野生大豆肌醇转运蛋白基因GsINT1的鉴定及应用

野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定及应用
技术领域
1.本发明属于农业生物种质资源挖掘与创新利用技术领域，尤其涉及一种野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定及应用。


背景技术：

2.土壤盐碱化是影响农业生产、生态环境以及粮食安全的重要因素之一。目前，全球约有10亿公顷盐碱地，而我国盐碱地面积为9913万公顷，约占世界总面积的10％。因其含有高浓度钠离子，导致植物产生高离子胁迫和渗透胁迫，大大限制了植物从土壤中吸收水分和营养物质，致使植物叶片出现黄化、失水、乃至坏死的现象，极大的降低了我国农作物的产量，给农业生产带来了巨大的影响。
3.大豆是世界上重要的蛋白和油脂来源，在我国农业产业结构和人民生活中占有特殊重要的地位，而且每年消费量保持10％左右的增长速度。但是，与小麦、水稻等主要农作物相比，大豆属于中度盐碱敏感型作物；在盐碱胁迫条件下，大豆产量可严重降低50％，对我国大豆产量造成严重影响。因此，提高我国大豆耐盐碱能力，发掘与大豆耐盐碱相关的功能基因，培育耐盐碱大豆新种质已迫在眉睫。
4.研究表明肌醇不仅可以缓解叶片光合能力和叶绿素含量的下降，减轻生长抑制；还可以参与到植物盐、干旱和冷害等非生物胁迫中改善植物抗氧化系统，减少ros积累和盐胁迫造成的氧化损伤，维持植物体内离子和渗透平衡，提高植物耐受力。而肌醇转运蛋白(int)是植物中肌醇摄取、脂肪、矿物质、糖类等重要代谢产物的关键转运体。已有研究表明，苹果肌醇转运蛋白mdint1定位于液泡膜中，其表达受盐胁迫诱导；该基因过表达后，通过提高液泡中肌醇的再利用，进一步改善离子平衡、抗氧化系统活性和渗透保护物质的积累，大大提高了苹果耐盐性，但是其相关研究在大豆中尚未见报道。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：如何有效挖掘大豆耐盐碱候选基因，提高大豆耐盐碱能力，为培育耐盐碱优质大豆品种提供依据。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：作物的耐盐碱性状一般受多基因控制，且与一些不良性状紧密连锁，常规育种方法很难获得耐盐碱、优质的大豆品种。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：受沿海地区nacl等中性盐及内陆地区nahco3等碱性盐的危害，大豆产量可严重降低50％，对我国大豆产量造成极大影响。因此，挖掘大豆耐盐碱基因，提高大豆耐盐碱功能，为我国大豆提质增效以及通过分子育种培育耐盐碱大豆新品种(系)提供高效候选基因和新思路，具有重要的应用价值。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定及应用。
9.本发明是这样实现的，本发明公开了一个液泡膜肌醇转运蛋白gsint1的鉴定与应用。本团队通过对125个野生大豆品系进行盐碱(nacl nahco3)及盐(nacl)耐受性表型的鉴
定，从中分别筛选到一个耐受型品系swby032及一个敏感型品系swlj092。在此基础上，利用lc-ms/ms及tmt(tandem mass tag)标签，进行了2个野生大豆品系盐碱(nacl nahco3)和盐(nacl)胁迫下的蛋白质组定量分析。最终获得了一个编码野生大豆液泡膜肌醇转运蛋白1(inositol transporter 1)的基因gsint1(glysoja_027082)，其在盐碱和盐胁迫下的根和叶片中表达量均最高。同时，将gsint1分别在酵母和大豆发状根中进行超表达分析，结果表明该基因表现出较强的耐盐碱功能。
10.本发明所述野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1是以野生大豆cdna为模板，通过反转录pcr方法获得gsint1基因的全长核苷酸序列，核苷酸序列为seq id no.1。
11.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的含有seq id no.1的互补及反向序列。
12.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的含有seq id no.1或反向及互补序列所编码的氨基酸序列。
13.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的含有肌醇蛋白转运体基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
14.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的含有肌醇蛋白转运体基因的表达载体的构建方法，主要包括：
15.(1)野生大豆gsint1基因克隆
16.以野生大豆cdna为模板，对gsint1基因进行克隆，pcr扩增体系为：模板1μl，10x buffer 2.5μl，dntp 2.0μl，gsint1-f 1.0μl，gsint1-r 1.0μl，ddh2o 17.5μl；94℃预变性10min，94℃变性1min，60℃退火1min，延伸2min，循环数为35；pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，与克隆载体peasy-t1连接，形成peasy-gsint1后进行测序。
17.(2)酵母载体的构建
18.将peasy-gsint1质粒与pyes2质粒分别用sac i与bamh i进行双酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在t4 dna连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pyes2-gsint1；将空载体即pyes2与pyes2-gsint1分别转化至酿酒酵母invsc1中，用于基因功能鉴定。
19.(3)植物表达载体的构建
20.将peasy-gsint1质粒与pcambia-flag质粒分别用nco i与spe i进行双酶切，回收目的基因与载体大片段，在t4 dna连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pcambia-gsint1；将空载体即pcambia-flag与pcambia-gsint1分别转化至发根农杆菌k599中，用于大豆发状根诱导及转化。
21.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1耐盐碱功能的鉴定，其步骤如下：
22.步骤一，超表达gsint1基因酵母耐盐和盐碱的表型鉴定；
23.将酵母表达载体pyes2-gsint1以及空载体pyes2分别转入酿酒酵母invsc1；利用sd-ura培养基挑选单克隆菌落，并在sc-ura galactose液体培养基中进行培养；用0.9％nacl将od600值调至0.5，继续稀释浓度至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
；分别取1μl点于空白sc-ura galactose培养基和胁迫培养基上，培养3～7天，以sc-ura galactose空白培养基为对照，观察并记录不同胁迫条件下pyes2酵母细胞与转入gsint1基因的酵母细胞的生长状态；其中，所述胁迫处理条件：700mm nacl和15mm nahco3 675mm nacl。
24.本发明超表达gsint1酵母和大豆发根在盐及盐碱胁迫下的表型鉴定结果显示，在nacl和nahco3 nacl胁迫下，转入pyes2-gsint1的酵母菌长势明显优于转入pyes2空载体的酵母菌，表现出较强的耐盐及耐盐碱特性，说明gsint1基因具有耐盐及耐盐碱的功能。
25.步骤二，超表达gsint1基因大豆发状根耐盐和盐碱的表型鉴定。
26.将植物表达载体pcambia-gsint1以及空载体pcambia-flag分别转入发根农杆菌k599中；用次氯酸钠和浓盐酸1：1混后，对大豆种子进行氯气过夜灭菌；用无菌水清洗大豆并将其种到经过高温高压灭菌的蛭石中，用1/4霍格兰溶液保湿；在人工气候室中25℃、光照16h、培养6天；将发根农杆菌k599在28℃培养箱过夜培养；用刀片刮菌收集菌体。
27.将发根农杆菌注射到临近子叶的下胚轴处；注射完成后保水5～6天；用灭过菌的蛭石将伤口盖住，并保水；培养15天去除真实根，在蛭石中缓苗3天后移到霍格兰培养液中培养；培养3天，开始进行胁迫处理，所述胁迫处理条件为120mm nacl和70mm nahco3 50mm nacl，以正常培养为对照，观察并记录不同胁迫条件下各植株的生长状态。
28.本发明超表达gsint1基因大豆发状根耐盐和盐碱的表型鉴定结果显示，在nacl和nahco3 nacl胁迫下，含有pcambia-gsint1质粒的发根农杆菌诱导的植株长势明显优于pcambia-flag空载体诱导的植株，表现出较强的耐盐及耐盐碱特性，进一步在大豆中证明了gsint1蛋白具有耐盐及耐盐碱的功能。
29.本发明的另一目的在于提供一种所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1在转基因植物中的应用，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
30.本发明的另一目的在于提供一种所述的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1在大豆耐盐碱胁迫过程中的应用。
31.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：肌醇作为渗透调节物质在植物耐盐碱等非生物胁迫中发挥重要作用。并且，位于质膜和液泡膜上的肌醇转运蛋白(inositol transporter,int)主要调控其在植物体内组织器官及亚细胞器中的分布。已有研究表明int1基因在提高拟南芥及苹果耐盐性方面发挥一定的功能，除此之外，在其他植物中有关肌醇转运蛋白及功能的研究鲜有报道，在大豆中及其相关农业中的应用更是尚未见报道。本团队通过对盐碱敏感型及盐碱耐受型野生大豆进行蛋白质组学分析，挖掘到与盐碱胁迫相关的基因-gsint1，首次探明了gsint1基因在大豆中耐盐碱胁迫的功能，对提高我国大豆耐盐碱能力及培育耐盐碱大豆优质品种提供依据。一方面明确了gsint1基因在大豆耐盐碱胁迫过程中的作用；另一方面为培育耐盐碱大豆新种质及其相关育种工作奠定基础。
32.本发明提供的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定和应用，涉及一个植物液泡膜肌醇转运蛋白的鉴定，并发现该蛋白受盐碱胁迫强烈诱导并具有较强的耐盐碱功能，为培育耐盐碱大豆新种质奠定基础。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1是本发明实施例提供的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定方法流程图。
35.图2是本发明实施例提供的耐盐碱野生大豆swby032和盐碱敏感型野生大豆swlj092表型鉴定示意图。
36.图3是本发明实施例提供的gsint1基因全长cdna片段的pcr扩增示意图。
37.图4是本发明实施例提供的gsint1基因酵母表达载体的构建示意图。
38.图5是本发明实施例提供的gsint1基因大豆发根表达载体的构建示意图。
39.图6a和图6b是本发明实施例提供的gsint1基因在酵母和大豆发根中的功能鉴定示意图。
具体实施方式
40.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
41.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的鉴定及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
42.本发明实施例提供的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1来源于野生大豆，核苷酸序列为seq id no.1。
43.菌种包括发根农杆菌k599和酿酒酵母invsc1，上述菌种均购自于上海昂羽生物技术有限公司；野生大豆盐碱耐受性品系swby032及敏感型品系swlj09材料均来自于吉林省农科院。野生大豆盐碱耐受性品系swby032及敏感型品系swlj09材料为海南大学热带作物学院热带大豆分子育种与种质创新团队所购买。
44.如图1所示，本发明实施例提供的野生大豆肌醇转运蛋白基因gsint1的功能鉴定如下：
45.s101，超表达gsint1基因酵母耐盐和盐碱的表型鉴定；
46.s102，超表达gsint1基因大豆发状根耐盐和盐碱的表型鉴定。
47.本发明公开了一个液泡膜肌醇转运蛋白gsint1的鉴定与应用，本发明以野生大豆盐碱耐受性品系swby032及敏感型品系swlj092为研究材料，通过盐碱(nacl nahco3)和盐(nacl)胁迫下的蛋白质组学分析，鉴定到一个编码液泡膜肌醇转运蛋白的基因gsint1，并发现该基因具有较强的耐盐碱功能。它是以野生大豆cdna为模板，通过rna提取及反转录pcr方法获得gsint1基因的全长核苷酸序列。本发明一方面探明了gsint1基因在大豆耐盐碱胁迫过程中的作用；另一方面为培育耐盐碱大豆新种质及其相关育种工作奠定基础。本发明公开了一种野生大豆液泡膜肌醇转运蛋白gsint1，并发现该蛋白受盐碱胁迫强烈诱导并具有较强的耐盐碱功能，为培育耐盐碱大豆新种质奠定基础。
48.本发明的目的是提供一个植物耐盐及盐碱胁迫基因gsint1。
49.本发明所提供的液泡膜肌醇转运蛋白基因gsint1来源于野生大豆，其核苷酸序列见seq id no.1。
50.atgactggggggggtatcactatgcaatcgacgccgggaagctcaggatacttggatttgtatccagagcggaagatgtcctttttcaaaaatccttacattctcggactggctgctgtcgccggcatcggtggtctcctcttc
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51.它是以野生大豆cdna为模板，通过反转录pcr方法获得gsint1基因的全长核苷酸序列。
52.一种含有seq id no.1的互补及反向序列。
53.一种含有seq id no.1或其反向及互补序列所编码的氨基酸序列。
54.含有本发明肌醇蛋白转运体基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌皆在本发明的保护范围之内。
55.本发明液泡膜肌醇转运蛋白基因在转基因植物中的应用，其在单子叶植物和双子叶植物中的应用均属于本发明的保护范围。
56.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
57.实施例1：125份野生大豆盐碱胁迫表型鉴定及蛋白质组学分析
58.1.1125份野生大豆耐盐碱胁迫表型鉴定
59.(1)将每个品种的30粒待检测种子分为对照组和胁迫组，每组设置3个重复，每个播种15粒种子；将其播种于装有珍珠岩的盆钵中，每盆播5粒。
60.(2)待子叶完全展开后(vc时期)，每隔两天浇灌一次200ml的1/4hoagland营养液；同时，每钵定株涨势一致的3棵幼苗，以便用于后期胁迫实验。
61.(3)胁迫培养：待真叶完全展开后(v1时期)，每钵加入200ml的胁迫液，胁迫处理一共10天，每次处理均固定在同一时间。
62.(4)对照培养：待真叶完全展开后(v1时期)，每钵加入200ml的1/4的霍格兰培养液进行培养，每次处理均固定在同一时间。
63.(5)胁迫处理后观察野生大豆生长情况，筛选出盐碱耐受型野生大豆。
64.1.2蛋白质组学分析
65.通过对125个野生大豆品系进行盐碱耐受性表型的鉴定，从中筛选出一个盐碱耐受型品系swby032和一个敏感型品系swlj092。在此基础上，利用lc-ms/ms及tmt对上述两个野生大豆品系盐碱胁迫下的蛋白质组进行定量分析。
66.结果显示，耐受型品系swby032在盐碱胁迫下，分别有332个和208个差异表达蛋白，其中上调表达分别为198个和128个；敏感型品系swlj092在盐碱胁迫下，分别有320个和119个差异表达蛋白，其中上调表达分别为182个和84个。由此可见，耐受型品系在盐碱胁迫下，无论是差异表达蛋白数量还是上调表达蛋白数量均高于敏感型品系。因此，除去与敏感型品系在盐碱胁迫条件下共有的37个差异表达蛋白，耐受型品系swby032特有的35个差异表达蛋白可能是该品系野生大豆耐盐碱基因的编码产物。基于此原因，我们首先分析了其中编码18个上调表达蛋白基因的mrna表达水平，结果发现编码野生大豆液泡膜肌醇转运蛋白1(inositol transporter 1)的基因gsint1(glysoja_027082)，在盐碱胁迫下的根和叶片中表达量均最高。因此，初步推测，gsint1可以作为影响野生大豆耐盐碱功能的候选基因。
67.实施例2：野生大豆总rna提取
68.(1)取新鲜野生大豆叶片组织(50-100mg)放置于液氮下充分研磨，直至粉末无明显颗粒感。
69.(2)加入适量体积的rnaiso组织液匀浆，室温静置5分钟后，12,000g,4℃离心5分钟。
70.(3)取上清转移至新的1.5ml离心管中，加入200ul氯仿混匀并室温静置5分钟，12,000g，4℃离心15分钟。
71.(4)将上清液转移到新的离心管中，加入与上清溶液等量异丙醇，室温静置10分钟，12,000g，4℃离心10分钟。
72.(5)弃去上层清液，沿离心管壁缓的加入75％的乙醇1ml，轻柔缓慢的颠倒离心管混匀，12,000g，4℃离心5分钟后倒掉上层乙醇。
73.(6)沉淀干燥2～5分钟，加入50ul的rnase-free水溶解沉淀，待rna沉淀完全溶解后于-80℃保存备用。
74.实施例3：野生大豆gsint1基因克隆
75.将上述rna反转录成cdna，并以其为模板，对gsint1基因进行克隆，pcr扩增体系见表3，主要为94℃预变性10min，94℃变性1min，60℃退火1min，延伸2min，循环数为35，其pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，与克隆载体peasy-t1连接，形成peasy-gsint1后进行测序，其测序结果见seq id no.1。
76.表3gsint1基因pcr扩增体系
[0077][0078]
实施例4：肌醇转运蛋白gsint1表达载体的构建
[0079]
4.1酵母载体的构建
[0080]
将peasy-gsint1质粒与pyes2质粒分别用sac i与bamh i进行双酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在t4 dna连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pyes2-gsint1。将空载体即pyes2与pyes2-gsint1分别转化至酿酒酵母invsc1中，用于基因功能鉴定。
[0081]
4.2植物表达载体的构建
[0082]
将peasy-gsint1质粒与pcambia-flag质粒分别用nco i与spe i进行双酶切，回收目的基因与载体大片段，在t4 dna连接酶的作用下进行连接，得到表达载pcambia-gsint1。将空载体即pcambia-flag与pcambia-gsint1分别转化至发根农杆菌k599中，用于大豆发状根诱导及转化。
[0083]
实施例5：超表达gsint1酵母和大豆发根在盐及盐碱胁迫下的表型鉴定
[0084]
5.1超表达gsint1基因酵母耐盐和盐碱的表型鉴定
[0085]
将酵母表达载体pyes2-gsint1以及空载体pyes2分别转入酿酒酵母invsc1。利用sd-ura培养基挑选单克隆菌落，并在sc-ura galactose液体培养基中进行培养。用0.9％nacl将其od600值调至0.5，继续稀释浓度至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
。分别取1μl点于空白sc-ura galactose培养基和胁迫培养基上，培养3-7天，以sc-ura galactose空白培养基为对照，观察并记录不同胁迫条件下pyes2酵母细胞与转入gsint1基因的酵母细胞的生长状态(胁迫处理条件：700mm nacl和15mm nahco3 675mm nacl)。
[0086]
结果显示，在nacl和nahco3 nacl胁迫下，转入pyes2-gsint1的酵母菌长势明显优于转入pyes2空载体的酵母菌，表现出较强的耐盐及耐盐碱特性，说明gsint1基因具有耐盐及耐盐碱的功能。
[0087]
5.2超表达gsint1基因大豆发状根耐盐和盐碱的表型鉴定
[0088]
本发明在前人的基础上，对发根诱导流程稍做改动，以适应后续对大豆发根耐盐及盐碱研究部分实验需要。首先将植物表达载体pcambia-gsint1以及空载体pcambia-flag分别转入发根农杆菌k599中。
[0089]
(1)用次氯酸钠和浓盐酸1：1混后，对大豆种子进行氯气过夜灭菌；
[0090]
(2)用无菌水清洗大豆并将其种到经过高温高压灭菌的蛭石中，用1/4霍格兰溶液保湿；
[0091]
(3)在人工气候室中25℃、光照16h、培养6天左右；
[0092]
(4)将发根农杆菌(k599)在28℃培养箱过夜培养；
[0093]
(5)用刀片刮菌收集菌体；
[0094]
(6)将发根农杆菌注射到临近子叶的下胚轴处；
[0095]
(7)注射完成后需保水5～6天；
[0096]
(8)然后用灭过菌的蛭石将伤口盖住，并保水；
[0097]
(9)培养15天左右去除真实根，在蛭石中缓苗3天左右后移到霍格兰培养液中培养。
[0098]
(10)培养3天左右，开始进行胁迫处理(胁迫处理条件：120mm nacl和70mm nahco3 50mm nacl)，以正常培养为对照，观察并记录不同胁迫条件下各植株的生长状态。结果显示，在nacl和nahco3 nacl胁迫下，含有pcambia-gsint1质粒的发根农杆菌诱导的植株长势明显优于pcambia-flag空载体诱导的植株，表现出较强的耐盐及耐盐碱特性，进一步在大豆中证明了gsint1基因具有耐盐及耐盐碱的功能。
[0099]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。