一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法和应用与流程

1.本发明涉及基于植物基因工程领域，尤其是涉及一种快速去除白杨、桉树细胞壁的酶解方法。
技术背景
2.白杨是我国黄河流域的主要人工林种植树种,由于其生长迅速、抗旱、耐贫瘠、树形优美,在我国北方地区广泛种植,是城市街道、高速公路景观绿化的主要树种,也是维护治理生态环境中防风固沙、退耕还林的重要树种,同时白杨在木材加工、造纸等林业产业中也发挥着重要作用。目前我国的杨树人工林总面积为850万公顷,已经超过1亿亩(2018年数据),位居世界第一。但是传统的杨树种苗育种存在育种周期长、难以对优良性状进行多元化整合的缺点,同时也存在优质品种相对单一,难以满足我们国家对生态建设、植被恢复、增加森林碳汇能力的多元化需求。
3.桉树是我国南方地区广西、广东、福建等地广泛种植的经济树种,每年贡献了我国超三分之一的木材产量,对维护我国“木材安全”,建设木材战略储备基地起到了关键支撑作用。仅我国的广西省,种植面积达到3000多万亩,木材产量2500多万立方米,经济效益规模已经达到4700多亿。同时桉树在减排吸碳环保方面,每年吸收二氧化碳超过8.5亿吨,也为国家的环保事业做出巨大贡献。然而桉树在发展过程中也被冠以了“抽水机”、“抽肥机”的外号,原因是桉树生长迅速,对于水肥的需求很大。如何通过基因工程手段培育高效利用“水分”“肥料”的桉树新品种,对于打赢“种业翻身仗”,解决林业种苗产业中的难点具有重要意义。
4.为了更好的解决白杨和桉树育种问题，就要分离植物原生质体，需要解决细胞壁的破壁问题，必须去掉由果胶质、纤维素、半纤维素及木质素等构成的细胞壁。林木植物由于木质化程度通常比草本植物高，使得其细胞壁结构更为复杂。在本世纪前期是采用分离机械法，即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织。后期发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，但白杨和桉树的细胞壁如何快速去除，并能够获得完整度为90％及以上的白杨、桉树的原生质体至今没有报告。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法,利用配置的酶解溶液将白杨或桉树的叶片进行酶解去除细胞壁，酶解孵育得到白杨或桉树的原生质体。该方法能够对白杨、桉树的细胞壁进行快速完全解离，解离程度能达到90％及以上，具有巨大的应用潜力。
6.本发明还提供一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法制备得到的原生质体。
7.本发明还提供了原生质体对外源dna质粒的转化中应用。
8.本发明是通过下述技术方案实现的：
9.一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法，至少包括如下步骤：利用配置的酶解溶液将白杨或桉树的叶片进行酶解去除细胞壁，酶解孵育即可。
10.进一步优选，一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法，包括如下步骤：白杨、桉树的叶片放置溶液i中浸泡；溶剂i浸泡后的白杨或桉树叶片放置到酶解溶液中进行酶解得酶解液，酶解终止后，再进行过滤和纯化即可。
11.一种实施方式，本发明所述的酶解溶液的组成，包括下述质量百分比或浓度的组分：1-2％(w/v)纤维素酶r-10，0.4-0.8％(w/v)离析酶r-10，0.2-1.0％(w/v)果胶酶y-23,0.4-0.8mol/l甘露醇、18-22mmol/l氯化钾kcl、18-22mmol/l2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)、8-12mmol/l氯化钙、0.03-0.08mmol/lβ-巯基乙醇、0.08-0.12％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)。
12.本发明的酶解溶液适用于制备白杨或桉树原生质体，特定种类及比例的酶解溶液能够快速酶解，不会破坏白杨或桉树的原生质体。本发明所述的果胶酶可以降解白杨和桉树细胞壁中的果胶，使细胞分开，再用纤维素酶r-10处理降解细胞壁。果胶酶加入降解果胶质，能够快速消除细胞壁，获得原生质体。添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
13.一种实施方式，本发明所述的酶解溶液的组成，所述纤维素酶r-10的质量百分比可以为1.3-1.4％(w/v)、1.4-1.5％(w/v)、1.5-1.8％(w/v)或1.8-2.0％(w/v)。
14.一种实施方式，本发明所述的酶解溶液的组成，所述果胶酶y-23的质量百分比可以为0.3-0.4％(w/v)、0.4-0.5％(w/v)、0.5-0.6％(w/v)、0.6-0.7％(w/v)或0.7-0.8％(w/v)。
15.一种实施例方式，本发明所述的酶解溶液的组成，所述牛血清白蛋白(bsa)的质量百分比可以为0.08-0.09％(w/v)、0.09-0.10％(w/v)、0.10-0.11％(w/v)或0.11-0.12％(w/v)。
16.一种实施方式，本发明所述的酶解溶液的组成，包括下述质量百分比或浓度的组分：1.5％(w/v)纤维素酶r-10，0.4％(w/v)离析酶r-10，0.5％(w/v)果胶酶y-23,0.6mol/l甘露醇、20mmol/l氯化钾kcl、20mmol/l2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)、10mmol/l氯化钙、0.05mmol/lβ-巯基乙醇、0.1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)。
17.本发明所述的一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法，其中溶剂i为甘露醇溶液，优选浓度为0.4-1.2mol/l。本发明所述的先用甘露醇溶液浸泡白杨或桉树叶片的目的可以使原生质体与细胞壁初步分离，能够快速酶解去除细胞壁。优选浓度可以为0.4-0.5mol/l,0.5-0.6mol/l,0.7-0.8mol/l,0.8-0.9mol/l或0.9-1.0mol/l。
18.甘露醇浸泡的目的是为了质壁分离，让细胞膜和细胞壁分开，有利于下一步的酶解解离。浓度太高会导致渗透压过高细胞死亡，浓度太低，没法发生细胞的质壁分离。
19.一种实施方式，甘露醇前处理的白杨或桉树叶片，沥干后，放入酶解溶液中，尽量不要带出甘露醇溶液，甘露醇浸泡的目的是为了质壁分离，让细胞膜和细胞壁分开，有利于下一步的酶解解离。
20.本发明所述的酶解条件为黑暗条件下，放置于水平摇床上，20-24℃，酶解3-5小时。该条件下能够提高酶活力、快速酶解，从而使细胞壁快速分离；5小时内完全解离程度能达到90％及以上。
21.一种实施方式，本发明所述的酶解条件，其中酶解温度可以为20-21℃、21-22℃、22-23℃或23-24℃。
22.本发明所述酶解终止的方法为向所述酶解液中加入w5溶液。
23.本发明所述过滤采用200-400目滤网过滤。可以为200-300目或300-400。
24.本发明所述纯化采用多次离心和清洗进行纯化。
25.一种实施方式，所述清洗包括向经过滤和离心后的所述酶解液中加入w5溶液并离心去上清，并执行多次。
26.本发明所述的一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法，其中所述白杨或桉树叶片是通过培养基对白杨或桉树组培苗无菌继代和培养得到的。
27.本发明提供一种白杨或桉树的原生质体，所述原生质体由一种快速去除白杨或桉树细胞壁的酶解方法制备方法制得。
28.本发明还提供一种白杨或桉树原生质体对外源dna质粒的转化中应用，制备得到的原生质体、外源dna质粒、peg/ca
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和mmg溶液进行孵育转化。
29.有益效果
30.本发明提出的用特定的酶解溶液配方，及一系列实施手段，对白杨、桉树的细胞壁进行快速解离，5小时内完全解离程度能达到90％及以上，解决了树木由于细胞壁成分复杂难以去除细胞壁的产业问题。应用此方法可以获得高完整性和活性的原生质体，用于后续的再生等途径，能够加速我国北方地区“白杨”,和南方地区“桉树”的基因工程育种,对于培育优良白杨、桉树的新品种,保障我国的木材安全具有重要的应用价值。该方法可以适用于白杨派中的毛白杨、银白杨、84k杨树、山新杨、新疆杨和青杨派中的毛果杨,黑杨派中的欧美杨、107杨的,以及桉树中的尾巨桉,巨尾桉,巨桉细胞壁的去除和解离,对于推动林木良种基因工程育种具有重要意义。
31.本发明发现原生质体酶解方法仅使用离析酶和果胶酶，很难降解掉木本植物如白杨、桉树这种细胞壁成分复杂植物，效率极低。在纤维素酶和离析酶的基础上，额外加入了果胶酶，并且设定了最佳的浓度进行酶解实验，能够对白杨和桉树细胞壁的中大量果胶进行酶解去除，从而解离出原生质体。
附图说明
32.图1为快速去除白杨、桉树细胞壁的酶解方法流程示意图。
33.图2去除细胞壁之后的“白杨”原生质体。
34.图3去除细胞壁之后的“桉树”原生质体。
具体实施方式
35.下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法,使用的试剂和材料如无特殊说明,均为市售商品。其中所使用的纤维素酶r-10、离析酶r-10和果胶酶y-23购自于yakult公司，各种药品试剂,如无特殊说明均购自sigma公司。
36.实施例一：白杨、桉树组培苗无菌苗的培养
37.将毛白杨组培苗分别经过如下培养基进行无性繁殖：
38.所用培养基配方如下：
39.愈伤诱导培养基：ms kt 0.5mg/l 0.1mg/l 2,4-d 6.5g/l琼脂
40.分化出芽培养基：ms tdz 0.05mg/l 6-ba 0.5mg/l 6.5g/l琼脂
41.芽伸长培养基：ms 6-ba0.5mg/l 6.5g/l琼脂
42.生根培养基：1/2ms naa0.5mg/l 6g/l琼脂
43.(1)外殖体消毒:首先将野外生长的毛白杨植株的茎段剪下，用毛刷轻轻刷洗，自来水流水冲洗12h，晾干，将枝条建成3cm长的茎段，在超净工作台上用75％的酒精浸泡30s，用无菌水3次，每次1min，再用2％的次氯酸钠(naclo)水溶液消毒10min，再用无菌水冲洗3次，每次1min，然后用无菌滤纸将表面水分吸干，将茎段放在“愈伤诱导培养基”上，黑暗情况下，培养30天，其中每隔10天换一次培养基，直到叶片边缘长出白色透明的愈伤组织；
44.(2)愈伤诱导:将愈伤组织小心切下，放置于“分化出芽培养基”上，放置在光下培养30d，其中每隔10天换一次培养基，直到愈伤组织长出芽；
45.(3)生芽诱导：将愈伤组织和芽一起放置于“芽伸长培养基上”，生长20天左右，直芽长出明显的茎；
46.(4)生根培养：将茎段切下，插入“生根培养基”中，光下培养30d，长成的完整植株备用。
47.将桉树组培苗分别经过如下培养基进行无性繁殖：
48.所用培养基配方如下：
49.愈伤诱导与分化出芽培养基：ms tdz0.5mg/l naa0.1mg/l 6.5g/l琼脂继代培养基：ms kt0.2mg/l 6-ba0.2mg/l naa0.1mg/l 6.5g/l琼脂生根培养基：1/2ms naa0.5mg/l iba0.5mg/l 6.0g/l琼脂
50.(5)首先野外生长的巨尾桉树茎段，按照毛白杨外殖体消毒的方法进行处理，处理之后再将茎段放置于桉树“愈伤诱导与分化出芽”培养基上，放置于黑暗下进行培养30d，其中每隔10d换一次培养基，之后再转移到光下，进行芽的诱导，直至长出幼嫩的芽。
51.(6)将带有芽和愈伤组织的茎段放置于“继代培养基”，生长30天左右，直芽长出明显的茎；
52.(7)将茎段切下，插入“生根培养基”中，光下培养30d，直到长成完整植株备用。
53.实施例二：质壁分离预处理
54.(8)配置0.8m的甘露醇溶液:准备直径为9cm的一次性培养皿，称取2.912g甘露醇溶于20ml ddh2o中，将甘露醇充分溶解混匀。
55.(9)用剪刀或刀片将白杨、桉树的叶片剪成宽度约为1mm宽度的细条，浸泡于上一步中配好的甘露醇溶液中，确保叶片细条都浸入溶液中。
56.(10)室温静置20min。
57.实施例三：酶解法去除细胞壁
58.用10ml离心管配置10ml如下配方的酶解液：
59.0.15g纤维素酶r-10
60.0.04g离析酶r-10
61.0.05g果胶酶y-23
62.1.092g甘露醇
63.1ml 200mm kcl
64.1ml 200mm mes
65.加入5ml的ddh2o，55℃孵育10min，待冷却至室温后，加入
66.100μl 1m cacl267.66.67μl 7.5mmβ-巯基乙醇
68.1ml 1％bsa
69.定容至10ml待用。
70.(11)捞出甘露醇处理后的白杨、桉树叶片细条，沥干后，放入酶解液中(尽量不要带出甘露醇溶液)，松散地均匀浸泡在含有10ml酶解液的10ml离心管中。
71.(12)黑暗条件下，放置于水平摇床上，23℃，10rpm，酶解3～5小时。
72.(13)酶解3h后，每隔1h用剪掉尖端的枪头吸取酶解液放在显微镜下进行观察分析。
73.(14)400目滤网过滤，滤液吸至10ml塑料离心管中，室温，100g离心2min，弃上清。
74.实施例四：观察分析
75.(15)向10ml离心管中加入(沿壁轻轻加入，不要太快)2ml预先冷处理的w5溶液(154mm nacl,125mm cacl2,5mm kcl,2mm mes,5mm葡萄糖),冲洗原生质体，轻轻颠倒混匀。
76.(16)100g离心力，4℃，离心1min，弃上清。
77.(17)再加入2ml预冷的w5溶液，轻微震荡使沉淀悬浮起来。
78.(18)在光学显微镜下进行原生质体完整性的观察统计。
79.(19)吸取1ml原生质体溶液，加入50μl浓度为5mg/ml的二乙酸荧光素(fda)溶液，染色2min后放置于荧光显微镜下进行观察，对原生质体的活性进行分析。
80.上述结果表明在荧光显微镜下观察原生质体，黄绿色的为有活力的细胞，有活性的细胞占总细胞的90％以上。
81.荧光通道200μm标尺下的白杨原生质体活力检测示意图如图2所示。
82.荧光通道200μm标尺下的桉树原生质体活力检测示意图如图3所示。
83.实施例五甘露醇前处理和不含前处理的对比数据
84.分别使用加甘露醇前处理和不加前处理的对后续解离效果影响较大，不加前处理，后续解离出的原生质体得率非常低约为2x103个/ml，而使用甘露醇先进行质壁分离后，后续原生质体的得率很高1-5x105个/ml。
85.实施例六酶解溶液配方的筛选试验
86.基础版的配方为1％的纤维素酶r-10、0.3％离析酶、0.4m甘露醇、20mmol/l kcl、20mmol/l mes和10mmol/l cacl2。利用纤维素酶和离析酶对细胞壁的主要成分进行降解，甘露醇起到维持渗透压的作用，kcl、mes、cacl2对细胞的活性起到维持作用。设置了1％、1.5％、2％纤维素酶，0.4％、0.6％、0.8％离析酶r-10，和加入0.2％、0.5％、1.0％果胶酶的浓度梯度，一共九种酶解液实验方案，其它成分同实施例三，最终确定了本发明中最佳的酶解液浓度为1.5％纤维素酶r-10，0.4％离析酶和0.5％果胶酶，获得的原生质体的得率最高，解离程度能达到90％及以上。
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