定向富集培养梭菌属微生物的方法与流程

1.本发明属于酿酒微生物发酵技术领域，具体涉及定向富集培养梭菌属(clostridium)微生物的方法。


背景技术：

2.梭菌属(clostridium)被认为是一类主产己酸的己酸菌，为厌氧或兼性厌氧菌，是优质窖泥中的优势微生物和浓香型白酒酿造过程中重要的风味贡献者，能将发酵原辅料中淀粉、蛋白质、纤维素等转化为有机酸(乙酸、丁酸、己酸)、醇类、co2等物质，可作为白酒呈香呈味的前体物质。同时，许多研究表明梭菌属对于提高窖泥质量、维护窖池等方面具有重要作用，且其中某些菌株具有高产丁酸、己酸的能力。例如，博士论文《浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究》(胡晓龙.浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究[d].江南大学,2015.)从窖泥中筛选分离clostridium kluyver n6，产己酸量为3.05g/l。
[0003]
己酸菌为厌氧或兼性厌氧菌，要进行可培养的要求特别高，例如，专利cn109971686a提出的己酸增殖培养基由蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、醋酸钠、半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸、氯化红血素组成，采用油液封，隔绝空气达到无氧培养。专利cn108865942a公开了不加caco3的nceam培养基培养clostridium.kluyveri jzz，但仍含有硫酸镁、磷酸氢二钾等类成分。专利cn102260640b采用的是乙酸钠、乙醇、硫酸铵、丢糟浸液、大曲粉、底锅水等作为已酸菌培养基但也含有硫酸铵、乙酸钠等化学成分。专利cn112011419a提出的产己酸富集的培养基由乳酸钠、乙酸钠、氯化钙、胰蛋白胨等组成，以通入氮气去除氧气维持厌氧环境。
[0004]
上述专利及目前的培养基中含有钠、钾等化学成分，不利于后续相关研究工作的开展，如菌体生长监测、菌液生产应用。因此，针对定向富集培养梭菌属(clostridium)，提供一种不添加任何化学成分的培养基，有利于白酒酿造窖泥的养护，在白酒生产和实际科研中具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
为了解决现有培养基需要加入其他化学成分而影响菌体生长监测、菌液生产应用等问题。本发明采用天然培养基，提供定向富集培养梭菌属微生物的方法。
[0006]
为了实现上述目的，本发明首先提供了定向富集培养梭菌属微生物的方法，其包括以下步骤：
[0007]
a、取窖泥进行培养，得到窖泥种子富集液；
[0008]
b、将五粮混合粉碎后，加水熬煮、糖化、沉淀、过滤得到天然培养基；
[0009]
c、将窖泥种子富集液接种到天然培养基中发酵，发酵温度为25-37℃，培养15-30天，即得富集梭菌属微生物的发酵液。
[0010]
其中，步骤a中，所述窖泥为上层、下层或底层窖泥中至少一种。
[0011]
优选地，窖泥窖龄为15-50年，更优选地，窖龄为30年。
[0012]
其中，步骤b中，所述天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13
°
bx，ph为6.8。
[0013]
其中，所述五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4。
[0014]
其中，步骤b中，采用液化酶、糖化酶分别进行液化和糖化，温度为60-62℃，酶活性均大于3700活力单位/克。
[0015]
其中，液化酶、糖化酶的添加量均为1-2g/l。
[0016]
其中，步骤c中，窖泥种子富集液按10％-20％体积比接种发酵。
[0017]
其中，步骤c中，发酵方式为密封厌氧发酵。
[0018]
其中，步骤c中，还包括加入乙醇和/或黄水补充碳源。
[0019]
优选地，所述黄水按发酵液体积比的1％-3％补充。
[0020]
优选地，所述乙醇按发酵液体积比的1％-3％补充。
[0021]
优选地，步骤c中，还包括在发酵培养的一周后补充乙醇。
[0022]
更优选地，所述乙醇按发酵液体积比的2％补充。
[0023]
最优选地，当在发酵培养一周后补充乙醇时，步骤a中的窖泥为上层窖泥，窖龄为30年。
[0024]
本发明还提供上述定向富集培养梭菌属微生物的方法在白酒酿造中的应用。
[0025]
有益效果：采用本发明的天然培养基定向富集后，梭菌属(clostridium)的相对丰度提高了3-16倍，且梭菌属的相对丰度比在巴氏培养基中提高了38.14％。本发明的天然成分培养基定向富集梭菌属(clostridium)的菌液未含有其他化学成分，能直接用于浓香型白酒应用生产，有利于梭菌属的科学研究和窖泥维护。且本发明的天然培养基配方选用的是黄水等酿酒生产副产物，可以使黄水转变成具有再利用价值的成分，减少了废水排放。
附图说明
[0026]
图1为本发明实施例1属水平下发酵液中原核微生物菌群；
[0027]
图2为本发明实施例2属水平下发酵液中原核微生物菌群；
[0028]
图3为本发明实施例3属水平下发酵液中原核微生物菌群；
[0029]
图4为本发明对比例1属水平下发酵液中原核微生物菌群。
具体实施方式
[0030]
本发明的目的是提供了一种天然培养基定向富集培养梭菌属微生物的方法，该天然培养基不添加任何化学成分，解决现有培养基需要加入其他化学成分而影响菌体生长监测、菌液生产应用等问题。所述天然培养基为五粮粉糖化液。
[0031]
为了实现上述目的，本发明首先提供了定向富集培养梭菌属微生物的方法，其包括以下步骤：
[0032]
a、窖泥种子富集液的制备：准确称取10.0g窖泥加入装有200ml已灭菌的巴氏培养基中，振荡混匀，放入80℃的恒温水浴锅中处理30min，处理结束后，34℃培养箱中培养15天，得到窖泥种子富集液；
[0033]
b、天然培养基的制备：以五种粮食混合粉碎后的五粮粉经过熬煮、糖化、沉淀、过
滤得到；其中，天然培养基为五粮粉糖化液，糖化液终浓度为12-13
°
bx。
[0034]
天然培养基的具体制备过程为：自来水煮沸，加入五粮粉，五粮粉(g):水(ml)＝1:10，熬煮40min，成稀粥状，冷却至60℃，同时加入液化酶1-2g/l和糖化酶1-2g/l，6-62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖调至糖度达到12-13
°
bx左右，ph为6.8，分装灭菌备用。其中，五粮质量配比为高粱：大米：糯米：小麦：玉米＝18：11：9：8：4，粉碎后过20目筛。
[0035]
c、接种发酵培养：将窖泥种子富集液按10％-20％体积比接种，发酵温度为25-37℃，优选为34℃，培养15-30天。厌氧瓶中每天定时定量通入氮气以去除氧气，密封厌氧发酵。厌氧瓶盖和封口膜之间插入已灭菌的针头，防止发酵过程中产气造成爆炸，针头为透气作用，外界杂菌是无法穿梭进入厌氧瓶。
[0036]
其中，步骤a中，年代越久的窖泥中菌群越丰富，因此选择的窖泥的窖龄为10年以上，优选地，窖泥窖龄为15-50年，更优选地，窖龄为30年；所述窖泥为上层、下层或底层窖泥中至少一种。
[0037]
上述技术方案中，梭菌属具有芽孢结构，根据芽孢杆菌的耐热性比非芽孢杆菌强的特点，故通过加热的方法淘汰非芽孢杆菌。通过每天定时定量通入氮气，目的是置换出微生物发酵产生的氧气，并补充氮源物质。厌氧瓶中始终处于动态无氧状态，达到定向富集培养梭菌属的目的。
[0038]
进一步地，在本发明的一种实施方式中，在上述定向富集培养梭菌属的方法中，可在发酵培养基中加入乙醇和/或黄水作为补充碳源，丰富天然培养基培养基成分。黄水按发酵液体积比的1％-3％补充。乙醇也按发酵液体积比的1％-3％补充。
[0039]
在本发明的一种实施方式中，定向富集培养梭菌属微生物的方法，其包括以下步骤：先按照上述a、b、c步骤进行，在步骤c中发酵培养的一周后按发酵液体积比的2％补充乙醇，且步骤a中所述窖泥为上层窖泥，窖龄为30年。
[0040]
在本发明的定向富集培养梭菌属微生物的方法，其包括以下步骤：先按照上述a、b、c步骤进行，其中，步骤a中所述窖泥为上层、下层、底层窖泥，窖龄为30年，在步骤c中按三个方案补充黄水、乙醇：(1)只补充1％黄水；(2)同时补充2％乙醇和1％黄水；(3)补充1％黄水和每隔2天定期补充(模拟流加方式)2％乙醇。
[0041]
黄水是白酒发酵过程中产生的副产物，其中含有大量的乳酸和少量乙醇，且在白酒发酵过程中，窖泥，特别是底层窖泥是直接浸泡于黄水中，故可作为一种天然成分丰富本发明发酵培养基成分。
[0042]
本发明采用乙醇作为碳源补充目的在于：作为碳源补充的选择方面主要是从微生物生长所需方面来考虑的，微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、co2及碳酸盐等。主要从合成己酸的代谢途径来考虑碳源补充。己酸生物合成途径如下式所示。
[0043][0044]
己酸通过β－氧化逆循环进行的羧酸链延长过程而合成。在该过程中，乙醇或乳酸作为电子供体，经过氧化反应合成乙酰辅酶a，提供己酸合成所需的电子和还原力。在丁酰辅酶转移酶等一系列酶的催化下，乙酰辅酶a首先与乙酸缩合为丁酸；再经己酰辅酶a转移酶等的催化作用，乙酰辅酶a与丁酸缩合为己酸。相对于乳酸，使用乙醇作为电子供体合成己酸在热力学方面具有能量增益的优势，是因为乙醇与乙酸的生化反应不会促进能够提供初始三磷酸腺苷(atp)的电子流。因此，有必要为羧酸链延伸过程提供外部能源。通常，一部分乙醇被氧化为乙酸以提供初始能量。根据热力学模型，乙醇作为唯一碳源也可能形成正己酸，因为在乙醇氧化过程中，能够为羧酸链伸长提供可用的所电子受体。因此，本发明选择乙醇作为碳源补充。
[0045]
进一步地，为验证本发明五粮粉培养基的定向富集梭菌属的能力，与经典巴氏培养基进行对比。
[0046]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0047]
实施例1
[0048]
天然成分培养基定向富集培养梭菌属的方法，包括以下步骤：
[0049]
a、窖泥种子富集液的制备：准确称取10.0g窖泥加入装有200ml已灭菌的巴氏培养基中，振荡混匀，放入80℃的恒温水浴锅中处理30min，处理结束后，34℃培养箱中培养15天，得到窖泥种子富集液；其中，窖泥为上层、下层和底层窖泥，窖龄为30年；
[0050]
b、天然培养基的制备：自来水煮沸，加入五粮粉，五粮粉(g):水(ml)＝1:10，熬煮
40min，成稀粥状，冷却至60℃，同时加入液化酶5g/3l和糖化酶5g/3l，62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖调至糖度达到12
°
bx左右，ph为6.8，分装灭菌备用。其中，五粮粉的配比为高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％，粉碎后过20目筛；
[0051]
c、接种发酵培养：窖泥种子富集液按10％体积比接种，发酵温度为34℃，培养20天。厌氧瓶中每天定时定量通入氮气以去除氧气，密封厌氧发酵。厌氧瓶盖和封口膜之间插入已灭菌的针头，防止发酵过程中产气造成爆炸，针头为透气作用，外界杂菌是无法穿梭进入厌氧瓶。
[0052]
将步骤c发酵培养后的发酵液通过高通量深度测序分析clostridium的相对丰度，如图1所示，选取相对丰度高的前15个属制图。
[0053]
由图1可以看出，通过天然培养基进行定向富集培养后，clostridium相对丰度相比种子液提高了7-11倍。上层、下层、底层的窖泥经定向富集培养后梭菌属的相对丰度分别为52.40％、76.48％和40.6％，相比文献《泸型酒酒醅与窖泥中梭菌群落结构、演替和功能差异》(钱玮,陆震鸣,柴丽娟,张晓娟,徐鹏翔,李崎,王松涛,沈才洪,史劲松,许正宏.泸型酒酒醅与窖泥中梭菌群落结构、演替和功能差异[j].生物工程学报,2020,36(06):1190-1197.)中分析糟醅中梭菌属相对丰度19.9％，提高了2-3倍；相比文献《高通量测序技术解析五粮液窖泥原核微生物群落结构》(赵东,郑佳,彭志云,吕学兰,杨康卓,张建敏.高通量测序技术解析五粮液窖泥原核微生物群落结构[j].食品与发酵工业,2017,43(09):1-8.doi:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014156.)中分析窖泥中梭菌属相对丰度22％，提高了2-4倍。
[0054]
实施例2
[0055]
丰富天然培养基定向富集培养梭菌属的方法，包括以下步骤：
[0056]
a、窖泥种子富集液的制备：准确称取10.0g窖泥加入装有200ml已灭菌的巴氏培养基中，振荡混匀，放入80℃的恒温水浴锅中处理30min，处理结束后，34℃培养箱中培养15天，得到窖泥种子富集液；其中，窖泥为上层窖泥，窖龄为30年；
[0057]
b、天然培养基的制备：自来水煮沸，加入五粮粉，五粮粉(g):水(ml)＝1:10，熬煮40min，成稀粥状，冷却至60℃，同时加入液化酶5g/3l和糖化酶5g/3l，62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖调至糖度达到12
°
bx左右，ph为6.8，分装灭菌备用。其中，五粮粉的配比为高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％，粉碎后过20目筛；
[0058]
c、接种发酵培养：窖泥种子富集液按10％体积比接种，发酵温度为34℃，培养20天，发酵培养的一周后补充2％乙醇。厌氧瓶中每天定时定量通入氮气以去除氧气，密封厌氧发酵。厌氧瓶盖和封口膜之间插入已灭菌的针头，防止发酵过程中产气造成爆炸，针头为透气作用，外界杂菌是无法穿梭进入厌氧瓶。
[0059]
将步骤c发酵培养后发酵液通过高通量深度测序分析clostridium的相对丰度，如图2所示，选取相对丰度高的前12个属制图。
[0060]
由图2可以看出，通过丰富天然培养基进行定向富集培养后，梭状芽孢杆菌属(clostridium)相对丰度相比种子液提高了3倍左右，相比窖泥提高了20倍以上。上层窖泥经定向富集培养后梭菌属的相对丰度分别为32.24％和70.38％。
[0061]
实施例3
[0062]
丰富天然培养基定向富集培养梭菌属的方法，包括以下步骤：
[0063]
a、窖泥种子富集液的制备：准确称取10.0g窖泥加入装有200ml已灭菌的巴氏培养基中，振荡混匀，放入80℃的恒温水浴锅中处理30min，处理结束后，34℃培养箱中培养15天，得到窖泥种子富集液；其中，窖泥为上层、下层、底层窖泥，窖龄为30年；
[0064]
b、天然培养基的制备：自来水煮沸，加入五粮粉，五粮粉(g):水(ml)＝1:10，熬煮40min，成稀粥状，冷却至60℃，同时加入液化酶5g/3l和糖化酶5g/3l，62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖调至糖度达到12
°
bx左右，ph为6.8，分装灭菌备用。其中，五粮粉的配比为高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％，粉碎后过20目筛；
[0065]
c、接种发酵培养：窖泥种子富集液按10％体积比接种，发酵温度为34℃，培养20天，按发酵液体积比分三种方案补充：(1)只补充1％黄水；(2)同时补充2％乙醇和1％黄水；(3)补充1％黄水和每隔2天定期补充(模拟流加方式)2％乙醇。厌氧瓶中每天定时定量通入氮气以去除氧气，密封厌氧发酵。厌氧瓶盖和封口膜之间插入已灭菌的针头，防止发酵过程中产气造成爆炸，针头为透气作用，外界杂菌是无法穿梭进入厌氧瓶。
[0066]
将步骤c发酵培养后发酵液发酵液通过高通量深度测序分析clostridium的相对丰度如图3所示。
[0067]
由图3可以看出，通过丰富天然培养基进行定向富集培养后，梭状芽孢杆菌属(clostridium)相对丰度相比种子液提高了0.5-16倍，相比窖泥提高了4-14倍。上层、下层、底层窖泥经定向富集培养后梭菌属的相对丰度10％-86％。定向富集梭状芽孢杆菌属(clostridium)相对丰度采用底层窖泥》下层窖泥》上层窖泥。
[0068]
对比例1
[0069]
验证本发明天然培养基与经典巴氏培养基定向富集培养梭菌属的方法，包括以下步骤：
[0070]
a、窖泥种子富集液的制备：准确称取10.0g窖泥加入装有200ml已灭菌的巴氏培养基中，振荡混匀，放入80℃的恒温水浴锅中处理30min，处理结束后，34℃培养箱中培养15天，得到窖泥种子富集液；其中，窖泥为底层窖泥，窖龄为30年；
[0071]
b、天然培养基的制备：自来水煮沸，加入五粮粉，五粮粉(g):水(ml)＝1:10，熬煮40min，成稀粥状，冷却至60℃，同时加入液化酶5g/3l和糖化酶5g/3l，62℃保温液化和糖化4h，期间每间隔1h搅拌一次，放置4℃冰箱过夜，8层纱布过滤，补足水分，加入葡萄糖调至糖度达到12
°
bx左右，ph为6.8，分装灭菌备用。其中，五粮粉的配比为高粱36％、大米22％、糯米18％、小麦16％、玉米8％，粉碎后过20目筛；
[0072]
c、接种发酵培养：窖泥种子富集液按10％体积比分别接种于五粮粉培养基和巴氏培养基中，发酵温度为34℃，培养20天。厌氧瓶中每天定时定量通入氮气以去除氧气，密封厌氧发酵。厌氧瓶盖和封口膜之间插入已灭菌的针头，防止发酵过程中产气造成爆炸，针头为透气作用，外界杂菌是无法穿梭进入厌氧瓶。
[0073]
其中，巴氏培养基为：每100ml培养基中乙酸钠1g、硫酸铵0.05g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.02g，酵母膏0.1g，121℃灭菌20min后加入乙醇2ml和无菌caco
3 0.75g。
[0074]
将两种培养基发酵培养后的发酵液通过高通量深度测序分析clostridium的相对
丰度，如图4所示。
[0075]
由图4可以看出，对比天然培养基与经典巴氏培养基进行培养后，梭菌属(clostridium)的相对丰度较种子液分别提高了4倍和6倍。在天然培养基中，梭菌属(clostridium)的相对丰度比在巴氏培养基中提高了38.14％。
[0076]
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。