FoCupin1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用的制作方法

focupin1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种focupin1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。


背景技术：

2.香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(fusarium oxysporum f.sp.cubense，foc)侵染而导致的一种香蕉土传病害，严重威胁香蕉的生产。根据foc对香蕉品种(系)致病性的差异，可将其分为3个小种：1号、2号和4号小种，其中以4号小种(foc4)危害最严重，几乎能侵染所有香蕉种类。开展foc4致病相关基因的功能研究，有助于全面了解foc4的致病分子机理，并为香蕉枯萎病的综合防控提供理论依据。
3.在前期开展的foc4分泌蛋白质组学研究中，我们鉴定到一个预测的含有cupin结构域的蛋白(cupin type-1 domain-containing protein，predicted，命名为focupin1)。生物信息学分析发现focupin1含有信号肽、定位在胞外，无跨膜结构域、无gpi锚定位点，属于经典分泌蛋白。含有cupin结构域的蛋白家族是一个具有多种功能的蛋白家族，其功能包括酶促活性(如双加氧酶、脱羧酶、水解酶、异构酶和差向异构酶)到非酶促功能(例如与生长素结合、核转录因子和种子存储)等。目前，关于含有cupin结构域的蛋白在真菌中的生物学功能并不明确，尤其在香蕉枯萎病菌中的生物学功能尚不清楚。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种focupin1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
5.本发明公开一种香蕉枯萎病菌基因focupin1及其编码蛋白focupin1的新功能。基因focupin1为seq id no：1中的核苷酸序列，其所编码的蛋白focupin1为seq id no：2所示的蛋白质。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体
△
focupin1；通过构建基因回补载体，将其导入
△
focupin1原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体
△
focupin1-com。
△
focupin1的菌落生长速率、产孢量、细胞壁完整性、抗高渗透胁迫、抗氧化胁迫、玻璃纸穿透等方面没有显著差异。致病性测定表明，敲除突变体
△
focupin1致病性显著降低；回补突变体
△
focupin1-com的致病性则恢复到野生型水平。qrt-pcr分析表明，敲除突变体
△
focupin1中镰刀菌酸5个关键合成基因中有4个基因表达量与foc4野生型相比显著降低。上述试验证明，香蕉枯萎病菌focupin1基因可能参与了香蕉枯萎病菌的致病过程。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.本发明提供一种focupin1基因在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
8.进一步，focupin1基因具有调控镰刀菌酸合成相关基因表达水平的作用。
9.所述的镰刀菌酸合成相关基因包括foig_16451、foig_16452、foig_16453、foig_
2000；泳道1：foc4；泳道2：清水对照；泳道3-5：转化子9、15、20。
27.图5是以focupin1基因部分片段为探针的foc4敲除突变体转化子的southern blot分析；
28.图6是以hph基因部分片段为探针的foc4敲除突变体转化子的southern blot分析；
29.图7是部分博来霉素抗性回补转化子的focupin1基因的pcr分析；其中，m：marker2000，
△
focupin1-com-1指
△
focupin1-15-com-1；
△
focupin1-com-2指
△
focupin1-15-com-2。
30.图8是敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com对不同胁迫条件的敏感性测定，其中，
△
focupin1-com指
△
focupin1-15-com-1。
31.图9是敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com玻璃纸穿透能力分析；其中，
△
focupin1-com指
△
focupin1-15-com-1。
32.图10是敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com的致病性分析；其中，
△
focupin1-com指
△
focupin1-15-com-1。
33.图11是敲除突变体
△
focupin1中镰刀菌酸合成相关基因的qrt-pcr分析；注：*表示差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
34.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
35.下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
36.实施例1
37.1、实验材料
38.1.1供试菌株及植物
39.供试菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种(foc4)，供试植物为具有4叶期的巴西蕉(cavendish，aaa)。
40.1.2宿主菌及质粒载体
41.宿主菌为大肠杆菌(escherichia coli)dh5α，克隆载体为pmd18-t vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pct74，基因回补载体为pctzn(由本实验室在pct74质粒基础上改造得来，即将pct74上的sgfp和hph基因替换成博来霉素基因)。
42.2、实验方法
43.2.1香蕉枯萎病菌focupin1上下游同源片段的扩增
44.香蕉枯萎病菌focupin1基因敲除载体的构建如图1所示。在focupin1基因的上游和下游各选取长度大小约为1000bp左右的序列(分别命名为同源臂a片段和同源臂b片段)，并设计引物(表1)。
45.表1 focupin1基因同源臂a片段和b片段的扩增引物
46.引物名称引物序列5
’‑3’
酶切位点
focupin1a-fggactagtgctgctcaacaacttcaaatcgspeifocupin1a-rcggaattcacatacatcgtgatacaaagcttccecorifocupin1b-fccgctcgagagcacagccgatctgaagatgtttxhoifocupin1b-rggggtacccgcgtttcgaatatcggtgtgkpni
47.用真菌dna提取试剂盒(omega fungal dna kit)，提取foc4基因组dna；以该基因组dna为模板，用引物focupin1a-f和focupin1a-r进行pcr扩增，获得focupin1基因的同源臂a片段(focupin1-a)；用引物focupin1b-f和focupin1b-r进行pcr扩增，获得focupin1基因的同源臂b片段(focupin1-b)。
48.具体的pcr反应体系为：
49.模板dna1μlfocupin1a-f/focupin1b-f1μlfocupin1a-r/focupin1b-r1μl10
×
ex taq buffer(mg
2
plus)(20mm)5μldntp mixture(2.5mm each)4μlex taq0.25μl加ddh2o至50μl
50.pcr反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，57℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min。用omega cycle pure kit试剂盒，对pcr扩增产物进行清洁回收。
51.2.2 focupin1基因敲除载体的构建
52.参考pmd18-t vector cloning kit(takara公司)试剂盒说明书，将focupin1-a和focupin1-b分别与t载体连接，获得重组质粒pmd18t-focupin1-a和pmd18t-focupin1-b。具体为：取1μl pmd18-t载体，分别加入4μl上述pcr回收产物(同源臂a片段或同源臂b片段)和5μl solution i，于16℃连接4～5h。取10μl连接产物快速加入解冻的100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻弹匀，冰浴30min。42℃水浴热激90s，迅速冰浴1～2min。加入800μl lb液体培养基，37℃、150rpm培养1h。再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μl菌液与沉淀混匀，涂布于lb固体培养基(含50μg/ml amp)；于37℃下培养8～12h。
53.挑取具有amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒dna，并进行测序鉴定。用kpni、xhoi分别对pmd18t-focupin1-b和pct74载体进行双酶切，回收b片段和pct74载体。用t4 dna连接酶将b片段与pct74连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；获得重组质粒pct74-focupin1-b。按同样程序，用ecori和spei分别双酶切pmd18t-focupin1-a和重组质粒pct74-focupin1-b，回收a片段和重组质粒。用t4 dna连接酶将a片段与pct74-focupin1-b连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pct74-focupin1-ko。
54.2.3 focupin1回补片段的扩增
55.香蕉枯萎病菌focupin1基因回补载体的构建如图2所示。在focupin1基因的上游选取长度约为1500bp的启动子序列，下游选取长度约为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。
56.表2 focupin1基因回补片段的扩增引物
[0057][0058]
用真菌dna提取试剂盒(omega fungal dna kit)，提取香蕉枯萎病菌foc4基因组dna；以该基因组dna为模板，用引物focupin1-com-f和focupin1-com-r进行pcr扩增，获得focupin1基因的回补片段(focupin1-com)。
[0059]
具体的pcr反应体系为：
[0060]
模板dna1μlfocupin1-com-f1μlfocupin1-com-r1μl10
×
ex taq buffer(mg
2
plus)(20mm)5μldntp mixture(2.5mm each)4μlex taq0.25μl加ddh2o至50μl
[0061]
pcr反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，58℃反应30s，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。用omega cycle pure kit试剂盒，对pcr扩增产物进行清洁回收。
[0062]
2.4focupin1基因回补载体的构建
[0063]
用spei和noti分别对focupin1-com和pctzn载体进行双酶切，回收focupin1-com片段和pctzn载体。用t4 dna连接酶将focupin1-com片段与pctzn连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；获得重组质粒pctzn-focupin1-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pctzn-focupin1-com。
[0064]
2.5foc4原生质体的制备
[0065]
将foc4接种到查氏培养基(硝酸钠3g，三水合磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.018g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1l，ph为6.0)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000
×
g离心10min，弃上清。用ncm培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20
×
硝酸盐50ml，1000
×
维生素1ml，1000
×
微量元素1ml，200
×
铁盐5ml，定容至1l，ph 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于ncm培养基中，使分生孢子终浓度为1
×
106个/ml；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/l nacl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量15g/l崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400
×
g离心10min，弃上清。加入1ml预冷的stc溶液(含10mmol/l tris-hcl(ph 7.5)，1.2mol/l山梨醇，50mmol/l cacl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20ml预冷的stc将沉淀重悬，得到foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1
×
107个/ml。
[0066]
香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体的制备，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤制备得到。
[0067]
2.6 foc4原生质体的转化
[0068]
用kpni对敲除载体pct74-focupin1-ko进行单酶切，获得敲除载体pct74-focupin1-ko线性化片段。将5μg的敲除载体线性化片段与200μl foc4原生质体混匀；或者，将pctzn-focupin1-com质粒与200μl香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min；逐滴加入1ml pstc转化缓冲液(40％peg4000，1.2mol/l山梨醇，50mmol/l cacl2，10mmol/l tris-hcl，ph7.5)，混匀后冰上放置15min；加入10ml预冷的stc，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6ml上清，用3ml psb再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1l)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5ml上清，加入12ml psa再生培养基(psb再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/ml潮霉素或200μg/ml博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/ml潮霉素(或200μg/ml博来霉素)的pda培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1l)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。
[0069]
2.7foc4敲除突变体的pcr验证分析
[0070]
按照真菌dna提取试剂盒(omega fungal dna kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组dna，进行pcr验证分析。分别用引物a-hph-f/a-hph-r进行a-hph基因片段的pcr扩增；用引物focupin1-f/focupin1-r进行focupin1基因片段的pcr扩增分析。
[0071]
a-hph-f：5
′‑
gcctgaagaagttctgctaccgccg-3
′
，
[0072]
a-hph-r：5
′‑
tggcaaactgtgatggacgacaccg-3
′
；
[0073]
focupin1-f：5
′‑
acagattgccggatcctatca-3
′
，
[0074]
focupin1-r：5
′‑
tggcccataatagaggcgga-3
′
，
[0075]
pcr反应体系如下：
[0076]
体系25μl reaction2
×
tsingke master mix12.5μl10μm primer f0.5μl10μm primer r0.5μltemplate dna0.5μl加ddh2o至25μl
[0077]
pcr反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，57℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
[0078]
2.8focupin1回补突变体的pcr验证分析
[0079]
按照真菌dna提取试剂盒法(omega fungal dna kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组dna，进行pcr验证分析。用引物focupin1-f/focupin1-r进行基因片段focupin1的pcr扩增。
[0080]
pcr反应体系如下：
[0081]
体系25μl reaction2
×
tsingke master mix12.5μl10μm focupin1-f0.5μl10μm focupin1-r0.5μltemplate dna0.5μl加ddh2o至25μl
[0082]
pcr反应条件为：94℃反应5min；94℃反应30s，57℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
[0083]
2.9foc4敲除突变体的southern blot分析
[0084]
按照dig high prime dna labeling and detection starter kit(roche公司)说明书，进行southern blot杂交。用focupin1 probe-f/focupin1 probe-r扩增目的基因探针，用hph-f/hph-r扩增hph基因探针。
[0085]
focupin1 probe-f：5
′‑
gctcagtgcggataacacga-3
′
，
[0086]
focupin1 probe-r：5
′‑
agttcaccactgctctcgtc-3
′
，
[0087]
hph-f：5
′‑
tgctgctccatacaagccaa-3
′
，
[0088]
hph-r：5
′‑
gacattggggagttcagcga-3
′
；
[0089]
dna探针的pcr扩增体系如下：
[0090]
模板dna1μlfocupin1 probe-f/hph-f1μlfocupin1 probe-r/hph-r1μl10
×
ex taq buffer(mg
2
plus)(20mm)5μldntp mixture(2.5mm each)4μlex taq0.25μl加ddh2o至50μl
[0091]
pcr反应条件为：94℃反应5min；98℃反应10s，57℃反应30s，72℃反应30s，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
[0092]
2.10foc4敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com的表型观察
[0093]
(1)菌落形态观察及生长速度测定。将foc4野生型、敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com分别接种于pda培养基上，于28℃黑暗条件下培养。在第5d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。每个处理设置3个重复。
[0094]
(2)敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com产孢量的观察。将敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com分别接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，3d后统计产孢量。每个处理设置3个重复。
[0095]
2.11敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com抗胁迫分析
[0096]
(1)高渗透压胁迫分析
[0097]
将foc4野生型、
△
focupin1和
△
focupin1-com分别接种在含有1mol/l nacl和1mol/l山梨醇的pda培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察
△
focupin1和
△
focupin1-com的菌落生长情况。每个处理设置3个重复。
[0098]
(2)氧化胁迫分析
[0099]
将foc4野生型、
△
focupin1和
△
focupin1-com分别接种在含有30mmol/l h2o2的pda培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观察
△
focupin1和
△
focupin1-com的菌落生长情况。每个处理设置3个重复。
[0100]
(3)细胞壁完整性分析
[0101]
将foc4野生型、
△
focupin1和
△
focupin1-com分别接种在含有0.05％sds、200μg/ml cr(刚果红)、100μg/ml cfw(钙荧光白)的pda培养基上，于28℃培养箱倒置培养5d后，观
察
△
focupin1和
△
focupin1-com的菌落生长情况。每个处理设置3个重复。
[0102]
2.12敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com玻璃纸穿透能力的测定
[0103]
将foc4野生型、
△
focupin1和
△
focupin1-com分别接种于覆盖一层再生纤维素膜(玻璃纸，购自solarbio，型号ya0620)的pda培养基中，培养3d后揭开玻璃纸，继续培养2d，观察培养基上是否能长出菌落。每个处理设置3个重复。
[0104]
2.13敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com的致病性分析
[0105]
取4叶期的巴西蕉伤根处理，分别用foc4野生型、敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com的分生孢子悬浮液(2
×
105个/ml)进行浸根30min，再移栽于营养土中；置于25
±
1℃的植物培养室内光/暗12h/12h交替培养，25d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。分别以foc4野生菌株和清水作为阳性和阴性对照。
[0106]
2.14敲除突变体
△
focupin1中镰刀菌酸合成相关基因的qrt-pcr分析
[0107]
用真菌rna提取试剂盒(omega fungal rna kit)，提取foc4和敲除突变体
△
focupin1基因组rna；以该基因组rna为模板，使用(primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser perfect real time)反转录试剂盒(rr047a takara)进行反转录得到基因组cdna。以foc4中镰刀菌酸合成相关基因(foig_16450(ncbi登录号：exl90277.1)、foig_16451(ncbi登录号：exl90278.1)、foig_16452(ncbi登录号：exl90279.1)、foig_16453(ncbi登录号：exl90280.1)、foig_16454(ncbi登录号：exl90281.1))为目的基因设计引物进行qrt-pcr反应，采用tubllin(foig_05875，ncbi登录号：exm02915.1)作为内参基因，对foc4及敲除突变体
△
foupe3中镰刀菌酸合成相关基因的表达量进行测定。
[0108]
fotubllin-f：5
′‑
cctcgtcgatcttgagcctg-3
′
，
[0109]
fotubllin-r：5
′‑
ctggaaaccctggaggcaat-3
′
；
[0110]
qfoig_16450-f：5
′‑
catcaacagtcccgccagtg-3
′
，
[0111]
qfoig_16450-r：5
′‑
cggagtttgcgagcgaagata-3
′
；
[0112]
qfoig_16451-f：5
′‑
cctagccaagcgacaagtcc-3
′
，
[0113]
qfoig_16451-r：5
′‑
tgactgttccattctcggcg-3
′
；
[0114]
qfoig_16452-f：5
′‑
gcaaagcaaaggacaaaatgg-3
′
，
[0115]
qfoig_16452-r：5
′‑
gcagcagcctcgtggaagaa-3
′
；
[0116]
qfoig_16453-f：5
′‑
cgagaagccccagacaccat-3
′
，
[0117]
qfoig_16453-r：5
′‑
tccccaagcccaactacagc-3
′
；
[0118]
qfoig_16454-f：5
′‑
tgctacatcgccctcaccaac-3
′
，
[0119]
qfoig_16454-r：5
′‑
cacaagcgtaggctgctcaat-3
′
；
[0120]
qrt-pcr反应液的配制参考transgen biotech公司perfectstart
tm
green qpcr supermix试剂盒(aq601)的说明书进行，具体如下：
[0121]
体系10μl reaction2
×
perfectstart
tm
green qpcr supermix5μl10μm primer f0.4μl10μm primer r0.4μlcdna0.8μl
加ddh2o至10μl
[0122]
将上述qrt-pcr反应液充分混匀并离心后，按照transgen biotech公司perfectstart
tm
green qpcr supermix试剂盒(aq601)的说明书进行qrt-pcr反应，具体反应条件为：94℃反应30s；94℃反应5s，60℃反应30s，循环40次；95℃反应10s；65℃反应5s；95℃反应5s。qrt-pcr反应结束后，实验数据使用2-δδct
方法计算相对表达水平。
[0123]
3结果与分析
[0124]
3.1香蕉枯萎病菌focupin1基因敲除载体的构建
[0125]
采用pcr扩增方法，分别克隆获得focupin1基因同源臂a片段和同源臂b片段；分别将其与t载体连接，经转化大肠杆菌、amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pmd18t-focupin1-a和pmd18t-focupin1-b。将pmd18t-focupin1-b与pct74质粒连接，获得重组质粒pct74-focupin1-b；将其与pmd18t-focupin1-a进行双酶切，经dna连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pct74-focupin1-ko(图1)。
[0126]
3.2香蕉枯萎病菌focupin1基因回补载体的构建
[0127]
采用pcr扩增方法，克隆获得focupin1基因回补片段；将其与pctzn载体连接，经大肠杆菌转化、amp抗性筛选、质粒提取与酶切鉴定，获得重组质粒pctzn-focupin1-com(图2)。
[0128]
3.3敲除突变体
△
focupin1的筛选
[0129]
3.3.1基因片段a-hph的pcr验证
[0130]
利用同源重组方法，将基因敲除载体pct74-focupin1-ko转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了28个潮霉素阳性转化子。经dna的提取，利用a-hph基因特异性引物，对其中的28个潮霉素阳性转化子进行了pcr验证分析。结果表明，上述28个转化子均扩增到了a-hph基因；图3为部分潮霉素阳性转化子a-hph基因的pcr扩增电泳图。
[0131]
3.3.2基因片段focupin1的pcr验证
[0132]
进一步利用focupin1基因特异性引物，对上述pcr扩增到a-hph基因的28个阳性转化子进行focupin1基因的pcr验证分析。结果表明，有14个转化子没有扩增出focupin1基因，进一步说明这14个转化子为阳性转化子；图4为部分潮霉素阳性转化子focupin1基因的pcr扩增电泳图。
[0133]
3.3.3敲除突变体
△
focupin1的southern blot验证
[0134]
对扩增出a-hph基因、同时没有扩增出focupin1基因的其中3个阳性转化子进行了southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，3个转化子均未有杂交条带(图5)。以hph为探针进行杂交，3个转化子均有单拷贝条带出现(图6)。上述试验进一步证明这3个转化子为阳性转化子。
[0135]
3.4敲除突变体
△
focupin1的菌落形态和生长速率测定
[0136]
将敲除突变体
△
focupin1接种于pda培养基中，在第5d对其生长情况进行了观察。结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，
△
focupin1的菌落形态和生长速率没有明显区别。
[0137]
3.5敲除突变体
△
focupin1的产孢量分析
[0138]
将敲除突变体
△
focupin1接种于查氏培养基，培养3d后进行产孢量分析。结果表明，敲除突变体
△
focupin1的产孢量与野生型相比没有明显区别。
[0139]
3.6回补突变体
△
focupin1-com的鉴定与表型分析
[0140]
利用随机插入的方法，将基因回补载体pctzn-focupin1-com转化香蕉枯萎病菌敲除突变体
△
focupin1-15原生质体，获得了2个博来霉素阳性转化子。经基因组dna的提取，利用focupin1基因特异性引物，对这些阳性转化子进行了pcr验证分析(图7)。结果表明，2个阳性转化子均可扩增到目的基因片段，说明这2个转化子含有focupin1基因；证实这2个转化子为阳性转化子。对回补突变体
△
focupin1-com进行菌落形态观察和产孢量分析，结果表明，回补突变体的菌落形态和产孢量均恢复至野生型水平。
[0141]
3.7敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com对不同胁迫条件的分析
[0142]
将敲除突变体
△
focupin1(
△
focupin1-15)和回补突变体
△
focupin1-com(
△
focupin1-15-com-1)分别接种于含1mol/l nacl、1mol/l山梨醇、0.05％sds、200μg/ml cr和100μg/ml cfw和30mmol/l h2o2的pda培养基中，对其菌落形态和直径进行了测定(图8)。结果表明，(1)在含nacl和山梨醇的pda培养基中，
△
focupin1和
△
focupin1-com与野生型均无明显差异，说明focupin1对foc4抗高渗透压的能力没有影响。(2)在含0.05％sds、cr、cfw的pda培养基中，与野生型相比，突变体
△
focupin1和
△
focupin1-com的生长与野生型均无明显差异，说明敲除focupin1基因对foc4的细胞壁完整性没有影响。(3)在氧化胁迫条件下，突变体
△
focupin1和
△
focupin1-com的生长与野生型相比均无明显差异。综上，focupin1基因的缺失不影响foc4的抗胁迫能力。
[0143]
3.8敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com玻璃纸穿透能力的测定
[0144]
将foc4、
△
focupin1(
△
focupin1-15)和
△
focupin1-com(
△
focupin1-15-com-1)的菌块分别接种于覆盖了一层玻璃纸的pda培养基中，培养3d后揭开玻璃纸，继续培养2d后发现
△
focupin1和
△
focupin1-com仍能穿透玻璃纸生长。说明focupin1基因的敲除不影响香蕉枯萎病菌的玻璃纸穿透能力(图9)。
[0145]
3.9敲除突变体
△
focupin1和回补突变体
△
focupin1-com的致病性分析
[0146]
利用伤根接种法，分别用foc4野生型、
△
focupin1(
△
focupin1-15)和回补突变体
△
focupin1-com(
△
focupin1-15-com-1)分生孢子分别接种巴西蕉，于25d后进行观察。结果表明，清水对照组的巴西蕉苗均未出现叶片黄化现象，且球茎没变色；foc4野生型接种后，香蕉整株上下部的叶片上都出现了明显黄化，发病明显；
△
focupin1接种后，致病性明显减弱。回补突变体
△
focupin1-com接种后，香蕉植株的上下部叶片也均出现大面积黄化，球茎区域的50％以上发生褐变(图10)，回补突变体
△
focupin1-com接种后的巴西蕉发病水平与野生型相近。综上，focupin1基因可能在调控香蕉枯萎病菌致病力这一方面发挥着重要的作用。
[0147]
3.10敲除突变体
△
focupin1中镰刀菌酸合成相关基因的qrt-pcr分析
[0148]
分别对foc4和
△
focupin1(
△
focupin1-15)中5个镰刀菌酸合成相关基因(foig_16450、foig_16451、foig_16452、foig_16453、foig_16454)的表达进行qrt-pcr分析。结果表明：与foc4野生型相比，敲除突变体
△
focupin1中有4个镰刀菌酸合成相关基因(foig_16451、foig_16452、foig_16453、foig_16454)的表达均显著降低(图11)。说明这可能也是敲除focupin1基因后导致foc4致病力降低的原因之一。
[0149]
因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药
物。
[0150]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。