一种维生素B1半抗原、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备方法与流程

一种维生素b1半抗原、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备方法
技术领域
1.本发明涉及单克隆抗体检测技术领域，具体涉及一种维生素b1半抗原、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备方法。


背景技术：

2.维生素b1,又称“硫胺素”，硫胺素分子包含一个嘧啶环和一个噻唑环，通过亚甲基桥连接而成。在动物体内，它以磷酸盐的形式存在，其中主要的形式是与焦磷酸生成硫胺素焦磷酸(tpp)，少部分为硫胺素一磷酸(tmp)、硫胺素三磷酸(ttp)和游离硫胺素。植物和某些低等动物能合成硫胺素，哺乳动物消化道中的细菌也能合成一些硫胺素，合成量与食物的摄取等许多因素有关。在大多数情况下，哺乳动物几乎完全依靠食物中的硫胺素。硫胺素进人细胞后，在多种酶的参与下即被磷酸化而成为磷酸脂，其中80％为tpp,10％为tpp,tmp和硫胺素，研究发现，在阿尔茨海默病(ad)患者中，ad患者和动物模型脑细胞糖与能量代谢闲着降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成，糖代谢障碍已被认为是ad的独立危险因素，进一步研究发现，在ad患者中，与脑细胞糖和能量代谢障碍有关的酶活性异常中，仅以硫胺素(维生素b1)作为辅酶的kgdh、pdh、tk等活性下降最为明显，因此研究体内硫胺素(维生素b1)的含量变化显得尤为重要。为了建立体内血清硫胺素(维生素b1)的免疫测定方法，开发针对硫胺素(维生素b1)的抗体显得尤为重要。
3.目前对于人体中硫胺素(维生素b1)含量的检测的仪器和检测方法各有不同，主要有微生物法、紫外分光光度法、荧光分析法、高效液相色谱法等。其中，高效液相色谱法中的前处理技术繁琐耗时、需要较多有机溶剂，且血清需要量较大，并且需要专门技术人员进行操作，检测方法繁杂，检测时间较长，所以不易推广。开发出一种针对硫胺素(维生素b1)单抗，进行免疫方法的建立会更便捷、准确。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本技术提供一种维生素b1半抗原、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备方法。具体采用维生素b1与载体蛋白的偶联物作为免疫原和检测原，免疫balb/c小鼠，常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0融合，利用改进的方法对融合细胞所分泌的抗体进行正筛选和负筛选；经过3次克隆，获得1株可稳定分泌抗维生素b1的杂交瘤细胞株，该株杂交瘤细胞分泌的抗体属于igg1亚类，相对分子质量约为150kd，抗体滴度为3.90
×
106，抗体亲和力为5.0
×
108l/mol，而且获得的抗体能够用于维生素b1免疫学检测方法的建立。
5.为实现本发明目的，本发明的技术方案如下:
[0006][0007]
第一方面，一种维生素b1半抗原，分子式结构如式(ⅰ)所示：
[0008]
进一步的，维生素b1半抗原的制备方法包括：
[0009]
s1、用钥匙取7.38g维生素b1与5.34g溴戊酸；
[0010]
s2、向试管中加入15mln,n-二甲基甲酰胺溶液；
[0011]
s3、将量取的维生素b1与溴戊酸加入到试管中的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，得到维生素b1反应溶液；
[0012]
s4、向所述维生素b1反应溶液中添加170mg碳酸钾，得维生素b1半抗原反应混合溶液；
[0013]
s5、将所述维生素b1半抗原反应混合溶液进行回流处理，用水淬灭反应混合物，然后再用甲苯对所述维生素b1半抗原反应混合溶液进行萃取，萃取出维生素b1半抗原有机混合层；
[0014]
s6、将所述维生素b1半抗原有机混合层用盐水进行洗涤，再用无水硫酸钠进行干燥，得纯度较高的维生素b1半抗原固体；
[0015]
s7、将所述纯度较高的维生素b1半抗原固体经真空浓缩后用石油对所述维生素b1半抗原固体进行浓缩，获得高纯度的维生素b1半抗原。
[0016]
需要说明的是，本技术所提供的维生素b1半抗原，相对于常规的维生素b1，其主要区别在于，维生素b1半抗原对维生素b1的氨基端进行加长修饰，将氨基上的一个氢原子取代为戊酸，使得维生素b1半抗原在不同的实验条件下不仅其羧基端可以与牛血清白蛋白上的氨基联合，形成维生素b1免疫原；而且其羟基端可以与卵清蛋白上的羧基端联合，形成维生素b1包被原。
[0017]
进一步的，为了得到维生素b1免疫原和维生素b1包被原，需要将维生素b1半抗原分别在不同的实验条件下和牛血清白蛋白与卵清蛋白进行联合，其中维生素b1半抗原的制备方法包括步骤：
[0018]
①
取20mg维生素b1半抗原，将其溶解于盛装有4mln,n-二甲基甲酰胺的试管中，再加入7.5mg可溶于水的碳二亚胺和9mgn-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌5小时，获得维生素b1半抗原半抗原活化液a液；
[0019]
②
取50mg牛血清白蛋白(bsa)，将其溶解于3ml 0.05mol/l的pb缓冲液中，获得免疫原载体蛋白b液；
[0020]
③
将所述a液滴加到所述b液中，搅拌24小时后用0.02mol/lpbs透析3天，得所述维生素b1免疫原。
[0021]
进一步的，维生素b1包被原的制备方法包括步骤：
[0022]
①
取17mg维生素b1半抗原，溶解于盛装有4ml dmso溶液的离心管中，再向所述试管中加入79μl三乙胺和46μl氯甲酸异丁酯，室温震荡所述装有混合溶液的离心管5小时，获得维生素b1包被原活化液c液；
[0023]
②
取50mg卵清白蛋白(ova)，将其溶解于3ml 0.05mol/l的pb缓冲液中，获得包被原载体蛋白d液；
[0024]
③
将所述c液滴加到所述d液中，搅拌24小时后用0.02mol/lpbs透析3天，得所述维生素b1包被原。
[0025]
需要说明的是，本技术所制备得到的维生素b1免疫原溶液和维生素b1包被原溶液都要置于零下20度的条件下保存。
[0026]
第二方面，本技术还包括利用维生素b1免疫原免疫balb/c小鼠，以获得维生素b1单克隆抗体的制备方法，包括步骤：
[0027]
①
将维生素b1免疫原对balb/c小鼠进行间隔免疫，以激活balb/c小鼠腹腔内的脾细胞产生维生素b1抗体；
[0028]
②
将所述产生维生素b1抗体的balb/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌维生素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞；
[0029]
③
将降植烷注射到所述balb/c小鼠腹腔内，10～14天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化,计算分子量和单抗亚类。
[0030]
④
在第三次免疫后，对小鼠腹腔进行回忆刺激，将维生素b1免疫原溶解于pbs缓冲液中，注射进小鼠的腹腔内。
[0031]
具体地，用维生素b1免疫原对balb/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述balb/c小鼠体内的脾细胞产生维生素b1单克隆抗体的步骤包括：
[0032]
①
用100μg所述维生素b1免疫原与福氏完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射balb/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
[0033]
②
3周后再用100μg所述维生素b1免疫原与福氏不完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射balb/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；
[0034]
③
此后每2周用50μg的维生素b1免疫原注射balb/c小鼠的腹腔，期间用载体竞争elisa法测定血清效价。
[0035]
具体地，载体竞争elisa法测定血清效价包括步骤：
[0036]
①
所述维生素b1包被原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，每孔100μl包被96孔酶标板，4℃过夜，用pbst清洗3次所述96孔酶标板，每次3分钟；
[0037]
②
加入牛血清白蛋白(bsa)与等量系列稀释的血清共100μl，37℃反应40分钟，洗板3次，每次3分钟；
[0038]
③
加入酶标羊抗小鼠igg，每孔100μl，37℃，30分钟，洗板3次；
[0039]
④
加邻苯二胺(opd)显色液，每孔100μl，37℃，10-15分钟；
[0040]
⑤
加入50μl终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。
[0041]
进一步的，维生素b1杂交瘤细胞株的构建过程包括：
[0042]
①
制备骨髓瘤细胞悬液：取处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后，获得所述骨髓瘤细胞悬液；
[0043]
②
制备免疫脾细胞悬液：将小鼠的免疫脾细胞1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完
全培养液混悬细胞后，获得所述免疫脾细胞悬液；
[0044]
③
混合细胞悬液：将所述骨髓瘤细胞悬液和所述免疫脾细胞悬液按1∶10的比例混合在离心管中，在1200rpm的转速下离心8分钟；
[0045]
④
peg细胞融合：向所述离心管中加入peg 4000进行细胞融合反应，反应90秒，然后加预热的不完全培养液，终止细胞融合反应；
[0046]
⑤
孵育培养：融合24小时后，加hat选择培养液培养3-7天，获得所述杂交瘤细胞株。
[0047]
进一步的，将产生维生素b1抗体的balb/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌维生素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞的步骤包括：
[0048]
①
采用peg细胞融合技术将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0融合，得到融合细胞；
[0049]
②
负筛，去除大量针对载体蛋白的阳性孔，得到维生素b1阴性克隆；
[0050]
③
正筛，用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选，得到维生素b1阳性克隆；
[0051]
④
竞争优选杂交瘤细胞；将所述维生素b1阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体，即为优选出的杂交瘤细胞。
[0052]
具体地，本发明所使用的碳酸盐缓冲液为0.05mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液。
[0053]
进一步的，对小鼠腹水内含有的维生素b1单克隆抗体进行鉴定的过程包括步骤：
[0054]
①
配制抗原包被液：将所述维生素b1包被原用ph9.6的碳酸盐缓冲液配制成维生素b1包被液，加入96孔elisa检测板，每孔加100ul维生素b1包被液，置于4℃冰箱内过夜；
[0055]
②
向所述96孔elisa检测板每孔加200ul封闭液，置于37℃温箱温育2小时，得封闭处理的elisa检测板；
[0056]
③
向所述封闭处理的elisa检测板中的每个孔加入100ul高纯度维生素b1单克隆抗体，37℃温箱温育2小时；
[0057]
④
向所述封闭处理的elisa检测板中的每个孔加入100ul品化羊抗鼠ig-hrp，37℃温育1小时；
[0058]
⑤
显色反应：将tmb底物加入elisa检测板的每个孔中，显色5～10min，然后添加2m硫酸100ul/孔终止显色反应；
[0059]
⑥
检测：用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度od值。
[0060]
本发明的有益效果在于：
[0061]
本发明首次提出了维生素b1半抗原，并将维生素b1半抗原制备成维生素b1免疫原和维生素b1包被原，将维生素b1免疫原免疫小鼠得到维生素b1单克隆抗体，再利用维生素b1包被原对所制备出的维生素b1单克隆抗体进行检测，实现对维生素b1单克隆抗体的准确检测。在此之前没有维生素b1单克隆抗体制备的相关技术研究，更没有将维生素b1包被原来检测维生素b1单克隆抗体的活性和准确度，制备过程简便、经济、效价高、灵敏度高、实用前景大。
附图说明
[0062]
图1为维生素b1半抗原结构图。
具体实施方式
[0063]
本发明公开了一种一种维生素b1半抗原、抗原及单克隆抗体的制备以及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0064]
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
[0065]
本发明提供的维生素b1单克隆抗体的制备方法中所用材料或试剂均可由市场购得。
[0066]
实施例
[0067]
本实施例提供一种维生素b1单克隆抗体的制备方法。
[0068]
维生素b1半抗原的制备，制备方法如下：
[0069]
a、量取24.6mmol的维生素b1与29.52mmol溴戊酸；
[0070]
b、向试管中加入15mln,n-二甲基甲酰胺溶液；
[0071]
c、将量取的维生素b1半抗原与溴戊酸加入到试管中的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，得到维生素b1反应溶液；
[0072]
d、向所述维生素b1反应溶液中添加170mg碳酸钾，得维生素b1半抗原反应混合溶液；
[0073]
e、将所述维生素b1半抗原反应混合溶液进行回流处理，用水淬灭反应混合物，然后再用甲苯对所述维生素b1半抗原反应混合溶液进行萃取，萃取出维生素b1半抗原有机混合层；
[0074]
f、将所述维生素b1半抗原有机混合层用盐水进行洗涤，再用无水硫酸钠进行干燥，得纯度较高的维生素b1半抗原固体；
[0075]
g、将所述纯度较高的维生素b1半抗原固体经真空浓缩后用石油对所述维生素b1半抗原固体进行浓缩，获得高纯度的维生素b1半抗原。
[0076]
维生素b1免疫原的制备，制备方法如下：
[0077]
a、取20mg维生素b1半抗原，将其溶解于盛装有4ml n,n-二甲基甲酰胺的试管中，再加入7.5mg可溶于水的碳二亚胺和9mgn-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌5小时，获得维生素b1半抗原活化液a液；
[0078]
b、取50mg牛血清白蛋白(bsa)，将其溶解于3ml 0.05mol/l的pb缓冲液中，获得免疫原载体蛋白b液；
[0079]
c、将所述a液滴加到所述b液中，搅拌24小时后用0.02mol/lpbs透析3天，得维生素b1免疫原——维生素b1-bsa。
[0080]
d、将所制备的维生素b1免疫原置于零下20度的冰箱内冷藏备用。
[0081]
用维生素b1免疫原对balb/c小鼠进行免疫，以获得维生素b1单克隆抗体，包括流程:
[0082]
首次免疫：用100μg维生素b1-bsa与等量弗氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；
[0083]
二次免疫：3周后再用100μg维生素b1-bsa与等量弗氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；
[0084]
三次免疫：此后每2周用半量维生素b1-bsa重复腹腔加强免疫。
[0085]
免疫完成后，要用竞争elisa法测定血清效价，其具体elisa程序包括步骤：
[0086]
a、将维生素b1-bsa用0.05mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，每孔100μl包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；
[0087]
b、将稀释后的维生素b1-bsa用pbst洗板3次，每次洗板3分钟；
[0088]
c、加入1μg/ml的bsa与等量系列稀释的血清共100μl，在37℃的温度下反应40分钟，用pbst板洗板3次；
[0089]
d、加入酶标羊抗小鼠igg(1∶4000)，每孔100μl，37℃下反应30分钟，用pbst板洗板3次；
[0090]
e、加邻苯二胺(opd)显色液，每孔加100μl，37℃下反应10-15分钟；
[0091]
f、加入50μl终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，经检测血清中抗体滴度为1:2
×
105。
[0092]
当获得能产生维生素b1单克隆抗体的健康balb/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。
[0093]
对杂交瘤细胞进行单克隆化的过程包括：
[0094]
a、制备饲养细胞悬液：抽取小鼠腹腔内部的巨噬细胞、或者胸腺细胞、或者脾细胞，用细胞培养液对所述细胞进行稀释，如果是巨噬细胞、其浓度为6～8
×
106/ml；如果是胸腺细胞、其浓度为6
×
106/ml；如果是小鼠成纤维细胞、其浓度为1
×
105/ml；从小鼠所获得的所有细胞都添加至96孔elisa板的孔中，每孔所添加的量为100μl/孔。
[0095]
b、计算每个阳性孔内细胞的数量，然后用细胞培养液将细胞浓度稀释调节至1～5
×
103/ml；
[0096]
c、取130个细胞，至离心管中，放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，再将稀释后的细胞悬液平均添加至96孔elisa板a、b、c三排的每个孔中，每孔2个细胞；
[0097]
d、将余下的2.9ml细胞悬液补充2.9ml含饲养细胞的完全培养液，即10个细胞/ml，再将稀释后的细胞悬液平均添加至96孔elisa板d、e、f三排的每个孔中，每孔1个细胞；
[0098]
e、将余下的2.2ml细胞悬液补充2.2ml含饲养细胞的完全培养液，即5个细胞/ml，再将稀释后的细胞悬液平均添加至96孔elisa板g、h两排的每个孔中，每孔0.5个细胞；
[0099]
f、将在96孔elisa板上获得的细胞静置培养4～5天，则在饲养细胞的完全培养液上可以观察到小的细胞克隆，再添加饲养细胞的完全培养液至200μl/孔；
[0100]
g、培养8～9天之后，肉眼可观察到细胞克隆的情况，此时可进入抗体检测的环节。
[0101]
需要说明的是：以上是对小鼠的腹腔细胞进行初次克隆化，初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中添加ht，以用于筛选出次黄嘌呤磷酸核糖转移酶和胸苷激酶活性缺陷细胞的培养基。
[0102]
h、再次免疫：采用有限稀释法连续克隆维生素b1阳性杂交瘤细胞3次，以构建稳健细胞株，然后扩大培养并置于冰箱冻存。
[0103]
对balb/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用peg细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0融合，采取如下正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进行筛选：
[0104]
(1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体bsa用0.05mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，4℃过夜包被96孔酶标板，用pbst洗板3次，每次3分钟；加入细胞培养上清液100μl，37℃反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠igg(1∶4000)，每孔100μl，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(opd)显色液，每孔加100μl，37℃下反应10-15分钟；加入50μl终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；
[0105]
(2)正筛选择维生素b1的目标克隆：用维生素b1筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用1μg/ml的维生素b1-ova(维生素b1包被原)包被elisa板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μl，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶标羊抗小鼠igg(1∶4000)，每孔100μl，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(opd)显色液，每孔100μl，37℃下反应10-15分钟；加入50μl终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；
[0106]
(3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的维生素b1阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用维生素b1-ova(1μg/ml)包被elisa板，洗涤后加入维生素b1标准品(20ng/ml)与细胞培养上清各50μl，37℃板内竞争反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠igg(1∶4000)，每孔100μl，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(opd)显色液，每孔100μl，37℃，10-15分钟；加入50μl终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，od值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；
[0107]
当获得能够稳定分泌维生素b1单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对balb/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：
[0108]
a、注射0.5～1.0ml高压灭菌的降植烷到若干只10周龄的雌性balb/c小鼠腹腔；
[0109]
b、1～9周后再注入2
×
106个杂交瘤细胞至雌性balb/c小鼠腹腔；
[0110]
c、收取小鼠腹腔内对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次，然后用1000r/min的离心机离心10min；
[0111]
d、取样，抽取小鼠腹腔内的细胞，用台盼蓝对小鼠腹腔内的细胞进行染色，然后计算活细胞的数量，重新用不完全培养液配成1.0
×
107细胞/ml的悬液；
[0112]
e、向接种了降植烷的的小鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml细胞悬液。(含1.0
×
107个细胞)
[0113]
f、接种10天后，根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性balb/c小鼠腹腔的腹水，间接采用elisa法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用sds-page电泳分析；
[0114]
g、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。
[0115]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。