1.本发明涉及对细胞进行代谢工程化以产生胆盐水解酶以抑制艰难梭菌(c.difficile)内生孢子的萌发和在人胃肠道内的定殖的方法、益生菌以及预防或治疗艰难梭菌感染的方法。
背景技术：
：：2.艰难梭菌(clostridiumdifficile)(也归类为clostridioidesdifficile)是能引起艰难梭菌感染(cdi)和复发性cdi(rcdi)的病原体。cdi是全球常见的医院获得性感染之一。然而，由于细菌内生孢子形成从而逃避抗生素治疗，cdi的治疗是困难的。在20.9％的患者中发生cdi的复发并且由于这些感染导致的死亡率为9.3％。据推测，在原生微生物组破坏或菌群失调后休眠内生孢子的萌发会导致感染和复发(图1)。内生孢子的萌发主要由人胃肠道中的胆盐牛磺胆酸盐促进。据推测，人胃肠道中微生物组的菌群失调会导致游离牛磺胆酸盐的量增加并促进内生孢子的萌发。3.粪便微生物群移植(fmt)是cdi的一种实验性治疗法。在fmt中，将从健康供体中提取的液体粪便悬浮液输注至患有cdi的患者。它旨在恢复胃肠道中的微生物群平衡。虽然疾病预后通常得到改善，但治疗的适应性有限。这部分是由于关于使用粪便物的安全性问题。此外，这种策略是一种黑匣子工程化形式，所述工程化形式未鉴定抑制感染所需的微生物组的具体物种。除了被认为是对被破坏的微生物组的大量替代之外，预后改善背后的机制在很大程度上是未知的。技术实现要素：4.本发明采用工程化益生菌菌株的形式，所述工程化益生菌菌株可以抑制艰难梭菌内生孢子在人胃肠道内的萌发。所述益生菌表达胆盐水解酶，其将艰难梭菌内生孢子萌发剂牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐。与牛磺胆酸盐相比，胆酸盐具有较低的内生孢子萌发效率。此外，胆酸盐对营养性艰难梭菌展现出生长抑制。这些导致对内生孢子萌发的抑制以及对艰难梭菌增殖和定殖发作的延迟(图2)。在此延迟期间恢复微生物组可以预防cdi和rcdi。所述益生菌被进一步加强以对所述微生物组的菌群失调作出响应。据报道，菌群失调会引起胃肠道中升高的游离唾液酸水平。胆盐水解酶的表达受唾液酸响应型元件的控制。这使得胆盐水解酶能够在所述微生物组发生变化时及时表达。此外，通过益生菌递送底架(chassis)对所述酶的表达使得通过在人胃肠道内的定殖实现了长期且稳健的表达。与未处理的对照相比，本发明在体外显示出将艰难梭菌的萌发抑制97.8％。5.本发明具有临床相关性。它解决了针对cdi和rcdi的预防需求。两组患者将尤其受益于本发明。有cdi风险的患者(如当前在医院接受抗生素方案的那些患者)将发现它有助于对cdi发作的预防。它也可以用于施用至当前cdi患者以作为对rcdi的预防。6.在第一方面，本发明涉及一种表达盒，所述表达盒包含：7.i)胆盐水解酶基因，以及8.ii)与所述胆盐水解酶基因可操作地连接的唾液酸响应型启动子。9.在一些实施方案中，所述胆盐水解酶基因是来自产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)的cbh蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码seqidno:13中列出的氨基酸序列或其功能变体。10.在一些实施方案中，所述胆盐水解酶多核苷酸序列包含与seqidno:8或seqidno:9中列出的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。11.应当理解，由于遗传密码的冗余性，多核苷酸序列可能具有小于100％的同一性，但仍编码相同的氨基酸序列，如seqidno:13中列出的胆盐水解酶的氨基酸序列。12.在一些实施方案中，所述唾液酸响应型启动子是来自大肠杆菌的pnana，其优选地包含seqidno:4中列出的核酸序列或其功能变体。13.在一些实施方案中，当在不存在唾液酸的情况下存在pnana的表达时，将pnana的阻遏子定位于pnana的上游，其中优选地所述阻遏子是nanr蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码seqidno:11中列出的氨基酸序列或其功能变体。14.在一些实施方案中，所述nanr蛋白编码多核苷酸序列包含与seqidno:5中列出的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。15.在一些实施方案中，所述盒还包含与nanr可操作地连接的组成型启动子，其中所述启动子选自包括以下的组：具有arac的pbad；具有rbs2、rbs3或rbs5的j23108；和具有rbs4的j23113。16.在一些实施方案中，与nanr可操作地连接的所述组成型启动子是j23113-rbs4。17.在一些实施方案中，所述盒包含j23113-rbs4-nanr，其优选地包含seqidno:6中列出的核酸序列或其功能变体。18.在一些实施方案中，所述盒还包含激活子和启动子以增加cbh的表达，如转录激活因子cadc蛋白编码序列和启动子pcadba，其中cadc定位于pnana的下游并受其控制，并且pcadba定位于cadc的下游并与所述胆盐水解酶cbh蛋白编码序列可操作地连接。19.在一些实施方案中，所述cadc氨基酸序列在seqidno:12中列出或为其功能变体。在一些实施方案中，所述cadc核酸序列在seqidno:14中列出或为其功能变体。20.在一些实施方案中，所述激活子和启动子核酸序列包含seqidno:7中列出的核酸序列或其功能变体。21.在一些实施方案中，所述盒包含在一种或多种质粒载体中。22.在一些实施方案中，所述质粒载体是peaat，其优选地包含seqidno:1中列出的核酸序列。所述载体包含复制起点、alr选择标记(seqidno:2和3)、卡那霉素抗性标记和多克隆位点。23.在一些实施方案中，所述盒还包含抗生素抗性基因，其侧翼为frt位点以使得所述抗生素抗性基因能够被去除。24.在一些实施方案中，cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达。cbh的密码子优化基因序列的例子是seqidno:9中列出的核酸序列。25.在一些实施方案中，cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达，所述益生菌细胞选自包括以下的组：大肠杆菌物种(e.colisp.)、拟杆菌属物种(bacteroidessp.)、梭菌属物种(clostridiumsp.)、栖粪杆菌属物种(faecalibacteriumsp.)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)和乳杆菌属物种(lactocbacillussp.)。26.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的表达盒用于重组产生胆盐水解酶蛋白的用途。27.在本发明的另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含：28.a)益生菌细菌；以及29.b)根据本发明的任何方面的表达盒，30.其中所述益生菌细菌包含所述表达盒以用于产生胆盐水解酶。31.所述益生菌细菌可以选自任何合适的益生菌细菌属。32.在一些实施方案中，所述益生菌细菌选自包括以下的组：大肠杆菌物种、拟杆菌属物种、梭菌属物种、栖粪杆菌属物种、乳酸乳球菌和乳杆菌属物种。33.在一些实施方案中，所述益生菌细菌是营养缺陷型的。34.在一些实施方案中，所述营养缺陷型细菌已缺失了丙氨酸消旋酶基因并且在不存在d-丙氨酸的情况下不能分裂。35.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的组合物，用于在治疗艰难梭菌感染(cdi)和/或复发性cdi(rcdi)的方法中使用。36.在一些实施方案中，所述cdi和/或rcdi由菌群失调引起。37.在本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防方法，所述治疗或预防方法包括向需要这种治疗或预防的受试者施用有效量的根据本发明的任何方面的组合物。38.在一些实施方案中，所述受试者患有艰难梭菌感染(cdi)或复发性cdi。39.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的组合物，用于制造用于治疗或预防cdi和/或rcdi的药物。40.在一些实施方案中，所述艰难梭菌感染(cdi)和/或复发性cdi是由于菌群失调造成。附图说明41.图1示出了菌群失调诱导的艰难梭菌的感染和复发性感染的示意图。1)从环境获得的艰难梭菌(cd)内生孢子可以作为微生物组的休眠成员存在。2)正常微生物组的破坏产生艰难梭菌定殖的生态位。3)内生孢子萌发成营养细胞，并进一步扩增至微生物组内的生态位中，从而导致宿主感染。4)在感染后期，将通过营养细胞产生另外的内生孢子。5)这些内生孢子能够逃避抗生素治疗。微生物组的持续菌群失调为复发性感染提供了脆弱性窗口，因为一旦治疗停止，内生孢子就可萌发。6)即使从感染中恢复，当菌群失调发生时，内生孢子仍可能持续存在并触发感染。42.图2示出了本发明用于实现对艰难梭菌内生孢子的抑制的策略的示意图。微生物组的菌群失调改变了胃肠道中的代谢物概况。这包括升高水平的游离唾液酸。工程化益生菌通过唾液酸激活以表达胆盐水解酶。所述酶能够将艰难梭菌内生孢子萌发剂牛磺胆酸盐去缀合为更弱的萌发剂胆酸盐。因此实现了对艰难梭菌内生孢子萌发的抑制，并且防止了艰难梭菌从无毒力形式向有毒力形式的转变。43.图3示出了提出的关于菌群失调诱导的艰难梭菌感染机制的模型。微生物组中的两组微生物(顶部)在菌群失调(底部)的情况下被破坏。i)第一组介导胆盐从小肠(si)的去缀合。在菌群失调期间这组微生物的丧失导致艰难梭菌(cd)内生孢子驻留于其中的结肠中的缀合胆盐。缀合胆盐触发内生孢子萌发成营养性艰难梭菌。ii)由唾液酸利用物种和唾液酸酶表达物种构成的第二组调节胃肠道内的游离唾液酸水平。菌群失调期间物种平衡的扰乱导致唾液酸升高。萌发的艰难梭菌能够利用唾液酸作为碳源进行其扩增，从而导致宿主感染。44.图4示出了缀合胆盐牛磺胆酸盐是艰难梭菌内生孢子的更有效的萌发剂，并且去缀合胆盐胆酸盐抑制艰难梭菌的生长。a)缀合胆盐牛磺胆酸盐被胆盐水解酶去缀合为初级胆盐胆酸盐和牛磺酸。b)从艰难梭菌菌株i)cd630、ii)vpi10463、iii)baa-1870和iv)9689中提取的内生孢子通过与不同浓度的牛磺胆酸盐(填充圆圈)和胆酸盐(空白圆圈)一起孵育的萌发。误差条表示一式两份的s.e.m。c)艰难梭菌菌株i)cd630、ii)vpi10463、iii)baa-1870和iv)9689在牛磺胆酸盐(填充圆圈)和胆酸盐(空白圆圈)情况下的生长。45.图5示出了对无抗生素选择的益生菌底架进行工程化的计划。a)无d-丙氨酸营养缺陷型抗生素选择的底架的示意图。对丙氨酸消旋酶基因的破坏导致无法内源性地产生d-丙氨酸。d-丙氨酸的缺乏会抑制细胞壁合成和细胞增殖。这种表型可以通过从质粒中表达丙氨酸消旋酶来挽救。这使得能够选择质粒，并由此选择合成基因电路。b)peaat载体的质粒图谱(seqidno:1)。alr(seqidno:3)编码在天然启动子(seqidno:2)控制下的丙氨酸消旋酶(seqidno:10)；neor编码抗生素抗性基因新霉素磷酸转移酶。其侧翼是用于经由flp切除的一对frt序列；ori编码复制起点coie1；通过设计添加九个独特的限制性位点。根据bglbrick标准，主要插入位点位于bglii与bamhi之间。c)在不具有(空白方块)或具有(空白圆圈)d-丙氨酸补充剂的情况下的ecn生长测定，以及用peaat质粒(灰色圆圈)的表型挽救。包括野生型ecn(黑色圆圈)作为对照。d)表达neor质粒的活细胞的百分比，所述neor质粒在具有(填充)和不具有(空白)d-丙氨酸补充剂的情况下在表达pbbe8k-j23108-lasr-plas-gfp的ecnwt(正方形)或表达peaat-j23108-lasr-plas-gfp的ecn(三角形)的质粒上共表达。在没有抗生素选择的情况下将细胞每日继代培养。细胞的活力指示质粒的存在。46.图6示出了nanr依赖性唾液酸诱导型启动子的优化。a)用于pnana的初始表征的质粒设计(peaat-pnana-gfp)。sa表示唾液酸诱导。b)在不同浓度的唾液酸诱导下，t10(左)和ecn(右)中用于peaat-pnana-gfp表征的10,000个样品的流式细胞术荧光读数的直方图。c)用于表征nanr(seqidno:11)和pnana(psc101-pbad-nanr)的共表达质粒的质粒设计。la表示l-阿拉伯糖诱导；sa表示唾液酸诱导。d)针对唾液酸(sa)和l-阿拉伯糖(la)诱导的每种组合，在流式细胞仪上10,000个样品的中值gfp荧光读数的矩阵数据。每种细胞的颜色按比例分级。e)用于在peaat-pnana-gfp中共表达nanr的质粒设计。f)通过调节nanr表达对pnana表达的优化。在不同启动子和核糖体结合位点下表达nanr的构建体的相对gfp荧光表达。用0.2％唾液酸诱导细胞。47.图7示出了在胃肠特定条件下对工程化唾液酸生物传感器的表征。a)唾液酸诱导型构建体(peaat-j2113r4-nanr-pnana-gfp)和b)唾液酸阻遏型构建体(peaat-pnana-gfp)对唾液酸和葡萄糖组合的诱导的响应。逻辑门图描绘了对唾液酸和葡萄糖作为输入的响应。c)唾液酸诱导型放大器构建体(peaat-j2113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)的质粒设计。在d)lb和e)具有甘油的m9基本培养基中对唾液酸诱导型构建体和唾液酸诱导型放大器构建体的表征。示出了诱导3和6小时后的相对荧光表达。f)在不同ph下对唾液酸诱导型放大器构建体的表征。示出了诱导3小时后的相对荧光表达。g)在没有碳源的m9基本培养基中，在具有和不具有唾液酸的情况下ecn的生长。48.图8示出了纯化的cbh-his6将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐并抑制艰难梭菌内生孢子萌发。a)在imac和尺寸排阻色谱后纯化的cbh-his6的12％sds-page解析。cbh-his6的预期大小是38kda。l表示蛋白质梯状标志。来自hplc分析的谱面积相对于b)牛磺胆酸盐和c)胆酸盐浓度的标准曲线。d)在进行和不进行10μm纯化的cbh-his6的3小时处理的情况下牛磺胆酸盐和胆酸盐的浓度。在处理与未处理之间对牛磺胆酸盐浓度进行学生t检验。*p《0.005。对应于e)牛磺胆酸盐和f)胆酸盐分别在保留时间12.2分钟和19.6分钟下洗脱的峰的hplc谱。g)基于艰难梭菌的cfu计数，在用cbh-his6处理后胆盐的萌发效率。进行无牛磺胆酸盐的阴性对照和无酶的阳性对照。在处理与阳性对照之间进行学生t检验。*p《0.05。误差条表示一式两份的s.e.m。49.图9示出了益生菌中的cbh表达抑制艰难梭菌内生孢子的萌发。a)基于艰难梭菌的cfu计数，在用cbh表达型ecn处理后胆盐的萌发效率。使用了两组构建体，一组没有放大器模块(pnana；空白柱)，并且一组具有放大器模块(pnana-cadc-pcadba；填充柱)。每组实验均用gfp表达对照、非诱导对照和无牛磺胆酸盐阴性对照进行。还进行了无细胞阳性对照(灰色柱)。对放大器构建体进行单因素方差分析和学生t检验。*p《0.005。误差条表示一式两份的s.e.m。b)从ecn在不同启动子下表达的cbh-his6的免疫印迹。用0.2％l-阿拉伯糖诱导pbad构建体(peaat-arac-pbad)，并且通过0.2％唾液酸诱导pnana(peaat-j23113r4-nanr-pnana)和pnana-cadc-pcadba放大器(peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba)构建体。通过od600调整细胞密度，然后进行蛋白质提取。l表示蛋白质梯状标志；s表示可溶性级分；is表示不溶性级分。cbh-his6的预期大小是38kda。c)在用来自放大器构建体的cbh表达型ecn处理后牛磺胆酸盐和胆酸盐的浓度。进行无细胞阳性对照、gfp表达对照、非诱导对照和无牛磺胆酸盐阴性对照。在处理与gfp表达对照之间对牛磺胆酸盐浓度进行学生t检验。*p《0.001。50.图10示出了cbh处理的艰难梭菌内生孢子展现出减少的外毒素分泌并改善caco-2细胞的感染预后。a)来自分别在艰难梭菌培养物的萌发时间点收集的10倍浓缩上清液的tcda免疫印迹。将萌发剂牛磺胆酸盐在与艰难梭菌内生孢子一起孵育之前在不同条件下进行处理。从左起，无细胞阳性对照、gfp表达对照、cbh表达处理和无牛磺胆酸盐阴性对照。l表示蛋白质梯状标志。tcda的预期大小是308kda。用通过在相应条件下的萌发艰难梭菌培养物收集的上清液处理的caco-2的相对细胞活力，所述相应条件即b)无细胞阳性对照、c)gfp表达对照、d)cbh表达处理和e)无牛磺胆酸盐阴性对照。将上清液稀释至1倍(填充)、0.1倍(灰色)和0.01倍(空白)的最终浓度。相对细胞活力通过mtt测定给出，针对未处理的caco-2对照进行归一化。数字相对细胞活力数据示出在矩阵中。f)用最终浓度为1倍的相应上清液处理24小时后，caco-2细胞的倒置光学显微镜照片。tau表示牛磺胆酸盐；sa表示唾液酸。51.图11示出了cbh表达型ecn在治疗用艰难梭菌感染的鼠cdi模型中的功效。a)感染测定的实验时间线，其示出治疗、益生菌和艰难梭菌的施用点。b)实验组和给予的工程化益生菌的表达构建体的表。c)存活曲线和d)在九天内，在用艰难梭菌细胞感染后相应组的平均体重。在治疗组与对照组之间进行gehan-breslow-wilcoxon检验。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。e)在六天内，用艰难梭菌细胞感染后每个组中相应小鼠展现出的最大临床疾病得分(css)。在治疗组与对照组之间进行未配对学生t检验。**p《0.01，***p《0.001。52.定义53.为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。54.如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。当“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和类似术语并不意为将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。55.如本文所用，术语“功能变体”或“变体”是指改变了一个或多个氨基酸但保留与非变体参考序列(例如胆盐水解酶)相同功能的氨基酸序列。变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。很少地，变体可能具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入、或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如软件(dnastar公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性的指南。56.如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”应解释为指定所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”还包括“由……组成”。词语“包含(comprising)”的变体(诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变体(诸如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有相应变化的含义。57.如本文所用，术语“益生菌”是指活的微生物补充剂，所述微生物补充剂通过其在肠道、泌尿道或阴道中的作用对患者具有有益影响。58.如本文所用，术语“预防”是指为了预防疾病(如预防cdi相关疾病)而给予的治疗或采取的行动。59.如在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指改善性、疗法性或治愈性治疗。60.术语“受试者”在本文中定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究的目的，受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，对于治疗或预防菌群失调、更特别是cdi相关疾病，受试者可以是人。具体实施方式61.为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献在实施例的末尾列出。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。62.关于cdi和rcdi机制的普遍共识涉及微生物组的菌群失调和随后造成的休眠内生孢子的萌发(图1)[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)]。在正常健康的微生物组中，艰难梭菌可能作为共生休眠内生孢子保留在人胃肠道中，并由于缺乏生态位而不会引起感染。矛盾的是，广谱抗生素的施用已被确立为是促进cdi的风险因素[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)；roberts,a.p.和mullany,p.clostridiumdifficile:methodsandprotocols.p.mullany,a.roberts编辑.springer美国,纽约.3-8(2010)]。据推测，施用抗生素会扰乱现有微生物组的平衡并导致菌群失调[gebhart,d.等人mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14(2015)]。来自萌发的休眠内生孢子或者从环境中新获得的艰难梭菌可以利用这个机会迅速扩增至达到导致感染的毒力负荷[gebhart,d.等人mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14(2015)；sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。使问题更加复杂的是，除了由于抗生素治疗的选择压力而产生的抗微生物抗性之外，艰难梭菌内生孢子对抗生素具有天然抗性[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)；roberts,a.p.和mullany,p.clostridiumdifficile:methodsandprotocols.p.mullany,a.roberts编辑.springer美国,纽约.3-8(2010)]。这使得内生孢子能够逃避根除治疗，并且被怀疑是rcdi顺着脆弱性窗口度过复发的原因，直到微生物组稳态恢复[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)]。[0063]证据表明，微生物组内的胆盐代谢物种，如闪烁梭菌(c.scindens)赋予对艰难梭菌的定殖抗性[chilton,c.h.,pickering,d.s.和freeman,j.clin.microbiol.infect.publishedaheadofprint.doi:10.1016/j.cmi.2017.11.017(2018)；buffie,c.g.等人nat.lett.517:205-8(2015)]。胆盐是艰难梭菌的已知萌发剂[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]，并且由于肠道微生物组破坏而引起的胆盐代谢破坏可导致萌发，从而导致cdi。[0064]在人中，胆盐在肝脏中合成并通过胆囊分泌到胃肠道中的小肠的十二指肠处[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。胆盐根据其缀合物和官能团以不同的分子形式存在。从人肝脏排出的胆盐以与牛磺酸或甘氨酸缀合的初级胆盐形式存在，从而分别形成牛磺胆酸盐或甘氨胆酸盐。牛磺胆酸盐是艰难梭菌的已知萌发剂，并且常规地用于在细菌的实验室操纵中诱导内生孢子萌发[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。应当理解，胆盐在其向下进入下胃肠道时经受微生物组的修饰[ridlon,j.m.,kang,d.和hylemon,p.b.j.lipid.res.47:241-59(2006)；begley,m.,gahan,c.g.m.和hill,c.fems.microbiol.rev.25:625-51(2005)]。明显的是，缀合胆盐去缀合为初级未缀合胆盐，并且初级胆盐7α-脱羟基化为次级胆盐。后一种反应可以由先前提到的闪烁梭菌介导[ridlon,j.m.和hylemon,p.b.j.lipid.res.53:66-76(2012)]。此外，次级胆盐脱氧胆酸盐显示出抑制艰难梭菌定殖[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。由于这些修饰，结肠中的胆盐主要以未缀合的初级或次级形式存在[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。[0065]在此提出了由于菌群失调导致cdi发作的机制的模型(图3)。提出由于菌群失调造成的两个事件诱导cdi。假设菌群失调破坏了微生物组中的参与胆盐修饰的这些物种。这导致了下胃肠道中胆盐成分的失调。增加浓度的缀合胆盐(特别是牛磺胆酸盐)充当萌发的触发剂，并且用于表示微生物组内存在用于艰难梭菌定殖的空缺生态位。第二个事件涉及胃肠道中游离唾液酸的升高。微生物群的菌群失调破坏导致唾液酸利用菌株的丧失和/或唾液酸酶表达菌株的增殖[ng,k.m.等人nat.lett.502:96-9910(2013)]。这会引起胃肠道内游离唾液酸的升高。萌发的营养性艰难梭菌利用游离唾液酸作为碳源进一步增殖和扩增，从而导致cdi。[0066]在此，我们寻求发明一种用于预防cdi的预防性抗微生物策略。通过了解艰难梭菌的发病机制，将艰难梭菌内生孢子的萌发鉴定为用于预防感染进展的潜在干预点。工程化益生菌可以利用感染发作的机制来调节内生孢子的萌发。[0067]在提出的菌群失调诱导的cdi的机制的模型中，假设缀合胆盐是艰难梭菌内生孢子萌发的驱动萌发剂。在微生物组的稳态期间，缀合胆盐在到达其中cdi期间艰难梭菌定殖的结肠之前被微生物组代谢。这在菌群失调期间被破坏。作为模型的原理证明，对缀合和去缀合胆盐的萌发效率进行测定。通过胆盐水解酶(酶委员会编号：ec3.5.1.24)将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐和牛磺酸[coleman,j.p.和hudson,l.l.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20(1995)](图4a)。与牛磺胆酸盐相比，去缀合胆盐显示出显著降低的萌发效率(图4b)。较高浓度的胆酸盐进一步抑制萌发，这与现有报告[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)；begley,m.等人,fems.microbiol.rev.25:625-51(2005)]一致。此外，胆酸盐显示出抑制营养性艰难梭菌细胞的生长(图4c)。这些结果表明，调节胆盐去缀合以防止艰难梭菌内生孢子的萌发并抑制其随后的生长可以充当可行的针对艰难梭菌的预防性抗微生物策略。[0068]我们设想了利用工程化益生菌菌株ecn(d-丙氨酸营养缺陷型大肠杆菌nissle)[hwang,i,y.等人,nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028(2017)]来通过胆盐水解酶的体内表达而调节胆盐去缀合的预防性抗微生物策略。胆盐水解酶的这种表达可以降低局部牛磺胆酸盐浓度，进而抑制艰难梭菌内生孢子的萌发。对艰难梭菌从内生孢子萌发的延迟和生长抑制可以防止导致cdi或rcdi的过度增殖。选择来自产气荚膜梭菌的胆盐水解酶cbh进行应用[coleman,j.p.和hudson,l.l.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20(1995)]。将所述酶的表达与唾液酸响应型启动子pnana(seqidno:4)偶联。唾液酸在微生物组的菌群失调期间显示出上调(10)。通过将pnana与cbh表达偶联，pnana可以在体内菌群失调的情况下调控cbh的表达。在这种设计下，当在菌群失调期间游离唾液酸水平升高时，pnana将做出响应并表达cbh。这使得对菌群失调发作的自主体内响应成为可能。[0069]ecn被用作递送所设计策略的底架。作为革兰氏阴性细菌，ecn对通常被施用以用于cdi治疗的革兰氏阳性菌靶向性万古霉素不太敏感[nelson,r.cochrane.database.syst.rev.18(3):cd004610(2007)]。这将允许并行施用用于治疗的抗生素和用于预防rcdi的益生菌。此外，ecn能够利用唾液酸进行代谢。作为益生菌菌株，它们作为微生物组的一部分定殖。因此，它们能够与艰难梭菌竞争营养物以及胃肠道内的空缺生态位。此外，ecn的营养缺陷型特征将使得能够设计出无需抗生素即可维持的质粒。已经通过从基因组中缺失丙氨酸消旋酶基因将菌株工程化以显示出对d-丙氨酸的营养缺陷型表型[hwang,i,y.等人,nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028(2017)]。将必需的丙氨酸消旋酶基因用作携带工程化电路的质粒中的选择标记。所得的工程化菌株可以在长时间段内在没有额外选择压力的情况下稳定地维持设计的质粒。总之，工程化ecn将赋予对胃肠道中的cdi的长期预防作用。[0070]实施例[0071]本领域中已知并且未明确描述的标准分子生物学技术大体上遵循如sambrook和russel,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratory,newyork(2001)中所述。[0072]实施例1[0073]对无抗生素选择的益生菌底架的工程化[0074]在体内实施工程化益生菌的挑战之一是确保底架中基因电路的长期稳定性。工程化基因电路通常在质粒上进行工程化并通过抗生素选择维持，但此类技术对于体内应用是不可行的。对于胃肠道中的定殖益生菌，不能便利地实现通过连续抗生素选择对质粒稳定性的维持。[0075]为了实现不需要抗生素维持的质粒底架系统，在大肠杆菌nissle野生型菌株中产生了营养缺陷型表型。从大肠杆菌nissle基因组中缺失了d-丙氨酸生物合成所必需的丙氨酸消旋酶基因，以产生菌株ecn(图5a)。d-丙氨酸是细菌细胞壁生物合成所需的。d-丙氨酸的缺失会防止细菌进一步分裂，从而产生营养缺陷型表型。[0076]设计质粒以挽救ecn底架中的营养缺陷型表型(图5b)。该质粒含有充当选择基因的丙氨酸消旋酶的拷贝。它还含有用于表征和放大目的的卡那霉素抗性基因。这种卡那霉素抗性基因的侧翼是frt位点，所述frt位点使得所述基因能够通过flp重组酶的表达被去除。这种设计使得能够容易地去除抗生素抗性基因，以产生含有自选择质粒的最终益生菌菌株。此举起到防止在应用期间抗性基因从工程化菌株到微生物组中的潜在水平基因转移的作用。[0077]丙氨酸缺失的ecn菌株成功地显示出丙氨酸营养缺陷型表型(图5c)。通过表达所设计的质粒peaat来挽救所述表型。还通过外源补充d-丙氨酸来挽救所述菌株。这使得所述菌株能够维持在实验室条件下。此外，质粒在不存在任何抗生素选择的情况下在ecn中稳定维持一个月(图5d)。将具有抗生素抗性基因的质粒转化至ecn或野生型菌株中。使细胞在不存在抗生素的情况下生长。然后以定期间隔测试细胞中质粒的存在。发现仅在工程化ecn中，质粒始终维持为接近于100％。总之，这些结果显示ecn充当在体内长期递送工程化基因电路的底架的适用性。[0078]实施例2[0079]nanr依赖性唾液酸诱导型启动子的优化[0080]来自mg1655大肠杆菌基因组的唾液酸诱导型启动子pnana(seqidno:4)的序列获自ecocyc数据库[keseler,i.m.等人nuc.acids.res.41:605-12(2013)].将启动子亚克隆在peaat质粒(peaat-pnana-gfp)中gfp基因的上游，且然后转化至t10和ecn中进行表达表征(图6a)。出人意料的是，两种大肠杆菌菌株对唾液酸诱导显示出不同的响应(图6b)。唾液酸的诱导导致t10pnana启动子的正向激活，从而导致gfp表达。另一方面，ecn中pnana启动子下的gfp在不存在唾液酸的情况下强表达，而在高浓度的唾液酸诱导下受到阻遏。[0081]响应的差异表明pnana在t10与ecn之间受到不同的调控。nanr(seqidno:5)先前被鉴定为大肠杆菌中唾液酸分解代谢的转录调控子[kalivoda,k.a.等人,j.bacteriol.185(16):4806-15]。鉴定了mg1655基因组中的nanr序列(genbank登录号cp012868.1)。分离基因序列以及在基因上游500bp和下游500bp的侧翼序列(nanr±500)。进行blastn检索，其中将nanr±500作为查询并且将t10(标识为dh10β；genbank登录号cp000948.1)或nissle(genbank登录号cp007799.1)基因组序列作为主题。t10基因组序列产生与mg1655基因组的100％匹配。nissle基因组序列返回了相对于nanr序列和下游500bp的96％的强匹配。然而，对于nanr上游的500bp没有相似性。在基因上游200bp内发现了nanr的调控元件。这表明，尽管nissle携带nanr序列，但与k-12亲缘的大肠杆菌相比，所述nanr序列在nissle中的基因调控被破坏。[0082]假设nanr在nan操纵子表达中充当转录阻遏子，并且nissle中nanr的基因组表达破坏导致观察到pnana启动子的活性。为了测试假设，将nanr从mg1655基因组亚克隆至在pbad启动子下的psc101载体(psc101-pbad-nanr)中(图6c)。将质粒与peaat-pnana-gfp共转化至ecn中。启动子pbad受共表达的arac调控，并且可通过l-阿拉伯糖诱导。l-阿拉伯糖和唾液酸在不同组合情况下的共同诱导可以确定从pnana引起理想响应所需的nanr表达水平。通过流式细胞术针对10,000个大小门控样品的中值gfp荧光读数对诱导细胞进行定量。从结果来看，即使在不存在l-阿拉伯糖诱导的情况下，nanr的基础表达也会显著阻遏pnana基础活性(图6d)。它还使得pnana启动子能够通过唾液酸诱导表达。nanr的增强表达降低了pnana基础活性和诱导活性两者。这表明nanr是pnana表达上游的调控子，并且对于调控仅需要低水平的nanr。[0083]由于在ecn中实现pnana的唾液酸诱导型响应需要nanr表达，因此重新设计基因构建体peaat-pnana-gfp以在组成型表达下共表达nanr(图6e)。将基因nanr亚克隆在具有核糖体结合位点rbs5、rbs3或rbs2的组成型启动子j23108下。三个核糖体结合位点具有不同的翻译起始率，其中rbs5是最强的并且rbs2是最弱的。将质粒转化至ecn中以表征在唾液酸诱导下的gfp表达。与流式细胞术结果一致，发现在核糖体结合位点rbs2下nanr的弱组成型表达在具有唾液酸的情况下显示出更好的诱导性(图6f)。nanr的表达在构建体中被进一步降低，由此用j23113替代组成型启动子，并且用rbs4替代核糖体结合位点(j23113-rbs4-nanr；seqidno:6)。尽管nanr的表达较弱，但与先前的构建体相比，这些构建体中唾液酸诱导时gfp表达的表征维持相似的表达水平。[0084]通过nanr转录调控子的共表达，启动子pnana的活性从唾液酸的阻遏型启动子的活性成功逆转为唾液酸的诱导型启动子的活性。此外，pnana的基础表达降低。这些导致用于ecn的通用型双功能启动子，所述启动子可以根据工程化电路对唾液酸做出不同的响应。启动子pnana可以根据nanr的存在充当唾液酸的诱导型启动子或阻遏型启动子。此外，可以将nanr置于进一步的诱导型或阻遏型表达下，以实现额外的控制层。选择构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp用于作为基于唾液酸的菌群失调生物传感器的进一步表征。[0085]实施例3[0086]在胃肠特定条件下对工程化唾液酸生物传感器的表征[0087]ecn的亲本菌株优先定殖于下胃肠道，特别是结肠和直肠中[sonnenborn,u.和schulze,j.micob.ecol.healthdis.21:122-58(2009)；schultz,m.inflammboweldis.14(7):1012-8(2008)]。这使其作为下胃肠道的菌群失调生物传感器是理想的。将所选择的构建体在特定于下胃肠道的一系列条件下进行表征，以评估其适用性。[0088]需注意，pnana序列含有在位置4→8的分解代谢物激活蛋白(cap)结合位点。cap是当结合至循环amp(camp)时启动转录过程的转录激活蛋白。camp水平在不存在葡萄糖的情况下升高，从而有效地充当低葡萄糖响应的转录激活因子。在唾液酸和/或葡萄糖诱导下对含有诱导型(peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp)或阻遏型(peaat-pnana-gfp)构建体的ecn进行gfp表达表征。预期地，表达诱导型构建体的ecn呈现出类似于经典lac操纵子的响应。即使存在唾液酸时，在存在葡萄糖的情况下阻遏gfp表达(图7a和7b)。这表明nanr可能在功能上与laci类似。有趣的是，表达阻遏型构建体的ecn与葡萄糖类似地作出响应，由此gfp表达在存在葡萄糖的情况下沉默。这些结果表明，pnana的转录是由camp-cap驱动的。在存在葡萄糖的情况下阻遏启动子使其对于在其中预期葡萄糖水平显著较低的下胃肠道中使用是理想的。诱导型和阻遏型的构建体两者在上胃肠道中可能被沉默并且对唾液酸是无响应的，且因此它们的作用在通过上胃肠道期间将被最小化。[0089]尽管ecn中pnana活性的趋势从唾液酸阻遏型启动子逆转为诱导型启动子，但需注意，诱导型构建体的诱导信号显著低于甚至阻遏型构建体的阻遏信号。低诱导的表达水平对于足够的cbh表达以去缀合牛磺胆酸盐是个问题。为了克服这个问题，设计放大器模块并将其添加至诱导型构建体。将编码转录激活因子cadc(seqidno:12)的基因亚克隆在pnana启动子下。将受cadc调控的启动子pcadba亚克隆在gfp的上游(j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)。在这种设计下，在唾液酸诱导时，cadc在pnana下的表达又进而激活pcadba启动子以实现更强的gfp表达(图7c)。在此，cadc和pcadba充当中间转导模块，以放大来自pnana的信号并导致gfp的更强表达。此外，cadc由于其对外部ph的响应性(如从后来表征(图7f)中明显的)而被选择。对构建体进行表征，并且诱导的gfp荧光信号显示出显著改善。将cadc-pcadba(seqidno:7)添加至电路中成功地实现对来自诱导型构建体的信号的放大(图7d)。然而，观察到与非放大器构建体相比的gfp表达的时间滞后。这可能归因于中间cadc表达的需要，从而延迟响应，以及增加基础表达水平。[0090]生物传感器定殖的靶位点是在下胃肠道中，在下胃肠道中预期环境的营养物水平很差。所有先前的表征测定都是在营养物丰富的lb中进行的。构建体可能在整体营养水平不同的肠道环境中表现不同。为了确定生物传感器是否可以在胃中如预期那样起作用，将唾液酸诱导型(j23113r4-nanr-pnana-gfp)和唾液酸诱导型放大器(j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)构建体在更接近肠道环境的m9基本培养基中进行表征。m9基本培养基典型地含有呈葡萄糖形式的碳源。如先前在葡萄糖干扰pnana活性的情况下所示，将甘油用作m9基本培养基的碳源。尽管在营养物贫乏条件下，但表达唾液酸诱导型构建体的ecn能够如预期那样对唾液酸诱导做出响应(图7e)。此外，先前观察到的时间响应滞后在m9基本培养基中表征期间并不那么突出。如先前提出理论，pnana表达可由camp-cap驱动。m9基本培养基的较低营养物含量可导致高水平的camp，且因此导致对唾液酸诱导的更快响应。然而，目前的结果仍然未获得证实这一提议的结论。尽管如此，结果证明较低的营养物条件未不利地影响诱导型构建体的活性。[0091]另一种模拟的肠道环境条件是ph水平。胃肠道中的ph水平是动态的，并且基于包括健康状况在内的因素而不同。据报道，健康受试者的ph范围在胃中为1.6至4.2的范围，在小肠中为6.7至7.3的范围，在盲肠中为5.4至6.5的范围，并且在结肠中为6.0至7.2的范围[maurer等人plos.one.10(7):e0129076doi:10.1371/journal.pone.0129076(2015)]。将唾液酸诱导型放大器构建体在ph范围为从3至9的具有甘油的m9培养基中进行表征。观察到ph水平会影响构建体的活性(图7f)。在从3至5的低ph下未观察到诱导活性。出人意料的是，在存在唾液酸的情况下，gfp的表达反而被阻遏。基础表达水平在ph6下增加并且随后降低。据报道，cad操纵子是ph敏感性的，并且在ph5.8下被激活[watson,n.等人,j.bacteriol.174(2):530-40(1992)]。这可导致在ph6下的基础活性，所述活性随后在更高的ph下降低。构建体在ph6下从基础水平被轻度诱导，但在从7至9的高ph下被强诱导。根据数据，可以预期生物传感器在胃中由于低ph环境是无活性的。预期其活性在其中ph在6.0与7.3之间的小肠和结肠中更高。此外，据报道，在艰难梭菌感染期间结肠和直肠的ph向碱性偏移，其中87％的cdi患者的粪便超过ph7[gupta,p.等人,south.med.j.109(2):91-6(2016)]。与报告一致，较低的ph与针对艰难梭菌感染的保护作用相关[may,t.等人,scand.j.gastroenterol.29(10):916-22(1994)]。尚不清楚ph偏移是微生物组菌群失调的结果还是病原体扩增的结果。尽管如此，ph的变化可使得生物传感器能够引起更强的响应。[0092]观察到，ecn能够利用唾液酸作为碳源以在不具有甘油的m9基本培养基中生长(图7g)。在含有甘油的m9基本培养基中未观察到生长速率的差异。据报道，在感染期间唾液酸被艰难梭菌和致病性大肠杆菌利用以进行扩增[ng,k.m.等人.,nat.lett.502:96-99(2013)；huang,y.l.等人,nat.commun.6:8141.doi:10.1038/ncomms9141(2015)]。这可以使得ecn除了作为生物传感器或递送底架之外，还兼做病原体的唾液酸营养物竞争者。此外，对ecn生长的补充可以放大cbh(seqidno:13)的表达。[0093]实施例4[0094]纯化的胆盐水解酶cbh将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐并抑制艰难梭菌内生孢子萌发[0095]将cbh的天然基因序列(seqidno:8)经密码子优化以在大肠杆菌中表达以及与bglbrick标准相容。密码子优化的序列在seqidno:9中列出。添加c末端his6标签序列，并且将最终基因序列亚克隆在peaat-arac载体中的pbad启动子下。然后将质粒转化至大肠杆菌菌株bl21中进行蛋白质表达。将cbh-his6通过l-阿拉伯糖来诱导表达，且然后首先通过imac纯化，之后进行尺寸排阻色谱。然后将含有cbh-his6的级分浓缩至2ml，并且产生30.66μm的最终浓度。在纯化蛋白质的sds-page测定上可以观察到大小与cbh-his6相对应的蛋白质(图8a)。[0096]通过牛磺胆酸盐到胆酸盐的转化来确定cbh的活性。利用hplc来确定酶处理后胆盐的浓度。首先对已知浓度的牛磺胆酸盐和胆酸盐进行hplc分析，以确定保留时间并获得标准曲线。胆盐的检测在205nm下进行。牛磺胆酸盐在大约12.2分钟的运行时间处洗脱，而胆酸盐在大约19.6分钟的运行时间处洗脱。构建了牛磺胆酸盐和胆酸盐的标准曲线(图8b和图8c)。[0097]通过将10μm纯化的cbh-his6与10mm牛磺胆酸盐一起孵育来测试cbh对牛磺胆酸盐的活性。提取胆盐并用hplc分析。对于实验和没有cbh-his6的阴性对照确定牛磺胆酸盐和胆酸盐两者的浓度(图8d-8f)。在阴性对照中未检测到胆酸盐。另一方面，与蛋白质一起孵育导致牛磺胆酸盐浓度降低100倍。相反，检测到高浓度的胆酸盐。在hplc操作条件限制的范围内未检测到对应于牛磺酸的峰。可以推断，异源表达的cbh-his6保留了其将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐的天然活性。此外，结果显示大约99％的牛磺胆酸盐在与纯化的cbh-his6一起孵育的3小时内发生去缀合。[0098]用适当的对照建立cbh-his6与牛磺胆酸盐的进一步反应，并收集等分试样。然后将等分试样与纯化的艰难梭菌内生孢子一起孵育。通过cfu计数来计数内生孢子的萌发。由于当与cbh-his6一起孵育时牛磺胆酸盐成分由于去缀合为胆酸盐而减少，因此预期来自等分试样的萌发效率会降低。预期地，与阳性对照相比，与cbh-his6一起孵育的牛磺胆酸盐显示出内生孢子萌发的12倍减少(图8g)。该结果与对牛磺胆酸盐和胆酸盐萌发效率进行的原理证明一致(图4b)。这些结果支持提出的通过胆盐成分调节进行cdi预防的策略。[0099]实施例5[0100]益生菌中的胆盐水解酶cbh表达抑制艰难梭菌内生孢子的萌发[0101]将基因cbh-his6亚克隆在唾液酸诱导型构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana中的pnana启动子下。表达gfp而非cbh的构建体充当表达对照。将所得的质粒peaat-j23113r4-nanr-pnana-cbh-his6和peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp转化至ecn底架中。将菌株与牛磺胆酸盐和唾液酸一起孵育。还建立了无细胞阳性对照、非诱导cbh-his6表达菌株对照和无牛磺胆酸盐cbh-his6表达菌株阴性对照。然后收集来自每个实验的过滤培养基并测试其艰难梭菌内生孢子萌发效率。与gfp表达阴性对照相比，表达cbh-his6的ecn菌株在唾液酸诱导后将艰难梭菌内生孢子萌发减少大约1倍(图9a；空白柱)。尽管这是一个有希望的结果，但相对于从纯化的cbh-his6获得的那些，倍数变化显著更低。差异是由于唾液酸诱导型构建体的低表达水平。使用抗his抗体进行免疫印迹，并且发现peaat-j23113r4-nanr-pnana构建体下的cbh-his6表达水平显著低于peaat-arac-pbad构建体下的表达水平(图9b；泳道2-5)。这与我们的菌群失调传感器表征数据一致。为了解决这个问题，将cadc放大器模块设计到基因电路中，以放大如先前概述的诱导型表达。[0102]将基因cbh-his6亚克隆在放大器构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba下。通过免疫印迹证实cbh-his6在ecn菌株中的表达(图9b；泳道6-9)。表达水平被放大，然而，它也导致高基础表达水平。然后我们用在新的放大器电路下表达cbh-his6或gfp的ecn重复艰难梭菌内生孢子萌发测定。观察到艰难梭菌内生孢子萌发减少的明显改善(图9a；填充柱)。与表达对照相比，表达cbh-his6的ecn菌株能够在唾液酸诱导后将艰难梭菌内生孢子萌发减少大约40倍。在不存在唾液酸诱导的情况下，实现了内生孢子萌发的大约10倍减少。这可能归因于cbh-his6的强基础表达。[0103]还收集来自实验和对照的过滤培养基用于hplc分析(图9c)。基于先前鉴定的保留时间检测牛磺胆酸盐和胆酸盐浓度。在无细胞阳性对照和gfp表达对照中没有检测到胆酸盐，而在诱导的cbh-his6表达菌株中未检测到牛磺胆酸盐。未诱导的cbh-his6表达菌株仅显示出牛磺胆酸盐的大约45％去缀合，而内生孢子萌发有10倍减少。这表明牛磺胆酸盐的高积累是实现有效的艰难梭菌内生孢子萌发所必需的。相反，对牛磺胆酸盐的积聚的略微破坏可以强烈降低内生孢子的萌发。这些结果与所进行的原理证明萌发效率测定一致(图4b)。放大器构建体展现出cbh-his6的强基础表达水平。即使在不存在唾液酸诱导的情况下，cbh-his6的这种基础表达也提供针对牛磺胆酸盐的任何积累的即时响应。[0104]实施例6[0105]胆盐水解酶cbh处理的艰难梭菌内生孢子展现出减少的外毒素分泌并改善caco-2细胞的感染预后[0106]cbh在ecn细胞中的表达显示出通过调节胆盐缀合状态来抑制艰难梭菌内生孢子萌发。抑制内生孢子萌发进而将延迟营养性艰难梭菌的扩增。为了确定延迟的扩增是否代表cdi的病理学差异，对从结直肠腺癌中分离的人结肠上皮细胞系caco-2细胞测试萌发的艰难梭菌。[0107]由于艰难梭菌和caco-2不能在同一实验室条件下生长，因此进行交错的共培养。由于cdi的病因是分泌的外毒素[carter,g.p.等人,mbio.6(3):e00551.doi:10.1128/mbio.00551-15(2015)]，此举变成可能。首先使萌发的艰难梭菌在允许条件下生长，其中以定期间隔收集培养基。然后浓缩过滤的培养基并进行缓冲液更换，然后与caco-2细胞一起孵育。尽管此方法没有考虑到艰难梭菌与caco-2细胞之间的直接相互作用，但它允许将从艰难梭菌中分泌的毒素针对caco-2细胞进行测试。[0108]建立类似于先前体外测定的实验和对照。在采用以下的情况下使艰难梭菌内生孢子萌发：通过cbh表达型ecn处理的牛磺胆酸盐(图10a，泳道8-10；图10d；图10f左下方小图)，以及无细胞牛磺胆酸盐阳性对照(图10a，泳道2-4；图10b；图10f顶部中间小图)、gfp表达型ecn表达对照(图10a，泳道5-7；图10c；图10f右上方小图)或无牛磺胆酸盐阴性对照(图10a，泳道11-13；图10e；图10f右下方小图)。对以定期间隔从实验收集的10倍浓缩过滤上清液进行免疫印迹，并且探测毒素tcda。结果表明，当用cbh表达型ecn处理时，分泌到上清液中的tcda的量减少(图10a)。还可以一致地观察到毒素的时间依赖性积累。可以表明，对艰难梭菌内生孢子萌发的抑制延迟了营养细胞的生长并减少了分泌到培养基中的毒素负荷。[0109]在艰难梭菌诱导萌发后以定期间隔收集上清液。将上清液浓缩且然后在与caco-2细胞一起孵育时连续稀释至1至0.01倍。在孵育48小时后用mtt测定caco-2的细胞活力。如预期，与表达对照相比，与从cbh表达型ecn处理的艰难梭菌收集的上清液一起孵育的caco-2显示出更高的最终细胞活力(图10b-图10e)。这与上清液中tcda的量一致。此外，观察到caco-2的细胞形态在用来自cbh表达型ecn和表达对照的上清液处理之间是不同的(图10f)。用来自cbh表达型ecn的上清液处理的caco-2显示出接近于未处理caco-2的形态。另一方面，用来自表达对照的上清液处理导致与用来自阳性对照的上清液处理相似的形态。caco-2细胞显示出与培养板的脱离和与细胞死亡相关的皱缩细胞形状。[0110]总体上，测定显示cbh表达型ecn可以改善离体caco-2细胞培养物的预后。从ecn表达的cbh可以将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐，从而导致艰难梭菌内生孢子的萌发减少。萌发的延迟影响外毒素向培养基中的分泌，且这进而又导致caco-2感染预后的改善。需注意，tcda继续分泌到来自cbh处理的上清液中，而不是完全被抑制。这与体外测定一致，即使在用工程化ecn处理后也有少的艰难梭菌萌发(图9a)。这些营养细胞在培养基中增殖，导致tcda的分泌。即使用工程化ecn处理后，外毒素也可能积累。然而，体内营养物贫乏的环境可限制艰难梭菌的增殖，并且细胞的初始萌发与随后的增殖相比对总体毒力负荷的影响更大。这些动态特性的程度需要在体内进一步阐明，以确定治疗的有效性。尽管如此，得出结论是用工程化ecn处理艰难梭菌内生孢子导致分泌的外毒素的量减少。与表达对照相比，这进而改善caco-2细胞活力。[0111]实施例7[0112]在鼠模型中用表达由菌群失调传感器控制的胆盐水解酶cbh的工程化益生菌进行预治疗提供了针对艰难梭菌感染的保护[0113]先前已经证明了cdi的鼠模型[chen,x.等人,gastroenterology.135:1984-1992(2008)].在本研究中对此模型进行了调整和修改，以测试工程化ecn的功效(图11a)。简而言之，在感染前3天(第-3天)，向小鼠给予一定剂量的工程化益生菌(治疗组或对照组)或空白(感染对照组)。在第0天进行艰难梭菌的感染(107cfu)。然后在9天的历程内记录小鼠的死亡率、体重和临床症状。然后根据先前建立的标准对临床症状进行评分和制表[shelby,r.d.等人,int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129(2019)]。[0114]向治疗组(‘ecn-cbh’)给予含有cbh表达构建体(peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-cbh)的益生菌。此构建体由多个基因模块，即传感器、放大器和执行器组成。为了充分证明完全工程化的益生菌的功效，产生了各种对照益生菌以包含缺少各基因模块之一的构建体。针对这些对照组产生的益生菌汇总在图11b中。向无传感器对照组(‘ecn-pcon-cbh’)给予在没有菌群失调传感器的情况下组成性表达cbh的工程化益生菌。向无放大器对照组(‘ecn-pnana-cbh’)给予缺乏放大器模块的工程化益生菌。向无执行器对照组(‘ecn-gfp)给予表达gfp而非cbh的工程化益生菌。将所有益生菌在第-3天以109cfu的单一剂量施用，并且向感染对照给予蔗糖而非工程化益生菌。[0115]在测定的第0天，用107cfu的艰难梭菌感染小鼠(图11a)。治疗组的存活率的表现显著优于所有对照组。相比于感染对照(70.0％；p＝0.0461)、无传感器对照(14.3％；p《0.0001)、无放大器对照(50.0％；p＝0.0063)和无执行器对照(25.0％；p＝0.0005)，100％小鼠从感染中存活下来(图11c)。感染小鼠在第2天至第4天之间显示出严重的症状。在此时间段期间，治疗组的相对体重相对于所有对照组是相当更稳定的，所有对照组显示出超过10％的相对体重减轻(图11d)。从第0天至第6天，每只小鼠每天还被分配了临床疾病得分(css)，其范围为从0至12。css根据三个标准即粪便、行为和体重减轻分配[shelby,r.d.等人,int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129(2019)]。基于css，感染的严重程度可以描述为正常(0至2)、轻度(3至5)、中度(6至8)和重度(9至12)。然后使用按每只小鼠评分的css来对组的平均得分制表(图11d)。与所有组相比，治疗组的css得分最低，平均值为3.3。与感染对照组(7.0；p＝0.0075)、无传感器对照组(8.7；p＝0.0005)、无放大器对照组(7.5；p＝0.0026)和无执行器对照组(8.5；p＝0.0011)相比，该得分显著更低。总之，这些结果证明，在艰难梭菌感染前施用工程化益生菌能够赋予预防性保护，从而通过降低死亡率和减轻症状的严重程度来改善感染预后。[0116]此外，结果显示，与无执行器对照相比，无传感器组中cbh的组成型表达并未改善小鼠的存活率(p＝0.247)。相反，与无传感器组相比，无放大器组中来自菌群失调传感器的cbh表达显示出存活率的改善(p＝0.0305)。尽管在体外来自组成型启动子的cbh表达水平高于来自pnana启动子的表达水平。各种对照组的结局表明，按需驱动体内cbh表达的菌群失调感测模块在实现调节艰难梭菌感染的预期功能方面是必要的。预期下胃肠道中的营养物水平较差，并且针对酶的连续表达而营养物分配效率低下可能对无传感器益生菌不利。结果突出了菌群失调传感器在控制cbh从工程化益生菌的表达以在体内实现针对cdi的高活性方面的重要性。[0117]总之，这些结果证明，表达由菌群失调传感器控制的胆盐水解酶cbh的工程化益生菌能够提供针对艰难梭菌感染的预防性抗性。胆盐代谢的恢复和菌群失调感测模块两者均被证明在提供针对感染的保护方面至关重要。总之，益生菌作为针对艰难梭菌感染的预防手段展示出高功效。[0118]实施例8[0119]在其他益生菌菌株中表达基因电路以实现类似的治疗性功能[0120]可以容易地将本发明的基因电路在革兰氏阴性和革兰氏阳性的其他益生菌物种中表达。许多天然益生菌物种可以被工程化为活生物治疗剂[o’toole,p.w.,marchesi,j.r.和hill,c.nat.microbiol.2:17057.doi:10.1038/nmicrobiol.2017.57(2017)]。此类物种的例子包括但不限于拟杆菌属物种、梭菌属物种、栖粪杆菌属物种、乳酸乳球菌和乳杆菌属物种。本发明解决了酶表达和对菌群失调的响应的技术难题。可以将表达移植到其他益生菌物种上以实现类似的治疗性功能。这可以使得工程化益生菌能够定殖于并靶向胃肠道的其他位置，如十二指肠、空肠或回肠。[0121]实施例9[0122]可以应用无抗生素选择的益生菌底架以原位递送其他基因电路[0123]通过在大肠杆菌nissle菌株中产生营养缺陷型表型来工程化无抗生素选择的益生菌底架。此底架伴有由作为选择标记的丙氨酸消旋酶基因组成的质粒。此底架实现原位递送工程化基因电路，并且可用于其他目的，如但不限于病原体靶向、癌症靶向和代谢物/生物合成和递送。[0124]实施例10[0125]基于唾液酸的传感器充当对菌群失调的代理并且可以应用于其他菌群失调相关疾病和感染[0126]本发明基于唾液酸响应型启动子对菌群失调事件作出响应。唾液酸响应型启动子可以被工程化为对唾液酸的上调或下调作出响应。微生物组的菌群失调还与许多其他疾病相关，所述其他疾病如但不限于炎性肠病、病原体感染、2型糖尿病、哮喘、肥胖症、自闭症和类风湿性关节炎[packey,c.,d.和sartor,r.b.curr.opin.infect.dis.22(3):292-301(2009)]。基于唾液酸的传感器可以应用于靶向此类疾病的工程化生物治疗剂。[0127]实施例11[0128]可以优化基因电路并将其整合至ecn基因组中以赋予进一步的稳定性[0129]在本发明中，基因电路在质粒上表达。替代性地，可以将基因电路整合至基因组中以实现进一步的稳定性。这将避免不必要但潜在的向微生物组的水平基因转移。已经在ecn基因组中鉴定出多个整合位点[isabella,v.m.等人,nat.biotech.36:857-864(2018)]。这种基因电路的整合可以在这些位点进行，而不会破坏益生菌菌株的基因组稳定性，同时抵抗整合基因电路的自发丧失或失活。[0130]总结[0131]工程化益生菌底架ecn[0132]本发明的一个实施方案提供了从基因组中缺失两个丙氨酸消旋酶基因的大肠杆菌nissle，所述大肠杆菌能够在延长的时间段内维持含有作为选择标记的丙氨酸消旋酶基因的质粒而无需额外选择。这避免了抗生素抗性基因不必要地暴露于微生物组。然后可以将ecn与靶向艰难梭菌的抗生素方案共同施用，以定殖于胃肠道并发挥针对艰难梭菌的抗微生物活性。工程化益生菌可以在延长的时间段内保留在胃肠道中，从而实现预防性应用。[0133]唾液酸诱导型系统[0134]在本发明的一个实施方案中，提供了一种唾液酸诱导型系统，所述唾液酸诱导型系统由包括pnana启动子和任选的nanr转录因子、cadc转录因子及其启动子pcadba的基因电路组成。nanr逆转pnana的诱导性，并且cadc-pcadba放大总体表达水平。此系统根据系统中使用的部件对唾液酸的变化作出响应。升高的唾液酸水平与胃肠道微生物组的菌群失调相关，因此所述系统通过受菌群失调事件发生限制的治疗性蛋白质表达提供对菌群失调事件的及时响应。[0135]cadc放大系统[0136]在本发明的一个实施方案中，提供了元件cadc蛋白和pcadba启动子以通过中间转录激活因子表达来放大来自唾液酸响应型启动子的表达。主要功能是将胆盐水解酶的表达放大至具有治疗意义的水平。次要功能是使得基因电路能够对ph敏感；这为胆盐水解酶表达提供了另外的控制层。[0137]胆盐水解酶表达[0138]表达胆盐水解酶以催化牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐，以便降低在菌群失调(在cdi之前的事件)期间由升高的胆盐引起的艰难梭菌内生孢子萌发效率。所述酶抑制内生孢子的萌发并且导致艰难梭菌分泌的毒素的总体减少。[0139]通过先行地响应于菌群失调而表达胆盐水解酶，益生菌能够充当针对cdi的自主预防手段。这种策略也将有效地预防rcdi。因此，此益生菌解决了cdi管理的缺口，并且可以靶向于有cdi和rcdi风险的患者。[0140]本发明的优点在于它提供了控制cdi和rcdi的非杀菌方法；从而避免了对此方法的抗性。[0141]参考文献[0142]在本说明书中对明显先前已公开的文件的任何列示或讨论都不应一定被视为承认这个文件是现有技术的一部分或者是公知常识。[0143]begley,m.,gahan,c.g.m,,&hill,c.(2005)theinteractionbetweenbacteriaandbile.fems.microbiol.rev.25:625-51.[0144]buffie,c.g.,bucci,v.,stein,r.r.,mckenny,p.t.,ling,l.,gobourne,a.,etal.(2015)precisionmicrobiomereconstitutionrestoresbileacidmediatedresistancetoclostridiumdifficile.nat.lett.517:205-8.[0145]carter,g.p.,chakravorty,a.,phamnguyen,t.a.,mileto,s.,schreiber,f.,li,l.,etal.(2015)definingtherolesoftcdaandtcdbinlocalisedgastrointestinaldisease,systemicorgandamage,andthehostresponseduringclostridiumdifficileinfections.mbio.6(3):e00551.doi:10.1128/mbio.00551-15.[0146]chen,x.,katchar,k.,goldsmith,j.d.,nanthakumar,n.,chekins,a.,gerding,d.n.,etal.(2008)amousemodelofclostridiumdifficile-associateddisease.gastroenterology.135:1984-1992.[0147]chilton,c.h.,pickering,d.s.,&freeman,j.(2018)microbiologicalfactorsaffectingclostridiumdifficilerecurrence.clin.microbiol.infect.publishedaheadofprint.doi:10.1016/j.cmi.2017.11.017.[0148]coleman,j.p.,&hudson,l.l.(1995)cloningandcharacterizationofaconjugatedbileacidhydrolasegenefromclostridiumperfringens.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20.[0149]gebhart,d.,lok,s.,clare,s.,tomas,m.,stares,m.,scholl,d.,etal.(2015)amodifiedr-typebacteriocinspecificallytargetingclostridiumdifficilepreventscolonizationofmicewithoutaffectinggutmicrobiotadiversity.mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14[0150]gupta,p.,yakubov,s.,tin,k.,zea,d.,garankina,o.,ghitan,m.,etal(2016)doesalkalinecolonicphpredisposetoclostridiumdifficileinfection？south.med.j.109(2):91-6.[0151]huang,y.l.,chassard,c.,hausmann,m.,vonitzstein,m.,&hennet,t.(2015)sialicacidcatabolismdrivesintestinalinflammationandmicrobialdysbiosisinmice.nat.commun.6:8141.doi:10.1038/ncomms9141.[0152]hwang,i,y.,koh,e.,wong,a.,march,j.c.,bentley,w.e.,lee,y.s.,&chang,m.w.(2017)engineeredprobioticescherichiacolicaneliminateandpreventpseudomonasaeruginosagutinfectioninanimalmodels.nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028.[0153]isabella,v.m.,ha,b.h.,castillo,m.j.,lubkowicz,d.j.,rowe,s.e.,anderson,c.l.,etal.(2018)developmentofasyntheticlivebacterialtherapeuticforthehumanmetabolicdiseasephenylketonuria.nat.biotech.36:857-864.[0154]kalivoda,k.a.,steenbergen,s.m.,vimr,e.r.,&plumbridge,j.(2003)regulationofsialicacidcatabolismbythednabindingproteinnanrinescherichiacoli.j.bacteriol.185(16):4806-15.[0155]keseler,i.m.mackie,a.,peralta-gil,m.,santos-zavaleta,a.,gama-castro,s.,bonavides-martinez,c.,etal.(2013)ecocyc:fusingmodelorganismdatabaseswithsyntheticbiology.nuc.acids.res.41:605-12.[0156]maurer,j.m.,schellekens,r.c.a.,vanrieke,h.m.,wanke,c.,iordanov,v.,stellaard,f.,etal.(2015)gastrointestinalphandtransittimeprofilinginhealthyvolunteersusingtheintellicapsystemconfirmsileo-colonicreleaseofcolopulsetablets.plos.one.10(7):e0129076doi:10.1371/journal.pone.0129076[0157]may,t.,mackie.r.i.,faheyjr,g.c.,cermin,j.c.,&garleb,k.a.(1994)effectoffibersourceonshort-chainfattyacidproductionandonthegrowthandtoxinproductionbyclostridiumdifficile.scand.j.gastroenterol.29(10):916-22.[0158]nelson,r.(2007)antibiotictreatmentforclostridiumdifficile-associateddiarrheainadults.cochrane.database.syst.rev.18(3):cd004610.[0159]ng,k.m.,ferreyra,j.a.,higginbottom,s.k.,lynch,j.,kashyap,p.c.,gopinath,s.,etal.(2013)microbiota-liberatedhostsugarsfacilitatepostantibioticexpansionofentericpathogens.nat.lett.502:96-99.[0160]o’toole,p.w.,marchesi,j.r.,&hill,c.(2017)next-generationprobiotic:thespectrumfromprobioticstolivebiotherapeutics.nat.microbiol.2:17057.doi:10.1038/nmicrobiol.2017.57.[0161]packey,c.,d.,&sartor,r.b.(2009)commensalbacteria,traditionalandopportunisticpathogens,dysbiosisandbacterialkillingininflammatoryboweldiseases.curr.opin.infect.dis.22(3):292-301.[0162]petrosillo,n.(2018)tacklingtherecurrenceofclostridiumdifficileinfections.med.mal.infect.48(1):18-22.[0163]ridlon,j.m.,kang,d.,&hylemon,p.b.(2006)bilesaltbiotransformationbyhumanintestinalbacteria.j.lipid.res.47:241-59[0164]ridlon,j.m.,&hylemon,p.b.(2012)identificationandcharacterizationoftwobileacidcoenzymeatransferasesfromclostridiumscindens,abileacid7α-dehydroxylatingintestinalbacterium.j.lipid.res.53:66-76.[0165]roberts,a.p.,&mullany,p.(2010)clostridiumdifficile:nolongeranenigmaticpathogen？clostridiumdifficile:methodsandprotocols.ed:p.mullany,a.roberts.springerus,newyork.3-8[0166]schultz,m.(2008)clinicaluseofe.colinissle1917ininflammatoryboweldisease.inflammboweldis.14(7):1012-8.[0167]shelby,r.d.,tengberg,n.,conces,m.,olson,j.k.,navarro,j.b.,bailey,m.t.,etal.(2019)developmentofastandardizedscoringsystemtoassessamurinemodelofclostridiumdifficilecolitis.int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129.[0168]sonnenborn,u.,&schulze,j.(2009)thenon-pathogenicescherichiacolistrainnissle1917–featuresofaversatileprobiotic.micob.ecol.healthdis.21:122-58.[0169]sorg,j.a.,&soenenshein,a.l.(2008)bilesaltsandglycineascogerminantsforclostridiumdifficilespores.j.bacteriol.190(7):2505-12.[0170]watson,n.,dunyak,d.s.,rosey,e.l.,slonczewski,j.l.,&olson,e.r.(1992)identificationofelementsinvolvedintranscriptionalregulationoftheescherichiacolicadoperonbyexternalph.j.bacteriol.174(2):530-40.当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.艰难梭菌(clostridiumdifficile)(也归类为clostridioidesdifficile)是能引起艰难梭菌感染(cdi)和复发性cdi(rcdi)的病原体。cdi是全球常见的医院获得性感染之一。然而，由于细菌内生孢子形成从而逃避抗生素治疗，cdi的治疗是困难的。在20.9％的患者中发生cdi的复发并且由于这些感染导致的死亡率为9.3％。据推测，在原生微生物组破坏或菌群失调后休眠内生孢子的萌发会导致感染和复发(图1)。内生孢子的萌发主要由人胃肠道中的胆盐牛磺胆酸盐促进。据推测，人胃肠道中微生物组的菌群失调会导致游离牛磺胆酸盐的量增加并促进内生孢子的萌发。3.粪便微生物群移植(fmt)是cdi的一种实验性治疗法。在fmt中，将从健康供体中提取的液体粪便悬浮液输注至患有cdi的患者。它旨在恢复胃肠道中的微生物群平衡。虽然疾病预后通常得到改善，但治疗的适应性有限。这部分是由于关于使用粪便物的安全性问题。此外，这种策略是一种黑匣子工程化形式，所述工程化形式未鉴定抑制感染所需的微生物组的具体物种。除了被认为是对被破坏的微生物组的大量替代之外，预后改善背后的机制在很大程度上是未知的。技术实现要素：4.本发明采用工程化益生菌菌株的形式，所述工程化益生菌菌株可以抑制艰难梭菌内生孢子在人胃肠道内的萌发。所述益生菌表达胆盐水解酶，其将艰难梭菌内生孢子萌发剂牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐。与牛磺胆酸盐相比，胆酸盐具有较低的内生孢子萌发效率。此外，胆酸盐对营养性艰难梭菌展现出生长抑制。这些导致对内生孢子萌发的抑制以及对艰难梭菌增殖和定殖发作的延迟(图2)。在此延迟期间恢复微生物组可以预防cdi和rcdi。所述益生菌被进一步加强以对所述微生物组的菌群失调作出响应。据报道，菌群失调会引起胃肠道中升高的游离唾液酸水平。胆盐水解酶的表达受唾液酸响应型元件的控制。这使得胆盐水解酶能够在所述微生物组发生变化时及时表达。此外，通过益生菌递送底架(chassis)对所述酶的表达使得通过在人胃肠道内的定殖实现了长期且稳健的表达。与未处理的对照相比，本发明在体外显示出将艰难梭菌的萌发抑制97.8％。5.本发明具有临床相关性。它解决了针对cdi和rcdi的预防需求。两组患者将尤其受益于本发明。有cdi风险的患者(如当前在医院接受抗生素方案的那些患者)将发现它有助于对cdi发作的预防。它也可以用于施用至当前cdi患者以作为对rcdi的预防。6.在第一方面，本发明涉及一种表达盒，所述表达盒包含：7.i)胆盐水解酶基因，以及8.ii)与所述胆盐水解酶基因可操作地连接的唾液酸响应型启动子。9.在一些实施方案中，所述胆盐水解酶基因是来自产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)的cbh蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码seqidno:13中列出的氨基酸序列或其功能变体。10.在一些实施方案中，所述胆盐水解酶多核苷酸序列包含与seqidno:8或seqidno:9中列出的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。11.应当理解，由于遗传密码的冗余性，多核苷酸序列可能具有小于100％的同一性，但仍编码相同的氨基酸序列，如seqidno:13中列出的胆盐水解酶的氨基酸序列。12.在一些实施方案中，所述唾液酸响应型启动子是来自大肠杆菌的pnana，其优选地包含seqidno:4中列出的核酸序列或其功能变体。13.在一些实施方案中，当在不存在唾液酸的情况下存在pnana的表达时，将pnana的阻遏子定位于pnana的上游，其中优选地所述阻遏子是nanr蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码seqidno:11中列出的氨基酸序列或其功能变体。14.在一些实施方案中，所述nanr蛋白编码多核苷酸序列包含与seqidno:5中列出的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性或100％序列同一性的核酸序列。15.在一些实施方案中，所述盒还包含与nanr可操作地连接的组成型启动子，其中所述启动子选自包括以下的组：具有arac的pbad；具有rbs2、rbs3或rbs5的j23108；和具有rbs4的j23113。16.在一些实施方案中，与nanr可操作地连接的所述组成型启动子是j23113-rbs4。17.在一些实施方案中，所述盒包含j23113-rbs4-nanr，其优选地包含seqidno:6中列出的核酸序列或其功能变体。18.在一些实施方案中，所述盒还包含激活子和启动子以增加cbh的表达，如转录激活因子cadc蛋白编码序列和启动子pcadba，其中cadc定位于pnana的下游并受其控制，并且pcadba定位于cadc的下游并与所述胆盐水解酶cbh蛋白编码序列可操作地连接。19.在一些实施方案中，所述cadc氨基酸序列在seqidno:12中列出或为其功能变体。在一些实施方案中，所述cadc核酸序列在seqidno:14中列出或为其功能变体。20.在一些实施方案中，所述激活子和启动子核酸序列包含seqidno:7中列出的核酸序列或其功能变体。21.在一些实施方案中，所述盒包含在一种或多种质粒载体中。22.在一些实施方案中，所述质粒载体是peaat，其优选地包含seqidno:1中列出的核酸序列。所述载体包含复制起点、alr选择标记(seqidno:2和3)、卡那霉素抗性标记和多克隆位点。23.在一些实施方案中，所述盒还包含抗生素抗性基因，其侧翼为frt位点以使得所述抗生素抗性基因能够被去除。24.在一些实施方案中，cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达。cbh的密码子优化基因序列的例子是seqidno:9中列出的核酸序列。25.在一些实施方案中，cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达，所述益生菌细胞选自包括以下的组：大肠杆菌物种(e.colisp.)、拟杆菌属物种(bacteroidessp.)、梭菌属物种(clostridiumsp.)、栖粪杆菌属物种(faecalibacteriumsp.)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)和乳杆菌属物种(lactocbacillussp.)。26.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的表达盒用于重组产生胆盐水解酶蛋白的用途。27.在本发明的另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含：28.a)益生菌细菌；以及29.b)根据本发明的任何方面的表达盒，30.其中所述益生菌细菌包含所述表达盒以用于产生胆盐水解酶。31.所述益生菌细菌可以选自任何合适的益生菌细菌属。32.在一些实施方案中，所述益生菌细菌选自包括以下的组：大肠杆菌物种、拟杆菌属物种、梭菌属物种、栖粪杆菌属物种、乳酸乳球菌和乳杆菌属物种。33.在一些实施方案中，所述益生菌细菌是营养缺陷型的。34.在一些实施方案中，所述营养缺陷型细菌已缺失了丙氨酸消旋酶基因并且在不存在d-丙氨酸的情况下不能分裂。35.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的组合物，用于在治疗艰难梭菌感染(cdi)和/或复发性cdi(rcdi)的方法中使用。36.在一些实施方案中，所述cdi和/或rcdi由菌群失调引起。37.在本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防方法，所述治疗或预防方法包括向需要这种治疗或预防的受试者施用有效量的根据本发明的任何方面的组合物。38.在一些实施方案中，所述受试者患有艰难梭菌感染(cdi)或复发性cdi。39.在本发明的另一方面，提供了根据本发明的任何方面的组合物，用于制造用于治疗或预防cdi和/或rcdi的药物。40.在一些实施方案中，所述艰难梭菌感染(cdi)和/或复发性cdi是由于菌群失调造成。附图说明41.图1示出了菌群失调诱导的艰难梭菌的感染和复发性感染的示意图。1)从环境获得的艰难梭菌(cd)内生孢子可以作为微生物组的休眠成员存在。2)正常微生物组的破坏产生艰难梭菌定殖的生态位。3)内生孢子萌发成营养细胞，并进一步扩增至微生物组内的生态位中，从而导致宿主感染。4)在感染后期，将通过营养细胞产生另外的内生孢子。5)这些内生孢子能够逃避抗生素治疗。微生物组的持续菌群失调为复发性感染提供了脆弱性窗口，因为一旦治疗停止，内生孢子就可萌发。6)即使从感染中恢复，当菌群失调发生时，内生孢子仍可能持续存在并触发感染。42.图2示出了本发明用于实现对艰难梭菌内生孢子的抑制的策略的示意图。微生物组的菌群失调改变了胃肠道中的代谢物概况。这包括升高水平的游离唾液酸。工程化益生菌通过唾液酸激活以表达胆盐水解酶。所述酶能够将艰难梭菌内生孢子萌发剂牛磺胆酸盐去缀合为更弱的萌发剂胆酸盐。因此实现了对艰难梭菌内生孢子萌发的抑制，并且防止了艰难梭菌从无毒力形式向有毒力形式的转变。43.图3示出了提出的关于菌群失调诱导的艰难梭菌感染机制的模型。微生物组中的两组微生物(顶部)在菌群失调(底部)的情况下被破坏。i)第一组介导胆盐从小肠(si)的去缀合。在菌群失调期间这组微生物的丧失导致艰难梭菌(cd)内生孢子驻留于其中的结肠中的缀合胆盐。缀合胆盐触发内生孢子萌发成营养性艰难梭菌。ii)由唾液酸利用物种和唾液酸酶表达物种构成的第二组调节胃肠道内的游离唾液酸水平。菌群失调期间物种平衡的扰乱导致唾液酸升高。萌发的艰难梭菌能够利用唾液酸作为碳源进行其扩增，从而导致宿主感染。44.图4示出了缀合胆盐牛磺胆酸盐是艰难梭菌内生孢子的更有效的萌发剂，并且去缀合胆盐胆酸盐抑制艰难梭菌的生长。a)缀合胆盐牛磺胆酸盐被胆盐水解酶去缀合为初级胆盐胆酸盐和牛磺酸。b)从艰难梭菌菌株i)cd630、ii)vpi10463、iii)baa-1870和iv)9689中提取的内生孢子通过与不同浓度的牛磺胆酸盐(填充圆圈)和胆酸盐(空白圆圈)一起孵育的萌发。误差条表示一式两份的s.e.m。c)艰难梭菌菌株i)cd630、ii)vpi10463、iii)baa-1870和iv)9689在牛磺胆酸盐(填充圆圈)和胆酸盐(空白圆圈)情况下的生长。45.图5示出了对无抗生素选择的益生菌底架进行工程化的计划。a)无d-丙氨酸营养缺陷型抗生素选择的底架的示意图。对丙氨酸消旋酶基因的破坏导致无法内源性地产生d-丙氨酸。d-丙氨酸的缺乏会抑制细胞壁合成和细胞增殖。这种表型可以通过从质粒中表达丙氨酸消旋酶来挽救。这使得能够选择质粒，并由此选择合成基因电路。b)peaat载体的质粒图谱(seqidno:1)。alr(seqidno:3)编码在天然启动子(seqidno:2)控制下的丙氨酸消旋酶(seqidno:10)；neor编码抗生素抗性基因新霉素磷酸转移酶。其侧翼是用于经由flp切除的一对frt序列；ori编码复制起点coie1；通过设计添加九个独特的限制性位点。根据bglbrick标准，主要插入位点位于bglii与bamhi之间。c)在不具有(空白方块)或具有(空白圆圈)d-丙氨酸补充剂的情况下的ecn生长测定，以及用peaat质粒(灰色圆圈)的表型挽救。包括野生型ecn(黑色圆圈)作为对照。d)表达neor质粒的活细胞的百分比，所述neor质粒在具有(填充)和不具有(空白)d-丙氨酸补充剂的情况下在表达pbbe8k-j23108-lasr-plas-gfp的ecnwt(正方形)或表达peaat-j23108-lasr-plas-gfp的ecn(三角形)的质粒上共表达。在没有抗生素选择的情况下将细胞每日继代培养。细胞的活力指示质粒的存在。46.图6示出了nanr依赖性唾液酸诱导型启动子的优化。a)用于pnana的初始表征的质粒设计(peaat-pnana-gfp)。sa表示唾液酸诱导。b)在不同浓度的唾液酸诱导下，t10(左)和ecn(右)中用于peaat-pnana-gfp表征的10,000个样品的流式细胞术荧光读数的直方图。c)用于表征nanr(seqidno:11)和pnana(psc101-pbad-nanr)的共表达质粒的质粒设计。la表示l-阿拉伯糖诱导；sa表示唾液酸诱导。d)针对唾液酸(sa)和l-阿拉伯糖(la)诱导的每种组合，在流式细胞仪上10,000个样品的中值gfp荧光读数的矩阵数据。每种细胞的颜色按比例分级。e)用于在peaat-pnana-gfp中共表达nanr的质粒设计。f)通过调节nanr表达对pnana表达的优化。在不同启动子和核糖体结合位点下表达nanr的构建体的相对gfp荧光表达。用0.2％唾液酸诱导细胞。47.图7示出了在胃肠特定条件下对工程化唾液酸生物传感器的表征。a)唾液酸诱导型构建体(peaat-j2113r4-nanr-pnana-gfp)和b)唾液酸阻遏型构建体(peaat-pnana-gfp)对唾液酸和葡萄糖组合的诱导的响应。逻辑门图描绘了对唾液酸和葡萄糖作为输入的响应。c)唾液酸诱导型放大器构建体(peaat-j2113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)的质粒设计。在d)lb和e)具有甘油的m9基本培养基中对唾液酸诱导型构建体和唾液酸诱导型放大器构建体的表征。示出了诱导3和6小时后的相对荧光表达。f)在不同ph下对唾液酸诱导型放大器构建体的表征。示出了诱导3小时后的相对荧光表达。g)在没有碳源的m9基本培养基中，在具有和不具有唾液酸的情况下ecn的生长。48.图8示出了纯化的cbh-his6将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐并抑制艰难梭菌内生孢子萌发。a)在imac和尺寸排阻色谱后纯化的cbh-his6的12％sds-page解析。cbh-his6的预期大小是38kda。l表示蛋白质梯状标志。来自hplc分析的谱面积相对于b)牛磺胆酸盐和c)胆酸盐浓度的标准曲线。d)在进行和不进行10μm纯化的cbh-his6的3小时处理的情况下牛磺胆酸盐和胆酸盐的浓度。在处理与未处理之间对牛磺胆酸盐浓度进行学生t检验。*p《0.005。对应于e)牛磺胆酸盐和f)胆酸盐分别在保留时间12.2分钟和19.6分钟下洗脱的峰的hplc谱。g)基于艰难梭菌的cfu计数，在用cbh-his6处理后胆盐的萌发效率。进行无牛磺胆酸盐的阴性对照和无酶的阳性对照。在处理与阳性对照之间进行学生t检验。*p《0.05。误差条表示一式两份的s.e.m。49.图9示出了益生菌中的cbh表达抑制艰难梭菌内生孢子的萌发。a)基于艰难梭菌的cfu计数，在用cbh表达型ecn处理后胆盐的萌发效率。使用了两组构建体，一组没有放大器模块(pnana；空白柱)，并且一组具有放大器模块(pnana-cadc-pcadba；填充柱)。每组实验均用gfp表达对照、非诱导对照和无牛磺胆酸盐阴性对照进行。还进行了无细胞阳性对照(灰色柱)。对放大器构建体进行单因素方差分析和学生t检验。*p《0.005。误差条表示一式两份的s.e.m。b)从ecn在不同启动子下表达的cbh-his6的免疫印迹。用0.2％l-阿拉伯糖诱导pbad构建体(peaat-arac-pbad)，并且通过0.2％唾液酸诱导pnana(peaat-j23113r4-nanr-pnana)和pnana-cadc-pcadba放大器(peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba)构建体。通过od600调整细胞密度，然后进行蛋白质提取。l表示蛋白质梯状标志；s表示可溶性级分；is表示不溶性级分。cbh-his6的预期大小是38kda。c)在用来自放大器构建体的cbh表达型ecn处理后牛磺胆酸盐和胆酸盐的浓度。进行无细胞阳性对照、gfp表达对照、非诱导对照和无牛磺胆酸盐阴性对照。在处理与gfp表达对照之间对牛磺胆酸盐浓度进行学生t检验。*p《0.001。50.图10示出了cbh处理的艰难梭菌内生孢子展现出减少的外毒素分泌并改善caco-2细胞的感染预后。a)来自分别在艰难梭菌培养物的萌发时间点收集的10倍浓缩上清液的tcda免疫印迹。将萌发剂牛磺胆酸盐在与艰难梭菌内生孢子一起孵育之前在不同条件下进行处理。从左起，无细胞阳性对照、gfp表达对照、cbh表达处理和无牛磺胆酸盐阴性对照。l表示蛋白质梯状标志。tcda的预期大小是308kda。用通过在相应条件下的萌发艰难梭菌培养物收集的上清液处理的caco-2的相对细胞活力，所述相应条件即b)无细胞阳性对照、c)gfp表达对照、d)cbh表达处理和e)无牛磺胆酸盐阴性对照。将上清液稀释至1倍(填充)、0.1倍(灰色)和0.01倍(空白)的最终浓度。相对细胞活力通过mtt测定给出，针对未处理的caco-2对照进行归一化。数字相对细胞活力数据示出在矩阵中。f)用最终浓度为1倍的相应上清液处理24小时后，caco-2细胞的倒置光学显微镜照片。tau表示牛磺胆酸盐；sa表示唾液酸。51.图11示出了cbh表达型ecn在治疗用艰难梭菌感染的鼠cdi模型中的功效。a)感染测定的实验时间线，其示出治疗、益生菌和艰难梭菌的施用点。b)实验组和给予的工程化益生菌的表达构建体的表。c)存活曲线和d)在九天内，在用艰难梭菌细胞感染后相应组的平均体重。在治疗组与对照组之间进行gehan-breslow-wilcoxon检验。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。e)在六天内，用艰难梭菌细胞感染后每个组中相应小鼠展现出的最大临床疾病得分(css)。在治疗组与对照组之间进行未配对学生t检验。**p《0.01，***p《0.001。52.定义53.为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。54.如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。当“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和类似术语并不意为将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。55.如本文所用，术语“功能变体”或“变体”是指改变了一个或多个氨基酸但保留与非变体参考序列(例如胆盐水解酶)相同功能的氨基酸序列。变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。很少地，变体可能具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入、或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如软件(dnastar公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性的指南。56.如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”应解释为指定所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”还包括“由……组成”。词语“包含(comprising)”的变体(诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变体(诸如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有相应变化的含义。57.如本文所用，术语“益生菌”是指活的微生物补充剂，所述微生物补充剂通过其在肠道、泌尿道或阴道中的作用对患者具有有益影响。58.如本文所用，术语“预防”是指为了预防疾病(如预防cdi相关疾病)而给予的治疗或采取的行动。59.如在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指改善性、疗法性或治愈性治疗。60.术语“受试者”在本文中定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究的目的，受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，对于治疗或预防菌群失调、更特别是cdi相关疾病，受试者可以是人。具体实施方式61.为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献在实施例的末尾列出。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。62.关于cdi和rcdi机制的普遍共识涉及微生物组的菌群失调和随后造成的休眠内生孢子的萌发(图1)[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)]。在正常健康的微生物组中，艰难梭菌可能作为共生休眠内生孢子保留在人胃肠道中，并由于缺乏生态位而不会引起感染。矛盾的是，广谱抗生素的施用已被确立为是促进cdi的风险因素[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)；roberts,a.p.和mullany,p.clostridiumdifficile:methodsandprotocols.p.mullany,a.roberts编辑.springer美国,纽约.3-8(2010)]。据推测，施用抗生素会扰乱现有微生物组的平衡并导致菌群失调[gebhart,d.等人mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14(2015)]。来自萌发的休眠内生孢子或者从环境中新获得的艰难梭菌可以利用这个机会迅速扩增至达到导致感染的毒力负荷[gebhart,d.等人mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14(2015)；sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。使问题更加复杂的是，除了由于抗生素治疗的选择压力而产生的抗微生物抗性之外，艰难梭菌内生孢子对抗生素具有天然抗性[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)；roberts,a.p.和mullany,p.clostridiumdifficile:methodsandprotocols.p.mullany,a.roberts编辑.springer美国,纽约.3-8(2010)]。这使得内生孢子能够逃避根除治疗，并且被怀疑是rcdi顺着脆弱性窗口度过复发的原因，直到微生物组稳态恢复[petrosillo,n.med.mal.infect.48(1):18-22(2018)]。[0063]证据表明，微生物组内的胆盐代谢物种，如闪烁梭菌(c.scindens)赋予对艰难梭菌的定殖抗性[chilton,c.h.,pickering,d.s.和freeman,j.clin.microbiol.infect.publishedaheadofprint.doi:10.1016/j.cmi.2017.11.017(2018)；buffie,c.g.等人nat.lett.517:205-8(2015)]。胆盐是艰难梭菌的已知萌发剂[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]，并且由于肠道微生物组破坏而引起的胆盐代谢破坏可导致萌发，从而导致cdi。[0064]在人中，胆盐在肝脏中合成并通过胆囊分泌到胃肠道中的小肠的十二指肠处[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。胆盐根据其缀合物和官能团以不同的分子形式存在。从人肝脏排出的胆盐以与牛磺酸或甘氨酸缀合的初级胆盐形式存在，从而分别形成牛磺胆酸盐或甘氨胆酸盐。牛磺胆酸盐是艰难梭菌的已知萌发剂，并且常规地用于在细菌的实验室操纵中诱导内生孢子萌发[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。应当理解，胆盐在其向下进入下胃肠道时经受微生物组的修饰[ridlon,j.m.,kang,d.和hylemon,p.b.j.lipid.res.47:241-59(2006)；begley,m.,gahan,c.g.m.和hill,c.fems.microbiol.rev.25:625-51(2005)]。明显的是，缀合胆盐去缀合为初级未缀合胆盐，并且初级胆盐7α-脱羟基化为次级胆盐。后一种反应可以由先前提到的闪烁梭菌介导[ridlon,j.m.和hylemon,p.b.j.lipid.res.53:66-76(2012)]。此外，次级胆盐脱氧胆酸盐显示出抑制艰难梭菌定殖[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。由于这些修饰，结肠中的胆盐主要以未缀合的初级或次级形式存在[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)]。[0065]在此提出了由于菌群失调导致cdi发作的机制的模型(图3)。提出由于菌群失调造成的两个事件诱导cdi。假设菌群失调破坏了微生物组中的参与胆盐修饰的这些物种。这导致了下胃肠道中胆盐成分的失调。增加浓度的缀合胆盐(特别是牛磺胆酸盐)充当萌发的触发剂，并且用于表示微生物组内存在用于艰难梭菌定殖的空缺生态位。第二个事件涉及胃肠道中游离唾液酸的升高。微生物群的菌群失调破坏导致唾液酸利用菌株的丧失和/或唾液酸酶表达菌株的增殖[ng,k.m.等人nat.lett.502:96-9910(2013)]。这会引起胃肠道内游离唾液酸的升高。萌发的营养性艰难梭菌利用游离唾液酸作为碳源进一步增殖和扩增，从而导致cdi。[0066]在此，我们寻求发明一种用于预防cdi的预防性抗微生物策略。通过了解艰难梭菌的发病机制，将艰难梭菌内生孢子的萌发鉴定为用于预防感染进展的潜在干预点。工程化益生菌可以利用感染发作的机制来调节内生孢子的萌发。[0067]在提出的菌群失调诱导的cdi的机制的模型中，假设缀合胆盐是艰难梭菌内生孢子萌发的驱动萌发剂。在微生物组的稳态期间，缀合胆盐在到达其中cdi期间艰难梭菌定殖的结肠之前被微生物组代谢。这在菌群失调期间被破坏。作为模型的原理证明，对缀合和去缀合胆盐的萌发效率进行测定。通过胆盐水解酶(酶委员会编号：ec3.5.1.24)将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐和牛磺酸[coleman,j.p.和hudson,l.l.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20(1995)](图4a)。与牛磺胆酸盐相比，去缀合胆盐显示出显著降低的萌发效率(图4b)。较高浓度的胆酸盐进一步抑制萌发，这与现有报告[sorg,j.a.和soenenshein,a.l.j.bacteriol.190(7):2505-12(2008)；begley,m.等人,fems.microbiol.rev.25:625-51(2005)]一致。此外，胆酸盐显示出抑制营养性艰难梭菌细胞的生长(图4c)。这些结果表明，调节胆盐去缀合以防止艰难梭菌内生孢子的萌发并抑制其随后的生长可以充当可行的针对艰难梭菌的预防性抗微生物策略。[0068]我们设想了利用工程化益生菌菌株ecn(d-丙氨酸营养缺陷型大肠杆菌nissle)[hwang,i,y.等人,nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028(2017)]来通过胆盐水解酶的体内表达而调节胆盐去缀合的预防性抗微生物策略。胆盐水解酶的这种表达可以降低局部牛磺胆酸盐浓度，进而抑制艰难梭菌内生孢子的萌发。对艰难梭菌从内生孢子萌发的延迟和生长抑制可以防止导致cdi或rcdi的过度增殖。选择来自产气荚膜梭菌的胆盐水解酶cbh进行应用[coleman,j.p.和hudson,l.l.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20(1995)]。将所述酶的表达与唾液酸响应型启动子pnana(seqidno:4)偶联。唾液酸在微生物组的菌群失调期间显示出上调(10)。通过将pnana与cbh表达偶联，pnana可以在体内菌群失调的情况下调控cbh的表达。在这种设计下，当在菌群失调期间游离唾液酸水平升高时，pnana将做出响应并表达cbh。这使得对菌群失调发作的自主体内响应成为可能。[0069]ecn被用作递送所设计策略的底架。作为革兰氏阴性细菌，ecn对通常被施用以用于cdi治疗的革兰氏阳性菌靶向性万古霉素不太敏感[nelson,r.cochrane.database.syst.rev.18(3):cd004610(2007)]。这将允许并行施用用于治疗的抗生素和用于预防rcdi的益生菌。此外，ecn能够利用唾液酸进行代谢。作为益生菌菌株，它们作为微生物组的一部分定殖。因此，它们能够与艰难梭菌竞争营养物以及胃肠道内的空缺生态位。此外，ecn的营养缺陷型特征将使得能够设计出无需抗生素即可维持的质粒。已经通过从基因组中缺失丙氨酸消旋酶基因将菌株工程化以显示出对d-丙氨酸的营养缺陷型表型[hwang,i,y.等人,nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028(2017)]。将必需的丙氨酸消旋酶基因用作携带工程化电路的质粒中的选择标记。所得的工程化菌株可以在长时间段内在没有额外选择压力的情况下稳定地维持设计的质粒。总之，工程化ecn将赋予对胃肠道中的cdi的长期预防作用。[0070]实施例[0071]本领域中已知并且未明确描述的标准分子生物学技术大体上遵循如sambrook和russel,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratory,newyork(2001)中所述。[0072]实施例1[0073]对无抗生素选择的益生菌底架的工程化[0074]在体内实施工程化益生菌的挑战之一是确保底架中基因电路的长期稳定性。工程化基因电路通常在质粒上进行工程化并通过抗生素选择维持，但此类技术对于体内应用是不可行的。对于胃肠道中的定殖益生菌，不能便利地实现通过连续抗生素选择对质粒稳定性的维持。[0075]为了实现不需要抗生素维持的质粒底架系统，在大肠杆菌nissle野生型菌株中产生了营养缺陷型表型。从大肠杆菌nissle基因组中缺失了d-丙氨酸生物合成所必需的丙氨酸消旋酶基因，以产生菌株ecn(图5a)。d-丙氨酸是细菌细胞壁生物合成所需的。d-丙氨酸的缺失会防止细菌进一步分裂，从而产生营养缺陷型表型。[0076]设计质粒以挽救ecn底架中的营养缺陷型表型(图5b)。该质粒含有充当选择基因的丙氨酸消旋酶的拷贝。它还含有用于表征和放大目的的卡那霉素抗性基因。这种卡那霉素抗性基因的侧翼是frt位点，所述frt位点使得所述基因能够通过flp重组酶的表达被去除。这种设计使得能够容易地去除抗生素抗性基因，以产生含有自选择质粒的最终益生菌菌株。此举起到防止在应用期间抗性基因从工程化菌株到微生物组中的潜在水平基因转移的作用。[0077]丙氨酸缺失的ecn菌株成功地显示出丙氨酸营养缺陷型表型(图5c)。通过表达所设计的质粒peaat来挽救所述表型。还通过外源补充d-丙氨酸来挽救所述菌株。这使得所述菌株能够维持在实验室条件下。此外，质粒在不存在任何抗生素选择的情况下在ecn中稳定维持一个月(图5d)。将具有抗生素抗性基因的质粒转化至ecn或野生型菌株中。使细胞在不存在抗生素的情况下生长。然后以定期间隔测试细胞中质粒的存在。发现仅在工程化ecn中，质粒始终维持为接近于100％。总之，这些结果显示ecn充当在体内长期递送工程化基因电路的底架的适用性。[0078]实施例2[0079]nanr依赖性唾液酸诱导型启动子的优化[0080]来自mg1655大肠杆菌基因组的唾液酸诱导型启动子pnana(seqidno:4)的序列获自ecocyc数据库[keseler,i.m.等人nuc.acids.res.41:605-12(2013)].将启动子亚克隆在peaat质粒(peaat-pnana-gfp)中gfp基因的上游，且然后转化至t10和ecn中进行表达表征(图6a)。出人意料的是，两种大肠杆菌菌株对唾液酸诱导显示出不同的响应(图6b)。唾液酸的诱导导致t10pnana启动子的正向激活，从而导致gfp表达。另一方面，ecn中pnana启动子下的gfp在不存在唾液酸的情况下强表达，而在高浓度的唾液酸诱导下受到阻遏。[0081]响应的差异表明pnana在t10与ecn之间受到不同的调控。nanr(seqidno:5)先前被鉴定为大肠杆菌中唾液酸分解代谢的转录调控子[kalivoda,k.a.等人,j.bacteriol.185(16):4806-15]。鉴定了mg1655基因组中的nanr序列(genbank登录号cp012868.1)。分离基因序列以及在基因上游500bp和下游500bp的侧翼序列(nanr±500)。进行blastn检索，其中将nanr±500作为查询并且将t10(标识为dh10β；genbank登录号cp000948.1)或nissle(genbank登录号cp007799.1)基因组序列作为主题。t10基因组序列产生与mg1655基因组的100％匹配。nissle基因组序列返回了相对于nanr序列和下游500bp的96％的强匹配。然而，对于nanr上游的500bp没有相似性。在基因上游200bp内发现了nanr的调控元件。这表明，尽管nissle携带nanr序列，但与k-12亲缘的大肠杆菌相比，所述nanr序列在nissle中的基因调控被破坏。[0082]假设nanr在nan操纵子表达中充当转录阻遏子，并且nissle中nanr的基因组表达破坏导致观察到pnana启动子的活性。为了测试假设，将nanr从mg1655基因组亚克隆至在pbad启动子下的psc101载体(psc101-pbad-nanr)中(图6c)。将质粒与peaat-pnana-gfp共转化至ecn中。启动子pbad受共表达的arac调控，并且可通过l-阿拉伯糖诱导。l-阿拉伯糖和唾液酸在不同组合情况下的共同诱导可以确定从pnana引起理想响应所需的nanr表达水平。通过流式细胞术针对10,000个大小门控样品的中值gfp荧光读数对诱导细胞进行定量。从结果来看，即使在不存在l-阿拉伯糖诱导的情况下，nanr的基础表达也会显著阻遏pnana基础活性(图6d)。它还使得pnana启动子能够通过唾液酸诱导表达。nanr的增强表达降低了pnana基础活性和诱导活性两者。这表明nanr是pnana表达上游的调控子，并且对于调控仅需要低水平的nanr。[0083]由于在ecn中实现pnana的唾液酸诱导型响应需要nanr表达，因此重新设计基因构建体peaat-pnana-gfp以在组成型表达下共表达nanr(图6e)。将基因nanr亚克隆在具有核糖体结合位点rbs5、rbs3或rbs2的组成型启动子j23108下。三个核糖体结合位点具有不同的翻译起始率，其中rbs5是最强的并且rbs2是最弱的。将质粒转化至ecn中以表征在唾液酸诱导下的gfp表达。与流式细胞术结果一致，发现在核糖体结合位点rbs2下nanr的弱组成型表达在具有唾液酸的情况下显示出更好的诱导性(图6f)。nanr的表达在构建体中被进一步降低，由此用j23113替代组成型启动子，并且用rbs4替代核糖体结合位点(j23113-rbs4-nanr；seqidno:6)。尽管nanr的表达较弱，但与先前的构建体相比，这些构建体中唾液酸诱导时gfp表达的表征维持相似的表达水平。[0084]通过nanr转录调控子的共表达，启动子pnana的活性从唾液酸的阻遏型启动子的活性成功逆转为唾液酸的诱导型启动子的活性。此外，pnana的基础表达降低。这些导致用于ecn的通用型双功能启动子，所述启动子可以根据工程化电路对唾液酸做出不同的响应。启动子pnana可以根据nanr的存在充当唾液酸的诱导型启动子或阻遏型启动子。此外，可以将nanr置于进一步的诱导型或阻遏型表达下，以实现额外的控制层。选择构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp用于作为基于唾液酸的菌群失调生物传感器的进一步表征。[0085]实施例3[0086]在胃肠特定条件下对工程化唾液酸生物传感器的表征[0087]ecn的亲本菌株优先定殖于下胃肠道，特别是结肠和直肠中[sonnenborn,u.和schulze,j.micob.ecol.healthdis.21:122-58(2009)；schultz,m.inflammboweldis.14(7):1012-8(2008)]。这使其作为下胃肠道的菌群失调生物传感器是理想的。将所选择的构建体在特定于下胃肠道的一系列条件下进行表征，以评估其适用性。[0088]需注意，pnana序列含有在位置4→8的分解代谢物激活蛋白(cap)结合位点。cap是当结合至循环amp(camp)时启动转录过程的转录激活蛋白。camp水平在不存在葡萄糖的情况下升高，从而有效地充当低葡萄糖响应的转录激活因子。在唾液酸和/或葡萄糖诱导下对含有诱导型(peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp)或阻遏型(peaat-pnana-gfp)构建体的ecn进行gfp表达表征。预期地，表达诱导型构建体的ecn呈现出类似于经典lac操纵子的响应。即使存在唾液酸时，在存在葡萄糖的情况下阻遏gfp表达(图7a和7b)。这表明nanr可能在功能上与laci类似。有趣的是，表达阻遏型构建体的ecn与葡萄糖类似地作出响应，由此gfp表达在存在葡萄糖的情况下沉默。这些结果表明，pnana的转录是由camp-cap驱动的。在存在葡萄糖的情况下阻遏启动子使其对于在其中预期葡萄糖水平显著较低的下胃肠道中使用是理想的。诱导型和阻遏型的构建体两者在上胃肠道中可能被沉默并且对唾液酸是无响应的，且因此它们的作用在通过上胃肠道期间将被最小化。[0089]尽管ecn中pnana活性的趋势从唾液酸阻遏型启动子逆转为诱导型启动子，但需注意，诱导型构建体的诱导信号显著低于甚至阻遏型构建体的阻遏信号。低诱导的表达水平对于足够的cbh表达以去缀合牛磺胆酸盐是个问题。为了克服这个问题，设计放大器模块并将其添加至诱导型构建体。将编码转录激活因子cadc(seqidno:12)的基因亚克隆在pnana启动子下。将受cadc调控的启动子pcadba亚克隆在gfp的上游(j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)。在这种设计下，在唾液酸诱导时，cadc在pnana下的表达又进而激活pcadba启动子以实现更强的gfp表达(图7c)。在此，cadc和pcadba充当中间转导模块，以放大来自pnana的信号并导致gfp的更强表达。此外，cadc由于其对外部ph的响应性(如从后来表征(图7f)中明显的)而被选择。对构建体进行表征，并且诱导的gfp荧光信号显示出显著改善。将cadc-pcadba(seqidno:7)添加至电路中成功地实现对来自诱导型构建体的信号的放大(图7d)。然而，观察到与非放大器构建体相比的gfp表达的时间滞后。这可能归因于中间cadc表达的需要，从而延迟响应，以及增加基础表达水平。[0090]生物传感器定殖的靶位点是在下胃肠道中，在下胃肠道中预期环境的营养物水平很差。所有先前的表征测定都是在营养物丰富的lb中进行的。构建体可能在整体营养水平不同的肠道环境中表现不同。为了确定生物传感器是否可以在胃中如预期那样起作用，将唾液酸诱导型(j23113r4-nanr-pnana-gfp)和唾液酸诱导型放大器(j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-gfp)构建体在更接近肠道环境的m9基本培养基中进行表征。m9基本培养基典型地含有呈葡萄糖形式的碳源。如先前在葡萄糖干扰pnana活性的情况下所示，将甘油用作m9基本培养基的碳源。尽管在营养物贫乏条件下，但表达唾液酸诱导型构建体的ecn能够如预期那样对唾液酸诱导做出响应(图7e)。此外，先前观察到的时间响应滞后在m9基本培养基中表征期间并不那么突出。如先前提出理论，pnana表达可由camp-cap驱动。m9基本培养基的较低营养物含量可导致高水平的camp，且因此导致对唾液酸诱导的更快响应。然而，目前的结果仍然未获得证实这一提议的结论。尽管如此，结果证明较低的营养物条件未不利地影响诱导型构建体的活性。[0091]另一种模拟的肠道环境条件是ph水平。胃肠道中的ph水平是动态的，并且基于包括健康状况在内的因素而不同。据报道，健康受试者的ph范围在胃中为1.6至4.2的范围，在小肠中为6.7至7.3的范围，在盲肠中为5.4至6.5的范围，并且在结肠中为6.0至7.2的范围[maurer等人plos.one.10(7):e0129076doi:10.1371/journal.pone.0129076(2015)]。将唾液酸诱导型放大器构建体在ph范围为从3至9的具有甘油的m9培养基中进行表征。观察到ph水平会影响构建体的活性(图7f)。在从3至5的低ph下未观察到诱导活性。出人意料的是，在存在唾液酸的情况下，gfp的表达反而被阻遏。基础表达水平在ph6下增加并且随后降低。据报道，cad操纵子是ph敏感性的，并且在ph5.8下被激活[watson,n.等人,j.bacteriol.174(2):530-40(1992)]。这可导致在ph6下的基础活性，所述活性随后在更高的ph下降低。构建体在ph6下从基础水平被轻度诱导，但在从7至9的高ph下被强诱导。根据数据，可以预期生物传感器在胃中由于低ph环境是无活性的。预期其活性在其中ph在6.0与7.3之间的小肠和结肠中更高。此外，据报道，在艰难梭菌感染期间结肠和直肠的ph向碱性偏移，其中87％的cdi患者的粪便超过ph7[gupta,p.等人,south.med.j.109(2):91-6(2016)]。与报告一致，较低的ph与针对艰难梭菌感染的保护作用相关[may,t.等人,scand.j.gastroenterol.29(10):916-22(1994)]。尚不清楚ph偏移是微生物组菌群失调的结果还是病原体扩增的结果。尽管如此，ph的变化可使得生物传感器能够引起更强的响应。[0092]观察到，ecn能够利用唾液酸作为碳源以在不具有甘油的m9基本培养基中生长(图7g)。在含有甘油的m9基本培养基中未观察到生长速率的差异。据报道，在感染期间唾液酸被艰难梭菌和致病性大肠杆菌利用以进行扩增[ng,k.m.等人.,nat.lett.502:96-99(2013)；huang,y.l.等人,nat.commun.6:8141.doi:10.1038/ncomms9141(2015)]。这可以使得ecn除了作为生物传感器或递送底架之外，还兼做病原体的唾液酸营养物竞争者。此外，对ecn生长的补充可以放大cbh(seqidno:13)的表达。[0093]实施例4[0094]纯化的胆盐水解酶cbh将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐并抑制艰难梭菌内生孢子萌发[0095]将cbh的天然基因序列(seqidno:8)经密码子优化以在大肠杆菌中表达以及与bglbrick标准相容。密码子优化的序列在seqidno:9中列出。添加c末端his6标签序列，并且将最终基因序列亚克隆在peaat-arac载体中的pbad启动子下。然后将质粒转化至大肠杆菌菌株bl21中进行蛋白质表达。将cbh-his6通过l-阿拉伯糖来诱导表达，且然后首先通过imac纯化，之后进行尺寸排阻色谱。然后将含有cbh-his6的级分浓缩至2ml，并且产生30.66μm的最终浓度。在纯化蛋白质的sds-page测定上可以观察到大小与cbh-his6相对应的蛋白质(图8a)。[0096]通过牛磺胆酸盐到胆酸盐的转化来确定cbh的活性。利用hplc来确定酶处理后胆盐的浓度。首先对已知浓度的牛磺胆酸盐和胆酸盐进行hplc分析，以确定保留时间并获得标准曲线。胆盐的检测在205nm下进行。牛磺胆酸盐在大约12.2分钟的运行时间处洗脱，而胆酸盐在大约19.6分钟的运行时间处洗脱。构建了牛磺胆酸盐和胆酸盐的标准曲线(图8b和图8c)。[0097]通过将10μm纯化的cbh-his6与10mm牛磺胆酸盐一起孵育来测试cbh对牛磺胆酸盐的活性。提取胆盐并用hplc分析。对于实验和没有cbh-his6的阴性对照确定牛磺胆酸盐和胆酸盐两者的浓度(图8d-8f)。在阴性对照中未检测到胆酸盐。另一方面，与蛋白质一起孵育导致牛磺胆酸盐浓度降低100倍。相反，检测到高浓度的胆酸盐。在hplc操作条件限制的范围内未检测到对应于牛磺酸的峰。可以推断，异源表达的cbh-his6保留了其将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐的天然活性。此外，结果显示大约99％的牛磺胆酸盐在与纯化的cbh-his6一起孵育的3小时内发生去缀合。[0098]用适当的对照建立cbh-his6与牛磺胆酸盐的进一步反应，并收集等分试样。然后将等分试样与纯化的艰难梭菌内生孢子一起孵育。通过cfu计数来计数内生孢子的萌发。由于当与cbh-his6一起孵育时牛磺胆酸盐成分由于去缀合为胆酸盐而减少，因此预期来自等分试样的萌发效率会降低。预期地，与阳性对照相比，与cbh-his6一起孵育的牛磺胆酸盐显示出内生孢子萌发的12倍减少(图8g)。该结果与对牛磺胆酸盐和胆酸盐萌发效率进行的原理证明一致(图4b)。这些结果支持提出的通过胆盐成分调节进行cdi预防的策略。[0099]实施例5[0100]益生菌中的胆盐水解酶cbh表达抑制艰难梭菌内生孢子的萌发[0101]将基因cbh-his6亚克隆在唾液酸诱导型构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana中的pnana启动子下。表达gfp而非cbh的构建体充当表达对照。将所得的质粒peaat-j23113r4-nanr-pnana-cbh-his6和peaat-j23113r4-nanr-pnana-gfp转化至ecn底架中。将菌株与牛磺胆酸盐和唾液酸一起孵育。还建立了无细胞阳性对照、非诱导cbh-his6表达菌株对照和无牛磺胆酸盐cbh-his6表达菌株阴性对照。然后收集来自每个实验的过滤培养基并测试其艰难梭菌内生孢子萌发效率。与gfp表达阴性对照相比，表达cbh-his6的ecn菌株在唾液酸诱导后将艰难梭菌内生孢子萌发减少大约1倍(图9a；空白柱)。尽管这是一个有希望的结果，但相对于从纯化的cbh-his6获得的那些，倍数变化显著更低。差异是由于唾液酸诱导型构建体的低表达水平。使用抗his抗体进行免疫印迹，并且发现peaat-j23113r4-nanr-pnana构建体下的cbh-his6表达水平显著低于peaat-arac-pbad构建体下的表达水平(图9b；泳道2-5)。这与我们的菌群失调传感器表征数据一致。为了解决这个问题，将cadc放大器模块设计到基因电路中，以放大如先前概述的诱导型表达。[0102]将基因cbh-his6亚克隆在放大器构建体peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba下。通过免疫印迹证实cbh-his6在ecn菌株中的表达(图9b；泳道6-9)。表达水平被放大，然而，它也导致高基础表达水平。然后我们用在新的放大器电路下表达cbh-his6或gfp的ecn重复艰难梭菌内生孢子萌发测定。观察到艰难梭菌内生孢子萌发减少的明显改善(图9a；填充柱)。与表达对照相比，表达cbh-his6的ecn菌株能够在唾液酸诱导后将艰难梭菌内生孢子萌发减少大约40倍。在不存在唾液酸诱导的情况下，实现了内生孢子萌发的大约10倍减少。这可能归因于cbh-his6的强基础表达。[0103]还收集来自实验和对照的过滤培养基用于hplc分析(图9c)。基于先前鉴定的保留时间检测牛磺胆酸盐和胆酸盐浓度。在无细胞阳性对照和gfp表达对照中没有检测到胆酸盐，而在诱导的cbh-his6表达菌株中未检测到牛磺胆酸盐。未诱导的cbh-his6表达菌株仅显示出牛磺胆酸盐的大约45％去缀合，而内生孢子萌发有10倍减少。这表明牛磺胆酸盐的高积累是实现有效的艰难梭菌内生孢子萌发所必需的。相反，对牛磺胆酸盐的积聚的略微破坏可以强烈降低内生孢子的萌发。这些结果与所进行的原理证明萌发效率测定一致(图4b)。放大器构建体展现出cbh-his6的强基础表达水平。即使在不存在唾液酸诱导的情况下，cbh-his6的这种基础表达也提供针对牛磺胆酸盐的任何积累的即时响应。[0104]实施例6[0105]胆盐水解酶cbh处理的艰难梭菌内生孢子展现出减少的外毒素分泌并改善caco-2细胞的感染预后[0106]cbh在ecn细胞中的表达显示出通过调节胆盐缀合状态来抑制艰难梭菌内生孢子萌发。抑制内生孢子萌发进而将延迟营养性艰难梭菌的扩增。为了确定延迟的扩增是否代表cdi的病理学差异，对从结直肠腺癌中分离的人结肠上皮细胞系caco-2细胞测试萌发的艰难梭菌。[0107]由于艰难梭菌和caco-2不能在同一实验室条件下生长，因此进行交错的共培养。由于cdi的病因是分泌的外毒素[carter,g.p.等人,mbio.6(3):e00551.doi:10.1128/mbio.00551-15(2015)]，此举变成可能。首先使萌发的艰难梭菌在允许条件下生长，其中以定期间隔收集培养基。然后浓缩过滤的培养基并进行缓冲液更换，然后与caco-2细胞一起孵育。尽管此方法没有考虑到艰难梭菌与caco-2细胞之间的直接相互作用，但它允许将从艰难梭菌中分泌的毒素针对caco-2细胞进行测试。[0108]建立类似于先前体外测定的实验和对照。在采用以下的情况下使艰难梭菌内生孢子萌发：通过cbh表达型ecn处理的牛磺胆酸盐(图10a，泳道8-10；图10d；图10f左下方小图)，以及无细胞牛磺胆酸盐阳性对照(图10a，泳道2-4；图10b；图10f顶部中间小图)、gfp表达型ecn表达对照(图10a，泳道5-7；图10c；图10f右上方小图)或无牛磺胆酸盐阴性对照(图10a，泳道11-13；图10e；图10f右下方小图)。对以定期间隔从实验收集的10倍浓缩过滤上清液进行免疫印迹，并且探测毒素tcda。结果表明，当用cbh表达型ecn处理时，分泌到上清液中的tcda的量减少(图10a)。还可以一致地观察到毒素的时间依赖性积累。可以表明，对艰难梭菌内生孢子萌发的抑制延迟了营养细胞的生长并减少了分泌到培养基中的毒素负荷。[0109]在艰难梭菌诱导萌发后以定期间隔收集上清液。将上清液浓缩且然后在与caco-2细胞一起孵育时连续稀释至1至0.01倍。在孵育48小时后用mtt测定caco-2的细胞活力。如预期，与表达对照相比，与从cbh表达型ecn处理的艰难梭菌收集的上清液一起孵育的caco-2显示出更高的最终细胞活力(图10b-图10e)。这与上清液中tcda的量一致。此外，观察到caco-2的细胞形态在用来自cbh表达型ecn和表达对照的上清液处理之间是不同的(图10f)。用来自cbh表达型ecn的上清液处理的caco-2显示出接近于未处理caco-2的形态。另一方面，用来自表达对照的上清液处理导致与用来自阳性对照的上清液处理相似的形态。caco-2细胞显示出与培养板的脱离和与细胞死亡相关的皱缩细胞形状。[0110]总体上，测定显示cbh表达型ecn可以改善离体caco-2细胞培养物的预后。从ecn表达的cbh可以将牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐，从而导致艰难梭菌内生孢子的萌发减少。萌发的延迟影响外毒素向培养基中的分泌，且这进而又导致caco-2感染预后的改善。需注意，tcda继续分泌到来自cbh处理的上清液中，而不是完全被抑制。这与体外测定一致，即使在用工程化ecn处理后也有少的艰难梭菌萌发(图9a)。这些营养细胞在培养基中增殖，导致tcda的分泌。即使用工程化ecn处理后，外毒素也可能积累。然而，体内营养物贫乏的环境可限制艰难梭菌的增殖，并且细胞的初始萌发与随后的增殖相比对总体毒力负荷的影响更大。这些动态特性的程度需要在体内进一步阐明，以确定治疗的有效性。尽管如此，得出结论是用工程化ecn处理艰难梭菌内生孢子导致分泌的外毒素的量减少。与表达对照相比，这进而改善caco-2细胞活力。[0111]实施例7[0112]在鼠模型中用表达由菌群失调传感器控制的胆盐水解酶cbh的工程化益生菌进行预治疗提供了针对艰难梭菌感染的保护[0113]先前已经证明了cdi的鼠模型[chen,x.等人,gastroenterology.135:1984-1992(2008)].在本研究中对此模型进行了调整和修改，以测试工程化ecn的功效(图11a)。简而言之，在感染前3天(第-3天)，向小鼠给予一定剂量的工程化益生菌(治疗组或对照组)或空白(感染对照组)。在第0天进行艰难梭菌的感染(107cfu)。然后在9天的历程内记录小鼠的死亡率、体重和临床症状。然后根据先前建立的标准对临床症状进行评分和制表[shelby,r.d.等人,int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129(2019)]。[0114]向治疗组(‘ecn-cbh’)给予含有cbh表达构建体(peaat-j23113r4-nanr-pnana-cadc-pcadba-cbh)的益生菌。此构建体由多个基因模块，即传感器、放大器和执行器组成。为了充分证明完全工程化的益生菌的功效，产生了各种对照益生菌以包含缺少各基因模块之一的构建体。针对这些对照组产生的益生菌汇总在图11b中。向无传感器对照组(‘ecn-pcon-cbh’)给予在没有菌群失调传感器的情况下组成性表达cbh的工程化益生菌。向无放大器对照组(‘ecn-pnana-cbh’)给予缺乏放大器模块的工程化益生菌。向无执行器对照组(‘ecn-gfp)给予表达gfp而非cbh的工程化益生菌。将所有益生菌在第-3天以109cfu的单一剂量施用，并且向感染对照给予蔗糖而非工程化益生菌。[0115]在测定的第0天，用107cfu的艰难梭菌感染小鼠(图11a)。治疗组的存活率的表现显著优于所有对照组。相比于感染对照(70.0％；p＝0.0461)、无传感器对照(14.3％；p《0.0001)、无放大器对照(50.0％；p＝0.0063)和无执行器对照(25.0％；p＝0.0005)，100％小鼠从感染中存活下来(图11c)。感染小鼠在第2天至第4天之间显示出严重的症状。在此时间段期间，治疗组的相对体重相对于所有对照组是相当更稳定的，所有对照组显示出超过10％的相对体重减轻(图11d)。从第0天至第6天，每只小鼠每天还被分配了临床疾病得分(css)，其范围为从0至12。css根据三个标准即粪便、行为和体重减轻分配[shelby,r.d.等人,int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129(2019)]。基于css，感染的严重程度可以描述为正常(0至2)、轻度(3至5)、中度(6至8)和重度(9至12)。然后使用按每只小鼠评分的css来对组的平均得分制表(图11d)。与所有组相比，治疗组的css得分最低，平均值为3.3。与感染对照组(7.0；p＝0.0075)、无传感器对照组(8.7；p＝0.0005)、无放大器对照组(7.5；p＝0.0026)和无执行器对照组(8.5；p＝0.0011)相比，该得分显著更低。总之，这些结果证明，在艰难梭菌感染前施用工程化益生菌能够赋予预防性保护，从而通过降低死亡率和减轻症状的严重程度来改善感染预后。[0116]此外，结果显示，与无执行器对照相比，无传感器组中cbh的组成型表达并未改善小鼠的存活率(p＝0.247)。相反，与无传感器组相比，无放大器组中来自菌群失调传感器的cbh表达显示出存活率的改善(p＝0.0305)。尽管在体外来自组成型启动子的cbh表达水平高于来自pnana启动子的表达水平。各种对照组的结局表明，按需驱动体内cbh表达的菌群失调感测模块在实现调节艰难梭菌感染的预期功能方面是必要的。预期下胃肠道中的营养物水平较差，并且针对酶的连续表达而营养物分配效率低下可能对无传感器益生菌不利。结果突出了菌群失调传感器在控制cbh从工程化益生菌的表达以在体内实现针对cdi的高活性方面的重要性。[0117]总之，这些结果证明，表达由菌群失调传感器控制的胆盐水解酶cbh的工程化益生菌能够提供针对艰难梭菌感染的预防性抗性。胆盐代谢的恢复和菌群失调感测模块两者均被证明在提供针对感染的保护方面至关重要。总之，益生菌作为针对艰难梭菌感染的预防手段展示出高功效。[0118]实施例8[0119]在其他益生菌菌株中表达基因电路以实现类似的治疗性功能[0120]可以容易地将本发明的基因电路在革兰氏阴性和革兰氏阳性的其他益生菌物种中表达。许多天然益生菌物种可以被工程化为活生物治疗剂[o’toole,p.w.,marchesi,j.r.和hill,c.nat.microbiol.2:17057.doi:10.1038/nmicrobiol.2017.57(2017)]。此类物种的例子包括但不限于拟杆菌属物种、梭菌属物种、栖粪杆菌属物种、乳酸乳球菌和乳杆菌属物种。本发明解决了酶表达和对菌群失调的响应的技术难题。可以将表达移植到其他益生菌物种上以实现类似的治疗性功能。这可以使得工程化益生菌能够定殖于并靶向胃肠道的其他位置，如十二指肠、空肠或回肠。[0121]实施例9[0122]可以应用无抗生素选择的益生菌底架以原位递送其他基因电路[0123]通过在大肠杆菌nissle菌株中产生营养缺陷型表型来工程化无抗生素选择的益生菌底架。此底架伴有由作为选择标记的丙氨酸消旋酶基因组成的质粒。此底架实现原位递送工程化基因电路，并且可用于其他目的，如但不限于病原体靶向、癌症靶向和代谢物/生物合成和递送。[0124]实施例10[0125]基于唾液酸的传感器充当对菌群失调的代理并且可以应用于其他菌群失调相关疾病和感染[0126]本发明基于唾液酸响应型启动子对菌群失调事件作出响应。唾液酸响应型启动子可以被工程化为对唾液酸的上调或下调作出响应。微生物组的菌群失调还与许多其他疾病相关，所述其他疾病如但不限于炎性肠病、病原体感染、2型糖尿病、哮喘、肥胖症、自闭症和类风湿性关节炎[packey,c.,d.和sartor,r.b.curr.opin.infect.dis.22(3):292-301(2009)]。基于唾液酸的传感器可以应用于靶向此类疾病的工程化生物治疗剂。[0127]实施例11[0128]可以优化基因电路并将其整合至ecn基因组中以赋予进一步的稳定性[0129]在本发明中，基因电路在质粒上表达。替代性地，可以将基因电路整合至基因组中以实现进一步的稳定性。这将避免不必要但潜在的向微生物组的水平基因转移。已经在ecn基因组中鉴定出多个整合位点[isabella,v.m.等人,nat.biotech.36:857-864(2018)]。这种基因电路的整合可以在这些位点进行，而不会破坏益生菌菌株的基因组稳定性，同时抵抗整合基因电路的自发丧失或失活。[0130]总结[0131]工程化益生菌底架ecn[0132]本发明的一个实施方案提供了从基因组中缺失两个丙氨酸消旋酶基因的大肠杆菌nissle，所述大肠杆菌能够在延长的时间段内维持含有作为选择标记的丙氨酸消旋酶基因的质粒而无需额外选择。这避免了抗生素抗性基因不必要地暴露于微生物组。然后可以将ecn与靶向艰难梭菌的抗生素方案共同施用，以定殖于胃肠道并发挥针对艰难梭菌的抗微生物活性。工程化益生菌可以在延长的时间段内保留在胃肠道中，从而实现预防性应用。[0133]唾液酸诱导型系统[0134]在本发明的一个实施方案中，提供了一种唾液酸诱导型系统，所述唾液酸诱导型系统由包括pnana启动子和任选的nanr转录因子、cadc转录因子及其启动子pcadba的基因电路组成。nanr逆转pnana的诱导性，并且cadc-pcadba放大总体表达水平。此系统根据系统中使用的部件对唾液酸的变化作出响应。升高的唾液酸水平与胃肠道微生物组的菌群失调相关，因此所述系统通过受菌群失调事件发生限制的治疗性蛋白质表达提供对菌群失调事件的及时响应。[0135]cadc放大系统[0136]在本发明的一个实施方案中，提供了元件cadc蛋白和pcadba启动子以通过中间转录激活因子表达来放大来自唾液酸响应型启动子的表达。主要功能是将胆盐水解酶的表达放大至具有治疗意义的水平。次要功能是使得基因电路能够对ph敏感；这为胆盐水解酶表达提供了另外的控制层。[0137]胆盐水解酶表达[0138]表达胆盐水解酶以催化牛磺胆酸盐去缀合为胆酸盐，以便降低在菌群失调(在cdi之前的事件)期间由升高的胆盐引起的艰难梭菌内生孢子萌发效率。所述酶抑制内生孢子的萌发并且导致艰难梭菌分泌的毒素的总体减少。[0139]通过先行地响应于菌群失调而表达胆盐水解酶，益生菌能够充当针对cdi的自主预防手段。这种策略也将有效地预防rcdi。因此，此益生菌解决了cdi管理的缺口，并且可以靶向于有cdi和rcdi风险的患者。[0140]本发明的优点在于它提供了控制cdi和rcdi的非杀菌方法；从而避免了对此方法的抗性。[0141]参考文献[0142]在本说明书中对明显先前已公开的文件的任何列示或讨论都不应一定被视为承认这个文件是现有技术的一部分或者是公知常识。[0143]begley,m.,gahan,c.g.m,,&hill,c.(2005)theinteractionbetweenbacteriaandbile.fems.microbiol.rev.25:625-51.[0144]buffie,c.g.,bucci,v.,stein,r.r.,mckenny,p.t.,ling,l.,gobourne,a.,etal.(2015)precisionmicrobiomereconstitutionrestoresbileacidmediatedresistancetoclostridiumdifficile.nat.lett.517:205-8.[0145]carter,g.p.,chakravorty,a.,phamnguyen,t.a.,mileto,s.,schreiber,f.,li,l.,etal.(2015)definingtherolesoftcdaandtcdbinlocalisedgastrointestinaldisease,systemicorgandamage,andthehostresponseduringclostridiumdifficileinfections.mbio.6(3):e00551.doi:10.1128/mbio.00551-15.[0146]chen,x.,katchar,k.,goldsmith,j.d.,nanthakumar,n.,chekins,a.,gerding,d.n.,etal.(2008)amousemodelofclostridiumdifficile-associateddisease.gastroenterology.135:1984-1992.[0147]chilton,c.h.,pickering,d.s.,&freeman,j.(2018)microbiologicalfactorsaffectingclostridiumdifficilerecurrence.clin.microbiol.infect.publishedaheadofprint.doi:10.1016/j.cmi.2017.11.017.[0148]coleman,j.p.,&hudson,l.l.(1995)cloningandcharacterizationofaconjugatedbileacidhydrolasegenefromclostridiumperfringens.appl.environ.microbiol.61(7):2514-20.[0149]gebhart,d.,lok,s.,clare,s.,tomas,m.,stares,m.,scholl,d.,etal.(2015)amodifiedr-typebacteriocinspecificallytargetingclostridiumdifficilepreventscolonizationofmicewithoutaffectinggutmicrobiotadiversity.mbio.6(2):doi:10.1128/mbio.02368-14[0150]gupta,p.,yakubov,s.,tin,k.,zea,d.,garankina,o.,ghitan,m.,etal(2016)doesalkalinecolonicphpredisposetoclostridiumdifficileinfection？south.med.j.109(2):91-6.[0151]huang,y.l.,chassard,c.,hausmann,m.,vonitzstein,m.,&hennet,t.(2015)sialicacidcatabolismdrivesintestinalinflammationandmicrobialdysbiosisinmice.nat.commun.6:8141.doi:10.1038/ncomms9141.[0152]hwang,i,y.,koh,e.,wong,a.,march,j.c.,bentley,w.e.,lee,y.s.,&chang,m.w.(2017)engineeredprobioticescherichiacolicaneliminateandpreventpseudomonasaeruginosagutinfectioninanimalmodels.nat.commun.8:15028.doi:10.1038/ncomms15028.[0153]isabella,v.m.,ha,b.h.,castillo,m.j.,lubkowicz,d.j.,rowe,s.e.,anderson,c.l.,etal.(2018)developmentofasyntheticlivebacterialtherapeuticforthehumanmetabolicdiseasephenylketonuria.nat.biotech.36:857-864.[0154]kalivoda,k.a.,steenbergen,s.m.,vimr,e.r.,&plumbridge,j.(2003)regulationofsialicacidcatabolismbythednabindingproteinnanrinescherichiacoli.j.bacteriol.185(16):4806-15.[0155]keseler,i.m.mackie,a.,peralta-gil,m.,santos-zavaleta,a.,gama-castro,s.,bonavides-martinez,c.,etal.(2013)ecocyc:fusingmodelorganismdatabaseswithsyntheticbiology.nuc.acids.res.41:605-12.[0156]maurer,j.m.,schellekens,r.c.a.,vanrieke,h.m.,wanke,c.,iordanov,v.,stellaard,f.,etal.(2015)gastrointestinalphandtransittimeprofilinginhealthyvolunteersusingtheintellicapsystemconfirmsileo-colonicreleaseofcolopulsetablets.plos.one.10(7):e0129076doi:10.1371/journal.pone.0129076[0157]may,t.,mackie.r.i.,faheyjr,g.c.,cermin,j.c.,&garleb,k.a.(1994)effectoffibersourceonshort-chainfattyacidproductionandonthegrowthandtoxinproductionbyclostridiumdifficile.scand.j.gastroenterol.29(10):916-22.[0158]nelson,r.(2007)antibiotictreatmentforclostridiumdifficile-associateddiarrheainadults.cochrane.database.syst.rev.18(3):cd004610.[0159]ng,k.m.,ferreyra,j.a.,higginbottom,s.k.,lynch,j.,kashyap,p.c.,gopinath,s.,etal.(2013)microbiota-liberatedhostsugarsfacilitatepostantibioticexpansionofentericpathogens.nat.lett.502:96-99.[0160]o’toole,p.w.,marchesi,j.r.,&hill,c.(2017)next-generationprobiotic:thespectrumfromprobioticstolivebiotherapeutics.nat.microbiol.2:17057.doi:10.1038/nmicrobiol.2017.57.[0161]packey,c.,d.,&sartor,r.b.(2009)commensalbacteria,traditionalandopportunisticpathogens,dysbiosisandbacterialkillingininflammatoryboweldiseases.curr.opin.infect.dis.22(3):292-301.[0162]petrosillo,n.(2018)tacklingtherecurrenceofclostridiumdifficileinfections.med.mal.infect.48(1):18-22.[0163]ridlon,j.m.,kang,d.,&hylemon,p.b.(2006)bilesaltbiotransformationbyhumanintestinalbacteria.j.lipid.res.47:241-59[0164]ridlon,j.m.,&hylemon,p.b.(2012)identificationandcharacterizationoftwobileacidcoenzymeatransferasesfromclostridiumscindens,abileacid7α-dehydroxylatingintestinalbacterium.j.lipid.res.53:66-76.[0165]roberts,a.p.,&mullany,p.(2010)clostridiumdifficile:nolongeranenigmaticpathogen？clostridiumdifficile:methodsandprotocols.ed:p.mullany,a.roberts.springerus,newyork.3-8[0166]schultz,m.(2008)clinicaluseofe.colinissle1917ininflammatoryboweldisease.inflammboweldis.14(7):1012-8.[0167]shelby,r.d.,tengberg,n.,conces,m.,olson,j.k.,navarro,j.b.,bailey,m.t.,etal.(2019)developmentofastandardizedscoringsystemtoassessamurinemodelofclostridiumdifficilecolitis.int.j.surg.doi:10.1080/08941939.2019.1571129.[0168]sonnenborn,u.,&schulze,j.(2009)thenon-pathogenicescherichiacolistrainnissle1917–featuresofaversatileprobiotic.micob.ecol.healthdis.21:122-58.[0169]sorg,j.a.,&soenenshein,a.l.(2008)bilesaltsandglycineascogerminantsforclostridiumdifficilespores.j.bacteriol.190(7):2505-12.[0170]watson,n.,dunyak,d.s.,rosey,e.l.,slonczewski,j.l.,&olson,e.r.(1992)identificationofelementsinvolvedintranscriptionalregulationoftheescherichiacolicadoperonbyexternalph.j.bacteriol.174(2):530-40.当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
