一种金纳米颗粒-DNA酶马达触发双色DNA镊子荧光扩增检测双酚A的方法

一种金纳米颗粒-dna酶马达触发双色dna镊子荧光扩增检测双酚a的方法
技术领域
1.本发明涉及一种双酚a的检测领域，特别是基于双色dna镊子荧光检测双酚a的方法领域。


背景技术：

2.双酚a是一种人工合成的雌激素单体，分子量为228.29g/摩尔。1891年，dianin首次合成。自20世纪50年代起，双酚a作为环氧树脂和硬塑料材料的前体，通过聚合制备保护涂层。基于双酚a的产品具有钢一样的强机械性能和玻璃一样的良好透光性和耐腐蚀性，具有广阔的市场前景。因此，双酚a大量用于工业生产，年产量超过60亿英镑。一些研究人员发现，超过90％的受试婴儿和儿童体内可检测到双酚a。双酚a在人体内的累积与心血管疾病、心脏病和糖尿病的风险增加相关。因此，开发简便、灵敏的双酚a检测方法是非常必要的。
3.迄今为止，双酚a检测最常用的商业方法是基于色谱法的方法，包括hplc、gc、lc-ms 和gc-ms等。尽管这些经典的分析方法准确、灵敏度高，但仪器成本高、预处理过程复杂以及对熟练程序的要求限制了其应用。
4.dna马达是一种模拟蛋白质马达生物功能的纳米机器。它可以在设计的轨道上实现短距离步行。它们通常由杂交诱导的核酸构象变化驱动。基于dna的马达可以沿着各种材料表面上的特定轨迹迁移，包括金膜或纳米材料、碳基纳米材料和硅衬底。近年来，dna酶由于其循环反应的特点，被用于dna马达。dna酶基于dna马达由酶链(e-dna)和底物链(s-dna)组成。e-dna可以通过watson-crick碱基配对与s-dna结合，s-dna是轨道上的锚链。e-dna剪切s-dna后，游离e-dna可以与表面附近的相邻s-dna结合。因此，通过循环剪切和再结合反应，e-dna在轨道上实现了显著的移动。迄今为止，基于dna酶的 dna马达已被用于生物组织中的信号放大、纳米颗粒运输、生物传感、定位和成像。
5.dna镊子是一种由多个dna序列组成的dna纳米结构。它可以通过编程watson-crick 碱基配对实现结构变化。dna镊子主要由dna序列组成。因此，它可以很容易地以低成本进行商业合成，显示出良好的生物相容性、简单的功能修饰和优异的热稳定性。dna镊子的结构可以通过靶向响应各种信号，包括金属离子、小分子、核酸、蛋白质或细胞。到目前为止，由于缺乏扩增方法，很少有dna镊子对生物传感表现出超灵敏度。


技术实现要素：

6.为解决现有技术的问题，我们开发了一种金纳米颗粒dna酶马达触发的超灵敏双色 dna镊子，用于荧光检测双酚a。核酸适配子可抑制金纳米颗粒上的pb
2 -e-dna。在双酚a 存在的情况下，适配子可以与双酚a结合并重新激活pb
2 -e-dna。因此，pb
2 -s-dna可以被释放的pb
2 -e-dna循环剪切，并从金纳米颗粒释放dna片段。释放的dna片段可以与y形 dna镊子的环结合形成mg
2
特异性dna酶，随后的剪切导致另两个dna片段的留下。最后，这两个dna片段可以打开y形dna镊子，从而恢复两种颜色的荧光信号。
7.具体来讲，本发明是一种金纳米颗粒-dna酶马达触发双色dna镊子荧光扩增检测双酚 a的方法的方法，包括如下步骤：
8.1)金纳米颗粒-dna酶马达的合成：双酚a适配子和硫醇修饰的pb
2 -e-dna杂交后，与硫醇修饰的pb
2 -s-dna一起和金纳米颗粒孵育过夜，固定在金纳米颗粒表面；
9.其中，双酚a适配子序列为：
10.gaagagatgccggtgggtggtcaggtgggatagcgttccgcgtatggcccagcgcatc acgggttcgcacca，硫醇修饰的pb
2 -e-dna序列为hs-(t)
30
‑ꢀ
accacccaccggcatctcttctccgagccggtcgaaatagtgagt，硫醇修饰的 pb
2 -s-dna序列为hs-(t)
10
‑ꢀ
cactcactatraggaagagatgtctcttcagcgattaaccaggttacacccatgttagt ga；
11.2)y形dna镊子的合成：序列h1、h2和h3在pbs缓冲液中培养形成y形基础框架，然后，环状序列与y形基础框架杂交形成的y形框架在pbs缓冲液中与荧光猝灭剂dabcyl 修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’以及两个锁定序列孵育，形成y形dna镊子结构；
12.其中荧光猝灭剂dabcyl修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5 修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’四者浓度相同；
13.其中，h1序列为
14.aaacgcggcactaccggtggagtgcactgttttatgccaccggtagtg；h2序列为 cactaccggtggcataaaacagtgccgcgttttatgtattact，h3序列为 gtgattacataaaacgcggcactccaccggtagtgccgcgttt，环状序列为 agtaatagataaaatcactatraggaagagaaaaatctaatcac，荧光猝灭剂dabcyl 修饰的镊子序列1为dabcyl-atagatcactaccggtgg，荧光基团fam修饰的镊子序列1’为ccaccggtagtgaatcac-fam，荧光基团cy5修饰的镊子序列2为 cy5-gagaaaaaacgcggcact，荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’为 agtgccgcgttttctaat-bhq3，两个锁定序列分别为：锁定序列 1
‑‑
atagtgattttatctattact和锁定序列2
‑‑
atagtgattttatctattact；
15.3)检测目标双酚a：被测溶液在含1mm pb(no3)2的pbs缓冲液中与步骤1)形成的金纳米颗粒-dna酶马达反应1小时后，加入10mm nacl，然后离心将上清液加入步骤2) 形成的y形dna镊子中，并在含10mm mgcl2的pbs缓冲液中培养；
16.4)检测荧光信号：分别检测步骤3)所得溶液的荧光基团cy5和荧光基团fam的荧光信号，并采用标准曲线法得出双酚a浓度。
17.优选的，步骤1)具体为：在含1mm nacl的1mm的ph 7.5的pbs缓冲液中杂交100 nm双酚a适配子和100nm硫醇修饰的pb
2 -e-dna，然后再以1:6的比例与硫醇修饰的 pb
2 -s-dna一起与金纳米颗粒孵育过夜，固定在金纳米颗粒表面。
18.优选的，步骤2)具体为：序列h1、h2和h3在37℃下以相同的摩尔比在含1mm nacl 的10mm的ph 7.5的pbs缓冲液中培养1小时形成y形基础框架，然后，环状序列与y形基础框架杂交形成的y形框架在含1mm nacl的10mm的ph 7.5的pbs缓冲液中与荧光猝灭剂dabcyl修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’以及两个锁定序列孵育30min，形成y形dna 镊子结构。其中荧光猝灭剂dabcyl修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’四者浓度相同。
19.优选的，步骤3)具体为：被测溶液在含1mm pb(no3)2的1mm的ph 7.5的pbs 缓冲液
acgggttcgcacca，硫醇修饰的pb
2 -e-dna序列为hs-(t)
30
‑ꢀ
accacccaccggcatctcttctccgagccggtcgaaatagtgagt，硫醇修饰的pb
2 -s-dna序列为hs-(t)
10
‑ꢀ
cactcactatraggaagagatgtctcttcagcgattaaccaggttacacccatgttagt ga；
31.2)序列h1、h2和h3在37℃下以相同的摩尔比在含1mm nacl的10mm的ph 7.5的 pbs缓冲液中培养1小时形成y形基础框架，然后，环状序列与y形基础框架杂交形成的y 形框架在含1mm nacl的10mm的ph 7.5的pbs缓冲液中与荧光猝灭剂dabcyl修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3 修饰的镊子序列2’以及两个锁定序列孵育30min，形成y形dna镊子结构。其中荧光猝灭剂dabcyl修饰的镊子序列1、荧光基团fam修饰的1'、荧光基团cy5修饰的镊子序列2、荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’四者浓度相同。
32.其中，h1序列为
33.aaacgcggcactaccggtggagtgcactgttttatgccaccggtagtg；h2序列为 cactaccggtggcataaaacagtgccgcgttttatgtattact；h3序列为 gtgattacataaaacgcggcactccaccggtagtgccgcgttt；环状序列为 agtaatagataaaatcactatraggaagagaaaaatctaatcac；荧光猝灭剂dabcyl 修饰的镊子序列1为dabcyl-atagatcactaccggtgg；荧光基团fam修饰的镊子序列1’为ccaccggtagtgaatcac-fam，荧光基团cy5修饰的镊子序列2为 cy5-gagaaaaaacgcggcact，荧光猝灭剂bhq3修饰的镊子序列2’为 agtgccgcgttttctaat-bhq3，两个锁定序列分别为：锁定序列 1
‑‑
atagtgattttatctattact和锁定序列2
‑‑
atagtgattttatctattact；
34.3)被测溶液在含1mm pb(no3)2的1mm的ph 7.5的pbs缓冲液中与步骤1)形成的金纳米颗粒-dna酶马达反应1小时后，加入10mm nacl，然后离心将上清液加入步骤2) 形成的y形dna镊子中，并在含10mm mgcl2的1mm的ph 7.5的pbs缓冲液中培养40min。
35.4)检测步骤3)所得溶液的荧光基团cy5和荧光基团fam的荧光信号，并采用标准曲线法得出双酚a浓度，其中荧光基团fam的激发波长设置为486nm，发射波长记录为500 nm至600nm。荧光基团cy5的激发波长设定为640nm，发射波长记录为650nm至750nm。
36.以上方法为本发明的最佳实施方案。
37.设计了六组平行实验，证明本发明的方法的可行性和优越性。
38.六组平行实验的结果如图2所示，六组平行实验的区别如下：通过一些设计样本研究了本发明的检测机制(图2)。由于适配子对pb
2 -e-dna的抑制，无靶双酚a的空白样品呈现微弱的背景信号。样本2中的适配子序列被一个短序列取代，这意味着适配子不能离开 pb
2 -e-dna，因此也会导致背景荧光强度。样品3中，环上mg
2
的s-dna被随机序列改变，导致环上没有裂解，也显示出微弱的荧光强度。样本4和样本5中的锁定序列1和2序列分别6个碱基的改变，导致环片段无法打开其相应的dna镊子，从而导致相应信号通道中的背景荧光强度较弱。典型完整条件下的样品6显示fam和cy5的强荧光信号。所有结果均符合检测原理，间接证明了本发明的可行性。
39.为评价双酚a的检测性能，在最佳条件下采用本发明的方法检测不同浓度的双酚a。fam 和cy5的荧光信号均随双酚a浓度的增加而增加(图3a和3b)，呈现出从0.44到2.2
×
10
3 pm的线性关系(fam的r2＝0.993，cy5的r2＝0.992)(图3c和3d)。根据空白样品标准偏差的三倍计算，fam的lod为0.07pm，cy5的lod为0.16pm。这种高灵敏度可归因于两个水平的循环裂解扩增反应。重要的是，双色荧光策略显著提高了准确率并减少了假阳性结果。
40.本发明的方法的选择性通过一些类似的类似物进行评估，包括双酚b(bpb)、双酚c(bpc)、双酚a乙氧基化物(bpe)和双酚f(bpf)。如图4所示，只有双酚a表现出较强的荧光强度。其他类似物的荧光强度与空白样品一样低。此外，混合样品显示出与双酚a样品相同的强信号强度。这些结果表明，适配子仅与双酚a有很高的亲和力，其他类似物的干扰可以忽略不计。这些结果表明，本发明的方法具有很强的选择性和抗干扰性。
41.真实的检测
42.为了证明该方法的实际应用，对一些食品和环境样品进行了检测。所有样品均需用0.45 μm滤膜过滤，测试前将样品ph值调节至7.5。用一定浓度的加标样品进行回收试验。如表1所示，加标样品的回收率从93.4％变为108.7％，所有样品的rsd从6.4％变为9.2％。实际样品的回收率和rsd结果满足实际应用的要求。
43.表1.实际样品的检测
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综上所述，本发明提供了一种金纳米颗粒dna酶马达触发的超灵敏双色dna镊子，用于荧光检测双酚a。本发明的方法的敏感性通过dna酶为基础的dna马达和y形dna镊子环的循环剪切得到放大。双色荧光策略显著减少了假阳性结果。实际样品检测结果令人满意。