黑果枸杞LrEIN3基因在延缓果实成熟中的应用

黑果枸杞lrein3基因在延缓果实成熟中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种黑果枸杞lrein3基因、及其编码蛋白在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用。


背景技术：

2.黑果枸杞(lycium ruthenicum)是茄科枸杞属多年生落叶小灌木，黑果枸杞果实成熟后迅速软化，使得黑果枸杞市场以干燥成熟果实为主，极大地制约了黑果枸杞产业的发展。
3.基因编辑技术可以实现对特定基因的定点敲除，以创制人工突变体。对非模式植物来说，基因编辑技术可以加速物种驯化过程，通过短时高效的生物技术手段获得突变体，打破传统育种方式的种种壁垒。例如，通过基因编辑技术对香蕉maaco1基因的定点编辑可以延缓香蕉自然成熟过程，提高香蕉的货架期(hu et al.,2021)。
4.因此，从黑果枸杞中发掘研究可以使黑果枸杞果实成熟延迟的基因，通过基因编辑技术对该基因进行定点编辑，使得黑果枸杞果实成熟滞后，放缓成熟软化过程，对延长黑果枸杞的货架期具有重要的意义。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的之一在于提供一种可以黑果枸杞lrein3基因在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用。
6.实现上述发明目的具体技术方案包括如下：
7.黑果枸杞lrein3基因在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用，所述黑果枸杞lrein3基因编码如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白。
8.在其中一些实施例中，所述黑果枸杞lrein3基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.本发明还提供了一种黑果枸杞lrein3蛋白在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用，所述黑果枸杞lrein3蛋白具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。
10.本发明还提供了上述黑果枸杞lrein3基因、或黑果枸杞lrein3蛋白在黑果枸杞遗传育种中的应用。
11.本发明还提供了一种黑果枸杞lrein3基因编辑载体，所述黑果枸杞lrein3基因编码如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白。
12.在其中一些实施例中，所述黑果枸杞lrein3基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
13.在其中一些实施例中，所述黑果枸杞lrein3基因编辑载体为pagm4723::cr-lrein3，所述黑果枸杞lrein3基因编辑载体具有如seq id no.8所示的核苷酸序列。
14.本发明还提供了上述黑果枸杞lrein3基因编辑载体在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用。
15.本发明还提供了上述黑果枸杞lrein3基因编辑载体在黑果枸杞遗传育种中的应用。
16.本发明还提供了一种转化有上述黑果枸杞lrein3基因编辑载体的工程菌。
17.在其中一些实施例中，所述工程菌为转化有pagm4723::cr-lrein3的农杆菌gv3101。
18.本发明还提供了上述工程菌在延缓黑果枸杞果实成熟中的应用。
19.本发明还提供了上述工程菌在黑果枸杞遗传育种中的应用。
20.本发明还提供了一种延缓黑果枸杞果实成熟的方法。
21.实现上述发明目的的技术方案包括如下：
22.一种延缓黑果枸杞果实成熟的方法，所述方法包括以下步骤：利用crispr-cas9系统对黑果枸杞lrein3基因进行编辑，使黑果枸杞lrein3基因的功能丧失；所述黑果枸杞lrein3基因编码如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白。
23.在其中一些实施例中，所述黑果枸杞lrein3基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.在本发明中，通过将采用cripsr-cas9基因编辑技术对lrein3基因进行精确编辑后的载体转入黑果枸杞中，得到lrein3基因纯合突变体植株，相对于野生型32天果实就变色成熟，lrein3基因突变体植株34天果实才开始转色。说明lrein3基因可以延缓黑果枸杞果实自然成熟，有助于延长黑果枸杞的货架期。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中黑果枸杞lrein3转录因子的结构域分析图。
27.图2为本发明实施例1中构建的重组载体的结构示意图。
28.图3为本发明实施例2中t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株的pcr结果；其中，wt为未转化的野生型植株，lrein3-4、lrein3-9、lrein3-10、lrein3-11和lrein3-16为t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株。
29.图4为本发明实施例2中t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株的基因型分析结果；其中，wt为未转化的野生型植株，lrein3-4、lrein3-9和lrein3-11为t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株。
30.图5为本发明实施例3中连续观测t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株花后37天的果实表型。
具体实施方式
31.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
32.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列
项目的任意的和所有的组合。
33.以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行实验。
34.在本发明中，所述黑果枸杞的品种可以是黑果枸杞常规品种，也可为野生黑果枸杞种质资源。以下实施例中使用的是宁夏回族自治区中卫市中宁县的黑果枸杞，为野生种。
35.本发明中lrein3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
36.seq id no.1
37.atgatgatgtttgaagagatcgggttttgtggtgatctagatttcttccccactccgctaaaggaggtggaagccgctgctccacagggtgatccggagccgttgatggacgacgattatagtgatgaagagattgaagttgatgagttggagaggaggatgtggagggataaaatgaagcttaaaaggcttaaagaaatgagtagtaagggcaaggaaggtgttgactcggtcaaacaacgccagtctcaggagcaagcgaggaggaagaagatgtcgagggcacaagatgggatcttgaagtacatgttgaagatgatggaagtatgtaaagctcagggtttcgtttacggaattatccctgagaaaggcaaaccggtgaccggggcttctgataatctaagggagtggtggaaggataaggtcaggttcgatcgcaacgggcctgccgccatagcgaagtaccaagctgataacgccatccctggcaagaacgagggatctaatccgattggtccgacccctcacaccttgcaggagcttcaagataccactcttggttctttattgtcagctttaatgcaacattgtgatcctcctcagaggcgattcccattggagaaaggcgttgcacctccatggtggcctaatggactggaggattggtggcctcaattgggacttccgaaggatcaaggtcctccaccttataagaagcctcatgatctgaagaaggcctggaaggttggtgttctcacagcagtgatcaagcatatgtcccctgatattgctaagattcgcaacctggtaaggcaatcaaagtgcttgcaggacaagatgacggcgaaggaaagtgcaacttggcttgccatcatcaatcaggaggaagtcttggctcgagaactttatcctgatcgctgtccgcctttgtcctccgctggcggtagtggaactttcactatgaatgacagcagcgagtatgatgttgaaggtgccgttgatgaccctattaactttgatgctcaagagcaaaaaccaaaccatctaggtttgctgaatgctaatgtcgatatgtttaaggagaggctacctctgcaacagcaatctcatccaatcaaggatgaaattattgccagcttagatttcactcggaagagaaagccggctgatgacctgacttttttgatggatcagaagatatatgtttgtgagtgtcttcaatgtccgcatagtgagctccgccatggatttccggacagatccattagagacaatcatcagttaagttgcccttacagaaatccttcgcaatttggagtttcaaactttcacgtggatgaagtcaagccggttttcccgcaacaatatgttcaaccaaagacggcttctctggcggttaacccagctccaccgtccttcgatctatcaggacttggggttcctgaagacgggcacaggatgatcaatgaccttatgtcattctatgatagtaacgtacaaggaaataaaagctcaatggttgggaatgttgagcagcctcgtaaacaacctagtgttcaacagaacaattacctacaaagccaaggaattgtgttggagggaaatgtctttggggactccaacatttctgctaatcataattccgtgttcgcgcaaggagatcggtttgatcagagcaaggctttaacttcaccgttcaatgcaggctctagtgacaatttccatttcatgttcgggtcttcattcaatttacaatccaccgattactctgaaggtctttctgggatctcacatgatagcttgccgaagcaagatgttccggtttggtact
38.seq id no.2
39.mmmfeeigfcgdldffptplkeveaaapqgdpeplmdddysdeeievdelerrmwrdkmklkrlkemsskgkegvdsvkqrqsqeqarrkkmsraqdgilkymlkmmevckaqgfvygiipekgkpvtgasdnlrewwkdkvrfdrngpaaiakyqadnaipgknegsnpigptphtlqelqdttlgsllsalmqhcdppqrrfplekgvappwwpngledwwpqlglpkdqgpppykkphdlkkawkvgvltavikhmspdiakirnlvrqskclqdkmtakesatwlaiinqeevlarelypdrcpplssaggsgtftmndsseydvegavddpinfdaqeqkpnhlgllnanvdmfkerlplqqqshpikdeii
asldftrkrkpaddltflmdqkiyvceclqcphselrhgfpdrsirdnhqlscpyrnpsqfgvsnfhvdevkpvfpqqyvqpktaslavnpappsfdlsglgvpedghrmindlmsfydsnvqgnkssmvgnveqprkqpsvqqnnylqsqgivlegnvfgdsnisanhnsvfaqgdrfdqskaltspfnagssdnfhfmfgssfnlqstdyseglsgishdslpkqdvpvwy
40.在本发明中，首先提供了黑果枸杞lrein3基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3，该载体具有如seq id no.8所示的核苷酸序列。所述黑果枸杞lrein3基因编辑载体是利用crispr/cas9系统对黑果枸杞lrein3基因进行编辑而得，crispr/cas9系统中包括cas9蛋白的编码基因、以及两个sgrna的编码基因，分别为sgrna1(seq id no.3)和sgrna2(seq id no.4)。
41.在本发明中，还提供了转化有上述黑果枸杞lrein3基因编辑载体的工程菌，所述工程菌为转化有重组载体pagm4723::cr-lrein3的农杆菌gv3101。
42.以下实施例中使用的pgreen ii 62-sk、pgreen ii 0800、pgadt7、pabai、pich86966::atu6p::sgrna_pds、picsl01009::atu6p、pich47751、pich47761、pagm4723、pich41780、pich47742::2x35s-5’utr-hcas9(stop)-nost和pich47732::nosp-nptii-ocst载体、pgreenii0800-luc均可从addgene载体库(http://www.addgen.org/)购买。
43.以下实施例中使用的pcr buffer kod-plus、kod-plus-dna聚合酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品；限制性内切酶、t4连接酶、dna连接试剂盒为neb公司产品；pcr产物纯化试剂盒和植物基因组dna提取试剂盒均为广州美基生物科技有限公司的产品；ms培养基购自北京珍永伟科技发展有限公司，货号为m519；gv3101感受态购自上海唯地生物技术有限公司(货号ac1001s)；引物为北京擎科生物科技有限公司合成；测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.以下结合具体实施例和附图来详细说明本发明。
45.实施例1 cripsr-cas9基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3的构建、并转化农杆菌
46.本实施例首先构建得到了cripsr-cas9基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3，再接着将基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3转化至农杆菌gv3101中，得到重组农杆菌pagm4723::cr-lrein3/gv3101，具体包括以下步骤：
47.一、获得lrein3基因cripsr-cas9基因编辑靶点序列
48.从黑果枸杞基因组信息中获得lrein3的基因组信息，对lrein3基因(序列为seq id no.1)转录因子的结构域进行分析，分析结果如图1所示。
49.应用在线软件http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/，在lrein3基因序列上，选取得分高、外显子区域、ngg序列前端的20bp长度的序列。通过设计最终选定了两条可提高编辑效率的sgrna靶点，sgrna具体序列如下：
50.sgrnal(seq id no.3)：
51.5'-gcggcttccacctcctttag-3'
52.sgrna2(seq id no.4)：
53.5'-gagaaaggcaaaccggtgac-3'
54.二、构建lrein3基因的cripsr-cas9基因编辑载体
55.1、sgrna扩增引物的设计
56.根据选定的靶点序列，设计构建sgrna扩增引物，具体为：
57.lrein3-g1(seq id no.5)：
58.5'-tgtggtctcaattggcggcttccacctcctttaggttttagagctagaaatagcaag-3'
59.lrein3-g2(seq id no.6)：
60.5'-tgtggtctcaattggagaaaggcaaaccggtgacgttttagagctagaaatagcaag-3'
61.sgrna-r(seq id no.7)：
[0062]5’‑
tgtggtctcaagcgtaatgccaactttgtac-3’[0063]
2、cripsr-cas9基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3的构建
[0064]
a、重组质粒pich47751::lrein3-sgrna1、pich47761::lrein3-sgrna2的构建
[0065]
以pich86966::atu6p::sgrna_pds为模板，分别以lrein3-g1(seq id no.5)和sgrna-r(seq id no.7)、lrein3-g2(seq id no.6)和sgrna-r(seq id no.7)为引物进行pcr扩增。
[0066]
pcr反应体系为：10
×
pcr buffer kod-plus 5μl、25mm mgso
4 2μl、正向引物lrein3-g1/lrein3-g2 1.5μl、反向引物sgrna-r 1.5μl、2mm dntps 5μl、模板10～200ng、kod-plus-dna聚合酶1μl、加双蒸水至50μl。
[0067]
pcr反应程序为：94℃变性120秒；98℃变性10秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共32个循环；4℃保温。
[0068]
扩增获得两侧带均带有bsa i酶切位点的靶点sgrna-1和sgrna-2核苷酸片段；采用pcr产物纯化试剂盒纯化pcr扩增产物，将纯化后的pcr扩增产物用bsa i酶切，sgrna-1与经同样酶切的pich47751载体和picsl01009::atu6p载体，在dna连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pich47751::lrein3-sgrna1；sgrna-2与经同样酶切的pich47761载体和picsl01009::atu6p载体，在dna连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pich47761::lrein3-sgrna2。
[0069]
b、cripsr-cas9基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3的构建
[0070]
根据文献“soyk s,muller na,park sj,schmalenbach i,jiang k,hayama r,et al.variation in the flowering gene self pruning 5g promotes day-neutrality and early yield in tomato.nature genetics.2017；49(1):162-168”中所述方法，利用golden gate克隆技术对pich47751::lrein3-sgrna1、pich47761::lrein3-sgrna2、pich47732::nosp-nptii-ocst、pich47742::2x35s-5'utr-hcas9(stop)-nost、pich41780和pagm4723进行重组，获得cripsr-cas9基因编辑重组载体pagm4723::cr-lrein3(其中cr是crispr的缩写，表示基因编辑)，重组载体结构图如图2所示，核苷酸序列如seq id no.8所示。
[0071]
三、将基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3转化农杆菌
[0072]
取1μg步骤二制备的基因编辑载体pagm4723::cr-lrein3置于100μl gv3101感受态中，液氮中速冻5分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml lb培养基，28℃培养4小时；涂布于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb平板上，28℃黑暗培养2天；挑单菌落，接种于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
[0073]
对菌液进行pcr鉴定，以cas9-f(5'-ccgacgctaacctcgataag-3'，seq id no.9)和cas9-r(5'-cgagctgagagaggtcgatt-3'，seq id no.10)为引物，进行pcr扩增(pcr反应体系
和反应程序同步骤二)，得到大小为757bp的扩增片段，即为阳性重组菌，将该重组菌命名为pagm4723::cr-lrein3/gv3101，-80℃冻存备用。
[0074]
实施例2 t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株的获得及鉴定
[0075]
本实施例获得了t0代lrein3基因编辑黑果枸杞植株，并进行了鉴定，具体方法如下：
[0076]
1、将实施例1的重组菌pagm4723::cr-lrein3/gv3101转化黑果枸杞叶盘外植体(转化方法参考中国科学院大学，薛定磊硕士学位论文)，然后在含0.5mg/l6-苄氨基嘌呤、0.4mg/l1-萘乙酸的ms固体培养基(ph为5.8)中，于25℃、暗处理条件下共培养48小时；再转入含有0.5mg/l6-苄氨基嘌呤、0.4mg/l1-萘乙酸、200mg/l头孢霉素和50mg/l卡那霉素的ms固体培养基(ph为5.8)中，于25℃、光周期16h/d、光照强度3000lux条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2～3cm时切下再生芽，转入含有200mg/l头孢霉素和50mg/l卡那霉素的ms固体培养基(ph为5.8)中，在25℃、光周期16h/d、光照强度3000lux条件下培养至生根，即为t0代再生植株。
[0077]
2、采用植物基因组dna提取试剂盒提取上述t0代再生植株dna，以dna为模板，cr-lrein3-f(seq id no.11)和cr-lrein3-r(seq id no.12)为引物，进行pcr扩增。
[0078]
pcr反应体系为：10
×
pcrbufferkod-plus5μl、25mmmgso42μl、正向引物cr-lrein3-f1.5μl、反向引物cr-lrein3-r1.5μl、2mmdntps5μl、模板10～200ng、kod-plus-dna酶1μl、加双蒸水至50μl。
[0079]
引物序列如下：
[0080]
cr-lrein3-f(seq id no.11)：
[0081]
5'-gcctttggttgttgctatatgtaat-3'
[0082]
cr-lrein3-r(seq id no.12)：
[0083]
5'-gatggcgttatcagcttggtact-3'
[0084]
pcr反应程序为：94℃变性120秒；98℃变性10秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共32个循环；4℃保温。
[0085]
3、对获得的pcr产物进行核酸电泳分析，结果如图3所示，与野生型植株wt相比，lrein3-4、lrein3-9、lrein3-10、lrein3-11和lrein3-16的pcr产物大小与野生型片段一致，说明在基因组水平没有发生大片段的缺失。
[0086]
进一步的，pcr产物通过t-a克隆测序分析，发现lrein3-10和lrein3-16存在野生型基因组，未完全编辑。lrein3-4、lrein3-9和lrein3-11的基因型分析结果如图4所示。从图4可以看出：与野生型基因组信息相比，lrein3-4出现-1bp/ 1bp的核酸突变类型、lrein3-9出现-6bp/-6bp的核酸片段的缺失，在另一条等位基因的一个位点上出现了-36bp/ 27bp的indel，另一个位点-6bp的突变体类型；lrein3-11出现 1bp/-6bp的碱基的插入。这些突变体测序结果说明lrein3-4、lrein3-9和lrein3-11均为lrein3基因纯合突变植株。
[0087]
实施例3 lrein3基因编辑黑果枸杞植株的果实成熟的研究
[0088]
连续观测实施例2获得的lrein3基因编辑黑果枸杞植株lrein3-4和lrein3-9开花后果实的表型，结果如图5所示。
[0089]
从图5可以看出：lrein3基因编辑黑果枸杞植株的果实发育明显受到了影响。野生
型黑果枸杞植株在花后32天果实突然转色成熟，之后果实骤然膨大；而lrein3基因编辑黑果枸杞植株lrein3-4在花后32天果实才略有转色，34天颜色稍深，37天后果实才完全成熟；lrein3基因编辑黑果枸杞植株lrein3-9在花后一直果实较小，直至34天果实才开始转色，果实尺寸也没有明显变化，37天后果实颜色才加深，果实尺寸开始膨大；说明lrein3基因编辑黑果枸杞植株的果实发育时长被增加，果实成熟被推迟。
[0090]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0091]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。