一个实验中，也显示0.15mmdtt是有效的。471.实施例xv：使用带条形码mhc‑抗原多聚体将t细胞受体序列与抗原结合表型连接472.许多tcr可结合特定抗原(具有不同的亲和力)并且鉴定对特定抗原具有特异性的个别克隆型是困难的。虽然流式细胞术和基于珠粒的富集方案允许对抗原结合细胞的物理分选，但当细胞稀少或样品有限时，与传统方法相关的细胞损失可能是不可接受的。此外，基于荧光检测的传统方法在多重化(在单个实验中同时测定多种独立抗原/配体的结合性质的能力)方面具有重要限制，因为可有效地组合使用的光谱可区分荧光标记的数量较少。此外，多种抗原结合克隆型可存在于异质样品中，这使得鉴定特异性抗原结合tcr复合物变得困难，即使当对表达抗原结合克隆型的细胞进行物理分选时。473.本文所述的组合物、方法和系统允许用寡核苷酸(dna或rna)官能化mhc‑肽多聚体，所述寡核苷酸包含对mhc‑肽身份具有特异性的独特肽条形码序列(例如，与肽egaliywpn相关的条形码1，与肽ahmrdsqq相关的条形码2等)。可将单一肽‑mhc复合物或肽‑mhc文库暴露于细胞(例如，t细胞)群体以产生用带条形码mhc多聚体“标记”的细胞。然后可如本文所述对这些细胞进行分配和加工以组装tcr序列并定量与每个细胞缔合的mhc‑肽条形码的数量。具有低水平的mhc‑肽来源的umi的克隆型对mhc‑肽具有低亲和力，而具有高水平的mhc‑肽umi的克隆型对抗原具有高亲和力。474.与链霉抗生物素蛋白核心结合的带条形码的肽结合的mhc四聚体通常如图54a所描绘并如下所述产生。尽管在以下系列实验中使用i类mhc‑四聚体，但是存在可与本文公开的组合物、方法和系统(例如mhc五聚体)(经由卷曲螺旋结构域组装的mhc，例如mhci类五聚体、(proimmune,ltd.)、mhc修饰的葡聚糖分子(例如，mhc(immudex))等一起使用的i类和/或ii类mhc‑抗原多聚体的许多可能的构型。475.如图57a所描绘，使用一般赖氨酸化学(经由具有nhs‑dbco的赖氨酸残基修饰的链霉抗生物素蛋白；随后经由dbco官能团附接叠氮化物修饰的寡核苷酸)将链霉抗生物素蛋白分子(5701)缀合至杂交寡核苷酸(5702)以产生链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。然后在tbe‑尿素变性琼脂糖凝胶上分析链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。如图58a所示，0.6μm、1.2μm、1.8μm、2.4μm和3μm未修饰的寡核苷酸全部观察到具有相似大小的条带，而链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸表现出明显的分子量偏移，从而表明成功的链霉抗生物素蛋白缀合。在链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸泳道中观察到的多个条带对应于附接有增加数量的寡核苷酸(例如，1个寡核苷酸、2个寡核苷酸、3个寡核苷酸等)的缀合的链霉抗生物素蛋白分子。如图58a所示，用最少过量的非缀合的寡核苷酸产生链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸。476.还在sds‑page蛋白质凝胶上分析了链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)。如图58b所示，0.25μg、0.5μg和1.0μg未修饰的链霉抗生物素蛋白表现出相似的分子量，而链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸表现出分子量偏移，指示链霉抗生物素蛋白与0、1、2、3、4个(或更多个)寡核苷酸缀合。可通过比较缀合的寡核苷酸条带的密度与0.25μg、0.5μg和1.0μg未修饰的链霉抗生物素蛋白条带的密度来估计缀合的寡核苷酸的定量。从这种比较，缀合的总体程度是每个链霉抗生物素蛋白亚基大约1个寡核苷酸(产生每个mhc四聚体大约4个寡核苷酸)。477.在定量缀合程度后，条形码寡核苷酸(5708)以条形码寡核苷酸(5708)与链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)的0.25:1至1:1之间的化学计量经由杂交寡核苷酸序列(5702)的反向互补序列(5704)与链霉抗生物素蛋白缀合的寡核苷酸(5703)杂交。在此，条形码寡核苷酸(5708)包含为杂交寡核苷酸序列(5702)的反向互补序列(5704)的序列、truseqr2测序引物序列(5705)、独特分子标识(umi)(任何“n”核苷酸系列)和条形码序列(5706)，以及与凝胶珠粒上的序列互补的衔接子序列(5707)。或者，条形码寡核苷酸可直接与链霉抗生物素蛋白缀合。478.在杂交后，将带条形码链霉抗生物素蛋白(5709)添加至展示埃‑巴二氏病毒(ebv)肽抗原(glctlvaml)的生物素化的hla‑a‑02:01mhc单体池(参见例如5606)以产生带条形码mhc四聚体(参见，例如，5608)。添加带条形码链霉抗生物素蛋白(5709)，直至达到生物素化的ebvmhc单体与生物素结合位点的1:1比率(4个生物素化的mhc单体/链霉抗生物素蛋白复合物)。479.然后将带条形码mhc四聚体(0.4μg或4.0μg)与约200,000(100μl)ebv抗原扩增的t细胞(astartebiologics)和/或约200,000(100μl)初始t细胞一起孵育30分钟。用pbs/1％fbs洗涤细胞三次以除去未结合的多聚体。然后将细胞重悬于pbs 0.04％bsa中，并分配成包含带条形码mhc结合的t细胞和带条形码凝胶珠粒的微滴(参见例如图11)。然后通常如本文所述加工带条形码mhc四聚体(参见例如图56c和随附文本)。然后裂解t细胞并且释放的mrna分子通常如本文所述进行加工(参见例如图11和随附文本)。然后使微滴乳液破乳并用大量pcr扩增来富集来自tcrcdna的带条形码的全长v(d)j区段。制备第二文库以量化与每个细胞缔合的mhc‑ebv肽umi的数量。然后使用illumina测序仪对完全构建的测序文库进行测序。生物信息学地组装t细胞受体克隆型，并且定量每个细胞和每种克隆型的来自带条形码mhc四聚体的umi计数的数量。480.图59示出来自带条形码mhc四聚体的umi计数对比通过条形码数量测量的克隆型频率。对于检测到的每种克隆型，针对对应于所述克隆型的所有细胞相关的细胞条形码计算每个细胞条形码的mhc多聚体来源的umi计数的平均数量，并且在y轴上绘制一加其每个细胞的平均umi计数值的log10。在x轴上绘制用每种克隆型检测的细胞相关细胞条形码的数量。出于可视化目的，将随机量的高斯噪声添加至每个点的x和y坐标值以避免过度绘制。特征5901显示将与4μgmhc多聚体一起孵育的ebv扩增的t细胞(“1kebc 4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；特征5902显示将来自与0.4μgmhc多聚体一起孵育的ebv扩增的t细胞(“1kebc 0.4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；特征5903显示将来自与4μgmhc多聚体一起孵育的初始t细胞(“1kt 4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值；并且特征5904显示将来自与0.4μgmhc多聚体一起孵育的初始t细胞(“1kt 0.4ugtet”)的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值。如图59所示，与针对初始t细胞群体(特征5903和5904)获得的值相比，ebv扩增的细胞类型具有与四聚体相关的最多umi计数(特征5901和5902)。此外，来自在ebv扩增的细胞群体内以高频率出现的ebv扩增细胞的克隆型(有界圆，特征5905)表现出更高的mhc‑四聚体umi值，从而表明它们在ebv扩增的群体中的富集频率与优先mhc‑四聚体结合相关。相反，预期初始t细胞不会优先结合抗原，并且所有都具有低背景水平的四聚体相关umi。481.在另一个实验中，在与上述带条形码mhc四聚体孵育之前，将ebv扩增的t细胞掺入初始t细胞背景中。然后如前所述将细胞进行加工、测序和分析。图60示出来自带条形码mhc四聚体的umi计数的数量对比来自混合t细胞群体的克隆型频率(遵循图59中使用的轴和绘图惯例)。特征6001显示将来自含有克隆型的细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值，所述克隆型先前观察到在独立加工的ebv扩增的细胞的至少一个样品中发生(“ebv(n＝1)”)；特征6002显示将来自含有克隆型的细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值，所述克隆型先前观察到在独立加工的ebv扩增的细胞的多于一个样品中发生(“ebv(n>1)”)；而特征6003显示将来自在实验(“其它”)中检测到的所有细胞的所有克隆型平均的log10(1 umi计数/每个细胞)的平均y轴值。如图60所示，虽然来自ebv加标的精确细胞数量未知(由于洗涤过程中初始t细胞与ebv扩增的细胞之间的细胞恢回收的差异)，但在这种混合样品中检测到代表总计四个细胞的两种克隆型(有界圆，特征6004)，所述样品表现出非常高的四聚体相关umi计数(比背景高约1000倍)。确定这四个细胞对应于ebv扩增的样品中最频繁检测到的细胞的克隆型，并且对应于ebv加标细胞。因此，可将目标特定克隆型与含有复杂克隆型分布的混合细胞群体区分开。482.尽管本文已示出和描述了本发明的一些实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。并不意图本发明受本说明书内所提供的具体实施例限制。尽管参照前面提及的说明书描述了本发明，但是本文实施方案的描述和说明并非从限制意义上进行解释。在不背离本发明的情况下本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代。此外，应该理解本发明的所有方面并非限制于在此阐述的取决于各种条件和变量的具体描绘、配置或相对比例。应当理解的是，可在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，应该想到的是，本发明还应该覆盖任何此类替代方案、修改、变化或等效物。以下权利要求书意图限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。当前第1页12当前第1页12
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